Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика липидно-белковых взаимодействий в модельных липопротеинах высокой плотности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Динамика липидно-белковых взаимодействий в модельных липопротеинах высокой плотности"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ПЕНТР

На правах рукописи

ЗАМАЕВА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА

ДИНАМИКА ЛИПЩЦЮ-ВЕШШИ ВЗАШЩЙСТШЙ В МОДЕЛЬНЫХ ЛШЮПРОТЕИНАХ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ

03. 00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в группе Химии Липопротеинов Института Экспериментальной Кардиологии Кардиологического Научного Шнтра Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель:

кандидат химических наук А. Ю. Мишарин

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук 0. И. Писаренко

Кандидат химических наук Г. ЯМузя

Ведущая организация - Научно-исследовательский Институт Физико-химической Медицины МЗ России

Защита состоится "15" июня 1994 г. в И часов на заседании Специализированного Ученого Совета в Кардиологическом Научном- Центре Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, д. 15-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кардиологического Научного Шнтра РАМН.

Л Л

Автореферат разослан _"____1994 г.

Ученый секретаь Специализированного совета, кандидат биологических на;

Т. И. Еенгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследования молекулярных основ атеросклероза неразрывно связаны с изучением структуры и метаболизма липопротеинов плазмы крови. Основной интерес к исследованию липопротеинов высокой плотности (ЛВП) обусловлен их важной ролью в метаболизме и транспорте холестерина. ЛВП представляют собой гетерогенный класс липопротеинов. Липиды и белки ЛВП способны к обмену с компонентами других липопротеинов и клеточных мембран. При этом происходят изменения состава, структуры, размеров и устойчивости частиц ЛВП. Наличие в плазме крови всего набора частиц объясняет наблюдаемую гетерогенность ЛВП и вносит дополнительную сложность в экспериментальные исследования.

В исследованиях ' липидно-белковых взаимодействий широко применяются модельные ЛВП- мицеллярные двухкомпонентные комплексы anoлипопротеинов с липидами. Исследования дискообразных комплексов позволили получить важные данные о прочности бе-лок-липидных контактов, о влиянии структуры пептидного фрагмента на связывание с липидами и влиянии белковой части комплекса на свойства липидов в комплексе, а также о метаболизме и транспорте ЛВП и роли отдельных компонентов ЛВП в опытах La. vivo.

Несмотря на значительный прогресс в исследованиях структуры и метаболизма липопротеинов (природных и модельных) многие вопросы строения и функционирования ЛВП исследованы недостаточно. В первую очередь, вопросу касающиеся причин гетерогенности и структурных изменений липопротеинов. До сих пор в литературе обычно лишь констатируется сам факт структурного изменения частицы, происходящего при метаболических превращениях, без попыток объяснения происходящих изменений на молекулярном уровне. Динамика липидно-белковых взаимодействий в составе частицы ли-попротеина и возможность изменения структуры частицы без диссоциации на отдельные компоненты играют важнейшую роль в подобных процессах.

Шли а задачи работы Исследования модельных ЛВП, проводимые в группе химии липопротеинов ИЭК КНЦ, позволили разработать модель взаимодействия аполипопротеинов с липидами в мицеллярных дискообразных комплексах. На основании этой модели в работе вы-

двигается гипотеза, согласно которой поверхностно-активные свойства аполипопротеина являются основной причиной стабильности ыицеллярного комплекса, а гибкость полипептидной цепи аполипопротеина и возможность многоточечного кооперативного связывания нескольких амфифильных участков белка на поверхности раздела вода/липидная мицелла объясняет наблюдаемую гетерогенность двухкомпонентных комплексов.

Целью работы являлось экспериментальное подтверждение данной гипотезы.

В работе были поставлены следующие задачи: I) провести структурное исследование комплексов, образуемых димиристоилфос-фатидилхолином (ДМФХ) с полипептидными молекулами с различным числом амфифильных участков; 2) исследовать рекомбинацию комплексов апоА1/ФХ, вызываемую присутствием одного из компонентов (аполипопротеина или фюсфатидилхолина); 3) провести кинетическое исследование обмена фосфатидилхолина между мицеллярными комплексами; 4) использовать полученные данные о поверхностно-активных свойствах апобежов и обмене фосфолипидов для направленного изменения липидного и липопротеинового спектра плазмы крови.

Научная новизна а практическая значимость работа В настоящей работе выдвинута и экспериментально подтверждена новая научная гипотеза о структуре и особенности липидно-белковых взаимодействий в составе мицеллярных комплексов апоА1/ФХ, моделирующих насцентньв ЛВП плазмы крови. В работе показано, что взаимодействие коротких амфифильных пептидов с ДМФХ описывается адсорбцией пептида на границе раздела фаз вода/липидная мицелла. Поверхностно-активные свойства апоАГ в составе комплексов апоА1/ ДМФХ различной стехиометрии изменяются и определяются содержанием липида в составе комплекса. Возможность кооперативного связывания апобелков с фосфолипидами обеспечивается гибкостью полипептидной цепи и приводит к рекомбинации модельных ЛВП в присутствии отдельных компонентов. Исследована кинетика скорость-лимитирующей стадии рекомбинации - обмена фо-сфолипидов.

Полученные результаты о динамике липидно-белковых взаимодействий в модельных ЛВП имеет важную практическую значимость: показана возможность использования иммобилизованных комплексов апоЛЕП/ФХ для направленной коррекции липидного и липопротеинов-

ого спектра плазмы по принципу лигандного обмена. Аптобапия работы. Результаты работы были представлены на 11 Российско-Израильском Симпозиуме по пептидам и белкам (Москва, 1992) и международном симпозиуме "Зссенциальные фосфолипиды" (Подмосковье, 1992). Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре ИЭК в КНЦ РАМН.

Структура н объем работы Диссертационная работа состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы" и "Список литературы" (... ссылок). Работа изложена на ... страницах машинописного текста, иллюстрирована ... рисунками- и 4 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Аполипопротеин AI выделяли ЛВП плазмы крови человека по методу [Мишарин с соавт., 1985]. Чистоту препарата контролировали по электрофорезу в полиакриламидном геле с добавлением додецил-сульфата натрия [Laemmll, 1970]. Ковалентно связанный димер anoAI - (апоА1)2 - получали обработкой anoAI диметилсуберимида-том [swaneу et al., 1978] с последующим выделением (anoAI)2 гель-хроматографией в 5 М растворе мочевины. Дансилированный anoAI (дансил-AI) получали по методу [Jonas, 1975].

Пептиды триптяческого расщепления anoAI получали в стандартных условиях [Дэвени, Гергей, 1976]. Пептид UP-20 был любезно предоставлен д-ром Sparrow J. Т. (Бэйлор колледж, Хьюстон, США). Пептид был синтезирован модифицированным твердофазным методом [Sparrow, 1976] и очищен БЭЖХ на 2.5X25 см колонке "Vydac С4".

АпоЛВП/ФХ-сефарозу получали как описано в работе [Антонов с соавт., 1992]. В препарате анализировали содержание фосфоли-пидов на I см^ сорбента. Комплексы апоЛВП/ФХ/ФХ* и апоЛВП/ФХ/ ФХ*-сефарозу получали при добавлении раствора дипальмитоилфо-сфатидил-[^с]_холина ("Araersham").

Полислойныэ липосомы ЯФХ получали по методу [Batzrl et al., 1973]. Спин-меченный ФХ получали по методу [Мишарин, 1983]. Липопротеиндефицитную сыворотку получали по метвду [Goldstein et al., 1983].

Материалы для модификации белка, трипсин и реагенты для электрофореза получены от фирмы "sigma"; сорбенты для гель-хроматографии (Sephacryl S200, Sephadex GlO, сефароза CL-4B) и

з

набор стандартных белсов - "Pharmacia"; бромциан, 2-хлорэтанол, 2-меркаптоэтанол, L -4-фосфатидалхолин из куриного желтка (ЯФХ), L-rf.-димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ) - "Merk"; эссенциальные фосфолипида - препарат LIpostabi1 ("Nattermann").

Спектры поглощения anoAI, дансил-AI регистрировали на спектрофотометре Shimadzu 2000 в кварцевых кюветах с оптическим путем I см.

Комплексы апоАГ/ДМФХ получали как описано в работе [Мишарин с соавт., 1988]. Содержание белка в комплексе определяли по методу [la wry et al., 1968], фосфолипидов - по методу [Vaskovsky et al., 1979]. Размеры комплексов рассчитывали из данных электронной микроскопии (негативное контрастирование) и недена-турирующего полиакриламидного гель-электрофореза [Blanche et al., 1981]. Электронные микрофотографии получены на электронном микроскопе JEM-IOO, üEOl при 66000- и 100000-кратном увеличениях.

Комплексы ДМФХ с пептидом lap-20, фрагментами anoAI, (апоА1)2 и дансил-AI получали аналогично комплексам anoAI/ДМФХ. В комплексах с фрагментами anoAI определяли содержание аминогрупп по методу [Satake et al., I960].

Аналитическое ультрацентрифугирование комплексов проводили на центрифуге фирмы Вескшап, модель Е.

Рекомбинацию комплексов anoAI/ДМФХ с anoAI и ФХ проводили как описано в работе [Мишарин с соавт., 1991]. Полученные комплексы анализировали градиентным неденатурирующим гель-электрофорезом, а также по содержании фосфолипидов, белка и по флуоресценции при 510 нм.

Спектры флуоресценции регистрировали на приборе "Ami neo SPF 500" в режиме "Rati о", в кварцевых кюветах с оптическим путем I и 0, 5 см при 24°С и длине волны возбуждающего света 295 нм. В экспериментах по флуоресценции концентрация lap-20 была 50 мкЕ

Поляризацию флуоресценции [Jonas et al., 1980] регистрировали на том же приборе, используя поляризационную приставку, в стандартной термостатированной кювете, и длину волны возбуждения 340 нм.

Спектры ЭПР регистрировали на приборе Vari an Е 109, используя микроволновую частоту 9.15 МГц, в плоской кварцевой кювете объемом 50 мкл при 24°С. Мощность СВЧ 20 и 5 мВт, амплитута модуляции 2. О и 0. 5 Гс.

Радиоактивность определяли методом сцинтилляционной радио-

метрии на приборе фирмы "Тгасог" в сцинтилляторе ЖС-8 "Реахим".

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинах hptlc-60 "Herck" в системе гексан: эфир: муравьиная кислота (90:9:1). Для идентификации продуктов использовались пары иода.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе выдвигается гипотеза, в которой устойчивость мицеллярных комплексов аполипопротеина с фосфолипидами объясняется поверхностно-активными свойствами аполипопротеина, а стабилизация комплексов разного размера и состава обеспечивается за счет гибкости полипегпидной цепи аполипопротеина и возможности кооперативного связывания амфифильных участков белка на поверхности раздела вода/липидная мицелла.

Комплексообразование коротких амфифильных пептидов с ДМФХ В работе проводилось исследование комплексообразования ДМФХ с синтетическим пептидом LAP-20 [Pownall et al., 1980], моделирующим один амфифильный сс-спиральный участок аполипопротеина. Структура LAP-20 и диаграмма "спирального колеса" приведены на рис. I [по Shi ffer 4 Edmundson, 1967].

Yal Ser Ser Lfu Leu Ser Ser Leu Lys Glu Tyr Trp Ser Ser leu Lyj Glu Ser Leu Ser

Рве. Ь Графическое изображение пептида 1АР-20.

Наличие Тгр остатка на гидрофобной поверхности пептида позволяет следить за связыванием 1.АР-20 с липидаыи по изменению соб-

ственной триптофановой флуоресценции пептида. Ранее было показано, что в присутствии ДМФХ положение максимума спектра флуоресценции сдвигается в коротковолновую область (с 350 нм в воде до 334 нм в составе комплекса 1АР-20/ДМФХ) [Рокпа11 е1 а 1.,

Влияние полярности окружения на положение максимума спектра флуоресценции Тгр остатка показано на рис. 2. Уменьшение полярности растворителя (титрование 2-ХЭ) приводит к коротковолновому сдвигу максимума спектра флуоресценции 1.АР-20 в 2-ХЭ по сравнению с пептидом в воде (кривая I, рис. 2). На кривых 2, 3 и 4 (рис. 2) приведены кривые титрования 1АР-20 2-ХЭ в присутствии ДМФХ. При концентрации 2-ХЭ 0<Х2_хэ<0.1 в присутствии ДМФХ наблюдается дополнительный коротковолновый сдвиг (6-12 нм). При концентрации Х2_хэ>0.1 положение Лтах не зависело от присутствия ДМФХ

Если в условиях избытка ДМФХ экстраполировать значение максимума спектра флуоресценции (кривая 4) к нулевой концентрации 2-ХЭ, то полученное значение (330 нм) соответствует положению максимума спектра флуоресценции I АР-20 в комплексе с ДМФХ Близкое значение было получено в работе [РоипаП е1 а1., 1984], при инкубации 1.АР-20 с избытком ДМФХ в водном растворе. Сравнивая положения Л,,,^ спектров флуоресценции в отсутствии и присутствии ДМФХ можно рассчитать концентрацию 1.АР-20 (в мольной доле \цр_2о). связанного с ДМФХ по формуле:

1984].

w ■»

Рис. 2. Влияние ДМФХ на положение максимума спектра флуоресценции LAP-20 (0.25 мМ) (кривая I) в зависимости от содержания 2-хлорэтанола. Кривая 2 - LAP-20 в присутствии ДМФХ, молярное соотношение I: 4; кривая 3 - то же при малярном соотношении I: 20; 4 -то же при молярном соотношении 1:80.

и ш 0.1 аоз о

Хз-хэ

х1АР-20 = ■

ЛLAP-20 -ЛаР-20+ДМФХ

\и?-го - 330

(I)

где Л|_др_2о - положение Лтах для свободного пептида при определенном значении концентрации 2-ХЭ (кривая I, рис. 2); -\ар-20+Д®Х ~ положение Дтах для связанного с ДОФХ пептида при различных соотношениях 1№-20/ШФХ и той же концентрации 2-ХЭ

(кривые 2-4, LAP-20/ДМФХ.

рис. 2); 330 - положение Лтах комплекса

[LAP-20/ДМФХ], *1<Р

5

О 20 40 60 80 [ДМФХ] / [LAP-20]

-т

12

0 4 8

[LAP-20] / [LAP-20/ДМФХ

Рис. 3. Связывание LAP-20 с ДМФХ. А. - Зависимость мольной доли связанного с ДМФХ пептида (вычислено по формуле I, си.текст) от отношения LAP-20/ДМФХ при разном содержании 2-ХЭ в инкубационной сшси. Б - График Скэтчарда, показывающий связывание lap-20 с ДМФХ при разном содержании 2-ХЭ в растворе. Кривые соответствуют следующему содержанию 2-ХЭ: 1-0,080; 2-0, 069; 3 - 0,053.

Зависимость Х|_др_2о от концентрации ДМФХ и мольной доли 2-ХЭ представлена на ряс. 3 (а). Видно, что при уменьшении концентрации 2-ХЭ, вызывающем агрегацию ДМФХ, увеличивается мольная доля связанного пептида.

На графике Скэтчарда (рис. 3 (б)) приведена зависимость образования комплекса 1АР-20/ДМФХ от содержания ДМФХ при трех разных концентрациях 2-хлорэганола в смеси. Линейность зависимости [1АР-20/ДМФХ] от [ с ар -20/[ ь ар -20/ДМФХ] ] при всех исполь-

зованных концентрациях 2-ХЭ (см. рис. 3 (б)) указывает на то, что концентрация комплекса зависит не от концентрации

ДМФХ в инкубационной смеси, а от концентрации агрегатов (мицелл) ДОХ.

Полученные результаты позволяют рассматривать комплексооб-разование 1АР-20 с ДМФХ как адсорбцию пептида на липидных мицеллах ДМФХ. Понятие адсорбции здесь используется в классическом определении - изменение концентрации компонента (в данном случае - пептида 1.АР-20) на границе раздела фаз (в данном случае - на поверхности липидная мицелла/вода).

Полагая, что именно адсорбция на поверхности агрегатов ДОХ является общим свойством коротких амфифильных пептидов, в работе было проведено исследование комплексообразования ДМФХ с цар— 20 и пептидами триптического гидролиза апоА1.

Комплексы 1АР-20/ДМФХ заметно диссоциировали в условиях гель-хроматографии, а при рехроматографии - диссоциировали практически полностью. По данным электронной микроскопии комплексы 1.АР-20 с ДМФХ представляли в основном протяженные ламел-лярньв структуры и частично разрушенные полислойные липосомы. Аш

адетошггрила! % Рис. 4. Разделение на колонке Уус1ак С4 (0. 5x25 см) делипи-дированной смеси пептидов триптического гидролиза апоА1 после инкубации с ДМФХ. Пунктиром показан градиент концентрации ацетонитри-ла.

• •II

о 10 20 30 40 Время, мин.

После обработки апоАГ трипсином к смеси пептидов добавляли ДМФХ и выделяли образующиеся комплексы При анализе делипидиро-ванной фракции комплексов было найдено 4 гидрофобных пептида (рис. 4).

По данным электронной микроскопии комплексы представляют

собой крупные ламеллярные структуры и полислойные липосомы. Дискообразных структур, ассоциированных в стопки, характерных для комплексов апобелков с фосфолипидами, как и для LAP-20 с ДМФХ выявлено не было. По мнению некоторых авторов сам факт образования дискообразного комплекса пептида с ФХ служит доказательством структурного сходства пептида с аполилопротеинами [Segrest et al., 1992]. Однако дискообразные комплексы коротких модельных пептидов с ДМФХ образуются только при "избытке" пептида [Anantharamal ah et al., 1985 ]. Используя формулу, связывающую размеры диска и весовые отношения пептида и липида [Tall et al., 1977]:

0=L 34 L/W2xt, (2)

(где d - диаметр частиц, l/p - соотношение липид/белок, at- диаметр «-спирального участка),

становится понятно, что в состав комплекса включено не более 30% пептида, присутствующего в смеси.

Таким образом южно заключить, что адсорбция коротких амфи-фильных пептидов на мицеллах ДМФХ не приводит к образованию дискообразных комплексов, имеющих определенный стехиометричес-хий состав и размеры

Повархностно-активные свойства anoAI g комплексах £ фосфолипида та. Для anoAI способность образовывать устойчивые дискообразные комплексы с фосфолипидами хорошо известна [Jonas, 1986]. Поскольку в полипептидной цепи anoAI содержится от 8 до 12 амфифильных а-спиральных учасков, очевидно, что комплексы ФХ с anoAI будут отличаться от комплексов с короткими пептидами. Мы предположили, что при образовании комплексов anoAI с липидами существует "многоточечное" связывание и вероятность связывания белковой молекулы с липидной мицеллой посредством разного количества отдельных амфифильных доменов. Т.е. одни и те же гидрофобные поверхности амфифильных участков anoAI стабилизируют конформацию делипидированного anoAI в водных растворах и связываются с липидом в составе комплекса апоАЕ/ДОКС. В таком случае, при многоточечном связывании anoAI в составе малого комплекса, ненасыщенного липидом, должна существовать гидрофобная белок-белковая складка. Структурные исследование комплексов

апоА1/ФХ разного состава [Медведева, Мишарин, 1991] указывают на разную толщину белковой оболочки. Другими словами, в малом комплексе белок, локализованный на периферии диска, имеет толщину больше, чем толщина сх-спирального домена. Многоточечное связывание anoAI с липидом учитывается в некоторых моделях, описывающих строение ЛВИ Так, по мнению Сегреста и соавторов, участок anoAI 66 - 120 связан с фосфолипидной поверхностью в ЛВП2, но погружен в водную фазу в ЛВП3 (шарнирный домен) [Segrest et al., 1992]. По мнению Филлипсa [Phi 11 ips, 1993], в стабилизацию структуры рекомбинантных ЛВП вовлечены как короткие (II-14-членные), так и длинные (22-членные) амфифильные фрагменты белка. Очевидно, если из II амфифилъных фрагментов молекулы anoAI в связывании с липидом участвуют не все, то гидрофообные поверхности оставшихся амфифилъных доменов будут образовывать белок-белковую гидрофобную складку. Тогда возможность одновременного существования гидрофобных белок-липидных и белок-белковых контактов в мицеллярном двухкомпонентом комплексе и их кооперативные переходы в составе такой частицы могут служить объяснением и гетерогенности, и известных структурных превращений и устойчивости дискообразных комплексов anoAI с фосфолипидами.

В связи с вышесказанным длина полипептидной цепи и количество амфифилъных доменов в цепи должны влиять на структуру и свойства комплексов соответствующих белков с ДМФХ

Таблица I. Характеристика комплексов anoAI/ДОФХ

Состав комплекса ДМФХ/anoAI, иоль/моль S 20 w, S АлоЛ1 / комплекс*, молекула/частица Средние размеры диска**, нм (2r*h)

20 З.б 4.7 10.6x4.4

40 3.4 3.7 10.6*4.4

100 3.7 . Z3 11.1*4.4

250 4.2*** 4.7 20.0*4.4

* Рассчитано на основании стехиометричесхого состава и парциальных объемов компонентов. •* Усредненные значения, полученные при измерении не менее 200 образцов. *** Значения для основного компонента (80%), гомогенного в условиях ультрацентрифугирования.

Комплексы anoAI/ДМФХ с разным стехиометрическим составом (1:20, 1:40, 1:100, 1:250 моль/моль) были получены инкубацией в присутствии 2-хлорэтанола по ранее разработанному методу [Mlsharln et al., 1985]. При исследовании механизма образования смешанных мицелл апоА1/ФХ в присутствии органических растворителей показано, что амфифильные участки anoAI не взаимодействуют с мономерами ФХ [Мишарин с соавт., 1983]. Данные аналитического ультрацентрифугирования и стехиометрического состава комплексов сведены в таблицу I. Из таблицы видно, что происходит образование комплексов разного диаметра, но одинаковой толщины. Рассчитав полную площадь поверхности дискообразной мицеллы S по формуле:

S = 2jtr( r+h), (3)

где г радиус диска, h толщина диска

и, принимая во внимание количество молекул бежа в каждом диске, п, можно рассчитать долю полной поверхности, приходящуюся на одну молекулу anoAI, s Aj:

sAj = S/n = 2Jlr(r+h)/n (4)

Поскольку поверхность мицеллы Sсвязана со значением максимальной полезной работы детергента Атах известным соотношением:

Araax =ffS (5)

понятно, что вклад каждой из молекул anoAI в стабилизацию больших и малых комплексов различен. Зависимости значений sAj от соотношения компонентов в комплексе представлены на рис. 5. Видно, что значения sAj увеличиваются с ростом содержания липида в составе комплекса.

Приведенные выше результаты указывают на важность гибкости и длины полипептидной цепи аполипопротеина AI для устойчивости и структуры дискообразных комплексов этого белка с ФХ, показывают, что аполипопротеин AI в составе дискообразного комплекса играет роль детергента, уменьшающего поверхностное натяжение на поверхности раздела фаз. Причем поверхностно-активные свойства anoAI зависят от стехиометрического состава частиц. Изменения этих свойств могут быть охарактеризованы с

помощью параметра sAj, описывающим энергетический вклад молекулы anoAI по стабилизации липидной мицеллы. Такое описание поверхностно-активных свойств молекулы anoAI объясняет существование стабильных двухкомпонентных комплексов anoAI: ДМФХ различного состава и позволяет сравнить структуру, размеры и состав комплексов anoAI с разными фосфатидилхолинами, полученных разными авторами (см. рис. 5)

Рис. 5. Зависимость параметра от состава комплексов anoAl/KC I - данные настоящей работы; 2 - рассчитано по данным [Nichols et al., 1983]; 3 - по данным [wetterau, Jonas, 1983]; 4 - по данным [Jonas, McHugh, 1984].

1UU I I .1

О 100 200 300

[ФХ]/[А1]

Рекомбинаиия комплексов апоА1/ФХ в присутствии отдельных компонентов. Мы предположили, что инкубация комплекса апоА1/ФХ с любым из компонентов должна вызывать образование мицелл, характиризующихся новым стехиометрическим составом и размерами. Поскольку добавление какого-либо из компонентов приводит к изменению химических потенциалов всех компонентов системы, то скорость уравновешивания химических потенциалов и определяет скорость образования новых мицелл. В самом деле, если комплексы апоА1/ФХ, в которых амфифильные участки anoAI связаны с липидом, смешать со свободным белком, в котором амфифильные участки с липидом не связаны, то происходит установление нового равновесия (т.е. выравнивается химический потенциал anoAI в системе с другим соотношением anoAI/ФХ). Если к малому комплексу anoAI/ФХ, в котором часть амфифильных доменов белка не связана с липидом, добавить ФХ, то за счет вовлечения этих участков в связывание с липидами, стехиометрия комплекса должна изменяться. На рис. 6 представлены данные неденатурирующего гель-электрофореза инкубационных смесей комплексов anoAI/ФХ со свободным anoAI или с полислойными липосомами ЯФХ. Из приведенных денситограмм видно, что при инкубации с делипидаро-

Абю

72.0

L_

Подвижность

Аб10

Подвижность

Aíio

Подвижность

А«10

Подвижность

Рис. 6. Денситограммы градиентного (4-30 %) гель-электрофореза: А - комплекса апоА1/ЯФХ (1:20 моль апоА1/моль ЯФл, 10 мкг anoAI); Б - комплексов anoAI/ЯФХ, выделенных после инкубации с избытком полислойных липосом ЯФХ;- В - комплекса апоА1/ДМФХ (1:100 моль апоА1/моль ДМФХ, Ю мкг anoAI); Г - смесь того же комплекса anoAI/ДМФХ и делипидированного anoAI (10 мкг).

ванным anoAI происходит образование гетерогенной смеси комплексов меньшего размера (рис. 6 Г). Тогда как инкубация комплексов anoAI-ЯФХ с избытком липосом ЯФХ приводит к значительному увеличению размеров комплексов и образованию дискретных фракций (рис. 6 Б), совпадающих по подвижности с крупными комплексами anoAI-ЯФХ полученными холатным диализом [Forte et al.,1985].

Чтобы регистрировать образование новых комплексов, при рекомбинации anoAI с комплексом anoAI/ДМФХ, а также оценить скорость этого процесса, мы использовали известную модификацию лизиновых остатков anoAI дансил хлоридом Как известно, дансили-рование anoAI не препятствует образованию комплексов с липидами [Antonov et al., 1985]. Изменение поляризации флуоресценции происходило мгновенно при смешивании дансил-Al и комплекса anoAI/ДМФХ. Это указывает на то, что связывание дансил-AI с комплексом не является скорость-лимитирующей стадией рекомбинации.

Для выяснения механизма происходящей рекомбинации была исследована кинетика взаимодействия ФХ входящего в состав комплекса, с липосомами из спин-меченого фосфатидилхолина (см-ФХ), формулы 1-стеароил-2-( 9-доксилгептадеканоил) -s п-глицеро-3-фос-фохолин.

На рис. 7 приведен спектр ЭПР полислойных липосом см-ФХ (10""4 у) в водном растворе (спектр А). Спектр представляет собой синглет, обусловленный обменным и диполь-дипольным взаимодействием парамагнитных центров. При добавлении к раствору липосом см-ФХ комплекса апоА1/ФХ наблюдается трансформация спектра во времени (спектры Б и В). Наблюдаемые спектральные изменения отражают уменьшение вклада синглетной компоненты (пропорциональной количеству липосомальной формы см-ФХ) и увеличение вклада встроенных молекул см-ФХ в комплекс апоА1/ФХ После 4 ч инкубации происходит полное перераспределение см-ФХ между частицами (спектр Б).

Кинетика рекомбинации см-ФХ с мицеллярными комплексами описывалась отношением I j/l 2» изменение которого со временем отражает процесс встраивания см-ФХ в комплекс anoAI/ФХ, а также уменьшение содержания липосом см-ФХ в среде. На рис. 7 Г представлена зависимость I j/l 2 от времени после добавления к см-ФХ липосомам комплексов anoAI/ДМФХ (кривая I) и апоА1/ЯФХ (кривая 2). Следует отметить, что спектры ЭПР см-ФХ встроенн-

ого в комплексы, идентичны как для комплексов anoAI с ДМФХ, так и с ЯФХ, т. е. скорость рекомбинации см-ФХ липосом с комплексом апоА1/ФХ не зависит от структуры липида в комплексе: как для anoAI/ДМФХ (кривая I), так и для ano AI/ЯФХ (кривая 2) параметр I j/l 2 после 3 ч инкубации не изменяется.

Исходя из того, что, во-первых, сигнал диссоциированной формы см-ФХ не наблюдается после добавления комплексов, во-вторых, характер изменения 11/12 и вРемя установления равновесия в системе (выход на плато кривых, представленных на рис. 7 Г) не зависят от структуры ФХ в составе комплекса, но ускоряются в присутствии лизоФХ, можно полагать, что процесс рекомбинации контролируется стадией диссоциации см-ФХ липосом.

1S

Таким образом показано, что при рекомбинации изменяются состав и размеры дискообразных комплексов, а следовательно, изменяются и поверхностно-активные свойства anoAI. Рекомбинация представляет собой кинетически сложный процесс, в котором скорость образования новых комплексов определяется скоростью перераспределения липида между мицеллами.

Следует отметить, что исследованные процессы взаимодействия anoAI с комплексом апоА1/ФХ принципиально отличаются от взаимодействия anoAI с природными ЛВП. В многочисленных работах показано, что присутствие "кора" из неполярных липидов стабилизирует глобулярную частицу ЛВП настолько, что наблюдается лишь замещение белкового компонента на поверхности частицы [Massey et al., 1980].

Кинетическое исследование обмена ФХ между мипелляряыми комплексами апоА1/ФХ В данном разделе исследована кинетика обмена фосфатидилхолина между мицеллярными комплексами. Наш разработан простой и эффективный метод, позволяющий проводить кинетические эксперименты по обмену липидов. Мы использовали распределение радиоактивномеченного фосфатидилхолина (ФХ*) между комплексами апоЛВП/ФХ, находящимися в растворе, и теми же комплексами, иммобилизованными на сефарозной матрице (апоЛВП/ФХ-сефароза). Использование иммобилизованных комплексов позволяет: изучать обмен ФХ между частицами одного класса; легко разделять исходные и прореагировавшие комплексы, находящиеся в разных фазах - растворе и геле; использовать аппарат формальной химической кинетики.

Результаты такого исследования приведены на рис. 8. ФХ* вводили или в комплекс апоЛЕП/ФХ или в апоЛВЦ/ФХ-сефарозу. Вьгаи проведены две серии экспериментов: I) определение выхода ФХ* из апоЛВП/ФХ/ФХ*-сефарозы в буфер, содержащий немеченые комплексы апоЛВП/ФХ (рис. 8 А); 2) определение включения ФХ* в состав ano ЛВП/ФХ-сефарозы при инкубации ее с меченым комплексом апоЛВП/ФХ/ФХ*, находящимся в бзфре (рис. 8 Б).

Инкубацию проводили при 20°С при начальных соотношениях ФХ раствора/ФХ геля равных 5:1; 3,5:1; 0, 9:1; 0,35:1. Из рис. 8 А, Б видно, что кривые, выражающие распределение ФХ* между раствором и гелем, имеют насыщаемый характер. Определение концентрации фосфатидилхолина в растворе показало, что в условиях эксперимента количество фосфолипидов в растворе и в

А4*10-5, имп/мин

0.8

0.4

(А»/ФХ) • 10-4, имп/ (мин*мг)

1.5 1.2

0.9

0.6

0.3

Аг1(Н, имп/мин

10

8 12 16 Б

Время, ч.

0 4 8

В

кг 103, 1/мин

12 Время, ч.

Т,К

Зависимость общего содержания ФХ* (имп/мгщ) в буфере инкубации: А - инкубация алоЛВП/ФХ/Фл -с е £

6 (2), _6. 4^3), 9. б (4)) и в отсутствии^ комплекса апоЛВА

Рис. 8.

времени ......„___,..... ......,________ _________ ... -

комплексом апоЛВП/ФХ (содержание ФХ (мг) в комплексе:

(кривая 5 апоЛВП/Ф:

инкубация а по ЛВП/ФХ-с е фар о з ы с комплек

_________ _.„ ... в отсутствии комплекса апоЛВП/ФХ (кривая I)

присутствии комплекса апоЛВП/ФХ (содержание ФХ (мг комплексе: 0.75 (2), I. 5 (3), 3.75 (4), 6.0 (5)): . зависимость кажущихся значений константы скорости выхода Фа апоЛВП/ФХ/ФХ -сефарозы (кт) в инкубационную среду температуры.

из от

8

б

геле оставалось неизменным, что указывает на отсутствие однонаправленного массопереноса ФХ. Удельная активность ФХ в растворе и в геле выравнивалась через 60 - 72 ч. Следовательно, наблвдаемый переход ФХ* между двумя фазами можно представить, как обратимый процесс.

Сумма констант скоростей первого порядка (к^+кз) определялась графически или из формулы:

(кх+к2)4 = -1п(Г - At/Aj (6)

Подставляя в формулу (6) значения (KJ+K2), получены отдельно значения Kj и к2- Они составили для kj 0. 45( ±0. 2) • I0-3 мин-1; для к2 I. 35(+0. 2)-Ю-3 мин-1.

Линейный характер температурной зависимости kj в интервале температур от 5 до 45°С (рис. 8 В) указывает на то, что зависимость kj выхода ФХ* из апоЛБП/ФХ/ФХ*-сефарозы подчиняется уравнению Аррениуса.

Полученное значение к2 (I. 35(+0. 2) х10~^ мин~^) близко к найденному в работе [Jonas et al., 1988] значению константы скорости первого порядка однонаправленного переноса ФХ из комплекса апоА1/ФХ к ЛНП ((1.6 - 2. 8) х1СГ^ мин"-1-). Найденные различия в значениях kj и K2 определяются эффектами иммобилизации, а также наличием межбелковых "сшивок", присутствующих в апоЛВП/ФХ-сефарозе и влияющих на подвижность фосфатидилхолина. Стабилизация белок-белковых контактов ковалентной связью в составе комплекса (апоА1)2/ДМФХ, как было показано [Мишарин с соавт., 1989], повышает температуру фазового перехода ДМФХ (или приводит к увеличению фракции прочно связанных с белком липидов).

Вышеприведенные данные позволяет считать обмен фосфатидилхолина между мицеллярными комплексами обратимой реакцией первого порядка. Однако, данное заключение справедливо только для модельных систем в отсутствии соединений, ускоряющих процессы обмена, или влияющих на мзханизм обмана.

Присутствие сывороточных белков сильно влияэ-i на скорость к механизм обмена фосфолигшдов. На рис. 9 представлены зависимости накопления радиоактивномеченого фосфатидилхо.яша в растворе, в котором присутствовали комплексы апоЛЕП/ФХ и беям сызо-ротки в различных концентрациях.

А1» 10-+, имп/мин

3

5

Рис. 9. Зависимость общего содержания ФХ* (имп/мин) в растворе от времени инкубации апоЛВП/ФХ/ФХ*-сефарозы с комплексом апоЛВП/ФХ при 37° С в присутствии белков сыворотки: 0. 4 (I), 0.6 (2), 1.8 (3), 6.0 (4), 18.0 (5) и 0. О (6) мг/мл.

4

2

I

3 2 1

б

80 160 240 время, мин.

Видно, что с увеличением содержания белков сыворотки скорость выхода ФХ* из апоЛВЦ/ФХ/ФХ<,-сефарозы возрастает. Кроме того белки сыворотки влияют на механизм обмена, входя в кинетическое уравнение. В самом деле, для скорости выхода ФХ*, имеющей первый порядок по концентрации ФХ и п-ный порядок по концентрации сывороточного белка, справедливо выражение [ Эмануэль, Кнорре, 1974]:

где кэф - кажущееся значение ^ ; [ФХ] и [Р] - концентрации фосфатидалхолина и белка; индекс 1 соответствует отношению содержания сывороточных белков в опыте, по сравнению с содержанием их в целой плазме.

Поскольку в данных опытах использовалась одна сыворотка с различным разведением, значения [Р}] составляли [0,01Р], [О, ОЗР], [0,1Р] и [О, ЗР]. После элементарных преобразований из выражения (7) следует:

где В - постоянная, не зависящая от разведения сыворотки в

1п(у,) = 1п(кэф) + 1п[ФХ] + г х 1п[р,]

(7),

1«^) = В + л х Ь[1]

(8),

данном опыте; i - отношение концентраций в опыте, по сравнению с концентрацией белка в целой плазме.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что белки сыворотки увеличивают скорость обмена ФХ, а также могут служить как дополнительные акцепторы обменивающихся липидов.

Использование апоЛБП/ФХ-сефарозь; для направленного изменения липидного состава плазмы. Поскольку известно, что мицеллярные комплексы апоА1/ФХ (в том числе и иммобилизованные) являются акцепторами холестерина [Misharin, Antonov- 1987], мы предположили, что инкубация плазмы с апоЛВП/ФХ-сефзрозой должна приводить к изменению липидного состава плазмы. Естественно, что инкубация плазмы с апоЛВП/ФХ-сефарозой эквивалентна локальному повышению концентрации ЛВП. Инкубация образцов плазмы крови человека с апоЛБП/ЗФХ-сефарозой (в качестве липидного компонента использовались полиненасыщенные, эссенциальные, фосфолипиды из бобов сои) в течение 4 ч. при 37°С приводит к изменению липидного состава плазмы (рис. 10). Инкубация апоЛЕП/ЭФХ-сефарозы с плазмой in vitro приводит к снижению общего холестерина плазмы на 30-40%, снижению триглицеридов на 8-12% и увеличению содержания линолевой кислоты (Cjg.2) на 8%. Снижение концентраций общего холестерина и триглицеридов происходило практически сразу же после смешивания образца плазмы с апоЛВП/ФХ-сефарозой и заметно не изменялось в течение остального времени инкубации, изменения уровня ФЛ в плазме варьировали в зависимости от образцов. Изменения концентрации ФЛ в плазме можно представить в виде двух процессов: быстрой сорбции на сефарозе и медленным обменом ФЛ между частицами.

На рис. II представлена хроматограмма неполярных липидов, сорбированных апоЛВП/ФХ-сефарозой из плазмы. Видно, что преимущественно сорбировались эфиры холестерина, поскольку в исходном образце апоЛВП/ЭФХ-сефарозы присутствовали только фосфолипидные компонента

Таким образом иммобилизованные комплексы апоЛВП/ФХ могут бьггь использованы как эффективные акцепторы холестерина плазмы, а также для введения в плазму липофильных биологически активных добавок, что имеет важное значение в предотвращении патологических процессов атеросклероза [Шумахер с соавт., 1989].

[Липиды] мг/дл

400

300

200

100

% С18:2 Рис. Ю. Изменение со-—— — •держания общего холес терина (I), триглицери-дов (2) и фосфолипидов

(3) и линолевой кислоты

(4) в образце плазмы при инкубации с а по ЛВП/Э ФХ-с е фа р о з о й

30 (3. 2 мг апоЛВП, 5. 2 мг ЭФХ на I см3 сорбента).

J_I_1_

20

1

3 4 Время,

Рис. II. Хроматограмма образца неполярных липидов, сорбированных апоЛВП/ФХ-сефарозой при инкубации с плазмой в течение 4 ч. на пластине НРТ1.С-60 "Мегск" в системе гексан: эфир: муравьиная кислота (90:9:1).

■ Эфиры холестерина

• Триглицериды

■ Жирные кислоты

• Холестерин Старт

1 2 3 4 5

ч

Изменения липидного состава, происходящие при инкубациии с апоЛВП/ЭФХ-сефарозой, сопровождаются также изменениями в липопротеиновом спектре плазмы (рис. 12). После 4 ч инкубации образца плазмы с а'поЛВП/ФХ-сефарозой были выделены и проанализированы фракции ЛВП И ЛНП. Сравнение седиментационных характеристик ЛВП, представленных на рис. 12 А, показывает, что

в условиях инкубации, приводящих к изменению липидного состава исходного образца плазмы, происходит увеличение фракции ЛВП2 и одновременно уменьшение фракции ЛВП3.

После инкубации того же образца плазмы с апоЛВП/ЭФХ-сефарозой при 37°С в течение 4 ч (рис. 12 Б) наблюдали изменения во флотационных характеристиках фракции ЛВД обусловленьв, по-видимому, процессами липидного обмена, а также адсорбцией целых частиц ЛНП на гидрофобной сефарозной матрице. Еще одним возможным объяснением происходящих изменений ЛНП может быть частичная деградация ЛНП при взаимодействии с матрицей, приводящая к образованию нестабильных частиц ЛНП, трансформирующиеся в более устойчивые подклассы ЛНП.

81.21

Рис. 12. Изменение спектра ЛВП (А) и ЛНП (Б) в плазме крови при инкубации с апоЛВП/ЗФХ-сефарозой. I - до инкубации; 2 -после 4 ч инкубации.

Представленные в данном разделе результаты показывают, что процессы обмена и рекомбинации мицеллярных комплексов, в данном случае иммобилизованных, важны для липидов и липопротеинов плазмы и могут быть использованы для направленных изменений в липидном и липопротеиновом спектре.

шводы

1. Взаимодействие амфифильных пептидов с ДОФХ описывается адсорбцией пептида на границе раздела фаз вода/липидная мицелла.

2. Поверхностно-активные свойства апоА1 в составе комплексов с фосфолгагадами различного стехиометрического состава изменяются и определяются содержанием липида.

3. Взаимодействие апоА1 или фосфатидилхолина с мицеллярными комплексами приводит к рекомбинации частиц, скорость-лими-тирукщей стадией которой является обмен липида.

4. Иммобилизация комплексов апоЛВП/ФХ на сефарозной матрице позволяет исследовать кинетику обмена липидов.

5. Показано использование апоЛВП/ФХ-сефарозы для коррекции липидного и липопротеинового спектра плазмы по принципу лиган-дного обмена.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мишарин А. Ю., Замаева Н. Ю., Антонов И. В. , Бушмакина Е Г., Медведева Н. В., Морозкин А. Д. Детергентные свойства аполипопротеина AI в мицеллярных комплексах с димиристоилфо-сфатидилхолином. - Биоорганическая химия, 1989, т. 6, с. 773 -780.

2. Мишарин А. Ю., Замаева Е Ю., Бушуева Т. JL , Медведева Е В. Рекомбинация мицеллярных комплексов аполипопротеина AI - фо-сфатидилхолин в присутствии компонентов комплекса. - Биоорганическая химия, 1991, т. 17, с. 53 - 59.

3. Антонов И. Е , Замаева К Ю., Медведева Е Е , Мишарин А. Ю. Иммобилизация фосфолипидных мицелл на модифицированной апоЛВП-сефарозе. - Биоорганическая химия, 1992, т. 18, с. 1214 - 1220.

4. Замаева Е Ю. , Антонов И. В. , Мишарин А. Ю. Обмен фосфатидилхолина в модельных липопротеинах. Использование фосфолипидных мицелл, иммобилизованных на апоЛВП-сефарозе. -Биоорганическая химия, 1992, т. 18, с. I22I-I229.

5. Medvedeva N. V. , Zamaeva N.Yu., Mlsharin A. Yu. Structural features of apol 1 poprotel n Al In native and recombinant HDL's. Spin labels study. II International Symposium "Peptide and protein chemistry". Moscow. 1992. Abstr. Book, p. 55.

6. Zamaeva N.Yu., Bushueva T.L., Mlsharin A. Yu. A comparltive study of the Interaction of apol1poprotein Al and the amphl-philic peptide LAP-20w1th phosphatidylcholine. II International Symposium "Peptide and protein chemistry". Moscow. 1992. Abstr. Book, p. 61.

7. Mlsharin A.Yu, Medvedeva N.V., Zamaeva N.Yu., Morozkin A. D. Complexes apo HDL/EPL Immobilized on sepharose matrix. The new approach for the correction of lipid and liplprotein composition in plasma. International Slmposium "Essential phospholipids". Moscow regi on, 1992, Abstr. Book, p. 60.

Зон X159 Тир. gQ зк

24 ПМБ РАУ

117606 Москва.пр.Вернадск