Диагностика Y-вируса картофеля и штаммовый состав патогена в Среднем Поволжье

Вологин, Семен Германович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Диагностика Y-вируса картофеля и штаммовый состав патогена в Среднем Поволжье
ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Диагностика Y-вируса картофеля и штаммовый состав патогена в Среднем Поволжье"

На правах рукописи

Вологин Семен Германович

ДИАГНОСТИКА У-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ И ШТАММОВЫЙ СОСТАВ ПАТОГЕНА В СРЕДНЕМ ПОВОЛЖЬЕ

Специальность 06.01.07 — защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 8 НОЯ 2013

00554024» Москва-2013

005540248

Работа выполнена в отделе сельскохозяйственной биотехнологии Татарского научно-исследовательского института сельского хозяйства Росселъхозакадемии

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Замалиева Фания Файзрахмановна

доктор сельскохозяйственных наук

Упадышев Михаил Тарьевич

доктор сельскохозяйственных наук, заведующий центром защиты и биотехнологии растений ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии

Усков Александр Иринархович

кандидат биологических наук, заведующий отделом биотехнологии и иммунодиагностики ГНУ ВНИИКХ им. А.Г. Лорха Россельхозакадемии

ФГБОУ ВПО Казанский государственный аграрный университет

Защита состойся « /?"» декабря 2013 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д220.043.04 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел./факс: (499) 976-24-92, е-таН:

dissovet@timacad.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке

им. Н.И. Железнова РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Автореферат разослан « 2013 г.

Ученый секретарь аі^а^ ^ ли

диссертационного совета Смирнов А.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Y-eupyc картофеля (YBK) широко распространен во всем мире и относится к числу наиболее вредоносных агентов поражающих культуру картофеля. Инфицирование YBK приводит к снижению урожайности на 30-90% [Struik, Wiersema, 1999]. К причинам широкого распространения патогена относят нарушение агротехнических приемов возделывания, использование зараженного семенного материала, а также несовершенство методов обнаружения вируса [Иванюк и др., 2005].

Область диагностики и идентификации вирусов является важным элементом в сфере защиты растений от болезней. Современные системы ведения семеноводства картофеля на оздоровленной безвирусной основе предусматривают применение диагностического контроля вирусного поражения на различных этапах семеноводческого процесса с целью своевременного удаления инфицированных партий посадочного материала из агропромышленного производства [Замалиева, 2009]. Также методы лабораторной диагностики применяются в ходе селекционного процесса при создании сортов картофеля устойчивых к YBK [Салихова и др., 2012].

В последние годы в России разработаны тест-системы для обнаружения вирусов картофеля, основанные на иммунобиологических и молекулярно-генетических методах исследования [Бобкова и др., 2003; Drygin et al., 2007; Вызова и др., 2009; Рязанцев, Завриев, 2009; Комаров и др., 2013]. При этом остаются не достаточно изученными аспекты, связанные преаналитической подготовкой биоматериала, условиями его обработки и хранения. Также, практически не уделяется внимание вопросам, связанным с биометрической интерпретацией данных. Эти аспекты могут оказывать влияние на достоверность результатов фитосанитарного мониторинга.

В настоящее время большую значимость приобретает фитосанитарный мониторинг, предусматривающий оценку видового и штаммового состава вирусов растений. Известно, что YBK обладает сложной популяционной структурой, включающей несколько штаммов, приводящих к образованию различных симптомов на растениях картофеля [Smith, Dennis, 1940; De Bokx, Huttinga, 1981; Beczner et al, 1984; Chrzanowska, 1987; Le Romancer et al, 1994; Blanco-Urgoiti et al, 1998; Chikh Ali et al, 2008; Chikh Ali et al, 2010]. Наибольшую угрозу для агропромышленного производства представляют штаммы, индуцирующие некротическое поражение клубней картофеля, приводящие к значительному снижению их товарного вида и пищевой ценности [Вайдеманн и др., 1999; Иванюк и др., 2005]. Также серьезную опасность несут рекомбинантные формы YBK, характеризующиеся высокой эффективностью переноса с помощью насекомых [Verbeek et al, 2010]. В результате быстрого распространения рекомбинантных штаммов YBK, способных к индукции

некрозообразования, многие сорта картофеля потеряли свою привлекательность для сельскохозяйственного производства [Basky, 2002].

В Средневолжском регионе России сосредоточены значительные площади посадок семенного и товарного картофеля. Кроме того, здесь функционирует ряд крупных селекционных и семеноводческих учреждений. В связи с этим, исследование аспектов связанных с лабораторной диагностикой и фигосанитарным мониторингом популяционного состава YBK на территории данного региона является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление особенностей диагностического выявления YBK и штаммового состава патогена в Среднем Поволжье.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Усовершенствовать процесс подготовки растительного материала для диагностического обнаружения YBK.

2. Изучить уровень распространения YBK и других вирусных патогенов в растениях картофеля открытого грунта, а также в меристемных линиях in vitro.

3. Осуществить биометрический анализ данных ИФА, полученных при диагностике YBK.

4. Исследовать штаммовый состав вируса на территории Среднего Поволжья.

Научная новизна. Впервые установлен эффект повышения достоверности результатов лабораторной диагностики при использовании комплекса преаналитических факторов: однократного цикла замораживания-оттаивания разрушенной листовой ткани растений, а также внесения в состав листовых и клубневых проб картофеля мертиолята натрия и тиосалициловой кислоты. С помощью биометрического анализа выявлено существование взаимосвязи между результатами ИФА и процессом распространения патогена в вегетативных поколениях картофеля. Впервые на территории Среднего Поволжья обнаружена циркуляция штаммов YBKfm и YBKиндуцирующих развитие симптомов кольцевого некроза клубней картофеля. На территории европейской части России показано распространение изолятов YBK, обладающих рекомбинантной формой генома.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть применены в испытательных лабораториях системы Россельхознадзора и Россельхозцентра, а также в учреждениях, связанных с семеноводством и селекцией картофеля. Разработанный алгоритм преаналитической подготовки исследуемого материала используется в ГНУ ТатНИИСХ при диагностическом выявлении вирусов в системе семеноводства картофеля на оздоровленной основе. Охарактеризованные изоляты YBK могут быть использованы в селекционных исследованиях при создании форм растений устойчивых к

патогену, а также могут быть применены при создании диагностикумов и контрольной панели образцов, предназначенной для оценки качества работы диагностических тест-систем.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа проводилась в соответствие с темами 04.15.01 и 04.15.02 Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению агропромышленного комплекса Российской Федерации на период 2006-2010 и 2011-2015 гг. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора (2005-2013 гг).

Положения выносимые на защиту.

1. Алгоритм пробоподготовки растительного материала, повышающий эффективность диагностических исследований методом ИФА.

2. Зависимость данных ИФА от продолжительности распространения YBK в ряду вегетативных поколений картофеля.

3. Структура патогена на территории Среднего Поволжья, представленная изолятами, проявляющими свойства штаммов YBK°, YBKYBKtJTN, YBK? и обладающими рекомбинантной формой генома.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на XI Международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2007), IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro» (Зеленоград, 2008), научно-практической конференции «Картофелеводство: результаты, инновации, практический опыт» (Москва, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» (Казань, 2009), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные разработки молодых ученых -АПК России» (Казань, 2010), Международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы научных исследований по картофелеводству, овощеводству и бахчеводству» (Алматы, 2011), П1 международного симпозиума «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011), Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России» (Екатеринбург, 2012), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы и перспективы аграрной науки в России» (Саратов, 2012), Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного комплекса России» (Казань, 2012), VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012), I международного симпозиума «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013), научной конференции «Молекулярно-генетические

подходы в таксономии и экологии» (Ростов-на-Дону, 2013), Всероссийской научной конференции с международным участием «Биотехнологии: наука и практика, инновации и бизнес» (Астрахань, 2013)

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 20 научных работ, из них 2 статьи в ведущих рецензируемых изданиях, 9 - в материалах всероссийских и международных конференций.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждений, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация содержит 21 таблицу, 23 рисунка и 1 приложение. Список литературы включает 189 литературных источников, в том числе 122 на иностранном языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служил биоматериал различных сортов и гибридов картофеля (Solanum tuberosum L.).

Листовые образцы отбирали со среднего яруса растений, находившихся в фазе цветения. Образцы клубней выдерживали при комнатной температуре в защищенном от света месте до выхода этиолированных ростков.

Культивирование растений в асептической культуре in vitro осуществляли в стеклянных пробирках на среде Мурасига-Скуга при комнатной температуре и 16 часовом световом периоде. Для диагностических исследований использовали побеги растений достигших размера 10-15 см.

Инфицирование растений картофеля вирусом проводили в марлевом изоляторе, расположенном на территории ГНУ ТатНИИСХ (г. Казань). Для этого нарушали пространственную изоляцию и в течении 14 суток с помощью естественного лёта насекомых, происходил перенос YBK с инфицированных растений обсадки на здоровые экспериментальные растения. В дальнейшем пространственную изоляцию восстанавливали, жизнедеятельность насекомых-переносчиков прерывалась применением инсектицидного препарата.

Идентификация оггаммовой принадлежности YBK проводилась согласно алгоритму, описанному в работе [Шуберт и др., 2004]. Искусственное заражение растений табака (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) проводили в марлевом изоляторе с помощью механической инокуляции инфицированным биоматериалом картофеля.

Иммуноферментный анализ проводили на полистироловых планшетах ОАО «Медполимер» (Россия) с использованием наборов поликлональных (Bioreba, Швейцария) и моноклональных (Neogen Europe, Великобритания) антител к вирусам картофеля. Детекцию осуществляли на многоканальном фотометре «Opsys MR» (Dinex Tech., США) при длине волны 405 нм против референсного светофильтра (620 нм). Рассчитывался коэффициент

позитивности - отношение величины оптической плотности исследуемого образца (ОП405) к значению критического порога (Р).

Реакцию ОТ-ПЦР проводили с использованием реактивов НПФ «СибЭнзим» (Росс™) на приборах «Терцик МС-2» (ДНК-технология, Россия) и «Mastercycler Gradient» (Eppendorf, Германия). Для ПЦР-диагностики вирусов картофеля, идентификации штаммового состава и секвенирования />/-гена YBK применяли олигонуклеотиды описанные в работах [Фолимонова и др., 1998; Nie, Singh, 2001; Зайнуллин, Зайнуллина, 2003; Volkov et ai, 2009]. Определение сайтов рекомбинации в генах НС-Pro и VPg осуществляли в системе мультиплексной ОТ-ПЦР согласно работе [Lorenzen et al., 2006]. Для конструирования оригинальных праймеров использовали программу Oligo 6.0. Очистка ПЦР-продуктов и процедура секвенирования проводилась в лаборатории ЗАО «Синтол» (Россия) на приборе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США). Результаты секвенирования обрабатывали с помощью программ BioEdit 7.1.3.0, BLAST, Mega 5.1 и SimPlot.

Математическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения Excel 2003 и Statística 6.0. Построение вариационных рядов выполняли согласно [Лакин, 1990]. Расчет достоверности различий при нормальном распределении признака осуществляли с помощью t-критерия Стьюдента, в случае не соответствия признака нормальному распределению - непараметрического Т-критерия Уилкоксона [Реброва, 2002].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Преаналитпческая подготовка растительного материала

Первым элементом преаналитической подготовки служит стадия разрушения растительного материала, способствующая переходу фитопатогенов из биологических тканей в диагностически-доступную водосодержащую фракцию пробы. Исследование трех способов разрушения листовых и клубневых образцов показало, что во всех случаях разрушенный биоматериал оказался неоднородным и содержал в своем составе включения разрушенных растительных компонентов (РРК).

Было исследовано влияние на результаты ИФА состава биопроб и условий их температурного хранения. При исследовании листовых проб, содержащих включения РРК и хранившихся в условиях холодильной камеры (температура +2...+8 °С) на протяжении 16 часов, был выявлен более низкий уровень детектируемого сигнала (рис. 1а), по сравнению с пробами не содержащих этих включений (р<0,01). В тоже время, в пробах, хранившихся в условиях морозильной камеры (температура -18...-25 °С) и, таким образом, подвергнутых однократному циклу замораживания-оттаивания, обнаружено достоверное возрастание величины коэффициента позитивности (р<0,01). Анализ листовых проб, подвергнутых центрифугированию и, таким образом, не

содержавших в своем составе РРК, не выявил значимого влияния процедуры замораживания-оттаивания на результаты диагностики (р>0,05).

тг

X і

■ Медпааа І I Межквартильный шггершл I Вариационные размах

£0

Тшяф)1>т>41 —►в" С

Температура -18—23* С

Темпераіура+2-+8вС Температуре-18--25вС

Рис. 1. Влияние состава биоматериала и условий его температурного хранения на результаты ИФА: а - листовые пробы, б — клубневые пробы. 1 - пробы содержащие РРК, 2 - пробы не содержащие РРК.

При изучении этиолированных клубневых ростков было установлено негативное действие РРК на результаты ИФА (рис. 16). Различия, выявленные между пробами, содержащими и не содержащими РРК, оказались статистически достоверными (р<0,01). Данное воздействие не зависело от температуры хранения данного биоматериала.

В дальнейших экспериментах был зафиксирован выход из РРК дополнительного количества вируса при проведении цикла замораживания-оттаивания осадочной фракцией листовых проб (данные представлены в диссертации). Полученные данные позволили сделать заключение о том, что РРК, являются ценным диагностическим материалом, а процесс их замораживания с последующим удалением - обязательный элемент подготовки растительного материала для проведения диагностических исследований.

Эксперименты по введению в состав листовых и клубневых проб картофеля химических соединений обладающих высокой буферной емкостью показало, что при различных режимах пробоподготовки наиболее оптимальным является применение 0,1 М Тпэ-НО буфера (данные представлены в диссертации).

Хранение биологического материала может быть осуществлено при введении в его состав химических соединений, обладающих антисептическими, бактерицидными и фунгицидными свойствами. В данной работе было исследовано преаналитическое действие двух соединений - азида натрия и мертиолята натрия (тимерозала).

Внесение 0,01 М азида натрия совместно с 0,1 М Тп5-НС1 буфером в состав листовых проб вызвало достоверное (р<0,01) снижение величины детектируемого сигнала (рис. 2). Использование данного соединения при подготовке этиолированных клубневых ростков привело к небольшому

■ Медиана I ) МежквартияьныЯ интервал \ ) ш Вариационный рлтмах

& 15

снижению исследуемого показателя, которое оказалось статистически не значимым (р>0,05). На основании полученных данных было сделано заключение о нежелательности использования азида натрия в процессах преаналитической подготовки растительного материала.

Введение мертиолята натрия в состав растительных образцов приводило к статистически значимому повышению уровня детектируемого сигнала (р<0,01). Позитивное воздействие соединения не зависело от вида исследуемого материала и обнаруживалось при изучении листовых и клубневых проб картофеля. Было сделано

предположение, что выявленный с процессом трансформации тимерозала с образованием двух соединений:

К АН МН Листовые образцы

К АН МН Клубиевьк образцы

Рис. 2. Преаналитическое воздействие консервирующих соединений на ИФА эффе1сг связан К - контроль, АН - азид натрия (0,01 М), МН — мертиолят натрия (0,01 М).

метилртути и тиосалициловой кислоты. Последнее соединение имело в своем составе тиогруппу, присутствие которой могло блокировать негативное воздействие веществ полифенольного ряда на аминокислотную структуру вирусного белка оболочки.

Эффект внесения 0,01 М тиосалициловой кислоты в состав листовых (рис. За) и клубневых (рис. 36) проб оказался сопоставимым с влиянием других тиосодержащих соединений: 2-меркаптоэтанола и тиогликолевой кислоты, а также соединений, обладающих антиоксидантными (сульфит натрия, аскорбиновая кислота), хелатирующими (ЭДТА) и фенолсвязывающими (поливинилпироллидон) свойствами, внесенными в такой же концентрации.

а Медиана ^

1 _ 1 МежквартилышА интервал I ВзриаииоиныЗ размах

ТТТтттТ

Рис. 3. Влияние стабилизирующих соединений на результаты ИФА: а -листовые образцы, б - клубневые образцы. К - контроль, ТСК - тиосалнциловая кислота, МЭ - 2-меркаптоэтанол, ЭДТА - этилендиамттетроуксусная кислота, ПВП -поливинилпироллидон, СН - сульфит натрия, АСК - аскорбиновая кислота

Различия, выявленные между контролем и экспериментальными вариантами, оказались статистически достоверными (р<0,05). В тоже время между всеми экспериментальными вариантами достоверных статистических различий обнаружено не было (р>0,05). Согласно полученным результатам, антисептическое действие тиосалициловой кислоты на протяжении 7 суток хранения в условиях холодильной камеры оказалось сопоставимым с эффектом внесения в растительные ткани мертиолята натрия. Учитывая высокую токсичность ртутьсодержащих соединений, было сделано заключение о предпочтительном применении в ходе пробоподготовки нетоксичной тиосалициловой кислоты.

На основании проведенных исследований предложен следующий алгоритм преаналитической подготовки. После процедуры разрушения растительный материал вносится в полипропиленовые емкости, содержащие 0,1 М Тле-НС! буфер и 0,01 М тиосалициловую кислоту, затем он подвергается замораживанию и до постановки анализа хранится в условиях морозильной камеры (температура -18...-25 °С). По завершении хранения и процесса оттаивания, РРК удаляются с помощью центрифугирования и полученный супернатант вводится в диагностическое исследование. Сравнительное изучение, проведенное методом ИФА доказало эффективность разработанного комплекса преаналитических процедур (табл. 1).

Таблица 1 — Сравнительный анализ способов пробоподготовки

Вариант п Количество УВК-иозити в н ых образцов

Стандартный алгоритм Разработанный алгоритм

шт. шт. % к стандарту

Листовые пробы 704 91 97 + 6,6*

Клубневые пробы 528 122 134 + 9,8**

Примечание: п — количество исследованных образцов, * — р<0,05; * * — р<0,01.

Подтверждение эффективности данного алгоритма также было получено при изучении растений картофеля, регенерированных из апикальной меристемной ткани и растущих на искусственных питательных средах.

В ходе диагностического исследования 127 меристемных линий, с помощью метода ИФА было выявлено 29 И?А"-позитевньгх образцов. При этом, применение разработанного алгоритма позволило повысить уровень детектируемого сигнала и достоверно диагностировать УВК в 4 образцах (13,8% от количества инфицированных линий), не обнаруженных при использовании обычного способа пробоподготовки (рис. 4, образцы 1-4). Кроме того, применение данного алгоритма позволило сделать заключение о наличии вируса в образце, результаты которого при обычном способе диагностики находились в области сомнительных результатов (рис. 4, образец 5).

1.ь 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0,4 0.2 ПО Критический поре i я * ft

-Е- I I й ri- il -V ч rt —J— 1 1

* Исследуемые образцы

| □ Стандартный зл-оритм в разработанный алгоритм I

Рис. 4. Преаналитическая подготовка биоматериала при диагностике УВК в меристемных линиях картофеля

Содержание УВК в данных серонегативных образцах было подтверждено с помощью метода ОТ-ПЦР.

Разработанный алгоритм

преаналитической подготовки

растительного материала в

последствие был использован при проведении диагностических

исследований вирусных патогенов в семенном материале картофеля.

Мониторинг вирусных патогенов в условиях открытого грунта

Скрининговое диагностическое исследование, осуществленное методом ИФА, позволило оценить уровень распространения основных вирусных патогенов, поражающих посадки семенного картофеля в северной части Среднего Поволжья (табл. 2).

Таблица 2 - Уровень распространения вирусов картофеля в семенном материале суперэлитной репродукции

Год

2005

2006

2007

2008

2009

2010 2011 2012

1 285 688 905 1 196 824 756 1 484

1040

Количество инфицированных образцов

YBK

МВК

ХВК

137 32 163 185 69 196 452 89

%±ш

То,7+0,9

4,7+0,8 18,0+1,3 15,5+1,0 8,4±1,0 ^9+1,6 30,5+1,2 8,5±0,9

13 21 10

15 20

%±ш 1,0±0,3 3,1 ±0,7 1,1 ±0,3 4,8±0,6 0,5±0,2 0,9±0,3 1,0±0,2 1,9+0,4

шт.

%+т 0,8+0,2 0,4±0,3 0,6±0,2 8,0±0,8 0,2±0,2 0,0 0,1 ±0,1 0,0

ВСЛК %±т 0,1±0,1 0,0 0,0 0,3±0,1 0,0 0,0 0,0 0,0

В течение восьми вегетационных сезонов было исследовано 8178 листовых проб. Наибольшим уровнем распространения характеризовался УВК. Было выявлено 1323 инфицированных образца, что составило 16,2% от всего исследованного материала.

На протяжении всего периода диагностических исследований в посадках картофеля стабильно выявлялся другой инфекционный агент - М-вирус картофеля {MBК). Было диагностировано 147 случаев поражения данным вирусом, с частотой встречаемости за период исследований 1,9%.

Диагностическое обнаружение Х-вируса картофеля (ХВК) было менее стабильным. Во все годы исследований диагностирование патогена находилось на низком уровне, за исключением данных 2008 г, в котором был выявлен значительный рост заболевания. Всего патоген был диагностировано в 118 образцах (1,4%).

Случаи инфицирования растений вирусом скручивания листьев картофеля (ВСЛК), отмечались крайне редко. Было обнаружено всего 4 вируссодержащих образца, что составило 0,05% от всего исследуемого материала.

Диагностика вирусов в меристемных линиях картофеля

Применение биотехнологических методов получения безвирусных растений, возможно не только в процессе семеноводства сортов картофеля, но и при проведении селекционной работы. Сочетание селекционного и биотехнологического процессов позволяет осуществлять оздоровление перспективных гибридов до проведения государственного сортоиспытания и может обеспечить более быстрое внедрение новых сортов в производственную практику.

С помощью методов ИФА и ОТ-ПЦР было исследовано 175 образцов растений картофеля, регенерированных из апикальной мерисгемной ткани и растущих in vitro. В том числе 103 линии, регенерированные из сортов российской и зарубежной селекции, а также 72 линии перспективных гибридов, полученных в лаборатории селекции картофеля ГНУ ТатНИИСХ. Сравнительный анализ двух методов диагностики показал, что использование ОТ-ПЦР характеризовалось более высокой эффективностью, чем применение ИФА (табл. 3), являющегося основным методом лабораторного обнаружения патогенов в растениях картофеля растущих in vitro [ГОСТ 29267-91]. С помощью генодиагностики было выявлено: 1 BCJIK-, 11 YBK- и 15 Мумифицированных меристемных линий, которые не были детектированы в ИФА. Дальнейший анализ данных был основан на результатах ПЦР-диагностики.

В растениях, регенерированных из тканей сортов картофеля, были обнаружены все четыре диагностируемых патогена. Наибольшей частотой встречаемости характеризовался YBK. В меристемных линиях гибридов были диагностированы только два патогена, причем частота встречаемости МВК более чем в 3,5 раза превосходила частоту с которой выявлялся YBK.

Таблица 3 - Сравнительный анализ применения методов ИФА и ОТ-ПЦР при выявлении вирусов в меристемных линиях картофеля

Метод

ИФА

ОТ-ПЦР

Количество исследованных линий, шт.

175

Количество инфицированных линий, шт. (% ± ш)

УВК

(22,3*3,1)

50** (28,6*3,4)

МВК

(29,7*3,5)

67** (38,3*3,7)

ХВК

(5,7*1,8)

ВСЯК

(1,1

(1,7*1,0)

Примечание: % + ш - относительное количество с ошибкой доли; ** - р<0,01.

При анализе структуры инфицирования изучаемых образцов было выявлено, что количество неинфицированных линий, полученных из образцов перспективных гибридов, достоверно превосходило аналогичный показатель, обнаруженный у линий сортового происхождения (табл. 4).

і аил и ца ч иидч« Патоген Сорта (п = 103) Гибриды (п = 72)

шт. %*ш шт. %*ш

увк** 39 37,9 * 4,8 11 15,3*4,2

МВК** 27 26,2 * 4,3 40 55,6*5,9

ХВК* 10 9,7 * 2,9 0 0,0

ВСЛК 3 2,9*1,7 0 «К ТТГ.ГТН- * П<П П 0,0 V **-п<0.01.

Количество линий, обладавших вирусной моноинфекцией, в исследуемых вариантах статистически не различалось. В то же время, при получении растений-регенерангов из сортового материала количество образцов пораженных смешанным типом инфекции было достоверно выше (р<0,05), чем при регенерации растений из тканей гибрцдов.

Биометрический анализ данных ИФА

Наблюдения, проведенные при выполнении скрининговых диагностических исследований, с применением как поликлональных, так и моноклональных антител, показали, что содержание УВК определяемое с помощью ИФА, не подчиняется закону нормального распределения, а в диагностических выборках было отмечено выраженное проявление элементов асимметрии и эксцесса. Выявлено четыре вида вариационных кривых, связанных с комбинированием различных типов асимметрии и эксцесса. Обнаруженные формы вариационного ряда оказались свойственны выборкам, сформированным как из листовых, так и клубневых проб картофеля.

Было выдвинуто предположение, что данные ИФА о содержании УВК-антигена отражают динамику распространения вирусной инфекции в популяции растений картофеля. Для проверки этой гипотезы был поставлен эксперимент с искусственным заражением растений картофеля. Заражение растений УВК проводилось в условиях защищенного фунта с помощью создания искусственного инфекционного фона и свободного лёта насекомых-переносчиков из популяции естественной среды.

При первичном ШЛ"-инфицировании растений картофеля была выявлена одновершинная форма распределения признака с асимметричным смещением кривой и высоким накопление частот в левой части вариационного ряда (рис. 5а).

г? -

2 60

3 50 т

| "0 X

ь 30

о 20 О ю

/А^

4'\ / ^

V Л- - і

О 0.5 1.0 1,5 2.0 2.5 3,0 3.5 4.0 <,5 5,0 5.5 ЕСнффщімт пошт и в воет и, отн. ед

10,0 20,0 30,0 40,0 50.0 60.0 70.0 Коэффициент ПОЗИТИВНОСТИ, ОТВ. СЛ.

Рис. 5. Вариационный ряд содержания УВК в листовых пробах (2007-2010 гг.): а - одновершинная форма кривой, б - двухвершинная форма кривой. 1 — первично-инфицированные растения, выращенные в защищенном грунте; 2, 3, 4 — растения, выращенные в открытом грунте, соответственно на 2,3 и 4 год после заражения.

Изучение растений, выращенных из инфицированного клубневого потомства (второй год исследований) в условиях открытого грунта, показало, что распределение изучаемого признака также оказалось одновершинным. На протяжении двух последующих вегетационных сезонов (третий и четвертый год исследований) был обнаружен переход от одновершинной к двухвершинной форме распределения признака (рис. 56), сопровождавшийся постепенным переходом частот из левой части в правую часть вариационного ряда.

Уровень содержания УВК в листовых пробах растений картофеля на протяжении первого и второго годов репродуцирования характеризовался положительными величинами коэффициентов асимметрии и эксцесса (табл. 5). В ходе третьего и четвертого годов выращивания был выявлен постепенный переход этих статистических показателей к отрицательным величинам. На протяжении четырех вегетационных сезонов отмечено последовательное повышение уровня содержания УВК, о чем свидетельствовало увеличение вариационного размаха, межквартильного интервала, среднего арифметического значения и медианы.

Таблица 5 - Статистические показатели данных ИФА при ГЯЯ-инфицировании вегетативных репродукций картофеля (коэффициент позитивности, отн. ед.)-

Показатель

Выборка, шт.

пнп — шах

Р25-Р7

Ме

Защищенный грунт

1 год

1,00-2,47

1,12-1,56

1,33

1,18

Открытый грунт

2 год

1,01-5,75

1,18-1,96

1,92

1,22

3 год

1,00-24,54

2,32-19,02

10,15

7,38

4 год

1,05-51,02

2,57-46,43

26,91

32,02

0,39

1,37

8,05

19,97

СУ, %

29,32

71,35

79,31

74,21

Аэ

+1,94**

+2,10**

+0,58

-0,21

Ех

+3,92*='

+3,70***

-1,18***

-1,78***

Примечание: тт-тах - вариационный размах, Р25-Р75 - «ежеквартальный интервал, X -среднее арифметическое значение, Ме - медиана, а - стандартное отклонение, Су -коэффициент вариации, Аз - коэффициент вариации, Ех - коэффициент эксцесса. Знаком « » отмечено достоверное отклонение показателей варьирования от нормального распределения. **- р<0,01; ***- р<0,001.

Параллельно с этим, происходило увеличение показателей варьирования: стандартного отклонения и коэффициента вариации. Наименьший уровень варьирования был обнаружен у первично-инфицированных растений картофеля, которые выращивались в условиях защищенного грунта. При возделывании растений в открытом грунте величина коэффициента вариации возрастала более чем в 2 раза, и в дальнейших поколениях оставалась относительно стабильной.

Структура популяции ¥ВК в Среднем Поволжье

Исследование ГЯЯ-инфицированных образцов, проведенное с использованием моноклональных антител, позволило установить частоту распространения ординарного (О/С) и некротического (Ы) серотипов вируса на территории северной части Среднего Поволжья, а также в двух прилегающих районах Волго-Вятского региона России (табл. 6).

Во всех исследованных популяциях обнаружена относительно высокая частота циркуляции К-серотипа, ранее считавшегося малораспространенным на

данной территории.

Установление штаммового состава изолятов УВК было осуществлено по совокупности визуального наблюдения симптомов болезни на растениях картофеля, результатов искусственного заражения растений табака, а также определения серологических свойств изучаемых изолятов. В ходе исследования обнаружено несколько различающихся групп патогена.

Таблица 6 —Частота распространения серотипов УВК(2011-2012 гг.)

Точка учета п Количество образцов, шт. Частота серотила, %±ш

О/С N О/С+Ы О/С N

с. Большие Кабаны (Республика Татарстан) 510 204 174 127 53,012,2 47,0+2,2

с. Савали (Кировская область) 289 103 73 107 55,3±2,9 44,7±2,9

с. Комсомольское (Чувашская Республика) 159 25 104 23 24,0+3,4 76,0±3,4

Изоляты первой группы (Бтг1-04, Бтг2-04, Кгп2-06, Кгп68-12, Ктз1-11), проявляли положительную реакцию с га/^-специфичными моноклональными антителами, не вызывали морфологических изменений на клубнях картофеля; при искусственном заражении растений табака приводили к симптомам просветления листовой ткани, примыкающей к листовым жилкам. Данная совокупность изолятов была идентифицирована как ординарный штамм УВК0.

Вторая группа (изоляты Кгп1-05, Кгпб2-12, Кгп77-12, Кт52-11, ЕЫ-11) взаимодействовали с ^/^-специфичными антителами, не индуцировали морфологических изменений на клубнях картофеля. При искусственном инфицировании растений табака образцы Кгп1-05 и Кгп77-]2 индуцировали процесс некротизации листовой ткани. Данная группа изолятов была идентифицирована как генетически-различающиеся варианты некротического штамма УВК?1.

К третьей группе были отнесены образцы Кгп2-05, Кт69-12 и 1,

которые, взаимодействуя с УВК0"--специфичными антителами, вызывали процесс некротизации тканей табака. Изоляты данной группы были идентифицированы, как штамм УВК- \ViIga (УВК^'т).

При изучении клубневого материала, выращенного на территории Республик Татарстан, Чувашия и Удмуртия, а также Пензенской, Свердловской и Челябинской областей, на поверхности клубней различных сортов и гибридов картофеля были выявлены некротические кольца, дуги, а также вдавленные участки из опробковевшей ткани (рис. 6а). В процессе хранения кольцевые структуры углублялись, растрескивались, а в ряде случаев распространялись на значительную часть поверхности клубня (рис. 66). Некротическая зона была представлена поверхностной опробковевшей тканью, не затрагивавшей сосудистое кольцо (рис. 6в). Выявленные симптомы являлись характерными проявлениями кольцевого некроза клубней картофеля (КНКК).

Рис. 6. Кольцевой некроз клубней картофеля: а - после уборки урожая, б - после хранения на протяжении 6 месяцев, в - особенности процесса некротизации.

Обнаружение зараженных растений носило спорадический характер. Согласно результатам трехлетнего изучения средневзвешенная частота встречаемости морфологически-выявляемой формы болезни в учетной точке, расположенной около с. Бол. Кабаны (Республика Татарстан) составила 0,2% от всей проанализированной выборки (табл. 7).

Таблица 7 - Частота встречаемости растений имеющих клубни с проявлениями

кольцевого Годы некроза Количество исследованных растений, шт. Количество инфицированных растений

шт. %

2009 10 245 15 0,15

2010 9510 17 0,18

2011 10 664 28 0,25

Изучение в условиях защищенного грунта показало, что при посадке в торфогрунт до 30% некротизированных клубней поражались почвенными патогенами и не давали всходов. Частота образования некрозов в клубневом потомстве пораженных образцов в различные годы варьировала и редко превышала 70 % уровень. На протяжении шести месяцев послеуборочного хранения количество клубней содержащих кольцевые некрозы не изменялось.

Дифференциальная диагностика, проведенная с помощью метода ИФА, показала отсутствие в данных образцах вируса метельчатости верхушки картофеля (ВМВК) и вируса погремковости табака (BUT), способных вызывать развитие подобных симптомов [Le Romancer et al., 1994]. В то же время, все образцы с проявлениями КНКК оказались позитивными в реакции с видоспецифичными YBlt)/c/N антителами. Большинство изученных изолятов YBK, выявленных в материале с симптомами КНКК показали положительную реакцию на наличие N-серотипа, а также индуцировали развитие некротических поражений листовой ткани табака. Было сделано предположение, что возбудителем выявленных случаев кольцевого некроза является штамм YBK?™.

Для проверки данного предположения была проведена идентификация патогена с помощью метода ОТ-ПЦР (рис. 7). - , . При исследовании образцов,

обладающих проявлениями ЬСНКК, 'дДрНИ был выявлен фрагмент, размером щ^Ё&^И^ИКВЕШншШШШШ^^^^Ш 835 п.н., соответствующий ! « амплифицируемой нуклеотидной

Рис. 7. Идентификация штамма УВК^т с помощью реакции ОТ-ПЦР М-маркер молекулярных размеров; 1 -отрицательный контроль; 2 - образец Кхп2-06 (УВК"), 3 - образец Кгп1-05 (УВКМ), 4-8-образцы К2П1-06, КгпЗ-Об; Кгп4-06, серодиагностики, процесс

Кгп1-08 и Кгп4-08 (УВК"™). некротизации клубней картофеля в

трех образцах - Кгпб-Об, Кгп25-11 и Кгп32-11 был индуцирован вирусом, обладающим О/С-серотипом. При этом искусственное заражение растений табака только биоматериалом образца Кгп32-11 приводило к процессу некротизации листовых жилок. Данные изоляты были идентифицированы нами как КНКК-индуцируюшие варианты штамма

последовательности штамма

ГВЯ™.

Штаммовый состав

возбудителя КНКК оказался неоднородным. Согласно данным

В настоящее время происхождение различных штаммов УВК связывают с процессом гомологичной рекомбинации, протекающим между базовыми

хсй., 1998].

Поиск, проведенный с помощью мультиплексной ОТ-ПЦР, выявил в геноме всех изолятов, отнесенных к штаммам УВК" и УВК1"'", двух рекомбинантных точек (рис. 8), находящихся в генах НС-Рго и VPg, Об этом свидетельствовало присутствие на электрофореграмме двух фрагментов, обладавших молекулярным размером 181 и 452 п.н. В случае изолятов, отнесенных к штаммам

УВКР и было

обнаружено одно

НС-Рго. В этом случае на электрофореграмме присутствовали фрагменты с молекулярной массой 181 и

Рис. 8. — Поиск рекомбинационных

сайтов с помощью мультиплексной ОТ-ПЦР

М - ДНК-маркер, 1 - негативный контроль, 2 - Kzn68-12 (YBK°), 3 - Kzn32-11 (ГВК*-т), 4 - Kznl-05 (YBR*), 5 - Ekl2-11 {УВК?™), 6 - Kzn3-06 (YBK7 - Izhl-11 (смесь штаммов), 8 - Pnzl-11 (смесь штаммов).

рекомбинационное событие в гене

689 п.н„ причем амплификация последнего фрагмента свидетельствовала об

отсутствии рекомбинационного перехода в гене

Также, рекомбинационному анализу была подвергнута нуклеотидная последовательность Р1-гена УВК (рис. 9). Все образцы, принадлежащие к штаммам УВК? и УВКут обладали нуклеотидной последовательностью, гомологичной базовому шЛгенотипу. Исследование идентифицированных по биологическим свойствам на штаммы УВК' и УВК показало, что данная группа по нуклеотидной структуре /Ч-гена относится к «УВК"-т-подобной» форме генома и дифференцируется на две подгруппы -УВ^т-АмУВ^....."

■т-в

Ш101 VI-В (шЬллЧ) Мп«1-11 (О) Кг«2-в5ГВ1» Кх»»-«*<»> Кг*«-12 (0) 5СМ-И

Н«ощ/-НТН («»л««*) 51*1-11 (Ю1> кгжзг-11 «к») ^-М (О) К2Ив»-1* (0) КИЛ 7-12 (Н) ЕКН-ИДО

ЕХ»2-11(Н) Кт2-11 (Н) Кг*«-12(КГН) Кш1-в7<»тО КгяЗ-О* (Н1Н) Кгв4-8( (КТИ) КгжЗ-в«(НТК)

Кг*1-««<НПГ>

КпвЗ-11 (И1Я)

см.1-0» О"«)

..Т..Т... ..Т..Т... „.Т..Т...

..т..т...

..Т..Т... ..Т..Т... ..Т..Т... Т..Т----

50САССМ6АСССЛТСйСТСйТйСМСГСС»е<»Т

..тс. ее..6..те...тс. .с.........

..тс.се..е..тс...тс..с............й-

,.«;.се..е..те.-.гс. с............

..УС.-С............

л1Стссоьс«сгсасБстстстссйСТ'па .....ЛАСС..ДС..........Т..ЛС.С.

..тс.ес.йв. ..1С.66. КС.

..тс.ее..6. ..тс.«;..с. ..тс.ес..с.

.. ТБ. И». -С.

..тс.ес..с.

..ТБ.СС..С. ..ТС.СС.-С. ..тс.се.-С.

..тс.ес..е. ..ТС.6С..е. ..TC.ee. .1 . .тс.«;,.с. ..1С. ее., с. ..тс.ес..с. ,.тс.сзе..с. ..тс.се. .с.

т....т....

ТС...Т...С......Т..

.ТС.Т.ТС..с.........

.тс,..тс..с.........

.тс...г..

■ 1С. .

С..С.-

.тс...тс..с.....

.тс.т.тс..с.....

.тс.т.тс. .с-----

.тс.т.тс..с-----

.тс...тс..с.....

.те...тс..е....

.тс...тс..с-----

[..те...тс..с,...;

li.CC -

*асс..»с...

ХАСС. .¡¡с... ..ас..

к:, е. ,,.т.,яе.е. ..г. .«т.е. •ЬС.е.

*дсс..яс----

ЯКС..ЙС----

Ы>СС..»С. ..,

идее.. .С----

ЗШСС.. -С----

алее..ьс----

Ui.CC. -5С----

«ее. .ЙС----

лисе..ас—

ксс. .»е....

8ЙСС..ас----

глее..ас— ЯйСС. .ЙС...

»се. .ас.,.

ХАСС..КС... Ьйсе.-ас... ЙДСС..ЙС... мДСС. . ДСЙ..

".____Т.-ЬС.С.

____..Т..1С.с.

......т. .хс.б.

......Т. .ЬС.е.

_______Т..6С.С.

......Т. -ЬС.С.

......Т. .АС.С.

......Т. .КС.6.

......т..»с.с.

......Т..40.Ч.

......т..*с.с.

......т..ьс.с.

......т..«с.е.

......т..не.с.

......Т..1С.с.

......т..кс.е.

......Г..АС.е.

......т..»е.с.

см.1-0» от» ............................

Рис 9 - фрагмент нуклеотидной последовательности Р1 гена исследованных изолятов УВК Изоляты сравнения: ЗСЮ-О (А:585196), РЫ_10А (0<}008213), ЗСШ-Ы (А1585197) и Нипг-ЫТМ (М95491). Подчеркиванием отмечены области рекомбинационных переходов Точками обозначены' совпадающие ну^еотидные позиции. Тире отражают пропущенные фрагменты нуклеотидной последовательности. „„ , ,,

Изоляты подгруппы УВК^"А {БЫ-П, Ъп69-12, Бтг1-04, Кгп32-11), обладали полной гомологией с базовым УЖ*-генотипом в Р1-области. Изоляты подгруппы УВД™ (Кш1-11, Кгг,2-05, Кгпб-Об, К2п68-12) имели частичную гомологию с УЖ°-генотипом и содержали одну минорную точку рекомбинации. В образцах Ктз1-11 и Кгп2-05 точка рекомбинации находилась в области 495-505 нуклеотидов генома УВК. В базе данных ОепВапк найдено более 50 изолятов УВК из разных стран мира со 100% уровнем гомологии по данному региону. В геноме образца Кгпб8-12 рекомбинационная точка находилась в области 700-710 нуклеотидов. В базе данных было обнаружено 6 образцов, имеющих подобный рекомбинационный переход: два изолята, выдеаенных на территории Польши, а также четыре изолята, выявленных на территории Сирии. Изолят Кгпб-Об содержал уникальную точку рекомбинации в области 550-560 нуклеотидов генома УВК, которая была выявлена впервые.

Нуклеотидная последовательность СР-гена УВК и аминокислотная структура белка оболочки являются молекулярными мишенями, которые детектируются при использовании методов ОТ-ПЦР и ИФА. Для определения

нуклеотидной последовательности CP-гена УВК были использованы ДНК-продукты, полученные с использованием разработанных оригинальных олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих концевые участки локусов Nib и З'-UTR. На основании данных секвенирования ДНК, был проведен расчет величин эволюционных дистанций между типичными представителями штаммов УВК и изучаемыми изолятами (табл. 8).

Таблица 8 — Показатели эволюционных дистанций между нуклеотидными последовательностями СР-гена исследуемых и типичных изолятов УВК_

№ п/п Изолят Штамм SCRI-O SCRI-N PRI-509

J-C N-G J -С N-G J-C N-G

1. SCRI-O YBK° 0,110 0,459 0,071 0,307

2. Smrl-04 УВК° 0,011 0,028 0,115 0,465 0,078 0,329

3. Smr2-04 УВК0 0,008 0,017 0,113 0,466 0,073 0,313

4. Kzn69-12 УВК° 0,008 0,017 0,104 0,430 0,076 0,333

5. Kmsl-11 УВК° 0,011 0,028 0,109 0,450 0,078 0,333

6. Kzn2-05 УВК"-т 0,015 0,045 0,113 0,479 0,079 0,340

7. Kzn6-06 УВК"-т 0,005 0,011 0,104 0,439 0,073 0,324

8. Kzn32-U УВК?'т 0,008 0,011 0,113 0,456 0,073 0,305

9. Syvl-11 УВК"-т 0,009 0,028 0,112 0,468 0,075 0,331

10. SCRI-N УВК* 0,110 0,459 — — 0,113 0,494

11. Kzn62-12 УВК? 0,094 0,347 0,029 0,106 0,107 0,444

12. Kzn77-12 УВІf 0,096 0,348 0,025 0,094 0,109 0,445

13. Kms2-ll УВК" 0,092 0,356 0,025 0,094 0,102 0,415

14. Ektl-11 УВК" 0,096 0,365 0,025 0,106 0,109 0,464

15. Kznl-06 YBtf™ 0,092 0,364 0,029 0,106 0,107 0,463

16. Kzn3-06 УВК"™ 0,096 0,365 0,025 0,106 0,103 0,425

17. Kzn4-06 УВКГ4 0,092 0,347 0,027 0,094 0,107 0,445

18. Kzn5-06 УВК*™ 0,089 0,338 0,024 0,088 0,104 0,434

19. Kznl-07 УВК 0,092 0,347 0,025 0,100 0,103 0,434

20. Chi 1-09 УВК*"™ 0,096 0,364 0,025 0,094 0,106 0,443

21. Kms3-ll УВКш 0,094 0,340 0,025 0,094 0,107 0,436

22. ЕЮ-11 YBK™ 0,094 0,356 0,027 0,113 0,107 0,454

23. PRI-509 УВК? 0,071 0,307 0,113 0,494 - -

Примечание: J-C - модель Джукса-Кантора, N-G - модель Неи-Годжобори. Подчеркиванием отмечены изоляты сравнения: SCRI-O (AJ585196), SCRI-N (AJ585197) и PRI-509 (EU563512).

Проведенный расчет показал высокий уровень гомологии СР-гена исследованных изолятов УВК? и УВЬ?~т с типичным изолятом БСШ-О (А1585196), а также эволюционную близость вариантов УВК? и УВК™ с

типичным нзолятом SCRI-N (AJ585197). Все исследованные образцы характеризовались высоким уровнем различий с изолятом PRI-509, который является типичным представителем штамма YBVP (EU563512). Таким образом, молекулярно-генетический анализ подтвердил правильность идентификации штаммового состава, проведенной на основании морфологических и серологических методов исследования.

На основании нуклеотидных последовательностей CP-гена были восстановлены аминокислотные последовательности белка оболочки изучаемых изолятов. Анализ основных антигенных детерминант, определяющих проявление серологических свойств [Nikolaeva et al., 2012] по аминокислотным позициям 1, 11, 17, 24 и 29, а также функционально-активных сайтов [Atreya et al., 1995; Seo et al, 2010; Mouiy, Simon, 2011] в позициях 6-8, 25, 68, 136-151 показал, что все исследованные российские образцы YBK обладали высоким уровнем гомологии с изолятами, широко-распространенными в странах Европы и Северной Америки.

ВЫВОДЫ

1. Применение усовершенствованного алгоритма преаналитической подготовки, включающего: а) внесение в состав разрушенного растительного материала 0,01 М тиосалициловой кислоты и 0,1 М Tris-HCl буфера, б) однократного цикла замораживания-оттаивания, в) удаления разрушенных растительных компонентов с помощью центрифугирования, позволило повысить уровень выявления YBK в листовых пробах на 6,6%; в клубневых этиолированных ростках на 9,8%; в биоматериале меристемных растений in vitro на 13,8%.

2. В условиях открытого грунта северной части Среднего Поволжья наибольшей частотой распространения характеризовался YBK, обнаруженный в 16,8% исследованных образцов. Другие патогены диагностировались реже: МВК- 1,9%, ХВК- 1,4% и ВСЛК- 0,05% изученных образцов.

3. Меристемные растения сортов и гибридов картофеля характеризовались различным количественным и видовым составом вирусных патогенов. Поражение меристемных линии сортов картофеля составило: YBK - 37,9%, МВК - 26,2%, ХВК - 9,7% и ВСЛК - 2,9%. Линии перспективных гибридов содержали МВК в 55,6%, a YBK в 15,3% исследованных случаев.

4. Результаты ИФА, отражающие уровень содержания YBK в биоматериале, характеризуются проявлениями асимметрии и эксцесса. Выявлен переход от одновершинной к двухвершинной форме вариационного ряда изучаемого признака, происходящий при распространении YBK в ряду вегетативных репродукций картофеля.

5. На территории Среднего Поволжья патоген представлен изолятами, проявляющими свойства штаммов YBK° и YBK?, а также штаммов YBKW™ и

, индуцирующих развитие кольцевого некроза клубней картофеля. В геноме изолятов обнаружены сайты рекомбинационных переходов в генах Р1, НС-Pro и VPg. Нуклеотидная последовательность CP-гена и аминокислотная последовательность белка оболочки соответствуют типичным штаммам патогена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью достоверного диагностического выявления YBK для своевременного удаления инфицированных партий семенного материала рекомендуется применять усовершенствованный алгоритм пробоподготовки, включающий внесение в состав разрушенных растительных тканей 0,1 М Tris-НС1 буфера и 0,01 М тиосалициловой кислоты, осуществление цикла замораживания-оттаивания и центрифугирование биоматериала.

2. Для выявления растений картофеля устойчивых к YBK при осуществлении селекционной работы на территории Среднего Поволжья, в качестве инфекционного материала целесообразно использовать различные штаммы патогена, в том числе способные индуцировать некротические повреждения клубней.

3. При проведении фитосанитарного мониторинга выбор диагностических тест-систем для выявления YBK методом ОТ-ПЦР должен осуществляться с учетом возможного детектирования рекомбинантных форм вируса.

Список работ по теме диссертации

Публикации в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Во логин, С.Г. Диагностика внутриклеточных патогенов в меристемных линиях картофеля / С.Г. Вологин, P.P. Назмиева, 3. Сташевски, Ф.Ф. Замалиева // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. — 2012. — №4. — С. 59-61.

2. Вологин, С.Г. Обнаружение кольцевого некроза клубней картофеля на территории Республики Татарстан / С.Г. Вологин, Н.Д. Былинкина, 3. Сташевски, Ф.Ф. Замалиева // Вестник защиты растений. - 2013. - №1. - С. 6064.

Публикации в материалах всероссийских и международных конференций

3. Вологин, С.Г. Анализ результатов диагностики вирусов в растениях картофеля, регенерированных их апикальной меристемы/ С.Г. Вологин, И.В. Пикалова // Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения: материалы Всероссийской научно-практической конференции. — Казань: Фолианть, 2009.- С. 190 - 193.

4. Вологин, С.Г. Технологические аспекты подготовки проб для проведения диагностики патогенов картофеля / С.Г. Вологин // Инновационные разработки молодых ученых — АПК России: материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. — Казань: Фолианть, 2010. - С. 221-226.

5. Вологин, С.Г. Биометрическое изучение результатов диагностики вирусов картофеля, осуществляемой методом иммуноферментного анализа / С.Г. Вологин // Состояние и перспективы научных исследований по картофелеводству, овощеводству и бахчеводству: материалы Международной научно-практической конференции. - Алматы-Кайнар, 2011. - С. 192-197.

6. Вологин, С.Г. Исследование кольцевого некроза клубней картофеля выявленного в Среднем Поволжье / С.Г. Вологин, Н.Д. Былинкина // Научное обеспечение агропромышленного комплекса России: материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Казань: Центр инновационных технологий, 2012. - С. 165-170.

7. Вологин, С.Г. Идентификация возбудителя кольцевого некроза клубней картофеля выявленного на территории Среднего Поволжья / С.Г. Вологин, Н.Д. Былинкина // Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России: материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Екатеринбург: Уральское издательство, 2012. - С. 299-303.

8. Вологин, С.Г. Штаммовое разнообразие У-вируса картофеля в Среднем Поволжье/ С.Г. Вологин, Н.Д. Былинкина // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых. - Саратов: Научная книга, 2012. - С. 24.

9. Былинкина, Н.Д. Структура популяции У-вируса картофеля в восточноевропейской части России / Н.Д. Былинкина, С.Г.Вологин // Инновационные разработки ученых - АПК России: материалы Всероссийской научно-практической конференции. — Казань: Фолиант, 2013. — С.78-81.

10. Вологин, С.Г. Особенности диагностики У-вируса картофеля в листовом и клубневом материале методом иммуноферментного анализа / С.Г. Вологин // Инновационные разработки ученых - АПК России: материалы Всероссийской научно-практической конференции. — Казань: Фолиант, 2013. - С.84-86.

11. Вологин, С.Г. Эффективность применения консервирующих соединений при подготовке растительного материала для изучения методом иммуноферментного анализа / С.Г. Вологин // Биотехнологии: наука и практика, инновации и бизнес: материалы Всероссийской научной конференции с международным участием. — Астрахань, 2013. - С. 98-101.

Публикации в других изданиях

12. Вологин, С.Г. Влияние состава исследуемого материала на результаты диагностики У- вируса картофеля методом иммуноферментного анализа / С.Г. Вологин, И.В. Пикалова // Биология-наука XXI века: сборник тезисов 11 Международной школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2007.-С. 186.

13. Вологин, С.Г. Влияние методов подготовки растительного материала на результаты молекулярной диагностики У-вируса картофеля / С.Г. Вологин, И.В. Пикалова//Нива Татарстана,- 2007.-№4.-С. 40-43.

14. Вологин, С.Г. Влияние преданалитического состояния биоматериала и методов пробоподготовки на результаты молекулярно-генетической диагностики У- вируса картофеля / С.Г. Вологин, И.В. Пикалова // Научные

основы технологий производства сельскохозяйственной продукции: материалы республиканской научно-практической конференции молодых ученых. -Казань, Фолианть, 2008. - С. 26-34.

15. Вологин, С.Г. Особенности диагностики некоторых патогенов картофеля в культуре in vitro/ С.Г. Вологин, И.В. Пикалова // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: тезисы IX Международной конференции. - М.: ИД ФБК-Пресс, 2008. - С. 76-77.

16. Вологин, С.Г. Статистическое варьирование результатов иммуноферментного анализа при различной обработке исследуемого материала/ С.Г. Вологин, И.В. Пикалова // Картофелеводство: результаты, инновации, практический опыт: материалы научно-практической конференции. -М., 2008,- Т.1. - С. 364-369.

17. Вологин, С.Г. Молекулярная диагностика вирусов в растениях картофеля растущих in vitro / С.Г. Вологин // Клеточная сигнализация у растений: тезисы докладов Третьего международного симпозиума. - Казань: ФизтехПресс, 2011. -С. 33-34.

18. Вологин, С.Г. Вирусологический анализ растений полученных из меристемной ткани сортов и гибридов картофеля / С.Г. Вологин, P.P. Назмиева, 3. Сташевски // Проблемы и перспективы аграрной науки в России: сборник докладов II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Саратов, 2012. - С. 15-19.

19. Вологин, С.Г. Преаналитическое действие антисептических соединений при диагностических исследованиях фитопатогенов / С.Г. Вологин // Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений: тезисы докладов I международного симпозиума. - Казань, 2013. - С. 22.

20. Вологин, С.Г. Идентификация и молекулярно-генетический анализ изолятов Y-вируса картофеля циркулирующих в ряде регионов России/ С.Г. Вологин, Н.Д. Былинкина // Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии: тезисы докладов научной конференции. - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦРАН, 2013. — С. 28.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПДМ7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 08.11.2013 г. Печ.л. 1,5 Заказ К-7324. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Вологин, Семен Германович, Москва

ТАТАРСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ

СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

На правах рукописи

04201365355

Вологин Семен Германович

ДИАГНОСТИКА У-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ И ШТАММОВЫЙ СОСТАВ ПАТОГЕНА В СРЕДНЕМ ПОВОЛЖЬЕ

06.01.07 - защита растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д. с-х. н. Замалиева Ф.Ф.

Казань-2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................5

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................11

1.1 Вирусные болезни картофеля......................................................................................11

1.2 Характеристика вирусов картофеля........................................................................13

1.2.1 Х-вирус картофеля................................................................................................14

1.2.2 М-вирус картофеля................................................................................................15

1.2.3 Вирус скручивания листьев картофеля..............................................16

1.2.4 У-вирус картофеля..................................................................................................17

1.3 Диагностика вирусных патогенов............................................................................26

1.3.1 Визуальное выявление вирусов..................................................................26

1.3.2 Метод биологического тестирования....................................................28

1.3.3 Электронная микроскопия................................................................................29

1.3.4 Иммунобиологические методы диагностики................................30

1.3.5 Молекулярно-генетические методы исследования..................33

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................36

2.1 Объект исследования............................................................................................................36

2.2 Учетные точки исследований......................................................................................36

2.3 Способы разрушения растительного материала..........................................37

2.4 Преаналитическая подготовка растительного материала..................37

2.5 Условия выращивания растений в защищенном грунте......................38

2.6 Идентификация штаммовой принадлежности УВК................................38

2.7 Искусственное заражение растений картофеля и табака....................40

2.8 Методика проведения ИФА..........................................................................................40

2.9 Перечень реактивов использовавшихся

при проведении ИФА............................................................................................................42

2.10 Методика проведения ОТ-ПЦР....................................................................................42

2.11 Конструирование олигонуклеотидных праймеров и определение нуклеотидной последовательности ДНК........................46

2.12 Математическая обработка результатов............................................................47

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ................................................48

3.1 Преаналитическая подготовка растительного материала для проведения диагностических исследований......................................................48

3.1.1 Анализ структуры листовых и клубневых проб

картофеля......................................................................................................................48

3.1.2 Влияние состава биоматериала и условий температурного хранения..............................................................................53

3.1.3 Влияние буферных соединений..................................................................58

3.1.4 Действие антисептических соединений............................................60

3.1.5 Алгоритм преаналитической подготовки

биоматериала..............................................................................................................67

3.2 Мониторинг вирусных патогенов в условиях

открытого грунта......................................................................................................................71

3.3 Диагностика вирусов в меристемных линиях картофеля..................72

3.4 Биометрический анализ данных ИФА..................................................................77

3.4.1 Анализ неинфицированных образцов..................................................77

3.4.2 Расчет величины порогового значения................................................77

3.4.3 Анализ У2?/£-инфицированных образцов..........................................79

3.5 Структура популяции YBK в Среднем Поволжье......................................86

3.5.1 Оценка частоты распространения серотипов вируса............86

3.5.2 Идентификация изолятов YBK......................................................................89

3.5.3 Идентификация возбудителя кольцевого некроза

клубней картофеля..................................................................................................92

3.5.4 Поиск сайтов рекомбинации в геноме изолятов YBK............100

3.5.5 Анализ нуклеотидной последовательности СР-гена и

белка оболочки УВК..............................................................................................105

ВЫВОДЫ......................................................................................................................................................112

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..............................................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................115

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................................137

ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................................................................................................138

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Растения картофеля {Solanum tuberosum L.) в силу своих биологических особенностей подвержены инфицированию различными вирусами. В естественных условиях возделывания картофель поражается 37 видами вирусных патогенов [Salazar, 1996]. Y-вирус картофеля (YBK) относится к роду Potyvirus семейства Potyviridae. Патоген широко распространен во всем мире и относится к числу наиболее вредоносных агентов поражающих картофель, а также других культурных представителей семейства пасленовых: томат, перец и табак. Согласно оценкам, инфицирование YBK приводит к снижению урожайности картофеля на 30-90% [Struik, Wiersema, 1999]. Основной путь передачи YBK связан со сложным пищевым поведением насекомых - крылатых тлей, осуществляющих неперсистентный перенос патогена. В инфицированных растениях картофеля вирус проникает в клубни, с помощью которых в условиях аграрного производства может распространяться на обширные территории. К причинам широкого распространения YBK в настоящее время относят: нарушение агротехнических приемов возделывания картофеля, использование зараженного семенного материала, а также несовершенство методов обнаружения патогена [Иванюк и др., 2005].

В последние годы в России разработаны тест-системы для обнаружения вирусов картофеля, основанные на методах иммуноферментного анализа [Бобкова и др., 2003; Комаров и др., 2013], иммунохроматографического анализа [Вызова и др., 2009], полимеразной цепной реакции [Рязанцев, Завриев, 2009], а также гибридизации нуклеиновых кислот [Drygin et al., 2007]. Данные работы, в основном, посвящены аналитическому этапу исследований: разработке новых или усовершенствованию существующих протоколов проведения сложных биохимических реакций, лежащих в основе диагностики. При этом, остаются не достаточно исследованными аспекты, связанные с преаналитическим состоянием исследуемого биологического материала: условиями его обработки и хранения, а также особенностями накопления вирусных патогенов в различных растительных тканях. Несомненно, что все перечисленные факторы оказывают значительное влияние на результаты лабораторной диагностики. Кроме того, в настоящее время практически не уделяется внимание вопросам, связанным с постаналитическим этапом диагностических исследований фитопатогенов. Публикации на эту тему немногочисленны [Sutula et al, 1986; Козлов и др., 1993; Обручков, Васильев, 1993]. В тоже время, статистическая обработка данных вносит большой вклад в процесс интерпретации результатов лабораторной диагностики [Свежова и др., 2008].

В настоящее время большую значимость приобретает фитосанитарный мониторинг, предусматривающий оценку видового и штаммового состава вирусов растений. Известно, что YBK обладает сложной популяционной структурой. Описано несколько штаммов вируса [Smith, Dennis, 1940; De Bokx, Huttinga, 1981; Beczner etal., 1984; Chrzanowska, 1987; Le Romancer et al., 1994; Blanco-Urgoiti et al., 1998; Chikh Ali et al., 2008; Chikh Ali et al., 2010], индуцирующих образование различных симптомов на растениях картофеля, а также различающихся по серологическим и молекулярно-

генетическим свойствам. Наибольшую угрозу для агропромышленного производства представляют штаммы, индуцирующие некротическое поражение клубней картофеля, приводящие к значительному снижению их товарного вида и пищевой ценности [Вайдеманн и др., 1999; Иванюк и др., 2005]. Также серьезную опасность несут рекомбинантные формы YBK, характеризующиеся высокой эффективностью переноса с помощью насекомых [Verbeek et al., 2010]. В результате быстрого распространения рекомбинантных штаммов, способных к индукции некрозообразования, многие сорта картофеля потеряли свою привлекательность для сельскохозяйственного производства [Basky, 2002].

В Средневолжском регионе России сосредоточены значительные площади посадок семенного и товарного картофеля. Кроме того, здесь функционирует ряд крупных селекционных и семеноводческих учреждений. В связи с этим, исследование аспектов связанных с лабораторной диагностикой и фитосанитарным мониторингом популяционного состава YBK на территории данного региона является актуальным.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Усовершенствовать процесс подготовки растительного материала для диагностического обнаружения YBK.

3. Осуществить биометрический анализ данных ИФА, полученных при диагностике YBK.

4. Исследовать штаммовый состав вируса на территории Среднего Поволжья.

Научная новизна. Впервые установлен эффект повышения достоверности результатов лабораторной диагностики при использовании комплекса преаналитических факторов: однократного цикла замораживания-оттаивания разрушенной листовой ткани растений, а также внесения в состав листовых и клубневых проб картофеля мертиолята натрия и тиосалициловой кислоты. С помощью биометрического анализа выявлено существование взаимосвязи между результатами ИФА и процессом распространения патогена в вегетативных поколениях картофеля. Впервые на территории Среднего Поволжья обнаружена циркуляция штаммов УВЫ^™ и УВВ^'т, индуцирующих развитие симптомов кольцевого некроза клубней картофеля. На территории европейской части России показано распространение изолятов УВК, обладающих рекомбинантной формой генома.

Охарактеризованные изоляты УВК могут быть использованы в селекционных исследованиях при создании форм растений устойчивых к патогену, а также могут быть применены при создании диагностикумов и контрольной панели образцов, предназначенной для оценки качества работы диагностических тест-систем.

Федерации на период 2006-2010 и 2011-2015 гг. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора, проводившихся на протяжении 2005-2013 гг.

Положения выносимые на защиту.

2. Зависимость данных ИФА от продолжительности распространения YBK в ряду вегетативных поколений картофеля.

3. Структура патогена на территории Среднего Поволжья, представленная изолятами, проявляющими свойства штаммов YBK°, YBKft YBF?m, YBBf'm и обладающими рекомбинантной формой генома.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на XI Международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2007), IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro» (Зеленоград, 2008), научно-практической конференции «Картофелеводство: результаты, инновации, практический опыт» (Москва, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» (Казань, 2009), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные разработки молодых ученых - АПК России» (Казань, 2010), Международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы научных исследований по картофелеводству, овощеводству и бахчеводству» (Алматы, 2011), III международного симпозиума «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011), Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России» (Екатеринбург, 2012), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы и перспективы аграрной науки в России» (Саратов, 2012), Всероссийской научно-

практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного комплекса России» (Казань, 2012), VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012), I международного симпозиума «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013), научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии» (Ростов-на-Дону, 2013), Всероссийской научной конференции с международным участием «Биотехнологии: наука и практика, инновации и бизнес» (Астрахань, 2013)

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 20 научных работ, из них 2 статьи в ведущих рецензируемых изданиях.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирусные болезни картофеля

Первые описания болезней картофеля, индуцированных вирусными патогенами, относятся ко второй половине XVIII века. В Нидерландах были выявлены симптомы скручивания листьев растений картофеля, приводившие к значительному падению урожайности. В публикациях того времени подобное состояние получило название «вырождения», «истощения» или «старения» растений [Лоусон, Стейс-Смит, 2005]. Было отмечено, что из клубней пораженных болезнью всегда вырастали слабые растения. Позднее, массовое вырождение посадок картофеля было обнаружено в Великобритании, Франции и Германии [Лоусон, Стейс-Смит, 2005].

На раннем этапе исследований было описано три типа вырождения картофеля, которые характеризовались мозаичностью, полосчатостью и скручиванием листовых пластинок. Была установлена вирусная природа данных заболеваний [Quanjer et al, 1916: цит. по Лоусон, Стейс-Смит, 2005], а также роль насекомых в их передаче [Schulz, Folsom, 1923]. Позднее было описано семь морфологических проявлений вирусных болезней на картофеле: мягкая мозаика, складчатая мозаика, скручивание листьев, мозаичное закручивание листьев, морщинистая мозаика, полосчатость и некрапчатая курчавая карликовость [Schulz, Folsom, 1923].

Важным открытием стало обнаружение явления латентного инфицирования [Johnson, 1925] при котором материал, полученный от внешне здоровых растений картофеля, вызывал проявления вирусной болезни у других видов растений.

Дальнейший прогресс в изучении вирусов картофеля был связан с работой Смита [Smith, 1931а] в которой было показано, что большинство мозаичных болезней картофеля связано с комплексным поражением несколькими вирусами. Смиту удалось обнаружить, что инфицирование, проведенное механическим уколом иглы и заражение с помощью насекомых,

приводило к появлению различных симптомов. Вирус, передаваемый с помощью механического повреждения и индуцировавший некротические поражения концентрической формы на листьях табака, был обозначен символом «X». Патоген, инфицировавший растения с помощью насекомых и приводивший к развитию мозаичных симптомов на листьях табака, был отмечен символом «Y» [Smith, 193 lb]. В настоящее время данные патогены хорошо охарактеризованы и идентифицированы как Х- и Y-вирусы картофеля (ХВК, YBK), являющиеся типичными представителями родов Potexvirus и Potyvirus.

Также Смитом был сделал важный вывод о том, что сходные симптомы заболевания могут быть вызваны различными вирусами, а инф

Информация о работе

Вологин, Семен Германович
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 06.01.07

Диссертация

Диагностика Y-вируса картофеля и штаммовый состав патогена в Среднем Поволжье - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы