Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие гормонов на заложение и рост примордиев в культуре верхушек побега гороха

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Действие гормонов на заложение и рост примордиев в культуре верхушек побега гороха"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

КАРА Андрей Николаевич

ДЕЙСТВИЕ ГОРМОНОВ НА ЗАЛОЖЕНИЕ И РОСТ ПРИМОРДИЕВ В КУЛЬТУРЕ ВЕРХУШЕК ПОБЕГА ГОРОХА

(03.00.12 — физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1993

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ им.К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

КАРА

Андрей Николаевич

ДЕЙСТВИЕ ГОРМОНОВ НА ЗАЛОЖЕНИЕ И РОСТ ПРИМОРДИЕВ В КУЛЬТУРЕ ВЕРХУШЕК ПОБЕГА ГОРОХА.

(03.00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1993

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты":

академик РАН, профессор

A.Т.Мокроносов

доктор биологических наук

B.Б.Иванов

кандидат биологических наук Э.Л.Миляева

Ведущее учреждение: Главный Ботанический Сад РАН

Защита состоится

1993 года в часов

на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К.002.45.01 при Институте физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН по адресу: 127 276, г.Москва, Ботаническая ул., д.35.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН;

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета канд.биол.наук

I •Л.И.Сергеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Понимание механизмов функционирования апикальной меристемы необходимо и для успешной работы в области микроклонального размножения, и в связи с проблемами других областей фгаиологш растений, 'затрагивающими механизмы гормонального контроля роста и развития целого растения. Клеточные механизмы заложения листьев были выяснены в основном в ходе дискуссии 70-х годов (Lyndon,1968;Ниввеу, 1972,1973;Nougarede,Rondet,1973,1976).Исследование действия гормонов на заложение примордиев в апексах про-" водили большей частью на побегах интактных растений: были получены противоречивые данные по действию на апекс и заложение в нем примордиев ауксинов, цитокининов и АЩ (Wardlaw,Mitra, 1958;Krekule, Horavka,i972;Seidlova,Khatoon,1976).Достаточно однозначные данные были получены лишь по ускорению заложения листьев гиббереллином (Bernier et al.,1964-;MakBymowyoh et al.,1976). Гормональную регуляцию начальных этапов роста листа в основной массе работ изучали на уже сформировавшихся, растущих листьях (0oodwlnfErwee,i933).

При культивировании апексов (или верхушек побега) предметом изучения обычно становится морфогенез эксплантов я его изменение под действием гормонов (Shabde,Murashige,1977;Smith,Muraehige,1970, 1982),- обычно ауксиновойи цитокининовой природы. Цель работ такого типа - получение системы клонового размножения in vitro. В других, работах (Smith,1968; Ншзвеу,1971а,1972) были получены результаты по действии гормонов на образование.и рост примордиев, но гормональные механизмы регуляции этих процессов не исследовали, к тому же не рассматривали и совместное действие гормонов.

Использование предложенного Г.Ха'ссе (Buseéy,i97ia,i972) метода кратковременного культивирования апикальных вксплвнтов позволяет вести прижизненное' наблюдение за ростом апекса, измеряя рост и частоту заложения примордиев. Нами разработана модельная система, позволяющая контролировать действие регуляторов роста на експлант, дапцая в качестве предмета анализа стандартный набор характеристик роста апекса, делающая возмо&ным отбор апексов, находящихся на одной стадии развития. Удобным нам представляется и применение биохимических , ингйбиторов синтеза " фитогормонов; нами был использован . один из . самых эффективных для гиббереллинов -паклобутразол (ПБ) (Couture,1982). .

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучить действие экзогенных регуляторов на нормальное функционирование шекса в культуре верхушек побега гороха, состоящее в регулярном залокении и росте новых примордаев. Перед наш стояли следующие задачи:

- изучить влияние ауксина, гиббереллина и цитокининов, и чувствительность к ним, на апекс культивируемой верхушки побега гороха по совокупности параметров, описывающих заложение и рост примордаев;

- определить влияние фитогормонов на кинетику начального роста примордая в апексе гороха;

выяснить особенности действия гормонов на ростовые характеристики двух последовательно закладывающихся в апексе гороха примордаев;

- исследовать действие ингибитора биосинтеза гиббереллина паклобутразола на модельную систему;

- сравнить действие на модельную систему природного (зеатин) и синтетических (кинвтин, ВАЛ) цитокининов.

Научная новизна работы. На основе. разработанной совместно ' с А.А.Котовым модельной системы, представляющей собой культивируемый на разных гормональных средах апикальный експлант гороха, было изучено действие ИУК, гиббереЖповой кислоты и цитокининов (зеатин, ки-нетин, БАЛ), а такта ингибитора биосинтеза гиббереллина паклобутразола на залонение и рост листовых примордаев в апексе гороха. Впервые было показано, что разным стадиям пластохрояа апекса гороха соответствует и разная чувствительность к фитогорзонам. Принципиально новым является н обнаруженная одинаковая чувствительность к гиббареллину и цитокинину двух' ростовых процессов - залог-линя и начального роста примордая в апексе гороха. Более того, показано изменение динамики роста примордая гороха под действием этих гормонов. Использование ПБ позволило обнаружить синтез некоторого количества гиббереллина в экспланте и его значение ■ для роста апекса. Данная модельная система была апробирована для сравнения' активности цитокининов.

Теоретическое и практическое значение. Разработана новая модельная исследовательская система, позволяющая проводить изучение гормональных механизмов роста и развития апекса. Данная модельная система может быть рекомендована в некоторых случаях и для тестирования новых синтетических регуляторов роста. Полученные

результаты вносят вклад в современные представления о гормональной регуляции ростовых процессов в апексах растений. Выявленные особенности действия гормонов на культивируемые верхушки побегов позволяют лучше представлять себе процессы роста и дифференцировки в меристемах при микроклональном размножении растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были долокены на 7-м конгрессе Федерации Европейских Обществ физиологии растений (Умеа,-Швеция, 1990), на ежегодных семинарах лаб. фотосинтеза ИФР РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа ( Ш страницы, Щ рисунков, /fo- таблиц) состоит из введения, обзора, литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов работы, изложение результатов экспериментов и их обсуждение, заключения, выводов, списка литературы ( наименования, из них зарубежных авторов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Растительный материал. Работу проводили на проростках гороха (Visum aatlvm L.) сорта Ульяновский-68 в климатической установке на основе холодильной камеры "Grönland". Все операции проводили в стерильных условиях. Семена стерилизовали I мин. серным эфиром, просушивали и проращивали в чашках Петри при 27°С. Замачивание было двуступенчатым: в первые сутки добавляли 3 мл стерильной воды на чашку Петри, во вторые - 10 мл. Проросшие семена высаживали в' сосуды с перлитом на I/2-й раствор Кногга, выращивали в камере при 15°С двое суток в темноте, затем при 14-часовом дне и освещении 10 тыс.лк. 8-дневные проростки препарировали под бинокулярным микроскопом МБС-9 Хувэл.х16). С верхушки побега микроскальпелем удаляли все листья и прилистники, и получали для культивирования апикальный эксплант 2,5 мм .в высоту, содержащий 5 укороченных междоузлий, апекс и самый молодой, 9-й примордий (рис.1). 9-й примордий был выбран в качестве типичного для периода экспоненциального роста апекса гороха.

Культура верхушек побега. Экспланты высаживали по одному в культуральные чашки со средой, на фильтровальный мостик (рис.2). Флажки и культуральные стаканчики автоклавировали, сами чашки обрабатывали интенсивным УФ I час. Экспланты культивировали в течение 10-20 суток при 15°С, при 14-часовом дне и освещении 5 тыс.лк. Модифицированную среду Мурасиге-Скуга (Murashige,Skoog,l962) гото-

Рис Л. Верхушка побега гороха без листьев после препарации, ви сверху на апекс (А), вид сбоку. (Б): I - место заложения 10-г примордия, 2 - апекс, 3-8 - места прикрепления 3-8-го листьев, 9 9-й примордий, с учетом рудиментарных листьев эпикотиля. ,

Рис.2. Культуральная чашка для выращивания апикальных эксплантс (Котов, 1991), вид сбоку (А), вид сверху (Б): I - фильтровальнь мостик, 2 - стеклянный стаканчик со средой, 3 - чашка Петри сЫ мм, 4 - влажная подложка из фильтровальной бумаги, 5 - пластиков! носик, 6 - металлическая стойка, 7 - деревянный держатель.

вили путем добавления к солшл.МЗ 2%-ной сахарозы и пептона (I г/л] автоклавировали. В базовую культуральную среду добавляли в разли" пых сочетаниях и концентрациях регуляторы роста: зеатин, кинетго БАЛ, ГК, МУК и ингибитор биосинтеза гиббереллина паклобутраз< (ПБ). Аскорбиновую "кислоту в виде стерильного раствора (I иг/л) все ростовые вещества добавляли в базовую среду непосредствен перед опытом. Ауксин и цитокинины предварительно автоклавировалз ГК фильтровали через мембранный фильтр, ПБ разбавляли втанолом. П; культивировании експлантов проводили измерение длин 9-го и 10-примордиев, предварительно сориентировав эксплант так, что достигнуть горизонтального их расположения. Длину приморд измеряли сверху под микроскопом МБР-3 (увел.хЭ) винтов

окуляр-микрометром ЫОВ—I—15х ежедневно в течение первых 6-ти суток культивирования, 10-й примордий - 3-4 суток после появления. Первое измерение проводили через сутки после препарирования.

Расчет показателей. О учетом того, что рост примордия гороха в течение первых пластохрояов происходит по экспоненте (Ьуп<1оп,1968), мы описывали его рост (в 1п-шкале) уравнением:

1п1пЭ = к0 + к1*-1 + 1с2«1;2. (1)

где Хдд - длина 9-го примордия, мкм; кд, к| и - коэффициенты. Коэффициент к| , или ц9 , равный тангенсу угла наклона касательной' к оси времени, использовали в дальнейшем как оценку скорости роста 9-го примордия. Коэффициент к2 (или Цд*) характеризует замедление экспоненциального роста 9-го примордия в конце измерений. Кривые вида (1) описывали рост примордия от размера 40 до 120-130 мкм. Для описания заложения примордиев использовали пластохрон р^, представляющий собой время между образованием 9-го и 10-го примордиев. Его величину определяли как отрезок на оси времени, соответствующий одинаковым размерам этих примордиев (Ег1оквоп,м1оЬе11п1,1957). Дополнительно использовали способность к заложению примордия з, представляющую собой отношение числа эксплантов, образовавших 10-й примордий, к числу давших рост-9-го примордия. Результаты для каждого опыта приведены в виде у + в(у), где у - оредняя арифметическая величина параметра (Цд, Цд* или р10) для эксплантов в опыте, з{у) - стандартная ошибка. Для каждого опыта суммированы данные, галученные для 5-8 эксплантов. Способность эксплантов к заложению зримордия в приведена для каждого опыта как доля единицы.

Планирование эксперимента. Постановку опытов осуществляли по тланам полных факторных экспериментов (ПФЭ) 23 и 24 (таб.1), где в «ачестве факторов использованы регуляторы роста (Х| - ИУК, х2 - ГК, Сд - один из цитокининов, х5 - ПБ); в качестве фактора х^ использовали начальный размер. 9-го , примордия. Верхний уровень факторов срХд определяли их концентрацией 10~6,10"6 и Ю-7 М, соответст-¡енно; нижний - как отсутствие веществ в среде (эксперимент I), шбо их концентрацией Ю-10 (эксперимент 2) и Ю-8 М (йютеримент !) (Ю-11 и 10 М для цитокининов). В качестве нижнего уровня фактора х4 рассматривали группу эксплантов, у которых исходный размер )-го примордия составлял 40-60 мкм (маленькие примордии), верхний -50-75' мкм (большие примордии).. Размер примордия 60 мкм в качестве юграничного между двумя группами эксплантов был выбран, поскольку

Таблица I. План полного факторного эксперимента 24 (»ирный шрифт) и 25 (жирный + нормальный шрифт).

N опыта Факторы : N опыта ' Факторы:

\ х2 х3 х4 х5 Х1 х2 х3 х4 х5

I -I -I -I -I 17 -I _ +1

2 +1 -I -т -Т -I 18 +1 - -] -I +1

3 -I +1 -I -I -I 19 -I + -I -I +1

4 ■ +1 +1 -I -I -I 20 +1 + -I -I +1

5 -I -I +1 -I -I 21 -1 - +1 -I + 1

6 +1 -I +1 -I -I 22 +1 - +1 -I +1

7 -I +1 +1 -I -I 23 -I + +1 -I +1

8 +1 +1 +1 -I -I 24 +1 + +1 -I +1

9 -I -I -I +1 -I 25 -I - -I + 1 +1

10 +1 -I -I +1 -I 26 +1 - -I + 1 +1

II -I +1 -I +т -I 27 -I + -I +1 +1

12 +1 +1 -I +1 -I 28 + 1 + -I +1 +1

13 -I -I +1 +1 -I 29 -1 - +1 + 1 +1

14 +1 -I +1 +1 -I 30 +1 - + 1 +1 +1

15 -I +1 +1 +1 -I 31 -I + +1 +1 + 1

16 +1 +1 +1 +1 -I 32 +1 + +1 +1 +1

показано, что примордий у гороха достигает этого размера в тот момент, когда на противоположной стороне' апикального купола закладывается очередной зачаток листа (Lyndon,1968). Отдельно были поставлены опыты по схеме ПФЭ 25 (таб.1), где в качестве 5-го фактора использовали ПБ (0 и 10-6М).

Расчет значимых коэффициентов полиномиальной регрессии, связывающей параметры и факторы, проводили по алгоритму йейтса (Максимов,I9S0,с.60). Значимость эффектов определяли графическим методом (Максимов,1980,с.64-65). В дальнейшем анализировали уравнение зависимости исследуемой величины - (ig, цд>, pjq или в -только от значимых факторов:

у - Ъ0 + Ь1»х1 + ... + bj»^ + ... + bjj»^»*^ + i..} . (2) где -• нормированные факторы где их нижнему

уровню соответствует кодовое значение (-1), верхнему - (+1). .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ-Кинетика роста тзимордиэв для -разных гормональных сред. Рост 9-го примордия слупил основой для анализа чувствительности апекса гороха к гормонам, поэтому сначала мы рассмотрели действие ИУК, ГК и кинетина на его динамику. Чтобы оценить действие вткх регуляторов и исходного размера 9-го примордяя на коэффициенты к, и kg (у-ние

5.0

4.0

0-1 2 3 , 4 5 0 1 2 3 4 5 /

"С, сут. ^ сут.

Рис.3. Рост Э-го примордия апикального экспланта гороха™ на безгормональной среде (1),с добавлением 10 ° М ГК (2), 10 М кинетина (3) или их вместе (4): А - группа аксплантов с размером 9-го примордия до 60 мкм; В - больше 60 мкм.

I), описыващие форму кривой роста 9-го примордия, были использованы планы ПФЭ 24. Значимые факторы, влияющие на рост 9-го примордия в экспланте гороха, представлены на таб.2,А1,Б1. ГК и кинетин, действуя раздельно, замедляют рост примордия в начале (кр Ъ2<0, ъ3<0) и усиливают его торможение в конце эксперимента (для отрицательных величин к2: ъ2>0,ъ3>0). Совместное же добавление обоих регуляторов приводит к ускорению роста (к|: ь2Э>о) и не торможению его .в конце измерений (к^ь^О). Обнаружена зависимость скорости роста 9-го примордия от его начального размера <кр Ъд<0): на всех средах большие' лримордии первоначально. растут медленнее, чем маленькие,- торможение роста примордия (к^) от стартовых условий роста не зависит.

• На рис.3, приведены кривые роста для сред с ГК и кинетином, раздельно - для эксплантов с, маленьким (рис.3,Л) и с большим (рис.З.В) начальным размером 9-го примордия, полученные в результанте усреднения коэффициентов к0, к[ и (у-ние I) для соЛветствую-щих- .опытов. Общий характер кривых -для двух , групп эксплантов одинаков:.совместное действие ПС и кинетина почти полностью компенсирует, падение скорости роста примордия, вызываемое этими гормонами в отдельности; - в последней фазе опытов их совместное действие предотвращает торможение роста.

Совместное действие ГК и кинетина на долговременный рост при мордиев может быть связано с синергическим действием гиббереллина ИУК и кинетином, как показано, стимулирующим камбиальную активност и ускоряющим коилогенез в эксплантах из сердцевины салата (Реаго et al., 1987) и сегментах стебля дуба (Zakrzew6ki,l983). Поскольк; именно формирование проводящей системы, предшествует и определяв заложение и начальный рост примордиев (Ьагвоп,1983), можно предаю ложить, что действие ГК и кинетина на образование проводяще: системы примордия проявляется в - их совместном аффекте н поддержание роста примордиев на фоне достаточного поступления ИУ] из апекса гороха.

Действие гормонов на рост апикального экспланта. По плану ПФ 24 нами были поставлены три эксперимента, различающиеся по нижнему уровню гормональных факторов.среда (таб.2): при переходе пос ледовательно от 1-го ко 2-му и 3-му экспериментам происходит суже ние поля опыта за счет сдвига его нижней границы, так что в послед нем случае тестируются те концентрации гормонов, которые мы предполагали близкими к оптимальным. Присутствие значимого отрицательное эффекта ь4 для скорости роста во всех экспериментах свидетельствует о более низкой скорости роста примордия большего стартовоп размера; в литература также показано, что скорость роста примордие) разного размера различается, и ети отличия сохра- няются в культур (Котов,1991). Деление эксплантов на группы, за счет. которого mi получали фактор х4, отражает реальную периодичность роста в апекс! гороха, по-видимому, наши группы эксплантов" соответствуют дву1 состояниям апекса гороха, выделяемым в ходе пластохрон; Р.Ф.Линдоном (Lyndon,i968). Тогда величина ц^ для двух групп эксплантов определяется ростом 9-го примордия, соотвествующим разил состояниям апекса гороха: во 2-й части пластохрона происходит образование "центра роста" нового примордия. Из других эффектов отметш отрицательное действие кинетина (ь3<о) на рост примордия, причем i эксперименте 3 ингибируыцее действие кинетина проявляется только h¡ больших примордиях в присутствии ауксина (Ъ134<0).Совместное действие ГК и кинетина, ускоряющее рост в эксперименте J ,(ъгз>о), в эксперименте 2 из-за изменения нижнего уровня кинетина с 0 до Ю-11] становится незначимым, т.е. эта концентрация достаточна, чтобы вызвать ростовую реакцию; В 3-м эксперименте, по-видимому, вблиз] оптимума по используемым гормонам, изменяется характер обнаруживав-

Таблица 2. Значимые факторы по результатам анализа стандартных таблиц ПФЭ 24 по действию ИУК (xj), ГК (х2), кинетина (х3) и начального размера Э-го примордия (х4) на апикальные экспланты гороха: (ig и рд'- скорость и торможение роста 9-го примордия, р10 -величина 10-го пластохрона, в - способность к заложению примордия.

Параметр Эксперименты:

I Преде. 0-10"6 М 2 ш варьирования ropi I0_1°-I0-6 М 3 ганов: IО"8-I0~6 M

Mg U) Ь0 = 19.26*10"2 Ь2'= -2.44*10-2 t>3 = -2.18*10-2 ьгз= 3.00*10-2 Ьд = -1 .54*Ю-2 bQ = 19.74*Ю"2 b3 = -3.28*10-2 b123= -2.68*10'2 b4 = -2.55*10 b0 = 15.52*10"2 b4 = -1.82*1O-2 b24= 1.56*10~2 b134= -1 .65*10"2

Цд' (Б) Ь0 = -20.29*Ю~3 Ьг = 8.10*10~3 Ь3 = 6.65*Ю~3 Ь2Э= -4.1 6*10"3 bQ = -22.25*10-3 b3 = 6.25*10-3 b123= 5.24*10"3 bQ = -14.32*10~3 ь2 = 3.01 *10"3. b..= -2.52*1O"3 b24= -3.49*10 J

Рю <в> Ъ0 = 10.468 Ь2 = -1.753 bQ = 11.460 ■ b2 = -3.142 b123= 1.330 bQ = 11.059 b2 = -1.790

В (Г) bQ - 7.69*10-1 bg .je 1 .15*10*"1 Ъ4 = 1.04*10-1. bQ = 7.68*10"1 b2 » 1.16*10"1 bQ <= 7.88*10"1

мых значимых коэффициентов - все они описывают, рост примордиев группы эксплантов с большим начальным размером 9-го примордия.

Анализ таблиц ПФЭ для пластохрона р10 (таб.2,В) позвВлил обнаружить во всех опытах ускорение заложение примордиев при добавлении ГК., Появление'во 2-м эксперименте эффекта взаимодействия трех гормонов означает, что при одновременном минимуме либо максимуме ИУК и кинетина сокращающее пластохрон действие ГК будет снижено и составит 1.812, что сопоставимо с другими экспериментами.Верхний уровень ЛУК или кинетина будет усиливать дейогвие ГК, ускоряющее заложение

Рис.4. Зависимость^ (I), ростовой характеристики 9-го примордия и пластохрона р^ (2) апикального экспланта гороха от концентрации кинетина в среде. Для вксплантов с начальным размером 9-го примордия свыше 60 мкм на фоне Ю-6 М ГК и Ю-10 М ауксина.

Рис.б. Зависимость цд (I), ростовой характеристики 9-го примордия и пластохрона рю (2) апикального экспланта гороха от концентрации ГК в среде. Для эксплантов с начальным размером 9-го примордия свыше 60 мкм на фоне 10~9 М кинетина и Ю-1" м ауксина.

Рис.6 - Зависимость способности к образованию 10-го примордия з апикальных эксплежгов гороха от концентрации ГК в культуральной среде (на фоне 10 3 М кинетина и 10 М ауксина), для эксплантов с начальным размером 9-го примордия:1 - больше 60 мкм;2 - до 60 мкм.

листьев. Способность закладывать 10-й примордий з (таб.2,Г) выше у эксплантов о большим стартовым размером _ 9-го примордия. По-видимому, отчасти эту способность увеличивает ГК.

По результатам факторного анализа мы предположили, что в области Ю~9-Ю_7М кинетина и Ю_6М ГК находится оптимум по всем, изученным параметрам роста апекса, гороха. Для дополнительного изучения действия ГК и кинетина были поставлены опыты, позволяющие исследовать действие ряда их концентраций на параметры р10 и з. Формирование групп эксплантов проводили аналогично тому, как это делали в факторных экспериментах: о начальным размером 9-го примордия более 60 мкм (1-я группа) и до 60 мкм (2-я группа). На .рис.4 представлены графики зависимости ростовых характеристик Э-го (цд) и 10-го (р|д) примордиев от концентрации кинетина г культуральной среде для эксплантов 1-й группы. Статистически значимое (Р > 0,95) превышение скорости роста над контролем было отмечено в области концентраций кинетина Ю-9 - Ю-3 М, снижение

_ Т Л -7

величины пластохрона р10 - в области 10 1и - 10 ' М. Для 2-й группы эксплантов чувствительность Цд и р10 к кинетину не обнаружена. Не отмечено и воздействие кинетина на способность эксплантов к образованию примордия а, для обеих групп.

На рис.5 приведены графики зависимости ростовых характеристик 9-го ((.ig) и 10-го (Pj0) примордиев от концентрации ГК для вксплан-. тов 1-й группы. Статистически достоверное (р>0,95) превышение скорости роста над контролем зафиксировано при 10~6-Ю_4М, а снижение p]Q - при Ю-7-Ю-4 М ГК. Для 2-й группы получены результаты, свидетельствующие об отсутствии чувствительности ц9 к ГК, для р10 форма кривой идентична такой ке для 1-й группы и не приводится. Зависимость способности эксплантов формировать 10-й примордий от концентрации ГК в среде для двух групп эксплантов дана на рис.6. Максимальные значения в, Слизкие к I (100%), и превышающие контрольные, появляются при концентрациях ГК Ю~6 -Ю-4 М. Способность к образованию примордия для всех концентраций ГК выше у эксплантов 1-й группы.

В конечном итоге, максимум чувствительности пластохрона р10 и • скорости роста 9-го примордия наблюдается одновременно , для обоих гормонов (рис.4-5). Сочетание концентраций Ю-8 М кинетина и Ю-6 М ГК дает снижение pjq до минимальной величины 6,09 сут. по сравнению с безгормональной средой (10,53 сут.). Для интактного апекса гороха длительность 10-го пластохрона составляет 1,92 сут., по данным А.А.Котова (1991). Обнаруженное нами стимулирование ГК заложения листьев ранее показано на интактных растениях (Beimier et al.,1964; MakBymowyoh. et al.,1976;Langenauer gt al.,1975). При'том же сочетании ГК и кинетина рост 9-го примордия (Цд) максимально ускоряется, достигая величины 24,04 * 10 .отн.ед. и сравним с безгормональной средой (25,84 * 10~2 отн.ед.). Скорость роста 9-го примордия в интакгном апексе составляет 81,12 * Ю-2 отн.ед. (Котов,1991). '

Опыты с использованием паклобутразола. Содержание эндогенных, фитогормонов может оказать существенное влияние на чувствительность эксплантов к экзогенным регуляторам роста. Одной из главных при- . чин слабого роста апекса в нашей системе оказывается, по-видимому, низкий уровень гиббереллинов, вырабатываемых у гороха в основном молодыми междоузлиями и листочками (их мы удаляем при препарации)■ верхушки побега (Coolbaugh,i9S5). Оценить, есть ли синтез гиббереллинов в экспланте, мы можем, используя- ингибитор их биосинтеза - ПБ. В этом случае, подавляя его, мы получим и действительную чувствительносить апекса гороха к'ГК.: Опыты с , ПБ проводили по плану ПФЭ 25 (таб.1). По действию' на показано (таб.3,2), что ГК ускоряет рост 9-го примордия (Ъ2>0), а совместное .

Таблица 3. Значимые факторы по результатам анализа» стандартных таблиц ГШ 25 по действию ИУК (х^, ГК (х2), кинетина (х3), ПБ (х5) и начального размера 9-го примордия (х4) на апикальные экспланты гороха: - скорость роста 9-го примордия, в - способность к заложению примордия.

Параметры Значимые факторы

М-д (1) ьо " Ь2 = 14.55*Ю~2 3.70*10~2 Ъ5 = -4.72*10 2 Ъ25= 1.47*10""2

в (2) Ъ0 ■ Ъ2 = 5.88*10"1 2.62*1О-^ Ъ4 = 0.87*10~1 Ъ5 = -1.80*10"1 Ъ£5= 1.47*10 1

действие ГК и ПБ (ь25>0). предотвращает падение его скорости, вызываемое самим ПБ (Ь5<0). Мы определяли и величину пластохрона но " поскольку ПБ полностью подавлял образование 10-го примордия, определение р10 в этих случаях не могло быть проведено, а способность эксплантов к заложению примордия в снижалась до 0. Анализ таблицы ПФЭ для з позволил обнаружить (таб.3,2) отрицательное действие ПБ (ъ5<0), подавляющего способность к заложению, и совместное действие ГК и ПБ (Ъ25>0), увеличивающее эту способность; з повышается и при действии одной ГК (Ъ2>0), и при переходе к эксплантам с большим стартовым размером 9-го примордия (Ъ4>0).

Т.о., ингибитор биосинтеза гиббереллина ПБ в отсутствие ГК подавляет и рост, и заложение примордиев у апикальных эксплантов гороха. Совместное добавление в среду ПБ и ГК полностью снимает ин-гибирующее действие ПБ: восстанавливается скорость роста 9-го примордия экспланта и его способность к образованию следующего; плас-тохрон был примерно той же длительности, что и для среды с ГК; обнаруженное нами синергическое действие этих регуляторов на растения гороха отмечено и в литературе (Нгас1Шк,Р1вегоуа,198б). Опыты с ПБ показывают, что синтез гиббереллинов в тканях экспланта не исключен и некоторое их количество в культивируемых верхушках побега присутствует, т.к. рост и заложение примордиев происходит и на безгормональной среде, а ПБ подавляет рост и заложение примордиев. Возможно, есть прямая корреляция между размером экспланта, зависящим от возраста проростка гороха, препарируемого для его получения, и уровнем эндогенных гиббереллинов. Как 'Следствие, это

может отражаться на способности эксплантов к заложению примордия, более высокой у тех, где стартовый размер 9-го примордия выше.

Сравнительное действие цитокининов.Еыли поставлены три факторных эксперимента, отличающихся по используемому цитокинину;они имели общую часть, состоящую из опытов, поставленных без цитокинина в культуральной среде. План ПФЭ 2 4 из 16-ти опытов (таб.1) состоял из двух частей: из 8 опытов, в которых перебирались все возможные сочетания ИУК (О и Ю~6М), ГК (0 и 10~6М) и начального размера 9-го примордия, и из 8 опытов, где те же сочетания факторов Xj, х2 и х^, соотвественно, проверяли на фоне одного из цитокининов (фактор х3): кинетина, зеатина или БАП (0 и 10_7М). Значимые факторы, в виде соответствующих коэффициентов, были сведены для всех трех экспериментов в одной таблице (таб.4).ПроЕвсти расчет значимых коэффициентов для пластохрона pIQ в эксперименте с БАП не удалось, поскольку в одном из опытов ни один эксплант не образовал 10-го примордия.

Все три цитокинина тормозят рост 9-го примордия в культивируемой верхушке побега (Ьэ<0: таб.4,1).Зеатин и кинетин действуют примерно одинаково (коэффициенты bg близки по величине), БАП- сильнее. Для всех цитокининов характерно их примерно равное по.величине совместное действие с ГК (Ь23>0), ускоряющее рост примордиев. Действия цитокининов на пластохрон Pjq не обнаружено, а способность к заложению 10-го примордия снижалась зеатином и БАП (bg<0).Только в эксперименте с БАП обнаружен его совместный с ГК эффект(bggiO) на в. -

Исследование цитокининов с целью сравнения их активности, предпринималось и раньше, обычно его проводили на основе сопоставления, структуры природных и синтетических цитокининов и их воздействия на культуральные системы .(Skoog et al. ,1967 ;Кулаева, 1973). Другой подход состоял в изучении их активности в гормональных взаимодействиях: в подавлении биосинтеза АБК в мезокарпной ткани плодов авокадо (Cowan,Railton,i987); в ингибировании окисления эют-каурена' в без-клеточной системе из жидкого эндосперма .семян. дикого- огурца (Coolbaugh,i984). Можно сказать, что в настоящее время нет других возможностей для оценки и сравнения активности цитокининов, кроме ее проявления в разнообразных тест-системах. Недостатком.приведенных методик сравнения можно считать то, что сопоставление цитокининов проводили в каждом случае лишь по 1-2 параметрам. Мы попытались использовать нашу модельную систему для сравнения цитокининов,,ана-' лизируя их активность по всем исследуемым параметрам роста апекса.

Таблица 4. Значимые факторы по результатам анализа5 стандартных таблиц ПФЭ 24 по действию ИУК (х;), ГН (х2), цитокининов (х3) и начального размера 9-го примордия (х4) на апикальные экспланты гороха: Рд - скорость роста 9-го примордия, р10 - величина 10-го пластохрона, в - способность к заложению примордия.

Параметры

Цитокинины

кинетин зеатин

р9 (1) Ъ0 = 19.261 *Ю-2 Ъ2 = -2.437*10""3 Ъ3 = -2.179*10""2 Ъ4 = -1.542*10-2 Ъ2Э= 2.995*10""2 Ь0 = 18.506*10-2 Ь2 = -2.049*1 о-2 Ь3 = -2.934*10"2 Ь4 = -1.701*10-2 Ъ23= 3.383*10"2

Р10 (2) bQ = 10.468 Ьг = -1.753 bQ = 11.249 Ь2 = -1.906

в (3) Ь0 = 7.688*10-1 Ь2 = 1,150*10-1 Ьд =» 1.038*10~1 Ь0 = 6.356*10"1 Ь3 = -1.181*10-1 Ь4 = 1.444*1О"1

БАП

Ь0 = 15.957*10

,-2

Ъ3 = -5.433*10

-2

Ъ23= 3.254*10'

,-2

Ь0 = 6. 619*10"

Ъ2 = 1. 469*10"

ъ3 - -0. 919*10"

ь4 = 1. 081*10"

Ъ23= -0. 894*10"

Сравнение природного (зеатин) (Short,Тогтеу,1972гeman et al., 1972) и синтетических (киштин, БАП) цитокининов показало высокую чувствительность хс ним ростовых характеристик апекса гороха. Синтез значительной части цитокининов у гороха идет в корне (Chen et al.,1905) и мы моием предположить, что чувствительность эксплан-та определяется снижением поступления цитокининов, и тестирование экзогенных горюнов мы проводит« на фоне недостатка эндогенных. Игнат взгляд, наблвдаэше изменения в культуре верхушек побега по сравнении с in vivo' - сникение скорости роста примордия и увеличение длительности пластохрона - определяются нарушением гормонального баланса. Компенсировать эти изменения мы пытались, добавляя в среду регуляторы роста, в том числе и цитокинины; сравнение между собой 3-х разных цитокининов, добавляемых в зквимолярних количествах, делали на основа результатов ПФЭ.

Сравнение цитокининов по значимым коэффициентам ПФЭ (таб.4) показывает, что непосредственно судить об их активности не представляется возможным. Если рассматривать эффекты самих цитокининов (коэффициент ъ^), то мы сможем оценить лишь неблагоприятное действие каждого из них, снижающее и скорость роста 9-го примордия (таб.4,1), и способность эксплантов к заложению следующего (таб.4,3). При разном тормозящем действии зеатина,, кинетина и БАЛ на рост примордия (t>3<0), их совместные с ГК эффекты, ускоряющие его (ь2з>0), примерно равны (таб.4,J). Таким образом, сами цитокинины тормозят рост примордия, снять это торможение позволяет одновременное добавление ГК, которая ускоряет и заложение нового примордия. Тогда, чтобы ускорить в нашей системе одновременно и рост, и заложение нового примордия, требуется наличие в среде веществ и гиббереллиновой, и цитокининовой природа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Для выяснения роли фитогормонов в росте верхушки побега была разработана модельная система, основой которой служит апикальный эксплант гороха. Эксплант представляет собой редуцированную верхуш-. ку побега, включающую в себя апекс, самый молодой на этой стадии 9-й и формирующийся в культуре 10-й примордии, несколько, молодых междоузлий. Во время культивирования измеряли длину 9-го и 10-го примордиев и рассчитывали параметры, описывающие состояние системы: кинетику экспоненциального роста 9-го примордия представляли по совокупности коэффициентов Цд (скорость роста) и (его торможение); заложение 10-го примордия описывали по величине 'пластохрона Pjq (которую рассматривали и как ростовуп характеристику этого примордия) и способности экспланта к заложению примордия s. Далее анализировали чувствительность этих 4-х параметров к гормонам, добавляемым в культуральную среду, на основе схем ПФЭ и по концентрационным кривым.

Поскольку рост верхушки побега определяется, по-видимому, в основном совокупным действием эндогенных фитогормонов ауксиновой, гиббереллиновой и цитокининовой природы, мы попытались выяснить их . роль, добавляя аналоги этих гормонов в среду эксплантов во всех возможных комбинациях. Для учета совместного действия гормонов были использованы методики планирования' эксперимента, опыты были поставлены по плану ПФЭ 24: в 3-х экспериментах сужали поле опыта в

направлении ожидаемого оптимума. Ауксин проявлял свое действие лишь в присутствии других гормонов, в высокой концентрации тормозя рост и заложение примордия. Показана высокая чувствительность ростовых характеристик апекса к ГК и кинетину, причем характер зависимостей изменяется в опытах, в которых испытывали концентрации гормонов, близкие к ожидаемым оптимальным. Это связано с тем, что рост апекса зависит от стадии пластохрона, на которой он находится: рост 9-го примордия тормозится во время заложения следующего, 10-го и с высокой достоверностью чувствителен к ГК и кинетину вблизи от предполагаемого оптимума Т.о., в этом эксперименте четко проявляется разная чувствительность к гормонам двух пластохроннных стадий апекса гороха, которые мы выделяли для анализа, разделяя экспланты на группы по начальному размеру 9-го примордия.

Для выяснения картины действия ГК и кинетина и чувствительности к ним роста апекса во время заложения примордия мы рассекли поле эксперимента по этим двум гормонам концентрационными кривыми. В одном случае варьировали концентрацию ГК от 0 до Ю-3 М на фоне Ю-9 М кинетина, его нижнего уровня в 3-м эксперименте, и Ю-10 М ИУК. В другом изменяли концентрацию кинетина от 0 до Ю-4 М на фоне Ю-6 М ГК, оптимального по всем экспериментам для заложения примордия, и 10"10 М №.. Эти секущие пересекались в точке с координатами Ю-6 М ГК и Ю-9 М кинетина. Было обнаружено, что для кинетина существует выраженный оптимум при 10 М, которому соответствует " максимальная скорость роста 9-го примордия и минимальная длительность 10-го пластохрона. Такой же оптимум по этим параметрам и по способности образовывать 10-й примордий был обнаружен для кривой по ГК, при ее концентрации Ю-6 М. Т.о., мы можем говорить о чувствительности роста 9-го и заложения 10-го (р10) примордия (при их ускорении) одновременно к ГК и кинетину.

Полученные данные показывают, что во время заложения примордия комплекс апекс плюс молодые примордии представляет собой единую 'систему, определенным • образом реагирующую на экзогенные гормоны, что может быть определено по одинаковой реакции на них его частей -9-го и 10-го примордиев. Одинаковая чувствительность к ГК и кинетину роста- 9-го и заложения 10-го примордия, видимо, обусловлена одинаковой компетенцией клеток; известно, что оба этих процесса определяются преимущественно клеточными делениями.

Если- отсутствие положительных эффектов ауксина в ПФЭ васгавля-

ет предположить автономность нашей модельной системы по этому гормону, то высокая чувствительность к кинетину (начиная с 10-11М) позволяет говорить о дефицитности системы по цитокинину. Полученные отрицательные эффекты высоких (Ю-7 М) уровней кинетина, зеатина I БАЛ связаны, на наш взгляд, с их избыточной концентраций. Высокая чувствительность к гиббереллину роста апекса и опыты с ингибитором его биосинтеза ПБ позволяют сделать вывод о полуавтономности системы по этому гормону: без экзогенной ГК возможен лишь слабый рост примордия и медленное заложение следующего,которые полностью подавлялись ПБ, тогда как добавление ГК позволяет снять все эффекты ПБ.

Попытка применить нашу модельную систему для сравнения цитокшшнов показала, что ее не стоит использовать как тест на эти фитогормоны. Оценка их биологической активности затруднена, поскольку избыточная концентрация цитокининов подавляет рост, при том, что диапазон тестируемых концентраций узок и зависит от активности цитокинина, велика трудоемкость исследования и сложен анализ полученных данных.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана модельная система, представляющая собой апикальный эксплант, культивируемый на разных гормональных средах, и позволяющая анализировать роль гормонов в заложении и начальном росте примордаев в апексе гороха. Установлено, что ускорение роста и заложения примордаев в апексе экспланта возможно лишь при восполнении дефицита одновременно и по гиббереллину, и то цитокинину.

2. По результатам анализа факторных экспериментов и концентрационных кривых показано, что чувствительность апекса гороха во время заложения нового примордия . характеризуется отчетливым оптимумом при концентрации Ю-6 М ГК и 10~8 М кинетина в среде. На стадии роста апекса, предшествующей заложению примордия, такая чувствительность не выражена.

3. Обнаружена одинаковая чувствительность ростовых характеристик 9-го и 10-го примордия к кинетину и гиббереллину, что позволяет предположить одинаковую компетенцию этих примордаев на данной стадии пластохрона. '

4. Одинаковая гормональная чувствительность роста 9-го примордия на одной стороне апикального купола и заложения 10-го -на другой позволяет предположить, что комплекс апекс плюс молодые

примордии представляет собой единую систему^ с одной чувствительностью к гормонам, по-видимому, благодаря единым механизмам роста на стадии заложения примордия.

5, Показана автономность апикального экспланта по ауксину, его добавление в.среду не дает положительного эффекта.

G. Эксплант полуавтономен по гиббереллину: подавление его синтеза паклобутразолом ингибирует рост и заложение примордиев, добавление ГК снимает эти эффекты; выявлена высокая чувствительность апекса и непосредственно к ГК.

7. Апекс очень чувствителен к цитокинину, по-видимому, эксплант гороха дефицитен по нему. "Избыток" цитокинина, в зависимости от активности, оказывает отрицательное действие на рост. Ускорявшая рост активность цитокинина наблюдается только на фоне добавления ГК.

8. На основании полученных данных мы можём предположить, что все три исследованных фятогормона включены в регуляторный механизм роста апекса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Вудаговская Н.В.,Кара А.Н.,Котов A.A. Исследование специфики прорастания различных по массе семян гороха//Физиология семян: Формирование, прорастали?, прикладные аспекты. Материалы Всес. симпозиума, 10-14 окт. 1988 г. Душанбе: Донш, 1990. С.158-162.

Budagovekaya К.V.,Kara A.N.,Kotov A.A. Hormonal regulation оi pea isolated арах development// 7th CongreeB of the Federation оi European Sooietee oi Plant Physiology: Abstarota. Umea, Sweden, Aug.5-10, 1990. PhyBiol.Plant. V.79. N 2. Ft.2. A7.

Кара A.H..Вудаговская H.B. Действие гормонов на образование и рост примордиев в культуре апексов гороха// Онтогенез. 1991. Т.22. N 3. С.325-330.

Кара А.Н. .Замолодчикоъ Д.Г. Влияние гиббереллина и кинетина н:л развитие верхушек побега гороха in vitro// Физиол.раст. 1991. Т.38. Вып.6. G.1124-1133.

Кара А.Н.

Объем 1'/г п. л.

Заказ 54.

Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44