Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДЕЙСТВИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ПЛАТИНЫ НА ВЕТВЛЕНИЕ КОРНЯ ПРОРОСТКОВ ОГУРЦА

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ДЕЙСТВИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ПЛАТИНЫ НА ВЕТВЛЕНИЕ КОРНЯ ПРОРОСТКОВ ОГУРЦА"

#-2 £434

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А.' ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ДУБРОВСКИИ Иосиф Григорьевич

УДК 635,63 : 581.144.2.04

ДЕЙСТВИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИИ ПЛАТИНЫ НА ВЕТВЛЕНИЕ КОРНЯ ПРОРОСТКОВ ОГУРЦА

Специальность: физиология растений (03,00.12)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1986

Работа выполнена в Институте общей и неорганической химии нменн Н. С. Курнакова АН СССР.

Научный руководитель—доктор биологических наук, профессор В. Б. Иванов.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор А. £. Петров-Спиридонов; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Н. >В. Обручева.

Ведущее учреждение—Ботанический институт АН СССР имени В. Л. Комарова.

Защита диссертации состоится . 1987 г.

часов на заседании Специализированного совета Д.120.35.07 при Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА.

Ученый секретарь Специализированного совета — кандидат биологических наук, доцент

Автореферат разослан * /г. >

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Важнейшие фуя}щил корня - поглотительная и оинтетичеокая - тесно - связаны о его способностью к быстро^ росту а ветвлению, с богатством корневой системы керистематичес-кими окончаниями. На это впервые обратил внимание Д.А. Сабинин (1949), Несмотря на то, что в жизнедеятельности растения ветвление корня играет столь важную роль, до сих пор оно мало изучено.

Процесс ветвления чувствителен к различным веществам в ризосфере с характеризуется высокой скоростью формирования корней. Разине факторы вызывают разные изменения в корневой системе. Многие вещества оказывают специфическое действие на рост корня, поэтому, анализируя реакцию корневой системы на исследуемые ве- -оества, можно получить информацию о типе их биологического действия.

' Среди биологически активных соединений наиболее интересную и недостаточно изученную группу представляют комплексное соединения платины. Некоторые из них в настоящее время уже широко ясполчзушся а онкологии в качестве противоопухолевых препаратов, например цис-дкхлородиашиш платина (II) (в дальнейшем - ДЯПК Растения как объект для изучения биологического действия комплексных соединений платина используются крайне редко. Однако только исследования, проводимые на разных организмах, в том числе на растительных, позволят понять общие фундаментальные основы механизма биологического действия этих соединений.

Чем быстрее происходит ветвление корня, тем раньше можно обнаружить цитостатичеокую активность тезСяяи иных веществ. Поэтому представляется целесообразным использование объектов с высокой скоростью ветвления корня: В качестве такого объекта бшш использованы, проростки огурца. Несм^^^на^повсеместное распространение

'*"" ""Ципггтдя ■ ■ ■ . ■■ Шучэзв

»пг-ия

ал ^««-си.и.ч. V; 1ем-1

.... 1* I К ... - .

этой .культуры, отдельные процессы ветвления корня, и, а частности, развитие боковых корней, у огурца ранее не изучалось.

Дель-и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение ветвления корня проростков огурца и анализ действия ДЕЛ на этот процесс, а такяе выработка на этой основе теста для обнаружения цитостатиков. В связи с этим решались следующие задачи;

1. Изучить, как протекает закладка, гистогенез и размножение клеток в ходе развития бокового корня проростка огурца.

2. Проанализировать действие ДДП на рост и ветвление корня проростка огурца при разных способах обработки ДДП,

3. Исследовать, как действует ДЗШ на развитие зачатков боковых корней; проанализировать действие ДДП на гистогенез, отдельные процессы дифференцирован, размножение и рост клеток.

4. Сравнить действие ДДП, его транс-аналога и других £Ьеди-нений на ветвление корня й выработать тест для обнаружения цитостатиков.

Научная новизна работы. В диссертационном исследовании впервые било изучено ветвление корня проростков огурца и проанализировано действие одного из самых сильных цитостатиков - цис-дихло-родиашин платины СИ) на этот процесс. Впервые было установлено существование системы зародышевых зачатков боковых .корней в семени огурца. Впервые также показано, что в формирование зачатка бокового корня вовлекается большое число клеток разных тканей. Доказано, что в формировании постоянных тканей бокового корня принимает участие кора материнского' корни.

Обнарухег что быстрое ветвление корня проростка огурца обусловлено првдсуиествующимя в семени зачатками боковых корней, большим числом клеток, вовлекаемых в формирование зачатка бокового корня, и высокой скоростью размножения клеток в ходе развития

зачатка. Показано, что при действии ДЛД останавливается ветвление корня. В основе этой реакции лежит ингибирование размножении клеток. Впервые было выявлено, что разные клетки одной'и той же клеточной системы - зачатка бокового корня - по-разному реагируют на воздействие ДЕЩ,. сохраняя или утрачивая способность к делениям. Установлено, что облазает рядом не известных ранее эффектов: изменяет полярность роста и ориентация деления клеток, нарушает согласованность процессов роста и деления клеток, ингибкрует рост мернотекатЕческих клеток. Обнаружено, что ДЦП не влияет на рост клеток растяжением. Также впервые были описаны относительно устойчивые к действию Д1Ш процессы, нормальное протекание которых не зависит от размножения клеток.

Практическая ценность работы. Предложенный в работе тест для поиска эффективных питостатяков, основанный на анализе степени ингябированин ветвления корня, может быть рекомендован для скривила цптостатаков, а также для оценки типа действия изучаемых веществ.

Установленные в работе структурно-физиологические особенности ветвления корня проростков огурца могут быть включены в курсы по анатомии и физиологии растений, читаемые в унввероитетах, педагогических и сельскохозяйственных ВУЗах, а также использованы для постановки различат задач при обучении студентов.

Работа представляет теоретический интерес. Установленные факты расширяют ваши представления о реакциях растений на воздействие цитостатнков и позволяют глубже понять механизм биологического действия ДЩ. ■ ,

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции молодых ученых М1СС АН СССР (Москва, ноябрь, 1С85),

«а седьмом Сабанкнскси семинаре (¿¡свода, 1066) и на ВтороЗ Всесоюзной конференции колодца ученик по физиология растительной клетки (Москва, 115?, март 19Б6).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 сечах— них работы.

Обгвм тоботц. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов к списка литературы (349 источников: 67 отечественных к 282 иностранных). Изложена на 164 страницах машинописного- текста, включает 9 таблиц и 52 рисунка.

Настоящая работа выполнена в Груше биохимических исследования "Института обцей я неорганической химия кдоии Н.С. Курнакова АН СССР(и'является часть» программ по изученсо мхакизка дейст-вш! физиологически активных Соошшний. Номер государственной регистрвцоонной геьш 76063829.

ОЙЕКШ II МЕТСЙЦ ЕССВДОШВИЙ

'Району проводили иа проростках огурца Сисии1о еа*1тшп ь. сорт КурсмскиЙ Сб. Семена раскладывала в чаааис Негра на фильтровальное оумагу, сиочеинуп водой ели растворои ингибитора, в вы-рсаавалн йроростка в течение 3-11 оуток при температуре 27° в тсшю*е. Все опыты повторяла не менее 3-х рай.

Йиксецш) проводили до каиачдоания сеиян в через I, 6, 12, 18, £4» 20, 36 , 42 , 48, 50, 52, 54, 72, 144, 192 д 264-ч пссЛй ■начала намачивая пл. {икс шит попользовали факсатори Бродского {Пйушева, 1970} л ЧсмЗорлена (Дженсен, 1965). Материал заключали в парафин по оС^епринятоЗ методике или в эпон-арадсст по методике В.Н. Филиппенко (1976 а) и резали на микротоме МсЕ. Толадна срезов 4 и 7 «км.

После удаления сарацина среза окрайиваля следующими способа-

ми: а) проционовыми красителями по метод:*.ке В.Б. Иванова в Т.К. Литинской (1967) с подкраской алцшшовым соням Э ОХ или без нее* 0) актквним ярко-красным 5 СЗС в растворе соды, в) о помощь» ШС-ре акция. сроэа материала,.заключенного в опоя-араддкт, окра-пищали 0,1? раствором толуидкнового синего в 1% cose.

Обучение секяя рентгеновскими лучами в дозах 250, 500, 1000, 2500, 5000 и 10000 Гр проводили на установке типа РУП-200-205 (режим работы установки 190 кЗ, 15 А» мосность дозы 7,76 Гр/мад).

Статистическую обработку результатов проводила по обаепрл-нятой методике (Лакин, 1973; ПлохкнекиЛ, I960).

РЕЗУЛЬТАТЫ И 1Я ОЕСтаШЕ I. РАЗКГГИЕ БОКОБНХ КОРНЕЯ У ПРОРОСТКОВ 0I7PIIA I.I. Роет и ветвление корня

¡¡ассовое прорастание секян наблцздлось через IS ч после па-чала намачивания сскял, нервно боковые корни появляются через 4248 ч. СтацколарииЛ рост корня начинался через 24 ч. Скорость роста корня и увеличения зоны боховше корней били приблизительно одилакови. Реет главного корня а $ор:игроваясе боковых корней происходили на протяжения лсего опыта (до II суток).

Анализ распределения боковых корней у проростков показал, что боковые корня располагаются у бодышнетва проростков упорядочений - группами. В состав группы входят боковые корни.раэяих протоксилемню.. рядов.

1.2. Латентная затюдывевая корневая система

В связи^с раннш-формированяем боковых корней у огурца представлялось'необходимым изучить, когда в онтогенезе закладываются первые зачатки боковых >торней. Было высказано предполо*е-

нив о возможности существования зачатков Соковых корней в заро-дыае семени огурца, подобно описанным в литературе зародышевым зачаткам боковых корней гречихи (о'РеИ, Роагй, 1969).

С целью проверить это предположение, облучали семена рентгеновскими лучами и лозах, полностью подавляющих клеточные деления (ГОСО-ЮОСО Гр). Проращивали такие семена, фиксировали корни проростков и заключала их в эпонт-араддит. Уже в залитых блоках при просмотре их поя бинокулярной лупой в толще тканей корня можно было ввдеть сформированные зачатки боковых корней. Это свидетельствует о тем, что набяпдаеше зачатка были заложены уже в сухом семени- Прямые наблюдения срезов сухих семян, заключенных в зпон-аралдит, подтвердили правильность этого вывода.

В зародышевом корне огурца имеется 4 ряда зачатков боковых корней, соответствующих 4 протокеилемным рядам. Зачатки з&Тиады-ваотся в семядольной и межсемядолькой плоскостях. Наиболее раз-паты базальные зачатки боковых корней. По направлению к апексу число клеток, составляющих зачатки боковых корней, уменьшается. В зародышевом корне зачатки закладываются преимущественно группами. Это объясняет упорядоченное расположение боковых корней на главном корне. В связи с тем, что в корне зародила встречается не более 20 зачатков боковых корней, располагавшихся в 5 группах, представляется возможным в корне проростка идентифицировать зародышевые боковые корни я боковые корни, закладывающиеся пссле прорастания.

Предложено для обозначения совокупности всех тлеющихся в зародыпе семени зачатков корней (главных, боковых и придаточных) использовать термин "латентная зародкиевая корневая система". Существованием латентной зародышевой корневой снстегл объясняется

высокая скорость формирования кооневой системы проростков огураа.

1,3. Гистогенез шзвиваяиегося зародышевого бокового корня

Данные о гистогенезе развяватецегося бокового корня Тыквенных противоречивы.' Ейе в 1874 г. Эд.ЯнчевскпЗ (Jane2ewabl, 1874) утверждал, что стель бокового корня развивается из першдасда, тогда как в формирования кора бокового корня принимает участие кора материнского корня. М.Ван-Тигем к Г.Дульо в противовес это! точке зрения утверждали, что боковой корень целиком возникает сэ перпцикла (TiofJjea, Douliot, 1886, юге ). Вояроо остается нерешенным ко настоящего вретени. Трудности в изучении гистогенеза бокового корня Ткхвенних обусловлены, в частности, тем, что закладка боковых корней происходит в участке главного корня на уровне, где типовые особенности конкретных тканей езе не четко вира^ны ( miitiHg» 1938, Hufiord, 1930; Hai Югу et al.,1970 ). Одйшо рассмотрение гистогепеза ухе заложенных структур облегчает идентификацию тканей материнского корня, прсникангпх участие в формировалпк бокового корня.

Особенности окраештния клеток базальноЗ части зачатка бокового корня огураа, их форма и расположение указиваат на стедяр-ное произхоаденЕе этих клеток. Об этом же свидетельствует формирование из этих клеток сосудистих элементов как в норме, так и поме облученул семян рентгеновским излучением, полностью ингв-биружсц митозы, поэтому базальную часть зачатка называли столярной. В состав стелярной части-зачатка входят"клетки перицикличес-; кого происхождения (расположенные ааикальнее). Клетки корн, расположенные в. области зачатка бокового корня, по своей структуре и окраязваемостя отличаются*от других клеток кора, Эти клетки при-

нлмают участке а формирования зачатка бокового корня, поэтому . апикальную часть зачатка ма называли коровой*

Анализ гистогенеза доказал, что кора материнского корня припишет участие в формирования кори бокового корня. На это, в частности, указывает следующие факты: а) на срезах ваяно, что ряды клеток корн главного корня переходят в ряды клеток коры бокового корня; б) зачатки боковых корней 2-го порядка закладываются недду тканевыми комплексами, развившимися из коровой и стеляриой частей зачатка; в) при снятии коры с главного корня в места выхода бокового оказывается, что кора бокового корня гистогенеютеокя есина о корой главного корня. Клетки коры, имеющие общее Происхождение из клеток коры ¡материнского Корея, дифференцируются по-разному, в зависимости от як положения в зачатке. Апикально расположенные клетки формируют чехликоподобкую структуру - йс^оВый чехлик. Периферические латералъно расположенные клетка формируют •рпзодерму. Впоследствии (через 42-48 ч от начала намачивания семян) клетки перициклического происхождения формируют инициала основных тканей бокового корня а иехлика;

Таким образом» развитый боковой корень состоит из клеток корового (кора и зпвдермио базального учабтка на протяжении 2-7 мм), стелярного {с те ль базального участка) и перицшшгЧйОКо-го происхождения (рис. I). Клетки коры еще до начала, делений вовлекаются в формирование зачатка бокового корня к изменяют направление своей двй^рекнкровки в отличав от других клеток коры тех же рядов, которые ни разу не селятся, а только растягиваются»

1.4. Динамика разложения клеток в развиввщемся зародысиЬсм элчптке бокового корня

Становление тканей бокового корпя происходит очень ЙисТро,

Рис. I. Основные стадия развития зародышевого бокового корня.

Цвфры - гремя от начала накачивания семян (ч). Зазтрихо-ваннне участка - ткаяя, построенные из клеток -стелярного (включая перпшиичеокяе клетка) происхождения. Вертикальная линия -ризодерма материнского корня. Обозначения: м - начало митозов; э - зшсермис (ризодерма) бокового корня; ст - столь; к^ - кора материнского корня; ¡^ ~ коря бокового корня; кл — колумелла; кч ■>- коровий чехлих.

Рис. 2. Изменение доля материнских клеток для разных по счету делений. По оси абсцисс - время от начала намачивания семян (ч). По оси ординат - процент клеток от общего■числа учитываемых в анализе клеточных комплексов, которие ста-■ нут (или уже стали)

матерянскими для I, 2, 3 й т.д. по счету делений, считая от начала делений клеток в зачатке'бокового корня.

фактически за 24-50 ч. Можно предполагать, что это обусловлено, высокой скоростью размножения клеток. Задача данного раздела работы состояла в изучении динамики размножения клеток в развивающемся зачатке. Исследование проводили, определяя число клеток в зачатках в разное время после начала намачивания семян и вычисляя среднее время удвоения числя клеток (Гуд), а также путем подсчета клеток в клеточных ксьялексах и оценки периода между делениями по методу П.Еарлоу £ Влг1о«, 1993). Клеточный комплекс представляет потомство I клетки, поэтому число клеток в комплексах показывает,' сколько раз поделилась материнская клетка комплекса.

Б каждый срок фиксации подсчитывали, какой процент клеток проходит I, 2, 3 и т.д. циклы деления. Результаты расчетов представлены графически ни рис. 2. Из данных следует, что средний промежуток между делениями в период от 16 до 48 ч составляет 6 ч.

Вычисление Туд проводили на основе уравнения -.(Иванов, 1974; ИасЬеой, ТЬоираои, 1979). Расчеты показали, что Туд в период 24-30 ч составляет 8,7 ч, в период 30-35 ч - 3,9 ч и в период 36-42 ч - 2,7 ч. Некоторое расхождение данных, полученных по методу П.Еарлоу и путем расчета Туд, вызвано процессом распада клеточных комплексов.

Результаты исследования показали, что высокая.скорость формирования корней обусловлена высокой скоростью размножения клеток. Подобная закономерность была описана ранее для ранних стадий развития зачатков боковых корней других видов растений (Сейтхожа-ев, 1971; ЫаоЬеоЗ, гЬо=рвоп, 1979; ТЬощреоп, Ивс1.«а<1| 1981, 1983). Изучение нормально протекающего процесса развития боковых корней показывает, что быстрое ветвление осуществляется благодаря: а) имеющимся уже в зародыае семени многоклеточным зачаткам

боковых корней; б) большетлу числу клеток разных тканей материнского корня, вовлеченных в формирование зачатка бокового корня; в) быстро осуществляющемуся процессу становления тканей бокового корня; г) высокой скорости размножения клеток в развивающемся зачатке бокового корня; д) близости закладки зачатков боковых корней к спексу главного корня.

Установленные структурно-физиологические основы ветвления корня позволяют провести сравнительный анализ развития корневой системы у проростков в норме я поело обработки их раствором ДЕЛ.

2. ДЕЙСТВИЕ ДЦП НА РАЗВИТИЕ ЕОКОЖ КОРНЕЙ У ПРОРОСТКОВ ОГУРЩ 2.1. Постоянная инкубация проростков,в раствоцлх ДЕД

Задачей данного раздела работы было проследить за развитием главного и боковых корней проростков, проращиваемых в растворах ДДП, и сравнить их с контрольными проростками и проростками, развквашкухся из облученных семян.

Опыты проводили при концентрациях ДЩ X, 2, 4 и 10 мкг/мд. При концентрациях I, 2 п 4 ыхг/мл проростки отличались по стссенв развития корневой системы. Поэтому было целесообразно все разнообразие частных ответов корней проростков на действие ДЕП свести к обгш типам. Было выявлено, 4 типа проростков, основные признаки которых представлены в таблице I.

С увеличением концентрации возрастала доля проростков о наибольшей степенью подавления развития корневой системы (проростков типа X). 4 мкг/ил (1,3'Ю-5 М) - минимальная концентрация ДЩ, вызывающая^максимальное подавление образования боковых корней. Поэтому данная концентрация была выбрана в качестве основной рабочей концентрации ■ в последующих экспериментах.

Таблица I

Тили ингкбирования ветвления корил проростков огурца, выращиваемых на растворах ДЕЛ I, 2, 4, 10 мкг/мл

Представлены значения среднего процента проростков для трех опытов С Р * *»р }

Типы пророст-кол

I - - - 19,2*5,5 45,1*6*9 $6,6*2,3 100,0*0,0

2 - - 7,7-3,7 21,6*5,8 014*2,3 0,0*0,0

3 + - Э,6±4,1 15,7*5,1 0,0*0,0 0,0*0,0

4 * * 63,4±6,7 17,6*5,3 0,0*0,0 0,0*0,0

Чем вызывается ингкбцрование выхода боковых корней на поверхность материнского корня при действии ДШ? Могут ли зачатки боковых корней выйти из тканей материнского 'коряя при полном подавлении делений? Результаты показали, что если подавить клеточные деления рентгеновским излучением, то боковые корни не возникают у 100* проростков. Это доказывает, что зародышевые боковые корни не могут выйти на поверхность материнского корня за счет растяжения клеток зачатков боковых корней и что Для дх выхода необходимо размножение клеток. Следовательно, вполне вероятно, что кнгвЗвро-ванпе ветвления корня при действии ДЦП происходит за счет подавления митозов» Это предположение подтвердилосьходе дальнейшего исследования (см. раздел 2,6.).

Таккм образом, установлено, что: I) ийгябкрованпе ветвления корня представляет соСоЯ простую, легко и быстро выявляющуюся качественную реакцию проростков на воздействие ДДП, в основе ко-

Признаки Концентрация ДШ (миг/мл)

Рост ¡Наличие .'Наличие ГЛавного:зароды-^е потто' корня ва:кевых ,:залояен-3-11 :боковых:них До-сутхк :корней ;ковых : :корней * 9 * I : 2 { 4 | 10 : 1 ! : 1 1 : с 1

тороЯ лозин подавление мятозов; 2) соотношение проростков выявленных типов свидетельствует о степени выраженности цктостати-ческого доЗствся разных концентраций ДНИ; 3) ДЙЛ почта подлостьи останавливает возникновение боковых корней при очень низкой концентрации (4 мкг/мя), что свидетельствует о ее крайне высокой биологической активности.

2.2. Действие ДЕЛ щш инкубации семян и проростков в разные периоды на протяжения первых суток

Задача данного раздела работы состояла в том, чтобы выяснить, как вдгибируется ветвление корня, если ДДД давать не постоянно, а в разные периоды иа протяжении первых суток.

При обработке семян до начала митозов формирование боковых корней ингябируется не полностью, в период начала митозов (18-24 ч от начала намачивания семян) проростки наиболее чувствительны к обработке Д1Ш. Бели ДШ давать только в этот период, то у 100£ пророотков боковые корни не возникают, что свидетельствует о необратимом характере действия ДШ. ДШ проникает к ткшшм эародыга не только в период прорастаяия оеиян, но и в сервиз часы намачивания семян (0-6 ч), т.к. у части проростков боковые корни не возникают.

Следовательно, степень ингкбирования формирования боковых корней зависит от периода и продолжительности их обработки ДШ1.

2.3. Сглвненпя глгдб крупного -о йот пул ДЩ1. дпппсмой по тдаличпоЯ^схема нп протяженпи первых суток

Обработка ДЛИ 4 мкг/мл, проводимая только в период 10-24 ч полностью ияг&бирует развитие корневой системы проростков в то время как при постоянной инкубации проростков в период 0-24 ч боковые корни впоследствии формируются.

Полно дать несколько возможных объяснений атому факту. Во-первнх, на протяжения:24 ч может меняться биологическая активность раствора ДДД. Однако изучение показало, что даже на протяжении трех суток биологическая активность ДШ, оцениваемая по критерии подавления ветвления корня, не игеняется. Во-втор:ос, к моменту введения препарата Ск 16 ч) клетки.зародызового корпя более метаболически активны по сравнению с клеткам, солучавгимя ДЕЛ от начала намачивания семян. Можно предполагать, что ДЭ1 сильнее кнгибирует более метаболически активные клетки.3-третык, в клетках могут происходить инактивация ЛЯП, либо репарация повреждений ДНК. Проверяя последнее предположение, оставляла проростка до II суток в чеежах Петри. Оказалось, при введении ДСП & период 16-24 ч у 14,4^4,05? проростков возникали боковые корпи, тогда как на 3-4 сутки у 100£ проростков боковые корни но образуются. Эти данные позволяют предполагать,' что в клетках зачатков боковых корней поело обработки ДЭД мойат происходить репарация поврежденной Д1К, что согласуется о некоторыми лдтературяцмк данными, полученными на других объектах.

2.4. Проростки огурца как тест-об^с'кт для обноружания пктостатпкоп

Из раздела 2.1. было видно, что ДДП ингибвруат ветвление корня за счет подавления размножения клеток, Сопоставленгэ ипги-бврования ветвленея корня ДДП.и ее транс-аналога показывает, что' действие ДДП является высоко специфическим, т.к. даже раствор траяс-ДЦП 100 шег/мл полностью не останавливает возникновение боковых корней. В связи с этим представлялось,необходимым сопоставить действие иных цитостатиков.и иеспецифячески действующих . ■веществ на ветвление корня.Эта задача решалась совместно с

В.Б. Ивановым в Е.И. Быстровой (Иванов с соавт., 1985)* Било изучено действие на проростки огурца окаю 100 различиих соединений. Среди них - аналоги ДЕЛ, антибиотики, аналоги пуринов о пиримядинов, гядраэид малеиновой кислоты, соли тяжелых и селоч-ных металлов и другие. Установлено, что при вирааиваиии проростков в растворах неспеци£ачаск:т действующих весеств образование боковых корней не останавливается даяе при более сильном, чем в растворах цитостатякОй, "ингкОяровании роста главного ::орня. Боковые корни возникали, 1тпр|»!ер, при действии таксис сильных ядов, как нви'д, ^¿¿о^, с4(П0д)2* Следовательно, возникновение боковых корНёй является крайне устойчивым процессом, остановка которого происходит только ври действии избирательных ингибиторов иятозов. В связи с отим проростки огурца представляет собой удобный тост-объект для поиска эффективных цитостатшеов. Данный тест позволяет проводить 1« скрининг быстро и с ыаяым расходом веществ.

2.5.^Анп?омическое и цитологическое исследование развития главного и бокорых корней при д^йдгрки £ДП

Остановка в развитии зародышевых зачатков Соковых корней и ингибирование роста главного корня происходят за счет сильного подавления размножения клеток. ДДД нарушает нормальную отруктуру зачатка бокового корня. В обработанных ДШ корнях изменяются полярность роста и деления клеток зачатка бокового корня. Это приводит в некоторых случаях к «формированию каллясоподобной клеточной кассы. ДЕЦ1 нарушает согласованность процессов роста и деления клеток, что приводит к межклеточным разрывам.

Оказалось, что ДШ не влияет на некоторые процессы развития зачатков боковых корней. При действии ДД1 в формирование зачатка

бокового корня, как и в контрольных проростках, вовлекается 5 рлдоз ::леток коры. Подобная же картина наблвдается в корнях проростков и после облучения семян. Ряд других процессов такте происходят без заметных изменения. Среди них такие процессы, как формирование корневых волосков, пятки, дкфференцировкя клеток сосудистых элементов стелярноЯ части зачатка бокового корня, формирование амилопластов в клетках корового чехлика; Этк факты означает, что дгщ но нарушает те процессы жизнедеятельности клеток, нормальное протекание которых не зависит от размножения клеток.

Анатомическая и цитологическая картина подавления развития зачатка бокового корня и апекса главного корня- при длительной , (до IX суток) инкубации проростков »'растворе ДШ и при введении ДЛИ в период 18-24 ч отличались незначительно, что свидетельствует о необратимом характере действия ДШ.- *

■ Б. Действие ДцП на процесса размножения клеток

Возможность использования анализа клеточных комплексов при изучении процессов размножения клеток является важнии достоинством корня как объекта изучения действия цитостатяков на деление клеток. Такой подход позволяет ¡давить различия в реакция отдельных клеток на воздействие препарата.

В зачатках боковых корней клеточные"комплексы, содержание больше 4-х клеток, практически не встречались, то ость клетки делились не более 1-2 раз,' Часть клеток в/отдельных зачатках яа протяжения всего опыта (до II суток) ни разу ке делилась. Анализ-данных, представленных;яа рис.-3;.показывает..что образование , клеток при действии Л^ екпьно иягибировалось' независимо'от того;1 присутствовала ли ЛЛД в растворег постоянно или**вводилась- только ■ с 18 по 24 ч. Даже .через* II 'суток'; число клеток;на срезе- возрас— V

но tw ыо

ISO

see no, ж во

юо *».

x «

M

* I 1 «

I i ! t-

""a"7i "HI "Ж

Рко, 3. Число клеток в зачатках боковых коркеtt. По оси абсцисс - время от начала намачивания семян (ч). По оси ординат - чисд" клеток на срединном срезе <Зазаяыюго зачатка бокового корня. Обозначения: • - постоянная инкубация в растворе ЛЕД (4 мкг/мл); tt - Енкубация fi растворе ДШ1 (4 мкг/кл) с 18 по 24 ч от начала немачквпния семян; х - проростки, развивающиеся из семян, облученных в дозе 6000 Гр в выращиваемых ita йоде. Горизонтальная линия - примятое походное число клеток на срезе зачатка бокового корня до начала клеточных делений.

МП П. %*•

9, S. 1. в

3 *

5

г i

MJ

за

в *» » *а

M

M

"S*.

rz sac

Рис. 4. Митотичес-кая активность в зачатках боковых корней в контроле а при постоянной инкубации в растворе ДСП (4 мкг/мл). А. МатотическиЯ индекс ti.Hl>. По оси ординат - ыитотпче-ский индекс.

- раствор ДШ.

Обозначения: ft - контроль; Р ± юр ■ ■

£> 1!кГи<5ярование мятотическоЛ активности в зачатках боковых корней по откошена» к контролю (я).

тало не более чем в 4 раза. Митотлчеекий индекс при обработке ДДИ значительно ниже, чем в контроле, к 3 (уткам мятотическая активность затухает (рис. 4).

Таким образом, при действии ДЦЯ у частя зачатков деление клеток не происходит; б тех же зачатках, в которых деления идут, делится лишь часть клеток. Эти наблюдения свидетельствуют о гетерогенности реакции разных зачатков и разных клеток одного зачатка

яа воздействие ДШ. Подобное явление гетерогенности было описано

[

в работе индийских исследователей ( Dutta et nl., 1932), который изучали действие ДЕЛ на брюхоресничяую инфузории.

2.7.Влияние ДЩ на рост клеток

Ухе в первых работах по изучению биологического действия ДШ было установлено, что ДЕЛ в меньшей степени ингсбируст реет клеток, чем процесс деления, так как этот препарат вызывает образование нитевидных форм Escherichia coli, а также гигантских клеток у животных (Rosenberg et al., 19651 Harder, Itooenberg, 1970J Howie, Qalo, 1970).

Нами было изучено действие ДШ на рост меристематичсских клеток и на рост клеток растяжением. Выло выяснено, что ДЕД но подавляет рост клеток коры зародышевого корня, которые в ходе прорастания растягиваются, но не делятся (рис, 5). Прп постоял-' ной инкубации проростков в растворе ДЭЗ (4 мнг/мл) средний размер клеток зачатков боковых корней возрастает в интервале 18-24 ч (Р < 0,01). Ыенду 24 и 72 ч размер клеток не меняется . (Р>0,05). Через II суток клетки стеляряой части зачатков в среднем на 60% больше,-чем через 72 ч. Если бы клетки не делались и росли с той же скоростью, с какой растут меристематичес-кие клетки, то их размер, удваивался бы в'среднем каждые.5 часов.-

Однако измерения помазали, что такой скорости не наблюдается, так как размер клеток практически не меняется с 24 по 72 ч, а впоследствии на протяжении 7 суток возрастает л иль в 1,7 раза. Эти факты свидетельствуют о том, что ДДП пнгябирует рост керис-тематическпх клеток.

Различие в действии Д2П на рост керистематических и растягивающихся клеток обусловлено, по-видимому, тем, что ингибирует-сл деление клеток и нарушается нормальное взаимоотношение роста в деления клеток. Рентгеновское облучение в такой же,степени как и ДЛИ подавляет рост керистенатическях клеток. Таким образом, ингабпроводив ДПЛ роста меркстематичесшэс клеток есть следствие иарукения согласованности процессов роста и деления клеток.

" мкм

190 150-

ца со. М

га и за

1 4

4 }

Рио. 5. Длина клеток коры

базолъной части главного корня огурца <2-3 ряд от ризодермы) при различных вариантах опыта. Х^рз.

Обозначения: • - вода; х - . проростки, развквашисся аз семян, облученных рентгеновскими лучами в дозе 5000 Гр, вода; А. - постоянная инкубация проростков от начала * щи намачивания семян в раство-

ло ' 4а Т1 гГ* Г5г~ ?е ДЕД мкг/мл); ф - то

же для проростков, развивающихся из семшг, облученных

рентгеновокккл лучами в дозе 2500 Гр.

20 БЫВОДЫ

1. Б зародышевом корна сухого семени огурца обнаружено 12-20 сформированных зачатков боковых корней, в формировании которых участвовали клетка коры.(включая эндодерму) и клетки стели (включая перицикл) зародышевого корня,

2. В ходе набухания семян до начала клеточных делений продолжается постепенное вовлечение-клеток коры зародызевого (главного) корня в формирование зачатка бокового корня, что сопровождается изменение« программы их развития.

3. После возобновления клеточных делений начинается гистогенез зародюавого бокового корня,, протекающий в два этапа. На . первом этапе клетки зачатка, имеющие коровое происхождение, формируют кору, ризодерму и временный чехлик бокового корня. Из клеток зачатка, имеющих стелярное происхожденкс, развиваются проводящие ткани, связывмсае стель бокового и главного корня. На втором этапе из клеток, гаещих перщиклэтссксо происхождение, возникают днкцпаля основних тканей бокового корня н чехлика.

4. Быстрое формирование зародышевого бокового корня (за 24-30 ч) осуществляется благодаря высоксчу темпу деления клеток зачатка, в котором до появления бокового корня проходит 5-6 циклов деления. . • ■ -

5. Высокая скорость формирования корневой систему проростков огурца обеспечивается существованием латентной зародцеевой ' корневой системы, как совокупности-зародазевых зачатяов главного и боковых корней, участием в формировании.зачатков большого числа ^ клеток разных тканей, а также высокой скоростью размножения клеток в ходе развития бокового^корня;.

6. В связи с высокой скоростью-ветвления корня проростки-

огурда можно использовать о качестве удойного тест-объекта для по&ока оФФектинцх цитостатиков. Главный критерий их отбора -ингибирование возникновения боковых корней.

7. Цис-дгхлородианмш! платина (II) (ДЩ) как сильный цкто-статик полностью и необратимо подавляет ветвление корня при минимальной концентрации 1,3*Ю-5 М, ингкбируя размножение клеток зародышевых зачатков боковых корней. В корнях, обработанных ДШ, клетки или на разу не делятся или делится только част» клеток и но более 1-2 раз,

' 8. ДШ изменяет полярность клеточных делений и направленна роста клеток зачатка бокового корня.

9. ДЕЛ ингибярует те процеоси, которые зависят от размножения клеток, и не затрагивает процессы, протекающие независимо от делений, например, вовлечение клеток коры я формирование зачатка, дефференцеровка сосудистых элементов, формирование корневых волосков.

10.. ДДП-jHe ингибярует рост клеток растяжением, по подавляет рост керистематических клеток. ,

II. ДШ можно рекомендовать для изучения морфогенеза растений как. средство, позволяли« "выключать" клеточные деления к следить за дальне&гей судьбой клоток органа.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Иванов В.Е., Еистрова Е.И., Дубровский И.Г. Проростки огурца как тест-объект для обнаружения эффективных цитостатиков // Физиология растений, - 1986. - Т.33, вш.1. - 0.195-199.

2, Дубровской Я.Г. Некоторые аспекты механизма биологического действия цко-дихлородиаммин платина (II) // Всесоюзная конференция молодых ученых.по физиологии растительной клетки:

тезисы докладов. - М.: АН СССР, 1966. - С.28.

3. Дубровский И,Г. Происхождение тканей зародышевого бокового корня 01трца, ыежтканевые взаимодействия и позиционный контроль в его развитии // Онтогенез. — 1986. — Т. 17, 12.-

С. 176-189.

4. Дубровский И.Г. Динамика размножения клеток и клеточные комплексы (клеточные пакеты) в развивающемся зародышевом боковом корне огурца // Онтогенез. - 1986. - Т.17, Й 5. - С.525-534.

Л 61690 28/ХГ—86 г. Объем I '/г п. л. Заказ 3319. Тяраж 100

Типография Московской с.-х. академии нм. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44