Биотехнологические приемы расширения исходного материала для селекции люпина

Костюченко, Дина Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнологические приемы расширения исходного материала для селекции люпина
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические приемы расширения исходного материала для селекции люпина"

На правах рукописи

КОСТЮЧЕНКО ДИНА АЛЕКСЕЕВНА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ РАСШИРЕНИЯ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЛЮПИНА

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Орел - 2004

Работа выполнена в отделе физиологии и биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института люпина; в лаборатории кафедры лесных культур и почвоведения Брянской государственной инженерно-технологической академии

Научный руководитель

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Лихачев Борис Степанович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Павловская Ниналь Ефимовна

кандидат биологических наук Голышкин Леонид Викторович

Ведущая организация

Орловский государственный университет

Защита состоится « » ьШХЛ_2004г. в N на заседании

диссертационного совета КМ 220.052.01 при Орловском государственном аграрном университете по адресу: 302019, г.Орел, ул. Генерала Родина, 69 Орел ГАУ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Орел ГАУ: г. Орел, Бульвар Победы, 19

Просим принять участие в работе совета или прислать отзыв в двух экземплярах, заверенных печатью

Автореферат разослан

« % » рп/га А л

2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Макеева Т.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Повышению результативности селекционного процесса должно способствовать совершенствование его технологии. В этом плане большое значение имеет качественно новое изучение генофонда культурных растений, направленное на выявление генетических источников и доноров селектируемых признаков. Для этого необходимо расширение исследований по всем направлениям, имеющим отношение к селекции, и особенно по частной генетике и биотехнологии, как в целях создания нового исходного материала, так и для выявления морфологических, физиологических, биохимических и т.д. маркеров селектируемых признаков.

В этой связи нами проведены исследования возможностей использования биотехнологических приемов в расширении генофонда исходного материала люпина - культуры, обладающей огромным биологическим и экономическим потенциалом.

Новые разработки, в которых используются культуры клеток и тканей, а также методы генной инженерии значительно сокращают затраты времени и труда на создание новых исходных форм для селекции. Техника рекомбинантных ДНК и ее последовательное применение в селекции растений способствует преодолению барьеров, препятствующих межвидовому скрещиванию, что особенно актуально для люпина. Она позволяет увеличить генетическое разнообразие, которое существенно пострадало из-за широкого распространения ограниченного числа высокопродуктивных сортов.

Быстрое внедрение нового сорта в практику сдерживается невозможностью получения большого количества семян или посадочного материала для вегетативного размножения в течение одного сезона. Это препятствие устраняется с помощью биотехнологии, которая предлагает селекционерам эффективный и быстрый метод микроразмножения растений.

Цель работы - изучить способность разных видов люпина к клональному микроразмножению и генетической трансформации.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

- оценить разные органы растений люпина по способности к каллусообразованию и регенерации;

- изучить морфо- и ризогенез в разных условиях культивирования;

- экспериментально подобрать наиболее эффективные питательные среды для клоналыюго размножения разных видов люпина;

- установить возможность использования культуры незрелых зародышей в сохранении ценных генотипов люпина;

- получить растения-регенеранты из различных органов люпина; отработать методику генетической трансформации клеток люпина с помощью агробактерий. Г^ПГлЦИОНЛЛЬНАЯ |

I библиотека I

Научная новизна. Выявлены особенности пролиферации верхушечных и пазушных почек при культивировании in vitro 16 перспективных сортов и сортообразцов желтого, 10 сортов узколистного, 4 сортов белого, а также многолистного люпина. Установлена зависимость умножения и развития побегов от количественного состава среды, содержания гормонов и режима пассирования. Определены наиболее эффективные среды для корнеобразования разных видов люпина. Предложены схемы для регенерации растений из незрелых зародышей желтого, узколистного и белого люпина. Впервые получена каллусная ткань узколистного люпина, трансформированная с помощью Agrobacterium tumefaciens и приобретшая в результате трансформации устойчивость к канамидину.

Практическая значимость результатов исследования. Предложены схемы регенерации растений из незрелых зародышей узколистного, желтого и белого люпина. Разработаны условия для этапа адаптации растений-регенерантов к культивированию ш vivo. Доказана возможность использования методов генетической трансформации тканей люпина с помощью агробактерий при создании принципиально нового исходного материала. Часть полученных регенерантов узколистного (АТ-Д-2-Г71) и желтого люпина (Искорость) используется в селекционных программах.

Обоснованность выводов и достоверность результатов исследований подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, собранного и обработанного с использованием современных методов исследований и ЭВМ, получением из каллусов растений-регенерантов и генетически измененных форм, использованием их в селекционных программах.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Видовая и сортовая специфичность реакции люпина на разные питательные среды и другие условия культивирования in vitro.

2. Схемы и условия клонального микроразмножения разных видов люпина.

3. Эффективность корнеобразования и адаптации к естественным условиям культивируемых видов люпина.

4. Способность люпина к генетической трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens

Личный вклад автора. Разработка программы и методики исследований, получение, обработка, анализ и обобщение экспериментального материала, формулирование общих выводов по результатам выполненной работы, подготовка докладов и статей, оформление диссертации выполнены самостоятельно.

Апробация результатов НИР. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались ежегодно на Ученом совете Всероссийского научно-исследовательского института люпина (1989-1995 гг.), научно-практической конференции "Ускорение научно-технического процесса в агропромышленном комплексе Брянской области" (Брянск, 1992), межрегиональной научно-практической конференции «Биологический и экономический потенциал люпина и пути его реализации» (Брянск, 1997), Саввичевских научных чтениях (Брянск: БГСХА, 2003, 2004), на научной конференции «Вклад ученых и специалистов в национальную экономику» (Брянск: БГИТА, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников и приложений. Она иллюстрирована 29 таблицами, 22 рисунками, список использованных источников включает 216 наименований, в том числе 133 на иностранных языках..

Объекты исследований. Объектами исследований являлись верхушечные и пазушные почки, незрелые зародыши, проростки, каллусные ткани видов люпина: желтого (Lupinus Iuteus), узколистного (L. angustifolius), белого (L. albus) и многолистного (L. polyphillus).

Методы исследований. Для работы с культурой ткани использовали модифицированную методику Р.Г.Бутенко (1964).

Семена подвергались поверхностной стерилизации: 20 мин в 96% этаноле, 15 мин в 0,1% растворе диацида с последующей пятикратной отмывкой стерильной водой. Стерильные проростки получали, высевая стерильные семена на "голодный" агар 0,8%. Для стерилизации тканей вегетирующих растений (зародышей, проростков, полученных из нестерильных семян, использовали метод, предложенный фирмой "Колбиохим-Беринг" (Fitter, Krikorian, 1982).

Используемые питательные среды: Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962); Гамборга В5 (Gamborg, Miller.Ojima, 1968); Линсмайера-Скуга (Sroga, 1983); Смирнова (Смирнов, 1970); Нича (Kyte, 1988); Хеллера (Kyte, 1988); Торри (Rundolf, Kocks, 1985).

Штаммы Agrobacterium tumefaciens А277, А281, А348, 1Д1, С58 и А. rhizogenes A8196, 15834 и A4b выращивали в жидкой питательной среде LB (Zhan X. et al., 1988) или на чашках Петри. Препарат плазмиды pBLHL3A, несущей ген запасного белка ячменя - гордеина и маркерный ген устойчивости к канамицину, был любезно предоставлен институтом Общей генетики РАН. Для дальнейших исследований плазмиду трансформировали в штамм Escherichia coli HB 101 и затем выделяли в препаративных количествах по методикам, описанным Р. Дэвисом (1984). По этим же методикам проводили трансформацию A. tumefaciens А281.

Трансформация каллусных клеток люпина агробактериями проводилась кокультивированием на агаризованной среде, отбор трансформантов вели на среде, содержащей антибиотик ампициллин (цефотаксим).

Статистическая обработка. Опыты проводили в трехкратной повторности. Полученные данные после статистической обработки представили в виде М ± т, где М - математическое ожидание, am- стандартная ошибка среднего (Снедекор, 1961; Доспехов, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Культура верхушечных и пазушных почек

Пролиферация верхушечных и пазушных меристем. Наши

предварительные исследования и анализ литературных данных указывают, что умножение побегов на одном экспланте люпина требует богатых по составу питательных сред, таких как MS и В5. При этом подтверждена видовая специфичность в реакции эксплантов на условия культивирования in vitro. В литературных источниках наиболее пригодные среды для клонального микроразмножения возделываемых видов люпина очень сильно варьируют по составу гормонов. Исходя из этого, в первых опытах было оценено влияние изменения в составе питательных сред содержания минерального азота, сахарозы и гормонов на коэффициент умножения побегов (табл. 1).

Таблица 1

Состав питательной среды и число побегов на одном экспланте из почки многолистного люпина

Среда MS Вариант

1 2 3 4 5

Сахароза, г/л 10 20 30 40 50

NH4NO3, мг/л 206 412 825 1650 3300

KNO3, мг/л 118 237 475 950 1900

БАП, мг/л 0 0,5 1,0 1,5 2,0

ИУК, мг/л 0 0,01 0,04 0,15 0,4

Число побегов 1,0 2,7 ± 0,3 2,9 ± 0,6 3,0 ±0,3 4,0 ± 0,6

Хотя, на первый взгляд, увеличение концентрации компонентов среды сопровождается повышением коэффициента умножения побегов, это увеличение непропорционально. Математическая обработка соотношения изучаемых компонентов и числа полученных побегов позволяет заключить, что оптимальной является питательная среда со вторым уровнем компонентов.

Высокий уровень содержания всех исследуемых компонентов в питательной среде (варианты 4 и 5) приводит к появлению бурно развивающейся каллусной ткани у основания побегов, а также к витрификации побегов, особенно в последнем варианте.

Клональное микроразмножение узколистного люпина исследовано на верхушечных и пазушных почках 7-8 дневных проростков сорта Брянский 123 (табл. 2).

Таблица 2

Состав питательной среды и число побегов узколистного люпина Брянский 123 на одном экспланте верхушечной и пазушной почки_

Среда Вариант

МБ 1 2 3 4 5

Сахароза г/л 5 10 15 20 30

N^N0,, мг/л 206 412 825 1650 3300

КЫОз, мг/л 118 237 475 950 1900

БАП мг/л 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0

ИУК мг/л 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2

Среднее 2,0 ± 0,9 2,9 ± 0,4 3,6 ± 0,3 2,8 ± 0,4 3,5 ± 0,68

Изучение соотношения числа индуцированных побегов и концентраций компонентов питательной среды показало, что оптимальными для размножения узколистного люпина являются: сахароза в концентрации 15г/л; минеральный азот в половинной норме от МБ, БАП 1мг/л и ИУК 0,1мг/л, что соответствует 3 уровню.

Для определения оптимального состава питательной среды для клонального микроразмножения желтого и белого люпина нами проведена серия опытов с разными питательными средами и опыты по исследованию богатых по составу сред, для которых применяли кратное снижение концентраций основных макро- и микроэлементов. Отработка метода проведена на сортах люпина желтого — Брянский 6 и белого - Козелецкий. Концентрацию гормонов рассчитывали с учетом опытов на узколистном и многолистном • люпине. Основные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Микроразмножение желтого и белого люпина на разбавленных питательных средах

Концентрация гормонов, мг/л Соотношение эксплант/побеги и коэффициент умножения

Брянский 6 Козелецкий

МБП) + БАП 0,5+ ИУК 0,05 24/88 3,7 24/57 2,4

МБ(2) + БАП 0,5+ИУК 0,05 24/86 3,6 24/61 2,5

В5(1) +БАП 0,5+ ИУК 0,05 24/69 2,9 24/79 3,3

В5(2) + БАП 0,5+ИУК 0,05 24/66 2,8 24/84 3,5

Примечание: 1) - питательные среды МС и В5 разводили в 2 раза;

2) в 4 раза снижали концентрацию макроэлементов и в 2 раза - концентрацию

микроэлементов.

Как видно из данных таблицы 3, пролиферация побегов желтого и белого люпина находится на уровне и даже несколько превышает результаты, полученные на узколистном и многолистном люпине. Снижение концентрации макро- и микроэлементов в питательной среде благоприятно сказывается на процессах пролиферации верхушечных и пазушных меристем желтого и белого

люпина. Необходимо отметить что белый люпин явно «предпочитает» среду 1 амборга В5 и более разбавленный вариант, а на среде MS в ряде случаев наблюдается образование каллуса.

На эксплантах желтого люпина не только увеличивалось число адвентивных почек, из которых в дальнейшем развиваются побеги, но и побеги росли быстрее, не наблюдалось признаков витрификации. На верхушечных и пазушных почках проростков желтого люпина сортов Брянский 6 и Жемчуг в предварительных опытах установлено, что на разбавленных средах MS повышение содержания гормонов в 2 раза увеличивает выход регенерантов без признаков витрификации.

В таблице 4 представлены результаты определения регенерационной способности различных генотипов желтого люпина в условиях in vitro.

Таблица 4

___Клональное микроразмножение желтого люпина_

Соотношение эксплант/ побеги и

Сорт коэффициент умножения на среде

(сортообразец) MS/2+БАП 0.5+ MS/2+БАП 1+ИУК0.1

ИУК 0,05

Кастрычник 24/93 3,9 24/105 4,4

С.Н 122/90 С.Н. 81/90 24/84 3.5 24/93 3,9

24/79 3,3 24/84 3.5

Ж1777 24/96 4,0 24/106 4,4

' WTD585 24/77 3,2 24/84 3.5

Жемчуг 24/108 4,5 24/112 4,7

ВБ 1717 24/100 4,2 24/108 4,5

Искорость 24/232 9.7 24/264 11,0

1 Цит 24/124 5,2 24/144 6,0

1 Афус 24/93 3,9 24/103 4,3

! Мутант 273 24403 4,3 24/120 5,0

' Гриф 24/96 4,0 24/100 4,2

Флорида 24/79 j.J 24/91 3,8

Брянский 6 С.Н. 118/90 24/88 24/91 3,7 24/117 ■ 4,9 ,

3,8 24/103 4,3

• С.Н.167/91 24/93 3,9 24/108 4,5

Примечание: концентрация гормонов приведена в мг/л.

Как видно из таблицы, значение коэффициента умножения варьирует от 3,2 до 9,7 в первом опыте и от 3,5 до 11,0 в опыте с увеличенным содержанием гормонов.

Из изученных сортов и сортообразцов по способности индуцировать многочисленные побеги выделился сорт Искорость (в отдельных случаях получали до 15-17 побегов на экспланте). Сорта и сортообразцы желтого люпина, показавшие более высокую интенсивность пролиферации побегов, характеризуются раннеспелостью, а сорт Искорость относится к ультраранним

формам. Позднеспелый WTD 585 показывает наименьшую степень умножения побегов в течение первых недель культивирования in vitro. Анализируя полученные нами данные, можно предположить, что одним из факторов, влияющих на способность к органогенезу, является скороспелость.

Оптимизированная для узколистного люпина питательная среда (вариант 3, табл.2) применялась для изучения клонального микроразмножения различных генотипов Ь. ап£шШЪЦш„ Кроме того, исследовано влияние удвоенного содержания гормонов на разбавленной среде (табл. 5)

Таблица 5

Сорт Соотношение зксплант/ побеги и коэффициент умножения на среде

MS/2+БАП 1+ИУК 0,1 MS/2+БАП 2+ИУК 0,2

Данко 24/67 2,8 24/71 3,0

Узколистный 109 24/92 3,8 24/98 4,1

Ладный 24/84 3,5 24/96 4,0

Сидерат 892 24/106 4,4 24/127 5,3

Першацвет 24/96 4,0 24/108- 4,5

Добрыня 320 24/93 3,9 24/100 4,2

Ащадный 24/91 3,8 24/101 4,2

Миртан 24/84 3,5 24/90 3,8

Митан. 24/81 3,4 24/88 3,7

Брянский 123 24/86- 3,6 24/97 4,1

Примечание: концентрация гормонов приведена в мг/л.

Анализируя данные таблицы 5, можно отметить более выровненные значения микроразмножения узколистного люпина. И хотя в пределах одного сорта наблюдалась гетерогенность по степени умножения побегов, средний коэффициент в зависимости от сорта варьирует от 2,8 до 4,4 в первом опыте и от 3,0 до 5,3 - во втором, при повышенном содержании гормонов.

Небольшой набор образцов белого люпина в исследованиях объясняется тем, что по своим характеристикам этот вид люпина характерен для более южных районов. В Брянской области посевы белого люпина ограниченны в связи с его позднеспелостью. В последнее время ведется работа по созданию и районированию скороспелых и устойчивых сортов белого люпина. В наших исследованиях использовались семена как известных, устойчивых сортов, так и новых сортообразцов белого люпина (табл. 6).

Таблица 6

Микроразмножение белого люпина

Сорт (сортообразец) Соотношение эксплант/побеги и коэффициент умножения на среде

MS(2)+BAn 0,5+ИУК 0,05 В5(2) +БАП 0, 5+ИУК 0,05

Козелецкий 24/61 2,6 24/83 3,5

Старт 24/45 1,9 24/69 2,9

№72 24/89 3,7 24/95 4,0

№73 24/74 3,1 24/81 3,4

Примечание: (2) в 4 раза снижали концентрацию макроэлементов и в 2 раза - концентрацию микроэлементов; концентрация гормонов приведена в мг/л.

Как свидетельствуют данные таблицы 6, пролиферация побегов на разбавленной среде В5 заметно выше, чем на среде MS.

При проверке влияния других гормонов роста, таких как гибберелловая кислота, оказалось, что на средах МS+БАП2+ГК0,2 у узколистного (Брянского 165) и многолистного люпина через каллус начали развиваться многочисленные побеги, которые после разделения и пересаживания на среды MS/2-б/г +уголь показали укоренение с хорошей частотой (около 60 % побегов дали корни через 4 недели, еще 20% - в течение последующих 4 недель), однако еще через 4 недели более 20% укорененных побегов выбросили цветочную кисть. По мнению Аль-Атаби и Поуэра (Al-Atabee J.S., Power J.В.,1990) гиббереллину принадлежит ключевая роль в снижении витрификации и стимуляции зацветания.

Оптимизация метода укоренения побегов. С довольно низкой частотой -примерно 20-25% - побеги образуют корни на безгормональных средах, и только добавление определенных ауксинов приводит к повышению частоты корнеобразования. В той или иной мере все ауксины могут индуцировать ризогенез. На белом люпине в первых опытах было получено укорененное растение-регенерант из пазушной почки при введении в питательную среду 2,4-Д. Единичные примеры можно получить и с НУК. Но в основном эти два ауксина приводят к образованию каллусных «пяток» у основания побегов.

Нами была определена степень воздействия разных ауксинов на укоренение побегов люпина, на разбавленной питательной среде MS. Первые опыты показали, что индолилмасляная кислота (ИМК) уже в таких низких концентрациях, как 0,02 мг/л, оказывает положительный эффект, но максимум достигается при концентрации 1 мг/л. При этой концентрации было проведено сравнительное исследование влияния трех ауксинов - индолилуксусной (ИУК), итаконовой кислоты (ИТАК) и ИМК на эффективность корнеобразования трех видов люпина (рис. 1).

Как видно из диаграммы, ИМК оказывает наибольший ризогенный эффект на всех трех видах люпина, хотя на узколистном различия более заметны. Для белого люпина различия в действии трех ауксинов несущественны.

Брянский 123 Брянский 6 Коэелецкий Узколистный Желтый Белый

Рис. 1. Влияние ИМК, ИТАК и ИУК на степень укоренения побегов трех видов люпина

Адаптация к естественным почвенным условиям Следует отметить, что несколько регенерантов узколистного люпина Ащадный и сортообразца ВБ-1717 зацвели в пробирках. В открытый грунт они высаживались имея цветки, в основном по одному на растении, которые в скором времени образовывали боб. Семена в этих бобах были недоразвитыми, щуплыми, с зеленым оттенком. В других бобах этих растений, сформировавшихся позже, семена соответствовали норме.

В полевых условиях продуктивность растений-регенерантов узколистного люпина Брянский 123 и желтого - Искорость, полученных in vitro из верхушечных и пазушных меристем, в целом не превышала уровня исходной формы. Однако среди регенерантов сорта Искорость было отобрано 4 растения, превосходящих исходную форму. Анализ продуктивности этих регенерантов показал, что по количеству бобов на растении и массы семян отдельные растения превышают исходные формы более чем в 2 раза, а количество семян одного растения-регенеранта примерно в 1,5 раза выше.

В условиях сильной вирусной инфекции узколистного люпина (1996г.) регенеранты Ащадный и Митан проявили повышенную устойчивость к заболеванию, собранные семена использованы в дальнейшем селекционном процессе.

Из верхушечной почки узколистного люпина коллекционного образца К-402 (АТ-Д-2-Г/1) было регенерировано полноценное растение. Его жизненный цикл (от вычленения верхушечной почки до созревания семян) составил более 11 месяцев. Для регенеранта АТ-Д-2-Г/1 наблюдался необычно высокий уровень завязываемости бобов - 202 боба, в фазу созревания убрано 123 боба. Общая масса зрелых семян составила 47,0 г. Собранные семена были использованы для получения урожая следующих поколений и для изучения электрофоретических

спектров белков. Электрофоретический анализ белков различных регенерантов выявил определенную гетерогенность регенерированных растений.

Культура незрелых зародышей

На питательных средах, различных по составу минеральных компонентов и гормонов, нами изучен характер направленности процесса регенерации незрелых зародышей 3-х видов люпина - белого, желтого и узколистного люпина, а также в отдельных опытах - многолистного. Незрелые зародыши размером 1-2 мм, вычлененные из бобов выращенных в поле растений развивались на питательных средах на основе М8 и Гамборга В5. Исследуемые варианты, среды М8 приведены в таблице 7.

Таблица 7

Состав среды для культивирования незрелых зародышей люпина

Компоненты среды МБ, МБг МБ3 мб4 мб5 МБб

Гидролизат казеина, г/л 2,0 2,0 2,0 - 2,0 -

БАП, мг/л - 1,5 1,5 5,0 - -

НУК, мг/л - - 1,0 2,0 - -

2,4-Д, мг/л - - - - 2,0 5,0

Кинетин, мг/л - - - - 0,25 -

Итаконовая кислота, мг/л - - - - - 1,0

Проведенные исследования показали, что реакция растительной ткани на состав питательной среды зависит от вида люпина (табл.8).

Таблица 8

Развитие полноценных растений из незрелых зародышей трех _видов люпина на вариантах питательной среды МК_

Узколистный Желтый Белый

Вариант Отношение Отношение Отношение

среды зародыш/побег/нор зародыш / побег / зародыш/побег/нор

м. раст. норм. раст. м. раст.

М8, 12/17/15 12/14/8 12/19/4

МБз 12/39/5 12/20/4 12/15/1

МБз 12/44*/0 12/34*/0 12/7*/0

мб4 12/51* 12/40*/0 12/3*/0

мб5 12/каллус 12/4^8» 12/0*/0

МБ« 12/каллус 12/12* 12/0*/0

Примечание: * - каллусообразование; сэ - соматические эмбрионы

На срстс М^ для кч |ьт>ры ироды шей туиемич шиов люпина

характерно рашпие одною-двух пооеюв которые впоследствии образуют корни с довольно высокой эффективностью

Введение в среду 1,5 мг/л БАП (среда МБ;) приводит к образованию множественных побегов как непосредственно из зародышевой почки, так и через образование каллуса Однако необходимо заметить, что в то же время БАП препятствует развитию корней индуцированные корни, достигнув среды, содержащей ЬАП, начинали темнеть и отмирать и только после перенесения на свежую среду без цитокинина. проростки образовывали добавочные корни Результаты наших опытов согласуются с литературными данными о том, что для успешного развития корней эмбриоиды или побеги должны выращиваться на среде без цитокининов

На всех остальных вариантах среды (МБч -МБе,) на зародышах узколистного люпина развивался каллус При этом на среде с высоким содержанием 2,4-Д (5 мг/л -MS6) каллус был водянистым, рыхлым и не давал дальнейшего развития ни в эмбрионы, ни в побеги

Каллус, индуцированный на MS, содержащей 2 мг/л 2,4-Д и 0,25 мг/л кинетина, при перенесении на среду, содержащую БАП 1,0 мг/л и НУК 1,0 мг/л. давал начало многочисленным побегам у многолистного люпина

В опытах с культурой незрелых зародышей желтого люпина подтверждаются литературные данные о недостаточности используемой концентрации БАП 1.5 мг/л для получения многочисленных побегов На средах MS1 и MS2 развиваются тонкие, удлиненные побеги с низким коэффициентом умножения Проведенные исследования показали, что на увеличение числа побегов из ткани незрелого зародыша желтого люпина положительно влияет использование питательной среды MS с уменьшенной вдвое концентрацией основных компонентов, и только в разбавленной среде дает эффект повышение концентрации цитокинина (до 5,0 мг/л БАП). На средах, содержащих 2,4-Д или НУК. зародыши образовывали каллус На среде MS3 на интактных зародышах желтого люпина наблюдалось явление соматического эмбриогенеза (рис 2) Эмбриогенез происходил только на одной, прилегающей к питательной среде семядоле, остающейся зеленой и даже увеличенной тогда как вторая семядоля желтела и усыхала

Рис 2 Соматический эмбриогенез на незрелых зародышах желтого люпина

Среда Гамборга, используемая в исследованиях, согласно литературным и нашим предварительным данным, является подходящей для культивирования незрелых зародышей люпина. Результаты культивирования незрелых зародышей трех видов люпина на питательных средах, приготовленных на основе В5, представлены в таблице 9.

Таблица 9

Получение нормальных растений из незрелых зародышей люпина на разных вариантах среды В5

Узколистный Желтый Белый

Вариант среды Отношение Отношение Отношение

(гормоны, мг/л) зародыш/ % зародыш/ % зародыш/ %

норм. раст. норм раст. норм. раст.

1 — без гормонов 11/9 82 9/7 78 14/3 21

2 БАП 0,1+ИУК0,()1 10/6 60 9/6 67 13/1* 7

3 Зеа 0,5+ ИУК0,05 13/9 69 12/7 64 12/0* 0

42,4-Д 0,1+ Кин 0,01 13/8* 62 12/8* 67 12/0* 0

Примечание: * - интенсивное каллу сообразован ие

Наибольший выход нормальных здоровых проростков получен для зародышей узколистного люпина. Зародыши белого люпина, развиваясь на полноценной среде В5, образуют деформированные листья с утолщенными черешками и корнями Такие проростки характеризуются пониженной жизнеспособностью и плохо адаптируются к почвенным условиям.

Анализ приведенных в табл 9 данных свидетельствует о том, что для нормального развития незрелых зародышей необязательно присутствие в питательной среде регуляторов роста. Из использованных фитогормонов наилучшие результаты для узколистного люпина получены при сочетании зеатина и индолилуксусной кислоты.

Проростки желтого люпина, полученные из незрелых зародышей размером 1-1,5 мм на среде В 51, при достижении размеров 4-6 см и хорошем развитии корневой системы, были перенесены в почвенную смесь и адаптированы к нестерильным условиям.

Таким образом, в результате наших исследований подтверждены данные, что на средах с добавлением 2,4-Д и кинетина происходит сдвиг в развитии зародышей в сторону каллусообразования. По нашим наблюдениям, люпин всех четырех исследуемых видов, а в особенности белый люпин, очень легко переходит к каллусообразованию на полноценной среде MS даже с незначительным содержанием фитогормонов (0,1 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л кинетина). На желтом люпине наблюдали явление прямого соматического эмбриогенеза при концентрации гормонов 2,4-Д 2 мг/л + Кин 0,2 мг/л. На питательной среде В5 получены полноценные растения трех видов люпина, причем на безгормональной среде идет простое развитие эмбрионов, без умножения побегов, с одновременным развитием верхушечных меристем и корней.

Также были проведены эксперименты по изучении жизнеспособности зародышей люпина на начальных стадиях развития. По литературным данным успешным оказался метод выращивания на двухфазных питательных средах (жидкость на агаре) с повышенной концентрацией сахарозы -80-120 г/л (Vuillaum, Hoff, 1986). Использование этой методики в наших опытах привело к тому, что через две недели зародыши прекращали развитие. Варьирование условий выращивания позволило установить, что определяющим фактором таких изменений является присутствие высоких концентраций сахарозы. Положительный эффект на развитие зародышей оказало ступенчатое снижение концентрации сахарозы в среде: 120 —> 90 —> 60 -> 30 —> 15 г/л

Ниже приводится схема выращивания незрелых зародышей белого люпина:

Зародыши

белого люпина Старт

В5/2 6/Г сах 90-120;

адаптация к условиям in vitro В5/2+&АП 1. сах 60;

умножение побегов В5/2 б/г, сах 30, агар 5 г/л

| развитие побегов • В5/2 б/г, сах 15, агар 5 г/л

| развитие побегов Смирнова б/г +акт.уголь укоренение

В таких условиях зародыши всех исследуемых нами видов люпина развивались нормально, почти со 100% выходом проростков.

Трансформация люпина с помощью агробактерий

В предварительных опытах была проверена вирулентность имеющихся в лаборатории штаммов A. tumefaciens: А277, А281, А348, 1Д1, С50 и A. rhizogenes А8196, 15834 и А4Ь на чувствительных к агробактериям растениях каланхоэ (Zhan, Jones, Kerr, 1988). Через 3-4 недели на месте введения бактерий развивалась опухоль.

Из испытанных штаммов A. rhizogenes только два, А4в и 8196, обнаружили способность образовывать характерную опухоль "бородатый корень".

При инокуляции вирулентных штаммов Agrobacterium tumefaciens и А. rhizogenes в ткани 5-8 дневных проростков люпина, в первом опыте результаты

были получены через три недели - штаммы А277, С58 и А281 индуцировали галлы на черешках листьев и семядолей. Изменение вирулентности штаммов агробактерий изучено при последовательных пассажах через ткани люпина. При повторном введении в ткани недельных проростков люпина чистых культур агробактерий, выделенных из галлов (обозначенные в дальнейшем индексом «л» - люпин), первые признаки развития опухоли наблюдали на восьмой день для штаммов А277л и А281л, на 12-15 день - для С58л и контрольных штаммов А277 и А281. Характерные галлы на люпине развиваются за 30-40 дней, причем наилучшие результаты получены при инфицировании черешков листьев. Можно отметить, что внешний вид галлов на каланхоэ и люпине отличается, но биохимический контроль (тест на 3-кетолактозу) доказывает, что в тканях люпина развивается именно штамм агробактерий.

При введении в ткани люпина штаммов А. rhizogenes эффекта не было. Невирулентными оказались и штаммы А. ШтеГааеш А348 и 1Д1, хотя, как показало исследование, агробактерии в тканях люпина не погибают и могут быть выделены из участка инфицирования.

Проведение еще одного цикла заражения люпина свежевыделенной культурой агробактерий подтвердило результаты: появление признаков опухолеобразования на 8-12 день и развитие характерных галлов через 30-40 дней.

Из полученных данных можно заключить, что на люпине возможно проведение генно-инженерных работ с использованием штаммов Agrobacterium ШтеГасеш А277, А281 и С58. Пассажи в тканях люпина повышают вирулентность агробактерий. Наиболее чувствительными к инфекции являются черешки листьев.

Для доказательства трансформации тканей люпина агробактериями предпочтительны штаммы, несущие маркерные гены устойчивости к какому-либо антибиотику. Такой штамм был получен нами при трансформации наиболее вирулентного для люпина штамма А. Штйашеш А281 ДНК плазмиды рВЬНЬЗА, несущей ген запасного белка ячменя - гордеина и маркерный ген устойчивости к канамицину. Для этого любезно предоставленная нам институтом Общей генетики РАН плазмида рБЬИЬЗА была вначале трансформирована в штамм Е.соК ИБ101, затем выделена препаративно. Электрофоретический анализ фрагментов рестрикции выделенного препарата плазмидной ДНК и исходной плазмиды показал тождество этих фрагментов. На последнем этапе

была проведена трансформация А. ШтеГашеш А281 препаратом выделенной плазмиды и отобраны клоны агробактерий, устойчивые к канамицину в концентрации 20 мг/л.

Для того, чтобы определить концентрации канамицина, эффективные для отбора трансформированных клеток и тканей люпина, было изучено влияние канамицина на развитие проростков, а также на рост каллусных культур. Было показано, что развитие проростков заметно ингибируется при 100 мг/л Км в среде. На каллусных культурах узколистного люпина было проверено действие канамицина в интервале концентраций от 0 до 100 мг/л (табл. 10).

Таблица 10

Рост каллусной ткани узколистного люпина Брянский 123 _1_на среде с канамицином__

Концентрация канамицина, мг/л Начальная масса, г Конечная масса, г Прирост, г %

0 0,1778+0,0093 0,703610,0527 0,525810,040 100

10 0,2048±0,0117 0,679110,0577 0,4743+0,0427 90,21

20 0,2132±0,0098 0,608810,0670 0,395610,0475 75,74

50 0,169910,0073 0,510310,0475 0,3404+0,0306 64,74

100 0,2087±0,0116 0,4047+0,0526 0,196010,0215 37,27

В таблице 11 представлены результаты исследования влияния канамицина на рост инфицированной агробактериями каллусной ткани узколистного люпина.

Таблица 11

Рост каллусной ткани узколистного люпина Брянский 123, инфицированной _ А. 1ите1ааеш А281, на среде с канамицином _

Концентрация Начальная Конечная Прирост*, %

канамицина, масса, масса*, г

мг/л г г

0 0,326310,0196 0,498310,0399 0,171710,0153 100

10 0,421010,0189 0,672510,0827 0,251710,0327 113,41

20 0,274310,0206 0,415010,0456 0,140810,0169 97,6

50 0,315410,0252 0,472510,0803 0,156710,0267 94,49

100 0,353610,0240 0,520010,0374 0,1675Ю,0114 89,92

* - третий пассаж (пересаживание каждые три недели)

Проведенные нами предварительные исследования показали, что в первые 4 недели после трансформации развитие каллуса на средах с канамицином в концентрации 20 мг/л и более заметно ингибируется. И только в третьем и последующих пассажах выявлена Км-устойчивость большинства исследуемых каллусных культур узколистного люпина.

Как видно из таблицы, низкие концентрации канамицина (10 мкг/мл) не только не ингибируют рост каллуса, но на них рост даже лучше, чем в контроле. Лишь при увеличении содержания антибиотика в среде до 50 мкг/мл и выше начинается ингибирование роста каллуса и при концентрации канамицина 100 мкг/мл снижение темпа роста составило чуть более 10% по сравнению с контролем.

Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что штаммы Agrobacterium ШтеГашеш, а именно А277, С58 и в наибольшей степени

Л281, могут трансформировать ткани люпина. Получена каллусная культура узколистного люпина, стабильно наследующая устойчивость к канамицину, что подтверждает передачу чужеродной генетической информации с помощью агробактериальной трансформации

Выводы

1. Показана видовая, сортовая и генотипическая специфичность тканей люпина в культуре in vitro.

2. Коэффициент умножения побегов в культуре верхушечных и пазушных почек зависит от количественного и качественного состава питательной среды: на бедных по составу средах Уайта, Готре, Миллера - происходит развитие побегов без пролиферации, тогда как на средах MS и В5 на одной почке развивается до 15 побегов в течение месяца.

3. Добавление гибберреловой кислоты благоприятно сказывается на развитии побегов и дальнейшем укоренении при микроклональном размножении люпина

4. Высокие концентрации гормонов, а также повышение содержания сахарозы и азота приводит к потере морфогенетического потенциала и появлению витрифицированных побегов.

5. Для культуры ткани люпина предпочтительным является постепенное изменение концентраций гормонов и сокращение периодичности пассирования с четырех до трех, а для белого - до двух недель.

6. Предложены схемы ведения культуры верхушечных и пазушных почек и культуры незрелых зародышей трех видов люпина в условиях in vitro.

7. Получены регенеранты люпинов желтого и узколистного, которые могут служить потенциальными источниками высокой семенной продуктивности.

8. Получены вирулентные для люпина штаммы Agrobacterium tumefaciens А281, А277, несущие плазмиду рВЬНЬЗД, кодирующую устойчивость к антибиотику канамицину и несущую ген запасного белка ячменя -гордеина.

9. Получена каллусная культура, устойчивая к канамицину в концентрации 100 мг/л, что свидетельствует об успешной генетической трансформации клеток люпина.

Практические рекомендации производству

1. В целях создания принципиально нового исходного материала для селекции люпина использовать клональное микроразмножение и генетическую трансформацию, обеспечивающие выявление наиболее ценных форм.

2. Рекомендуется использовать разработанные нами схемы, и условия клонального микроразмножения и адаптации к естественным условиям выращивания.

3. Для гарантированного сохранения наиболее ценных генотипов люпина предлагается использовать культуру незрелых зародышей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Костюченко Д.А., Сычева Т.П., Костюченко В.И. Культивирование незрелых зародышей Lupinus poiyphyllus в условиях in vitro: Тез. докл. научн.-практ. конф. Ускорение научно-технического процесса в агропромышленном комплексе Брянской области. - Брянск, 1992. - С. 129-130.

2. Сычева Т.П., Костюченко Д.А., Костюченко В.И. Регенерация люпина непосредственно из культивируемых эксплантов: Тез. докл. научн.-практ. конф. Ускорение научно-технического процесса в агропромышленном комплексе Брянской области. - Брянск, 1992. - С. 160-161.

3. Kostyuchenko, V.I.; Kharaborkina, N.I. and Kostyuchenko, D.A. Callus cultures of Lupinus spp.: A comparison of peroxidase and amylase activity and plant regeneration: Abst/ - VII Intern.Lupin Confer, April, 18-23, Evora, Portugal, 1993.

4. Костюченко В.И., Костюченко ДА, Хараборкина Н.И., Яговенко Т.В. Изучение водорастворимых белков, активности амилазы, пероксидазы в тканях разных видов люпина //Биологический и экономический потенциал люпина и пути его реализации: Тез. докл. Межрегион научн. - практ. конф. 15-17 июля 1997г. - Брянск, 1997. -С.85-88.

5. Пимохова Л.И., Костюченко В.И., Костюченко Д.А., Пигарева С.А. Оценка селекционного материала люпина с помощью физиолого-биофизических методов //Биологический и экономический потенциал люпина и пути его реализации: Тез. докл. Межрегион.научн.-практ. конф. 15-17 июля 1997г. -Брянск, 1997.-С.88-90.

6. Костюченко Д.А., Яговенко Т.В, Костюченко В.И., Пигарева С.А.. Сравнительная характеристика различных генотипов люпина в культуре ткани in vitro //Сельскохозяйственная биология. - 1998. - №5. - С.69-74.

7. Костюченко В.И., Костюченко Д.А., Пигарева С.А., Яговенко Т.В. Развитие незрелых зародышей трех видов люпина на различных питательных средах //Биологический и экономический потенциал зернобобовых и крупяных культур и пути его реализации. - Орел, 1999. - С. 136-142.

8. Яговенко Т.В., Пигарева С.А., Костюченко Д.А. Особенности недифференцированного роста разных видов люпина в условиях in vitro //Сб.статей. Саввичевские научные чтения. - Брянск: Изд-во БГСХА, 2003. -С.41-47.

го - р ^:

Формат 60x84 1/16 Тираж 100 Объем 1 п. л.

Брянская государственная инженерно-технологическая академия Редакционно-издательский отдел

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Костюченко, Дина Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Методы культуры ткани в селекции растений.^

1.2 Культивирование изолированных тканей и клеток растений.д

1.3 Методы получения новых форм растений.^ ^

1.3.1 Мутационная изменчивость.

1.3.2 Сомаклональная изменчивость и клеточная селекция.

1.3.3. Использование гаплоидов в селекции.lg

1.3.4 Использование методов генетической инженерии.

1.4 Практическое значение клонального микроразмножения.

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Культура верхушечных и пазушных почек.^

3.1.1 Пролиферация верхушечных и пазушных меристем.^у

3.1.2 Оптимизация метода укоренения побегов.^

3.1.3 Адаптация к естественным почвенным условиям.^

3.2 Культура незрелых зародышей.^

3.3 Трансформация люпина с помощью агробактерий.ол выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические приемы расширения исходного материала для селекции люпина"

Актуальность темы. Длительное время селекция была ориентирована на увеличение уборочного индекса - отношения полезной массы урожая к общей массе, при практически неизменной величине чистого фотосинтеза. Но при этом снижалась экологическая устойчивость сортов и агроценозов. Необходимость переориентации селекции вытекает из реалий современного сельского хозяйства:

- уменьшение генетического разнообразия и, как следствие, снижение приспособленности агроценозов, их уязвимости по отношению к абиотическим, биотическим и антропогенным стрессам;

- дефицит энергоресурсов и возрастание цены пищевой калории;

- загрязнение агроландшафта и сельскохозяйственной продукции (Жученко, 1994, 2001; Кильчевский, Хотылева, 1999; Лихачев, Артюхов, 2002).

Повышению результативности селекционного процесса должно способствовать совершенствование его технологии. В этом плане большое значение имеет качественно новое изучение генофонда культурных растений, направленное на выявление генетических источников и доноров селектируемых признаков. Для этого необходимо расширение исследований по всем направлениям, имеющим отношение к селекции, и особенно по частной генетике и биотехнологии, как в целях создания нового исходного материала, так и для выявления морфологических, физиологических, биохимических и т.д. маркеров селектируемых признаков.

Новые разработки, в которых используются культуры клеток и тканей, а также методы генной инженерии значительно сокращают затраты времени и труда на создание новых исходных форм для селекции. Техника рекомби-нантных ДНК и ее последовательное применение в селекции растений способствует преодолению барьеров, препятствующих межвидовому скрещиванию, что особенно актуально для люпина. Она позволяет увеличить генетическое разнообразие, которое существенно пострадало из-за широкого распространения ограниченного числа высокопродуктивных сортов.

Цель работы - изучить способность разных видов люпина к клональ-ному микроразмножению и генетической трансформации.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

- оценить разные органы растений люпина по способности к каллусообразованию и регенерации;

- изучить морфо- и ризогенез в разных условиях культивирования;

- экспериментально подобрать наиболее эффективные питательные среды для клонального размножения разных видов люпина;

- установить возможность использования культуры незрелых зародышей в сохранении ценных генотипов люпина;

- получить растения-регенеранты из различных органов люпина;

- отработать методику генетической трансформации клеток люпина с помощью агробактерий.

Научная новизна. Выявлены особенности пролиферации верхушечных и пазушных почек при культивировании in vitro 16 перспективных сортов и сор-тообразцов желтого, 10 сортов узколистного, 4 сортов белого, а также многоли-стного люпина. Установлена зависимость умножения и развития побегов от количественного состава среды, содержания гормонов и режима пассирования. Определены наиболее эффективные среды для корнеобразования разных видов люпина. Предложены схемы для регенерации растений из незрелых зародышей желтого, узколистного и белого люпина. Впервые получена каллусная ткань узколистного люпина, трансформированная с помощью Agrobacterium tumefaciens (рВЬНЬЗД) и приобретшая в результате трансформации устойчивость к кана-мицину.

Практическая значимость результатов исследования. Предложены схемы регенерации растений из незрелых зародышей узколистного, желтого и белого люпина. Разработаны условия для этапа адаптации растений-регенерантов к культивированию in vivo. Доказана возможность использования методов генетической трансформации тканей люпина с помощью агробактерий при создании принципиально нового исходного материала. Часть полученных регенерантов узколистного (АТ-Д-2-Г/1) и желтого люпина (Искорость) используется в селекционных программах.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Схемы и условия клонального микроразмножения разных видов люпина.

3. Эффективность корнеобразования и адаптации к естественным условиям культивируемых видов люпина.

4. Способность люпина к генетической трансформации с помощью Agro-bacterium tumefaciens (pBLHL3A).

Апробация результатов НИР. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались ежегодно на Ученом совете Всероссийского научно-исследовательского института люпина (1989-1995 гг.), научно-практической конференции "Ускорение научно-технического процесса в агропромышленном комплексе Брянской области" (Брянск, 1992), межрегиональной научно-практической конференции «Биологический и экономический потенциал люпина и пути его реализации» (Брянск, 1997), Саввичев-ских научных чтениях (Брянск: БГСХА, 2003, 2004), на научной конференции «Вклад ученых и специалистов в национальную экономику» (Брянск: БГИТА, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Костюченко, Дина Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Показана видовая, сортовая и генотипическая специфичность тканей люпина в культуре in vitro.

7. Получены регенеранты люпинов желтого (Искорость) и узколистного (АТ-Д-2-Г/1), которые могут служить потенциальными источниками высокой семенной продуктивности.

8. Получены вирулентные для люпина штаммы Agrobacterium tumefaciens А281, А277, несущие плазмиду рВЬНЬЗА, кодирующую устойчивость к антибиотику канамицину и несущую ген запасного белка ячменя - гордеина.

Практические рекомендации

1. Рекомендуется использовать разработанные нами схемы и условия клонального микроразмножения и адаптации к естественным условиям выращивания.

2. Для гарантированного сохранения наиболее ценных генотипов люпина предлагается использовать культуру незрелых зародышей, для чего предложены схемы эффективного получения полноценных растений трех агрономически важных видов люпина - узколистного, желтого и белого

3. В целях создания принципиально нового исходного материала для селекции люпина использовать клональное микроразмножение и генетическую трансформацию, обеспечивающие выделение и сохранение наиболее ценных форм.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата сельскохозяйственных наук, Костюченко, Дина Алексеевна, Брянск

1. Атанасов А.И. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск, 1993. -242с.

2. Байбурина Н.В. Микроклональное размножение как способ сохранения редких и исчезающих видов растений. -http://vvww.ib.komisc.rU/t/ru/ir/vt/02-56/061 .html (ЮКВ) 03.08.2002

3. Бобков С.В., Уваров В.Н. Каллусогенез и регенерация растений в культуре пыльников гороха. Достижения науки и техники АПК. - 2004. - №2. -С.2-3.

4. Бойко В.В., Бабоша А.В. Использование веществ с антистрессовой активностью при оздоровлении картофеля от вирусов методом апикальной меристемы. // Биотехнология. 2002. - №3. - С. 42-44.

5. Болдырева Я.А., Величко Н.А. Влияние элементов минерального питания на рост каллусной ткани и синтез алкалоидов в культуре ткани катаранту-са розового. //Биотехнология. 2003. - №1. - С.53-62.

6. Бондаренко A.M. Сомаклональная изменчивость и биотехнологические методы в селекции злаковых культур // Физиол. и биохим. культурн. раст. 1991. -т.23. -3. - С.222-232.

7. Бондаренко Е.Д, Киссель Н.И. Биотехнология. Культура клеток и тка-Hefi.http://vet.kharkov.ua/journals/shbioll2002

8. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие. М.:ФБК ПРЕСС, 1999. - 160с.

9. Бутенко Р.Г. Использование культуры тканей растений в сельскохорзяй-ственной науке и практике // С.-х. биология. XIV. 1979. - №3. - С.306-315.

10. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике // Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., 1990. - С. 154-235.

11. Бутенко Р.Г. Культура изолированных органов и тканей и физиология морфогенеза растений. -М.гНаука, 1964. -294с.

12. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. М.:Наука, 1975.

13. Величко Н.А. Культивирование эфедры односемянной в условиях in vitro // Биотехнология. 2002. - №5. - С. 59-64.

14. М.Ветчинникова (Конина) JI.B. | 13 Kb |http://insteco.krc.karelia.ru/HP/vetchinnikova/18.09.2003.

15. Вечерко Л.И., Вечерко Н.А. Особенности биологии развития и селекции фрезии в условиях закрытого грунта Юго-Восточного Казахстана// Депонированные научные работы.- Алматы. 1996. - Вып.1. Деп. в КазгосИН-ТИ.

16. Володин В. Лаборатория клеточной инженерии. http://www.agrobiotech.ru/departments%20informatiol 04.03.2002 | 6 Kb.

17. Воробьева Г.А., Приходько Н.И. Использование культуры зародышей in vitro для получения межвидовых гибридов томатов // Тр. по прикл. ботан., генет. и селекции ВНИИ растениеводства. 1980. - Т.63, №3. - С.64-74.

18. Гапоненко А.К., Мунтян М.А., Маликова Н.И., Созинов А.А. Регенерация растений различных генотипов пшеницы Triticum aestivum L in vitroZ/Докл. АН СССР. 1984. - 278. - №5. - С.1231-1235.

19. Гёринг X., Цоглауэр К., Гоффман Б., Пинкер И. Влияние ауксина и красного света на корнеобразование у побегов березы in vitro / Культура клеток растений и биотехнология. М.:Наука, 1986.-С. 106-110.

20. Гирко B.C., Волощук С.И. Наследование в ряду поколений некоторых признаков в расщепляющихся гибридных популяциях озимой пшеницы при мутагенезе in vitro // Докл. РАСХН. 2002. - №4. - С.9-13.

21. Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Бирюков В.В. Отбор солеустойчивых газонных трав с помощью методов биотехнологии // Биотехнология.- 2003. -№5. -С. 11-15.

22. Глеба Ю.Ю., Сытник, К.М. Клеточная инженерия растений. Киев: На-ук.думка, 1984.-345с.

23. Головко А.Э., Погребняк Н.Я., Банникова М.А. Особенности культивирования in vitro и трансформации сахарной свеклы //Физиол. и биохим. культ, раст. 2002. - 34. - №5. - С. 394-405.

24. Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий. -М.:Мир, 1984. 176с.

25. Джигадло М.И. Использование биотехнологических и биофизических методов в селекции и сорторазведении плодовых и ягодных культур. Авто-реф.дис. канд. с.-х. наук. Орел, 2003. - 26с.

26. Джигадло М.И. Клональное микроразмножение черной и красной смородины // Селекция и сортоизучение черной смородины. Мичуринск, 1988.- С.141-143.

27. Джигадло М.И., Джигадло Е.Н. Размножение вишни методом верхушечных меристем // Улучшение сортимента и прогрессивные приемы возделывания плодовых и ягодных культур. -Приокское кн. изд-во, Тула, 1988.- С.65-68.

28. Диксон Р. А. Биотехнология растений: культура клеток. -М.:Агропромиздат, 1989.-280с.

29. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта /с основами статистической обработки результатов исследований/: Учебник для студентов сельскохозяйственных вузов по агрономическим специальностям. Изд. 4-е перераб. и доп.-М.:Колос, 1979.-416с.

30. Епифанова О.И. Гормоны и размножение клеток. -М.:Наука, 1965. 165с.

31. Жученко А.А. Адаптивная система селекции растений (эколого-генетическая основа). В двух томах. М.: Изд-во РУДН, 2001. - 1490с.

32. Захватов Е.В. ВНИИС им. И.В.Мичурина история и перспективы http://urojai.nm.ru/arh/a-38.htmll 26.09.2003 | 63 Kb

33. Ишмуратова М.М. Влияние экстрактов родиолы розовой на развитие экс-плантов родиолы розовой и иремельской в условиях in vitro// Биотехнология.-2002. №6.-С. 52-56.

34. Калашникова Е.А. Морфофизиологические особенности пробирочных растений, каллусной ткани и суспензионной культуры картофеля, обусловленные действием экзометабиолитов гриба Rhizoctonia solani // Биотехнология. 2003. - №3. - С. 36-41.

35. Калашникова Е.А. Получение растений-регенерантов после клеточной селекции моркови на устойчивость к патогенному грибу Alternaria radicina М., Dr. et Е. // Биотехнология. 2003. - №2. - С. 65-68.

36. Калашникова Е.А., Родин Н.В. Биотехнологические методы при культивировании in vitro некоторых древесных и кустарниковых пород.:Учеб. пос. -М.: МГУЛ, 2001.- 162с.

37. Калинин Ф.Л., Сорнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980.

38. Катаева Н.В., Аветисов В.А. Клональное размножение растений в культуре ткани: Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1980. -С. 116-121.

39. Кильчевский А.В., Хотылева JI.B. Экологическая селекция растений. -Минск: «Тэхналопя», 1997. 372с.

40. Киселева Б.Н. Изучение влияния Р-индолилуксусной кислоты на синтез ДНК в проростках ясменя методом радиоавтографии и цитофотомет-рии//Половой процесс и эмбриогенез растений: Тез. докл. всесоюз. симп. -М., 1973. С.21-22.

41. Копертех Л.Г., Стрибная JI.A. Регенерация растений из листовых эксплан-тов пшеницы. Физиология растений. - 2003. - 50. - №3. - С.410-414.

42. Кострубин М.М., Голышкин JI.B., Нагорнюк М.В. Микроразмножение люпина в культуре in vitro: Тез.докл. Междунар. конф.:Биология культи-вир. клеток и биотехнология. Новосибирск, 1988. -ч.2.

43. Костюченко В.И., Яговенко Т.В. Изучение наследуемых изменений белков люпина желтого и узколистного в культуре тканей in vitro //Докл. Росс. Акад.с.-х. наук. 1997. - №6. - С. 10-12

44. Крупнова Э.В., Хотылева JI.B, Анохина В.А. Культура тканей и микро-клональное размножение люпина желтого: Тез.докл. Междунар. конф. «Биология культивир. клеток и биотехнология. Новосибирск, 198 8. -ч.1, С.156-157.

45. Кунах В.Ф., Алпатова JI.K. Роль фитогормонов в изменчивости числа хромосом в культурах тканей Haplopappus gracilis // Докл. АН СССР. -1979. 245. - №4. - С. 967-970.

46. Курсаков Г.А., Панфиткина Т.И. Применение искусственной культуры зародышей при отдаленной гибридизации моравской рябины // Бюлл. научн. информ. центр, ген. лаб. им. Мичурина. 1976. - №23. — С.3-6.

47. Кутас Е.Н., 2003: http://hbc.bas-net.by/cbg/strukture.php

48. Кучеренко J1.А. Подходы к разработке технологии массовой регенерации растений in vitro: Биология культивируемых клеток и биотехнология. -М.: Наука, 1991. С.232-235.

49. Кучук Н.В. Выделение и культивирование протопластов пяти видов семейства бобовых // Физ. раст. 1989. - 36. - № 4. с. 821-824.

50. Лихачев Б.С., Артюхов А.И. Роль сорта и семян в стабилизации региональных экосистем. Брянск: Изд-во БГСХА, 2002. - 46с.

51. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений. С-Пб.:Изд-во С-Петерб.ун-та, 2003. - 228с.

52. Лутова Л.А., Забелина Е.К. Каллусо- и побегообразование у различных форм гороха Pisum sativum в условиях in vitro //Генетика. — 1988. — XXIV. 9. - С.1632-1640.

53. Машкина О.С., Буторина А.К. Генетическая инженерия лесных древесных растений //Генетика. 2003. - т.39. - №3. - С. 309-317.

54. Мельников Н.Н. Регуляторы роста. М.:Наука, 1987, - 728с.

55. Мигранова И.Г., Леонова И.Н., Салина Е.А., Чураев Р.Н.,Мардамшин А.Г. Влияние генома и типа специализации тканей экспланта на способность каллусной ткани борца северного к длительному культивированию in vitro // Биотехнология. 2002. - №2. - С. 37-41.

56. Мурсалиева В.К., Вечерко Н.А., 2003. http://ncbrk.by.ru/n2/Art2l l.htm

57. Нейфак Л.А., Тимофеева М.Я. Молекулярная биология процессов развития. М.:Наука, 1977.

58. Першина JI.A., Исаева НА. Каллусообразование и особенности органогенеза в культуре тканей межвидовых и межродовых гибридов ячменя // Физиол. раст. 1982. - Т.29. - №3. - С.557-563.

59. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений.-М.гКолос, 1985 -417с.

60. Рукавцова Е.Б., Золова О.Э. Бурьянова Н.Я., Борисова В.Н., В.А.Быков, Бурьянов Я.И. Анализ трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В //Генетика. — 2003. т.39. - №1. - С.51-56.

61. Сергеева Л.Е. Новая селективная среда с ионами бария альтернативная система для отбора солеустойчивых клеточных линий //Биотехнология. -2002.- №2.-С. 47-51.

62. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Киев: Наукова Думка, 1990.

63. Сковородников Д.Н. Особенности клонального микроразмножения и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины. Автореф. дис. канд.с.-х.наук. Брянск, 2004. - 20с.

64. Смирнов A.M. Рост и метаболизм корней в стерильной культуре. -М.:Наука, 1970.-252с.

65. Снедекор Д.У. Статистические методы в применении к исследованиям в сельском хозяйстве и биологии. Перев. с англ. В.В.Перегудова. -М.:Сельхозгиз, 1961.-502с.

66. Стаутмайер В. Регуляторы роста растений в сельском хозяйстве. М.: Изд-во Иностр. литературы, 1958.

67. Строгов С.Е., Зайцева Г.В., Туркин В.В., Козловцева Л.В., Фетисова Е.М., Белоусова И.М., Украинцев А.Д. Влияние условий культивирования клеток воробейника краснокорневого с метилжасмонатом на выход шиконина // Биотехнология. 2003. - №4. - С. 63-69.

68. Терновский М.Ф., Бутенко Р.Г., Моисеева И.Е. Применение культуры ткани для преодоления барьера несовместимости видов и бесплодия межвидовых гибридов //Генетика. 1972. - Т.8. - №1. - С. 38-45.

69. Титова И.Б., Тимии Н.И., Юрьева Н.А., Дмитриева Н.Н. Применение метода изолированных зародышей в межвидовой гибридизации лука // Тр. ВНИИ сел. и семен. овощ, культур. —1982. Т. 15. - С. 57-65.

70. Тиходеев О.Н., Бузовкина И.С. Лутова Л.А. Возможности агробактери-альной трансформации в генной инженерии растений //Вестн. С.-Петербург.ун-та, Сер.З. 1999. - №4. - С. 72-81.

71. Харченко П.Н. http:// www.agrobiotech.ru /departments%20information /kharchenko.htm (6КБ) 04.03.2002

72. Чесноков Ю.В. Проблемы генетической трансформации растений. Методические подходы (обзор). Сельскохозяйственная биология.- 2004.- № I.- С.26-40/

73. Чумаков М.И., Курбанова И.В., Соловьева Г.К. Агробактериальная трансформация неповрежденных растений //Физиол. раст. 2002. - 49. №6. -С.898-903.

74. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Особенности мофрогенетических изменений в культивируемых in vitro пыльниках моркови // Биотехнология, 2002. -№5.-С. 65-69.

75. Юркова Г.Н., Сирант JI.B., Труханов В.А. Прямая регенерация растений из мезофильных клеток растения. // Цит. и генет., 1989. т.23. - №1. -С.68-69

76. Яговенко Т.В. Расширение спектра исходного материала для селекции люпина с использованием методов культуры тканей. Авто-реф.дис.канд.биол. наук. -М., 1998. 18с.

77. Abe Т., Futsahara Y. Genotipic variability for callus formation and plant regeneration in rice (Oryza sativa L.)//Theor. and Appl. Genet. 1986. -V.72. -N.l. -P.3-10.

78. Ahn B.J., Huang F.H., King J.W. Regeneration of bermudagrass cultivars and evidens of somatic embriogenesis// Crop Sci. 1987. - 27. - N3. - P.594-597.

79. Ahn B.J., Huang F.H., King J.W. Regeneration of bermudagrass cultivars and evidence of somatic embryogenesis// Crop Sci., 1987,27. P.594-597

80. A1-Atabee J.S., Power J.B. Control of vitrification and in vitro flowering of plantlets regenerated from callus of Dimorphotheca aurantiaca (Composita). //J. PI ant Physiol. 1990. - 136, 6. - P. 705 - 709.

81. Ammirato P.V. Embryogenesis // Handbook of plant cell culture. New York, London: Macmillan, 1983,-V.l.-P. 82-123.

82. Aparecida F.J., Cameiro V.M.L., Geraldi J.O., Appozzato-da-Gloria B. Anatomical study of somatic embryogenesis in Glycine max (L) Merric // Braz. Arch.Biol. and Technol. 2002. - 45. - №3. - C. 277 - 286.

83. Arcioni S., Pezzotti M., Damiani F. In vitro selection of alfalfa plants resistant to Fusarim oxysporum f. sp. medicaginis // Theor.Appl.Genet. 1987. - 74. -P.700-705.

84. Bajaj Y.P.S., Reinert J. and Heberle E. Factors enhancing in vitro production of haploid plants in anthers and isolated microspores. In R.J.Gautheret ed., La culture des tissus et des cellules des vegetaux, 47-58, Masson. Paris and New York., 1979.

85. Baruah A., Bordoloi D.N. High frequency plant regeneration of Cymbopogon martinii (Roxb.) Wats by somatic embryogenesis and organogenesis. //Plant Cell Rep.- 1989.- 8.-483-485

86. Bayer E.V., Barra M. Interspecific crossing L.polyphyllus x L.mutabilis: Proc. 6th Int.Lupin Conf.,1990, Chile. 138

87. Benvenuto E. Plante geneticamente modificate: "Novel products" al servizio della medicina // Rend. Acad, naz.sci. XL Man.Sci.fis.e.nator. 2001. - 23, № 1. - p.2. - P.559-562.

88. Bhansali R.R. Somatic embryogenesis and regeneration of plantlets in pomegranate// Annals of Botany. 1990. - 66. - P.249-253.

89. Bhansali R.R., Driver J.A., Durzan D.J. Rapid multiplication of adventitious somatic embryos in peach and nectarin by secondary embryogenesis // Plant Cell Rep. 1990. - 9. - P.280-284

90. Birnboim H.C., Doly J. Nucleic Acids Res., 1979. 7. - P. 1513. Цит. по кн.: п.р.Харди К. Плазмиды. Методы. -М.:Мир, 1990.-С. 14.

91. Catlin D.W. The effect of antibiotics on the inhibition of callus induction and plant regeneration from cotyledons of sugarbeet (Beta vulgaris L.) // Plant Cell Rep. 1990. - 9. - C. 285 - 288.

92. Charest P.J., Halbrook L.A. et.al. Agrobacterium-mediated transformation of thin cell laier from Brassica napus L. //Theor.and Appl.Genet. 1988. - 75. - 3. - P.438-446.

93. Chen H.K., Мок M.C., Mok D.W.S. Somatic embryogenesis and shoot organogenesis from intershecific hibrids//Plant Sci. 1987. -48. - P. 181-188.

94. Chen T.H.H., Marowitch J. Screening of Medicago falcata germplasm for in vitro regeneration // J. Plant Physiol. 1987. - 128. - N3. - P.271-277

95. Chuang M.J., Chang W.C. Embryoid formation and plant regeneration in callus cultures derived from vegetative tissues of Disosma pleintha (Mance) Woodson // J. Plant Physiol.- 1987. 128. - N3. - P.279-283

96. Chung W.W. A novel approach for efficient plant regeneration from tissue culture of Cassava// Plant Cell Rep. 1990. - 8. - 11.-P. 639-642.

97. Cirinova В., Sladky Z. A study of the regeneration capacity of oak {Quercus robur L.) II Scr.fac.sci.natur.UJEP brun. 1987.- 17.- N3-4. - C. 103-110

98. Cousins Y.L., Lyon B.R., Liewellin D.J. Transformation of an cotton culti-var: prospects for cotton improvement through genetic ingeneering //Aust.J.Plant Physiol. -1991. 18. - P.481 -494.

99. Doley W.P., Saunders J.W. Hormone-free medium will support callus production and subsequent shoot regeneration from whole plant leaf explants in some sugarbeet (Beta vulgaris L.) populations // Plant Cell Rep., 1989. 8. -№4. -P. 222-225.

100. Duak M. and Brown D.C.W. Pattern of direct and indirect embryogenesis from mesophyll protoplsts of Medicago sativa // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1987. - 9. - P.121-130.

101. Durbin R.D. Nicotiana procedures for experimental use, USDH, SEA.// Technical Bulletin, 1979, N.1586.- P. 1358-1359.

102. Durzan D.J., Gupta P.K. Biotechnology of somatic embryogenesis and plantlet regeneration in loblolly pine // Biotechnology. 1987. - N5. - P.147-151.

103. Ellis D.D., Lazaroff W.R., Roberts D.R., Flinn B.S., Webb D.T The effect of antibiotics on elongation and and bud formation from embryogenic tissue of Picea glauca // Can.J.Forest.res. 1989.- 19. - № 19. - P. 1343-1346.

104. Evans D.A., Sharp W.R., Flick C.E. Ctll culture methods for crop improvement // Handbook of plant cell culture. New York, 1981.

105. Finer J.J., McMullen M.D. Transformation of cotton (Gossipium hirsutum L.) via particle bombardment // Plant Cell Rep. 1990. - 8.-P.586-589.

106. Fitter M.S., Krikorian A.D. Plant protoplasts. Calbiochem-Boehring. -Hoechst, 1980.

107. Franks Т., Birch R.G. Gene transfer into intact sugarcane cells using micro-projectile bombardment // Aust.J.Plant Physiol. 1991. - 18. - P. 471-480.

108. Freytag A.H., Anand S.C., Rao-Arelli A.P., Owens L.D. An improved medium for adventitious shoot formation and callus induction in Beta vulgaris L. in vitro // Plant Cell Rep. 1988. - 7. - 30-34.

109. Fujii J.A.A., Slade D.T., Redenbaugh K., Walker K.A. Artificial seeds for plant propagation. //Tibtech.,1987. 5. -P.335-339.

110. Fujii J.A.A., Slade D.T., Redenbaugh K., Walker K.A. Artificial seeds for plant propagation// Tibtech. 1987. - 5. -P.335-339.

111. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrient requirement of suspension cultures of sybean root cells// Experimental Cell Resources. 1968. - 50. - P. 151-158.

112. Gamborg O.L., Shiluk J.P., Shamin E.A. Plant tissue culture ethods and application in Agriculture. - Academic Press. New York, 1981.

113. Gladstones J.S. More important problems in Lupinus angustifolius breeding: Proc. of 5th Int. Lupin conf., July, 5-8, 1988, Poznan, Poland. P. 15-24.

114. Gladstones L.S. Prospects for interspecific hybridization of L. atlanticus with L.cosentini // Theor. and Appl. Genet. 1985. - N.2. - P.71.

115. Gosch-Wackerle G., Avivi L., Galun E. Induction, culture and differentiation of callus from immature rachises, seeds and embryos of Triticum// Z.Pflanzenphysiol. 1979. - 91. - N.3. - P.267-278.

116. Gould J., Devey M., Hasegava O., Ulian E.C., Peterson G., Smith R. Transformation of Zea mays L. using Agrobacterium tumefaciens and the shoot apex //Plant Physiol. 1991. - 95. - P.426-434.

117. Grimes H.G., Hodges Т.К. The inorganic N03*:NH4+ ratio influences plant regeneration and auxin sensitivity in primary callus derived from immature embryos of Indica rice (Orisa sativa L.)// J. Plant Physiol. 1990. - 136. - P.362-367.

118. Haccius D. Questions of unicellular origin of non-zigotic embryos in callus cultures// Phytomorfology. 1978. - 28. - 78-81.

119. Hammatt N., Davey M.R. Somatic embryogenesis and plant regeneration from cultured zygotic embryos of soybean (Glycine max L. Merr.). J.Plant Physiol.- 1987.- 128.- N3.-219-226.

120. Hammatt N., Davey M.R. Somatic embryogenesis and plant regeneration from cultured zygotic embryos of soybean (Glycine max L. Merr.) // J. Plant Physiol. 1987.- 128.-N3.-C.219-226.

121. Hanischten C.Ch.H. Regeneration and characterization of plants transformed Rhi-plasmids //Theor. and Applied Genetics, 1988. 75. - 3. - P. 452-460.

122. Holdgate D.P. Propagation of ornamentals by tissue culture // Appllied and Fundamental Aspects of plant cell, tissue and organ culture. Ed. J.Reinhert and J.P.S.Bojaj, Berlin, Heidelberg and New York:Springer-Ver lag. -1975.

123. Howell E.C., Stewart C.E., Evans P.K. Tissue culture and plant regentration of Indigofera potaninii // J.Plant Physiol. 1987. - 128. - N3. - P. 259-269.

124. Hu C.U. and Wang P.J. Handbook of plant cell culture, V.l. New York. 1983.

125. Jansen M.A.K., Booij H., Schel J.H.N., de Vries S. C. Calcium increases the yield of somatic embryos in carrot embryogenic suspension cultures // Plant Cell Rep.,1990. 9. - P.221-223.

126. Johansson L.B., Calleberg E., Gedin A. Correlations between activated charcoal, Fe-EDTA and other organic media ingredients in cultured anthers of Anemone canadiensis // Physiol.Plant., 1990. 80. - P.243-249.

127. Juned S.A., Jackson M.T., Ford-Lloid B.V. Genetic variation in potato cv. Record: evidence from in vitro regeneration ability //Ann. of Bot. 1991.-67. -P. 199-203

128. Kao H.M., Keller W.A., Gleddie S., Brown G.G. Efficient plant regeneration from hypocotyl protoplasts of broccoli (Brassica oleracea L. ssp. italica Plenck) // Plant Cell Reports 1990.-9.-P. 311-315.

129. Kim Joo Hang, La Motte C.E.,Hack E. Plant regeneration in vitro from primary leaf nodes of soybean (Glycine max.) seedlings // J.Plant Physiol. 1990. - 136,6.-P.664-669.

130. Kyte L. Plant from test tubes. N.Y., 1988.-285p.

131. Laemmli F. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. V.4.//Nature. 1970. - 227. - P. 680-685.

132. Lag Sanchez-Gras M.S., Segura J. In vitro propagation of Sideritis angusti-folia // J.Plant Physiol.- 1987. 130. - N1. - P.93-99.

133. Lulsdorf M.M., Rempel H., Jackson J.A., Baliski D.S., Hobbs S.L.A. Optimizing the production of transformed pea (Pisum sativum L.), callus using disarmed Agrobacterium tumefaciens strains // Plant Cell Rep.-1991. 9. -P.479-483.

134. M.A.Rahim, P.D.Scalligari. Multiple shoot regeneration in Lupinus mutabi-lis sweet: Proc. 8th International Lupin Conference, California , 1996 . — P. 354.

135. Maheswaran G. and Williams E.G. Direct secondary somatic embryogenesis from immature sexual embryos of Trifolium repens cultured in vitro // Annals of Botany. 1986. - 57. - P.109-117.

136. Makunda R., Kester D.E. Micropropagation of cherry rootstocks: II. Invigo-ration and enhanced rooting of "46-1 Mazzard" by co-culture with "Colt" // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1988.- 113(1). - P.150-159

137. Matthiss A.G., Torrey J.C. Factors limiting the stimulation of polyploid mitosis in intact pea roots and excised root segments// Bot.Gaz. 1969. -130. -P.62-69.

138. McLaughlin J., Karnovsky D.F. Controlling vitrification in Larix decidua via culture media manipulation // Can. J. Forest Res. 1989. -19. - N10. -P.1334-1337.

139. McWilliam A.A., Smith S.M. and Street H.E. The origin and developments of embryoids in suspension cultures of carrot (Daucus carota) // Annals of Botany. 1974 - 38. - P.243-250.

140. Meijer E.J.M., Brown D.C.W. A novel system for rapid high frequency somatic embryogenesis in Medicago falcata// Physiol.Plant. 1987. - 69. - P. 591-596

141. Miller C., Skoog F., Saltra M., Strong F. Kinetin , a cell division factor from deoxyribonucleic acid // J. Amer. Chem. Soc. 1955. - V.77. - N. 10. - P. 13921399.

142. Miller R.M., Kaul V., Hutchinson J.F., Richards D. Adventitious Shoot regeneration in carnalion (Dianthus caryophyllus) from axillary bud explants // Ann. ofBot. 1991. - 67. -P.35-42.

143. Murashige T. Manipulation of organ culture in plant tissue cultures // Botanical Bull.Acad.Sinica. -1977. -N.18.-P.1-24.

144. Murashige T. Plant propagation through tissue cultures // Ann.Rev.Plant Physiol.-1974.-25.-P. 135-166

145. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum 1962. - 15.-473-479.

146. Nadolska-Orczyk A. Somatic embryogenesis of agriculturally important lupin species (Lupinus angustifolius, L.albus, L.mutabilis)// Plant Cell Tissue and Organ Culture -1992.-28. P. 19-25.

147. Nadolska-Orczyk A.,Orczyk W. Study of the factors influencing Agrobacte-rium -mediated transformation of pea (Pisum sativum L.) // Mol. Breed. -2000.-6. №2.-P.l85-194.

148. Ohta Y. High-efficiency genetic transformation of maize by a mixture of pollen and exogenous DNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. - V.83. -715-719.

149. Ormerad A., Kaligari P.D.S. Receiving of the embryos from gaploids of lupine albus//Proc. 8th Int.Lupin Conf.,1993. P.258.

150. Orshinsky B.R., McGregor L.J., JohnsonG.I.E., Hucl P., Kartha K.K. Improved embryoid induction and green shoot regeneration from wheat anther cultured in medium with maltose // Plant Cell Reports. 1990. - N.9. - 365 - 369.

151. Parrot W.A., Dryden G., Vogt S., Hildebrandt D., Collins G.B., Williams E.G. Optimization of somatic embryogenesis and embryo germination in soy-bean//In vitro cell developm.Biol. 1988.-24. - 8. - P.817-820.

152. Perez-Bermudes P., Falko J.M., Segura J. Morphogenesis in root tip meris-tem cultures of Digitalis obscura L. // J.Plant Physiol. -1987. 130. -N.l. - P. 87-91.

153. Plarre W. Mutacion selection // Proc. of 6th Int.Lupin Conf., Chile, 1990-P.340-345.

154. Podima E., Rybczynski J.J. Somatic embryogenesis in immature embryo culture of Lupinus albus // 6th Int.Lupin Conf., Chile, 1990- P. 143

155. Power C.J. Organogenesis from Helianthus annuus ibreds and hybrids from the cotyledons of zygotic embryos // Amer.J.Bot. 1987. - 74. - P. 497-503

156. Prado E. Introduction of somatic embryo development //Plant Sci. Lett.-1990.-67.- 1.-P.73-82.

157. Querci M., Lupotto E. Effect of hormonal balance during leaf-disc infection of Nicotiana plumbaginifolia with Agrobacterium tumefaciens nopaline strain C58 // G.Bot.Ital. 1988. - 122 .- №3-4. - C.237-247.

158. Rahim M.A., Scalligari P.D. Multiple shoot regeneration in Lupinus mutabi-lis sweet. // Proc. of 8th Int.Lupin Conf., California , 1996. - P.26.

159. Reisch B. Genetic variability in regenerated plants//Handbook of plant cell culture. New York, London: Macmillan, 1983. - V. 1. -P.748-769.

160. Reustle Gotz. Okologischer mit Gentechnik? //Dtsch. Weinmag. 2002. -№11. - C.32-34.

161. Rollier M. Introduction des biotechnologies dans le selection// C.r.Acad.agr.Fr. 1988. - 74. - 7. - P.29-32.

162. Rybczynski J.J., Podyma E. Preliminary studies of plant regeneration via somatic embryogenesis induced on immature cotyledons of white lupin (Luri-nus albus L.) II Genetica Polonica. 1993. - 34. - 237-247.

163. Sator C. Studies on shoot regeneration of lupins (Lupinus spp.) //Plant Cell Rep. 1985. -4. - N3.-P.126-128

164. Saxena P.K., Gill R., Rashid A. Optimal conditions for plant regeneration from mesophyll protoplasts of eggplant (Solanum melongena L.) // Sci.hort. (Neth).- 1987.-N3-4.- P. 185-191.

165. Schafer-Menuhr A. Embryo culture of Lupin species // Proc. of 4th Int.Lupin Conf., W.Australia. 1986. - P.26.

166. Schafer-Menuhr A. A modern breeding methods // Proc. of 6th Int. Lupin conf., Chile, 1990. P. 335-336.

167. Schafer-Menuhr A., Busman A., Czerwinski E. Embryo rescue of interspecific hybrids // Proc. of 5lh Int. Lupin conf., July, 5-8, 1988, Poznan, Poland. P. 424-428.

168. Sears C.G., Decard E.L. Tissue culture variability in wheat: callus induction and plant regeneration//Crop Sci. 1982.-22. - P.546-550.

169. Sellars R.M., Southward G.M., Phillips G.C. Adventitious Somatic Em-bruogenesis from cultured immature zygotic embryos of Peanut and Soybean // Crop Sci. 1990.-90.-408-414.

170. Selva E., Stouffs В., Briquet H. In vitro propagation of Vicia faba L. by mi* crocutting and multiple shoot induction. // Plant Cell, Tissue and Organ Cult.1989.- 18.-2.-P. 167-179.

171. Sharma H.S., Gill B.S. Effect of embryo age and culture media on plant growth and vernalization responce in Winter wheat //Euphytica. 1982. -31.-P. 629-634.

172. Sheerman S. A rapid transformation method for Solanum //Plant Cell Rep.- 1988.-7.- 1.-P.13-17.

173. Shenk R.U., Hildebrandt A.C. / Medium and techniques for induction and growth of monocotiledonous and dicotiledonous plant cell cultures // Can.J.Bot.- 1972.-50.- P. 199-204.

174. Singh B.D. Variation in chromosome number and structure in plant cells during in vitro culture // Plant Tissue and Cell culture Application to crop im-provement:Proc.Int.Symp.01omoue, Czechoslovakia, Sept. 24-29, 1984. Prague, 1984.-P. 305-314.

175. Smith D.L. Krikorian A.D. Release of somatic embryogenic potential from excised zygotic embryos of carrot and maintenance of proembryonic cultures in hormone-free medium //Amer.J.Bot. -1989. 76. - 12. - P. 1832-1843

176. Smith D.L., Krikorian A.D. Growth and maintenance of an embryogenic cell culture of Daylily (Hemerocallus) on gormon free medium // Ann.Bot. -1991. -67. P.443-449

177. Smith R.G. Inorganic carbon sources: effect of culture media on plant growth // Crop Sci. 1991. - 98. - P. 114-119.

178. Sroga G.E. Callus and suspension culture of Lupinus angustifolius cv. Tur-cus//Plant Sci.Letttrs. 1983.-V.32, N.l.-P. 183-192.

179. Sroga G.E. Studies on morfogenetic ability of callus cultures of Lupinus spp. / 4th Intern . Lupin conf., Geraldton, Western Australia, 15-22 Aug., 1986

180. Sroga G.E. Plant regenereration of two Lupinus spp. from callus cultures via organogenesis //Plant Sci. 1987. - 5. - V.l. -245-249

181. Tomes Dwight Т., Weissinger Arthur, Sanford John C., Klein Theodore M. Stable transformation of plant cells: Пат: 6258999, США, МПК7 A01H 5/00, A01H 1/00 / Pioneer Hi-Bred International Inc/ N 08/442522 Заявл. 16.05.95. Опубл. 10.07.01. НПК 800/300.1

182. Stamp J.A., Henshaw G.G. Somatic embryogenesis from clonal leaf tissues of cassava //Ann. Bot. (USA), 1987. 59. - N4. - P. 445-450

183. Sticklen M.B., Rumpho M.E., Kenedy R.A. Somatic embryogenesis in rice seedlings // J. Plant Physiol. 1987. - 83. - N4. -P. 75.

184. Stiekema Introduction of forein genes into potato cultivar //Plant Cell Rep., 1988. — 7.-№1. P. 47-51.

185. Tisserat В., Esan E.B., Murashige T. Somatic embryogenesis in angiosperms // Horticultural Rev. 1977. - N. 1. - P. 1 -78.

186. Tulecke W. Somatic embryogenesis in woody perennails. In Cell and Tissue culture in Forestry. Vol.2, eds. J.M.Bonga and D.J Durzan, Martinus Nijhoff Publisher, 1987- Boston, pp. 61-91

187. Vincent J.M. A manual for the practical study of root nodule bacteria. -Blackwell scientific publications, Oxford & Edinburg, England , 1970.

188. Von Aderkas P., Bonga J.M. Formation of haploid embryoids of Larix de-cidua: early embryogenesis // Amer.J.Bot. 1988. - v.75. - N.5. - 690-700.

189. Vuillaum E., Hoff T. Development in vitro d'embryosis immatures de Lupinus albus L. et de Lupinus mutabilis Sweet par culture de gouses, d'ovules on d'enbryons isoles//Agronomie. 1986. - 6. - №10. - P.925 - 930

190. Wan G., Sorensen E.L., Liang G.H. The effect of kinetin on callus characters in alfalfa (Medicago sativa L.)//Euphytica. 1988. - 39. - №3. - P.249-254.

191. Wang L., Huang В., He M., Hao S. Somatic embryogenesis and its hormo-w nal regulation in tissue cultures of Freesia refracta // Ann. of Bot.,1990. 651. C.271-276.

192. Wang L., Huang В., He M., Hao S. Somatic embryogenesis and its hormonal regulation in tissue cultures of Freesia refracta // Ann. of Bot.,1990. 65 -C.271-276.

193. Weed R., Koorneef M., Zabel P. A simple, nondestructive spraying assay for the detection of an active kanamycin resistance gene in transgenic tomato plants //Theor. and Appl. Genet. 1989. - 78,№2. - С. 169-172.

194. Wenzel G., Bolik M., Deimling S. Breeding for disease resistant crop plants by cell culture techniques // Plant tissue and cell culture. New York: A.R.Liss, 1987. - P.343-358.

195. White Ph.R. Plant Tissue cultures: a preliminary report of result obtained in the culturing of certain plant meristems // Arch.exptl.Zellforsch. 1932-Bd.l2-P.602-620.

196. Wright M.S. Plant regeneration by organogenesis in Glycine max.//Plant Cell Rep., 1986.-5.- 150-154.

197. Yang Y.M., He D.G., Scott R.J. Establishment of embryogenic suspension cultures of wheat by continuous callus selection. Aust.J.Plant Physiol., 1991. - 18.-445-452.

198. Yeoman M.M. Plant cell culture technology // Botanical monographs. Planttissue culture. Blackwell Sci.;Publ.-1986.-V.23.1.-P.373.

199. Zgagacz S.E., Rybcznski J.J. Assestment of present status of in vitro culture of lupin. (Rewies). In: Proceedings of 8th International Lupin Conference, 11-16,May,1996.

200. Zgagacz S.E., Rybcznski J.J. Regeneration potential of lupins in in vitro culture conditions. (Rewies). In: Proceedings of First All-Poland Lupin Conference, Poznan 29-30,11,1993, 39-53.

201. Zhan X., Jones D.A., Kerr A. Regeneration of flax plants transformed by

202. Agrobacterium rhizogenes // Plant Mol.Biol., 1988. 11,5. -P.551-559.

203. Zhou H., Konzak S.F. Improvement of anther culture methods for haploid production in wheat //Crop Sci. 1989. - 29. - N3. - P. 817 - 821.

204. Ziauddin A., Simion E., Kasha K.J. Improwed plant regeneration from shed microspore culture in barley (Hordeum vulgare L. cv.igr)//Plant Cell Rep. -1990. 9. - N.2. - P.69-72.

Информация о работе

Костюченко, Дина Алексеевна
кандидата сельскохозяйственных наук
Брянск, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Биотехнологические приемы расширения исходного материала для селекции люпина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы