Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические исследования по безотходному использованию околоплодника ореха черного

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические исследования по безотходному использованию околоплодника ореха черного"

На правах рукописи

Дудников Михаил Эдуардович

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО БЕЗОТХОДНОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ОКОЛОПЛОДНИКА ОРЕХА ЧЕРНОГО (Juglans nigra L.)

, 03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 2006

Работа выполнена в Пятигорской государственной фармацевтической академии и Ставропольском государственном университете

Штучный руководитель: доктор биологических наук, доиент

Мешк-Гусейнов Валерий Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Дударь Юрий Александрович

доктор химических наук, профессор Бры калов Анатолий Валерьевич

Ведущая организация: Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

Защита состоится 2006 г. в часов на заседа-

нии диссертационного совета ДМ 212.256.04. при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, кора 2, зуд. 506

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1.

Автореферат разослан /сРЛ^У?4?__ 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Джандарова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время, как в России, так и за рубежом, наблюдается устойчивая тенденция к повышению интереса населения и фирм производителей к парафармацевтическим и гомеопатическим средствам из растительного сырья. Несмотря на особую социальную значимость увеличения производства этих средств, уровень их выпуска в России обеспечивает удовлетворение потребности населения всего лишь на 30-35%. Одной из причин такого положения является сокращение промышленного возделывания лекарственных растений и ограничение возможности заготовки их дикорастущих видов.

Одним из путей решения проблемы расширения ассортимента отечественных гомеопатических и парафармацевтнческих средств является освоение промышленной переработки растений, зарекомендовавших себя как эффективно используемые в традиционной медицине и одновременно имеющих достаточную сырьевую базу (Яковлев, 1995; Арзамасцев, 1997).

Таким объектом является орех черный Juglans nigra L. семейства Juglandaceae L. Растение завезено на Северный Кавказ в XIX веке как интрЬдуцент (Мисник, 1963; Дюваль-Строев, 1963; Кулыгин, 1998). Лист и околоплодник ореха черного в Северной Америке издавна использовались в качестве общеукрепляющего, иммуномодулирующего, противопарази-тарного средства. На Российском рынке в последнее время появились биологически активные добавки к пище на основе чёрного ореха, производителями которых, в основном, являются иностранные фирмы.

Ранее исследование биологически активных веществ (БАВ) листа ореха черного выполнено Шинкаренко A.A., Дородиева В.И. (1959). Ими была выделена полифенольная фракция и проведен фармакологический скрининг. Однако отечественных парафармацевтнческих и гомеопатических средств на основе ореха черного до сих пор предложено не было.

В литературе сведения о ресурсах этого несомненно интересного растительного объекта и о возможностях его использования в медицинской практике и косметологии ограничены (Аленгьев, 1988,1998; Поповичев, 1998).

Изучение сырьевой базы ореха черного региона Северного Кавказа, выявление оптимальных условий его заготовки, проведение подробных бнотехнолошческих исследований этого растения будут способствовать расширению диапазона использования флоры Северного Кавказа и пополнению ассортимента парафармацевтнческих н косметических средств полученных из фитосырья.

Поэтому биотехнологические исследования ореха черного, его малоотходная комплексная переработка-вопрос важный и своевременный.

Цели работы — проведение биотехнологических исследований по безотходному использованию околоплодника ореха черного и создание технологической схемы переработки околоплодника ореха черного с использованием селективных экстракционных схем.

Задачи исследования:

• изучить с помощью химических и биотехнологических методов основные групп действующих веществ околоплодника ореха чёрного;

• оптимизировать способы стандартизации сырья с помощью физико-химических методов анализа;

• разработать комплексную бнотехнологическую схему переработки свежего околоплодника ореха чёрного с учетом характеристик сырья;

• изучить влияние двух независимых биотехнологических процессов — сушки и замораживания на выход основных БАВ ореха черного;

• получить матричную гомеопатическую настойку ореха чёрного и разработать для нее нормы качества;

• получить масляный экстракт околоплодника ореха черного и предложить для него нормы качества;

• провести биологическое исследование матричной настойки и масляного экстракта;

• разработать нормативную документацию на матричную настойку ореха черного м его масляный экстракт.

Научная новизна. Проведены фотохимические исследования околоплодника ореха чёрного. Установлен его элементный состав и подтверждено высокое содержание дубильных веществ, аскорбиновой кислоты, органических кислот и флавоноидов. Показано, что орех черный содержит значительное количество гидрофобных компонентов — хлорофилла и каротиноидов. Впервые путем сравнительного биологического тестирования спирта водных извлечений из свежих и высушенных околоплодников ореха чёрного доказана более высокая эффективность извлечений из свежесобранного сырья.

Разработана оригинальная комплексная биотехнологическая схема переработки свежих околоплодников ореха черного с использованием двухфазного процесса экстракции. При этом получены два целевых продукта—матричная настойка и масляный экстракт. Установлены нормы оценки их качества.

Экспериментально доказано что, разработанные парафармацевгичес-кие и гомеопатические средства обладают выраженной биологической активностью: матричная настойка ореха черного достоверно снижает содержание сахара в крови при использовании модели аллоксанового диабета, а масляный экстракт при наружном применении обладает репара-тивным действием, оба средства не токсичны.

Теоретическая и практическая значимость. Полученный экспериментальный материал послужил теоретическим основанием дм разработки комплексной биотехнологнческой схемы переработки свежего околоплодника ореха чёрного. С помощью разработанных технологических процессов путем последовательной экстракции действующих БАВ получены следующие продукты: матричная гомеопатическая настойка и масляный экстракт. Определены нормы стандартизации их качества, которые включены в разработанную нормативную документацию (НД). Разработаны ТУ и ТИ на настойку и масляный экстракт. Определена область применения полученных продуктов в качестве гомеопатических средств и средств дерматокосметики.

Основные положения, выносимые на защиту:

• разработка технологических процессов экстракции свежих околоплодников ореха чёрного позволяет получить парафармацевтические и гомеопатические средства с заданными фарматгерапевтическими свойствами;

• фитохимические исследования околоплодника ореха чёрного доказывают целесообразность его заготовки в регионах Северного Кавказа (Ставропольский край, Краснодарский край, Ростовская область) в августе;

• Экстракция липоф ильных веществ околоплодника в двухфазной системе растворителей: спирт - растительное масло дает максимальный выход готовых продуктов;

Апробация работы и публикация результатов исследований. Основные положения диссертационной работы доложены на: 57-ой, 58-оЙ, 59-оЙ региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (г. Пятигорск, 2002,2003,2004 г.), на 61-ой научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Волгоград, 2003 г.) и на региональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых Краснодарского края «Медицинская наука и здравоохранение» (г. Анапа, 2004,2005,2006 г.).

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в которых отражено основное содержание диссертации.

Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста в компьютерном наборе, содержит 17 рисунков и 29 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследований, трех глав собственных исследований, выводов, ¿писка литературы, который включает 127 отечественных и 23 зарубежных источника, и приложения.

Материалы и методы исследования

Объектом исследований являлся околоплодник ореха черного, произрастающего на территории Ставропольского и Краснодарского краев, Ростовской области, а также полученные из него экстракты.

В диссертационной работе использовались стандартные общепринятые методы исследований (Георгиевский, 1976; Гринкевич, 1983; Беликов, 2005. Обработка экспериментальных данных (Беленький, 1963), построение трафиков проводилась с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel.

Схема проведения исследований приведена на рисунке 1.

Рисунок 1 — Схема проведения исследований

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Фнтохнмнческне и технологические исследования околоплодника ореха черного

Установлено, что культуры ореха черного, созданные посевом в изучаемой местности, достаточно многочисленны и имеют надежную сырьевую базу для производства. В ходе исследований определены товароведческие

показатели сырья, собранного в различных районах произрастания, в разные годы, и в разное время сбора. Плоды собирались с деревьев 30-40-летнего возраста произрастания в Ростовской области, Ставропольском и Краснодарском краях в июне, июле, августе и сентябре 2002-2005 гг. Как следует из полученных данных, основные числовые показатели, зеленого околоплодника черного ореха имеют незначительный разброс в зависимости от места произрастания.

Минеральный состав околоплодника ореха чёрного включает В а, В, ВЦ С а, У, УЪ, Со, Мп, Си, Мо, N1, Бп, РЬ, Бг, Бс, Т1, И, Р, Сг, 2л, Тт. В целом содержание отдельных элементов не превышает средние значения распространенности этих химических элементов в земной коре (ВегаШо, 1985) и фитосырье (Ноздрюхина, 1980; Медико-биологические..., 1990; СанПиН 2.3.2.1293-03). Количество токсических элементов в золе околоплодника, оказалось не выше допустимых норм. А присутствие таких элементов как марганец, медь, фосфор, хром, цинк, бор позволяет спрогнозировать терапевтическую значимость околоплодника черного ореха.

Результаты анализа качественного состава БАВ приведены в таблице 1.

Таблица 1 — Результаты анализа качественного химического состава околоплодника ореха черного

БАВ Реактивы, используемые для щентифккадаи Извлечения из околоплодника ореха черного

Спиртовые ПетрояейыыП эфир

Дубильные вещества Раствор хлорида железа (Ш) 1% Зеленое, переходящее в черное окрашивание

Раствор ванилина в конц серной кислоте 1% Малиновое окрашивание Слабое окрашивание

Флавоноиды Цианндиновая проба Оранжево-красное окрашивание —

Натрия гндроксщ 10% Желтое окрашивание —

Алюминия хлорки Желтое окрашивание

Аскорбиновая кислота Раствор 2,6-дих-лорфешлнденин-дофенолята натрия Розовое окрашивание раствора

Органические кислоты Раствор ацетата сеинпа 2% в уксусной кислоте Белый осадок —

Каротиноиды Раствор фосфорномо-либденовой кислоты Синее окрашивание Синее окрашивание

Хлорофилл гид ро \и ноны УФ-светлрн 320 им Красное свечение Красное Свечение

Как следует из представленных данных, химический состав околоплодника ореха черного довольно разнообразен и богат как гидрофильными, так и гидрофобными соединениями. Для подтверждения качественного химического состава полученных спиртовых и эфирных извлечений нами были изучены их УФ спектры.

На рисунке 2 представлена спектральная кривая поглощения спиртового извлечения околоплодника ореха черного в диапазоне длин волн 240400 нм с двумя максимумами поглощения, характерных для полифенол ь-ных соединений.

На рисунке 3 приведена спектральная кривая поглощения пигментного состава лнпидной фракции околоплодника ореха черного.

260

400

I 300 320 330 МО 360 380

длина волны, нм

Рисунок 2 — Спектральная кривая поглощения спиртового извлечения из околоплодника ореха черного

оптическая плотность

350 400 410 420 440 450 480 600 в20 640 650 660 600

длина волны, нм

Рисунок 3 - Спектральная кривая поглощения петролейного извлечения из околоплодника ореха черного

На профиле спектра отмечено 2 максимума, характерных для кароти-ноидов {>. = 410 им), и хлорофилла (X = 668 нм).

Следующим этапом наших исследований явилось установление оптимального срока заготовки околоплодника. Для этого был проведен сравнительный анализ 12 образцов сырья, собранных в разные сроки созревания плодов ореха черного. Динамика накопления основных групп БАВ ореха черного приведены в таблице 2.

Таблица 2—Результаты исследования химического состава околоплод ника ореха черного в зависимости от сроню сбора (в перерасчете на сухое вещество, %)

Показатели Содержание, %

Июнь Июль Август Сентябрь

Сухой остаток. % 17,7^0,6 23,7±1.1 32.6Н.6 49,7*2.1

Дубильные вещества, % 3,2*0,12 8,6*031 14,1*0,44 8,3*021

Кислота аскорбиновая, мг% 701±83 402±8,20 440*63 130,2*2,6

Кислоты органические, % 102Ш.61 93±0,40 9Г7±0,55 5,3*037

Флавоноиды, % 0.012^0,0005 0.023±0.0001 0,044*0.002 0.015*0,0007

Общие лип иды, % 1,01±0,05 1,2*0.06 1,8*0.09 1,б±ао8

Каротиноиды, мг% 22&Ш.045 10,41*0,21 31,73*0,63 22,6 (±0,45

Хлорофиллы, мг% 15,6740,91 13,62*0,27 5,28*0,12 3,26*0,06

Как следует из данных, представленных в таблице, в околоплоднике ореха черного по мере созревания накапливаются как липофильные, так и гидрофильные БАВ. Максимальное количество основных природных соединений в околоплоднике ореха черного наблюдается в июле-августе, а в середине сентября содержание многих веществ резко падает; что свидетельствует об активно проходящих биохимических процессах старения. Исходя из этого, нами установлен оптимальный срок сбора для околоплодника ореха черного — август. Установлено накопление дубильных веществ в гидрофильной и каротиноидов в липофнльной фракциях сырья; в дальнейших исследованиях мы ориентировались на эти труппы БАВ.

Д ля изучения биологической активности экстракта околоплодника ореха черного в качестве биологической модели использовали культуру Рагашеаит саийаШт, выделенную из естественных мест обитания, та которой получены отдельные клоны (из одной особи бесполым путем). Результаты исследований приведены в таблице 3.

Как следует го результатов, представленных в таблице 3, извлечения го околоплодника ореха черного, как из свежего, так и из высушенного, стимулируют размножение парамеций, переводя их из стационарной в лаг-фазу. При этом установлено, что наиболее выраженное стимулирующее влияние на размножение клеток инфузорий оказывает фнтокомпозиция из

свежего околоплодника, которая стимулировала размножение в концентрации, наминая с 10"3, Данное стимулирующее действие наиболее выражено проявляется с увеличением разведения до Ю'МО4*. Ф иго композиция, выделенная из сухого сырья, заметно стимулировала размножение только в разведении 1СН. Таким образом, извлечение из свежего околоплодника проявляет активность, которая подчиняется приншпу гомеопатического разведения. Как следует из полученных в дальнейшем данных, повышение толерантности клеточной культуры к неблагоприятному воздействию раствора перекиси водорода достоверно значимо оказывают оба извлечения го околоплодника. Однако протектнвная активность фшокомплекса свежего околоплодника ореха черного в среднем на 50% выше, чем сухого. Таким образом, в хроническом опыте ангиоксидантная активность экстракта, полученного из свежего околоплодника выше, чем у такового из сухого. Это позволяет сделать вывод о том, что в процессе сушки ряд веществ, определяющих антиоксидантное действие околоплодника ореха черного, подвергаются деструкции.

Таблица 3 — Результаты сравнительной оценки стимулирующего действия извлечений из околоплодника ореха черного свежего и высушенного на размножение инфузорий

Разведение Количество особей па рамеций в поле зрения

Опыт острый Опыт хронический

Высушенное Свежее Высушенное Свежее

1<Н 3-5 шт. 3-5 шт. 3-5 шт. 5-8 шт.

10° Так же Так же 3-5 шт. 20-25 шт.

КГ* «-« «-« 20-25 шт. 5-15 шт.

10' 10-15 шт. 30 шт.

Ю"4 3-5 шт. 50-70 шт.

С целью разработки технологической схемы комплексной переработки околоплодника ореха черного нами были изучены сроки и условия хранения свежего сырья. Установлено уменьшение концентрации дубильных веществ и аскорбиновой кислоты в процессе хранения околоплодника ореха черного; особенно быстрые изменения происходят при температуре свыше +20°С. При хранении в темном месте внешних изменений в плодах ореха и падения концентрации действующих веществ не наблюдалось в течение I месяца; при замораживании плодов — 3 месяцев. Таким образом, наиболее оптимальным является хранение плодов ореха черного до переработки в опилках в темном и прохладном месте в течение не более 1 месяца, в замороженном состоянии допустимо хранить более 3-х месяцев.

Тем самым, доказана целесообразность проведения технологического процесса переработки сырья в сезон сбора околоплодника ореха черного.

2. Разработка комплексной биотехнологической схемы производства гомеопатических н парафармацевтнческнх средств на основе околоплодника ореха черного

В результате проведенных исследований, нами предложена биотехнологическая схема последовательной экстракции из свежего околоплодника ореха черного (I этап - спирт этиловый, 70%, II этап — двухфазная система экстрагенгов: спирт этиловый 90%—масло растительное в соотношении 1

Бнсггехнйлошческая схема комплексной переработки околоплодника ореха черного представлена на рисунке 4. Целевые продукты приведенной схемы — гомеопатическая настойка ореха черного (матричная) и масляный экстракт.

Рисунок 4 - Бнотехнолошческая схема комплексной экстракции околоплодника ореха черного

Результаты качественного и количественного состава БАВ гомеопатической настойки представлены в таблице 4. Из полученных данных следует, что все проанализированные серии настойки ореха черного по основным показателям соответствуют требованиям НД,

Таблица 4 — Результаты анализа пяти серий настойки ореха черного

Показатель качества Норматив по ГФ XI и проекту НД Серии

1 1 2 | 3 | 4 | 5

Описание Жидкость темно-бурого цвета Со слабым специфическим запахом Соответствует

Подлинность:

- дубильные вещества Образование осадка (мути) с 1% раствором желатина; к 1 мл препарата добавляют 3-5 капель раствора железоаммо-ниевых квасцов, появляется черно-зеленое окрашивание. Положительная

- флавоноиды Оранжево-красное окрашивание в результате цнакидкловой реакции; максимум поглощения комплекса спиртового раствора с А1СЬ при длине волны 398 ± 2 им Положительная

Содержание этилового спирта, % об, не менее 65,0 67,7 66,8 65,1 66,3 69,2

Сухой остаток (экстрактивные вещества), %, не менее 1,72 1,84 1.78 1,91 1,69

Содержание действующих веществ, %

- дубильных ве шести Не менее 1,2 2,02 1,99 1,94 1,96 2,04

- флавотюидов Не менее 0,01 0,019 0,018 0,15 0,017 0,021

Плотность От 0,970 до 0,995 гУ см1 0,988 0,984 0,974 0,979 0,991

Микробиологическая чистота В 1 мл препарата должно быть не более 104 аэробных бактерий; ¡О2 общее число грибов; itf эн-теробактерий и других грамот-рицагельньк бектерпй; отсутствие в 1 мл — Pseiidomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia cott Соответствуют

В процессе хранения выявлено, что основные показатели качества настойки стабильны в течение 2,5 лет. Следовательно, установлен срок хранения — 24 месяца.

Стандартизацию масляного экстракта околоплодника ореха черного проводили по следующим показателям: описание, подлинность, числовые показатели, количественное содержание хлорофилла и каротиноцдов. Проведенные исследования позволили регламентировать качество масла околоплодника ореха черного по комплексу основных параметров. Все исследования проведены для образцов масляного экстракта, заложенных на хранение при пограничных значениях нормальной температуры помещения (при температуре+15°С и при температуре +25°С).

Установлено, что накопление в масляном экстракте перекисных соединений зависит от условий хранения, в частности от температуры. При хранении экстракта при пониженной комнатной температуре (+15°С) изменений в показателях кислотного и перекисного числа не наблюдали в течение 2,5 лет.

3. Фармакологическое изучение разработанных гомеопатических и парафармацевггическнх средств

С помощью биохимических исследований крови у лабораторных животных определяли токсичность полученной гомеопатической настойки (таблица 5).

Таблица 5 — Результаты клинического анализа крови (M±m, п -= 12)

Показатели I группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 trvymiri

Эритроциты. 10" г/л 4,2*0,03 4.7±ai3 4АМД 4,54*0.05 4,6±0.13

Ретнкулоциты. % 2Л5И),12 2,i6tai9 Z14±0.1 2,1510,1 2,15*0,2

Гемоглобин, г/л 144.1±2Л 139, 144.7±3 144.5*4,4 147?4±7/з

СОЭ. мм/ч 23±0,4 2,0*05 2,1±03 2,I±ft4 23±0,4

Гемагокрит 0.45*0,02 0,46ЫШ2 0,45*0.01 0.42±0,01 0,44±0.02

Осмотическая резистентность, %ЫаС1 0.37*0,07 031±0,02 035*0,03 03&0.01 0,4I=fc0,03

Лейкоциты, 10 ч/л 4,9*0.2 5,liOf(W 4,8*0,2 5.1±ft7 4,0*0,09

Эозинофклы. % 1,0+0,18 1.2±0.1 1,0*0,18 0.8±0,18 1.5Щ.18

Базофилы, % 0,0 0.0 0,0 0.0 0.0

Нейтрофилы палочковдерные, % 5.9±03 53±0J 5,4±0,4 5.6*0.5 5.7±0.4

Нейтроф|1жгсегметодцф1гыг, % 32,6*0.9 34,Sil,8 33.3±1.8 32.6*0.9 34.8±l,08

Лимфоциты, % 56Д±0,8 52.1Ü.8 54

Моноциты. % 4J±0.42 4.4±03 43±0.03 43=t0.4 4.4±02

Тромбоциты. 10 7л 528J±2I 520.1±11 517,0*7,3 522.0t 16 521,0*18

Примечание: для всех показателей р < 0,05.

Гематологические исследования показали отсутствие достоверных отличий по результатам клинического анализа крови у животных, принимавших воду очищенную, спирт этиловый 10% и матричную настойку околоплодника ореха черного в объеме 2,5 и 5 мл/кг в течение 28 дней, что свидетельствует об отсутствии токсичности разработанной матричной настойки.

Исследование гипогликем ической активности матричной настойки показало, что содержание глюкозы в плазме крови у животных с аллоксановым диабетом под влиянием разработанной настойки из околоплодника ореха черного достоверно снижалось до 45% относительно контрольной группы.

При изучении ранозаживляющей активности наружных лекарственных форм на модели термического повреждения кожи у белых крыс, динамику заживления ожогового повреждения оценивали по изменению площади раны весовым методом. Результаты ожогового повреждения оценивались на 2-е и 8-е сутки. Результаты эксперимента отображены на рис. 5.

в*сед(м)

31 2.52 15 I

0,5 (Н-

0 2 4 В 8 10 12 14 16

Врв«м, сутки

| « Кануогь №стобгвмки —^—МззгнЛ экстракт иреачержто!

Рисунок 5—Влияние масла ореха черного на процесс заживления ожоговой раны

Под влиянием масляного экстракта ореха черного наблюдали равномерное образование мягкой корочки. Нагноения ран у опытных животных отмечено не было. Визуально животные опытных и контрольных групп не отличались ни по поведению, ни по потреблению корма и воды. Различие во внешнем виде животных разнились от контрольной группы, которым ежедневно наносили физиологический раствор на поврежденную поверхность. Площадь ожогового повреждения достоверно уменьшилась по сравнению с контролем, но несколько была выше, чем у масла облепихи.

Контролировали течение воспалительною процесса с помощью скорости оседания эритроцитов. Под влиянием масла ореха черного скорость оседания эритроцитов достоверно уменьшалась относительно физиологического раствора и масла облепихи к 15 суткам. Таким образом, противоожоговая активность у масла ореха черного сравнима с активностью масла облепихи.

ВЫВОДЫ

1. Проведены фотохимические исследования околоплодника ореха черного и установлен его элементный состав. Обнаружены марганец, медь, фосфор, хром, цинк, бор, молибден. Количественное содержание токсических элементов, оказалось не выше допустимых норм. Идентифицированы основные биологически активные вещества и установлено их количественное содержание: дубильных веществ — 14,1%, аскорбиновой кислоты -0,44%, органических кислот—до 9%, суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин - 0,04%, а также липидов общих - 1,8%, каротиноидов -32 мг%, хлорофилла-до 6,1 мг%.

2. 'Установлено, что максимальное количество биологически активных веществ в околоплоднике накапливается в августе. Определены сроки хранения и условия хранения свежего сырья до переработки: при температуре 15°С в темном месте до 30 дней, в замороженном состоянии при -8"С до 3-х месяцев.

3. Проведен и теоретически обоснован выбор способа экстракции из свежего околоплодника ореха черного на основании базовых технологических характеристик сырья: двухфазная экстракция. Разработана комплексная технологическая схема, позволяющая из свежего околоплодника ореха черного последовательной экстракцией получить матричную гомеопатическую настойку (70%) и масляный экстракт.

4. Разработана технологии производства масляного экстракта из шрота околоплодника, остающегося после получения настойки. Предложена экстракция липофильных веществ двухфазной системой экстрагентов: смесью спирта 90% и масла растительного в соотношении 1 с последующим удалением спирта этилового при нагревании.

5. Установлены нормы и критерии качества и проведена стандартизация настойки гомеопатической околоплодника ореха черного по следующим показателям: описание, подлинность, сухой остаток, содержание спирта этилового, микробиологическая чистота, количественное содержание дубильных веществ и флавоноидов. Определен срок годности настойки - 2 года.

6. Установлены нормы и критерии качества, проведена стандартизация масляного экстракта околоплодника ореха черного по следующим параметрам: описание, подлинность, числовые показатели, содержание каротиноидов

и хлорофнллов. Установлены условия хранения и срок годности масляного экстракта околоплодника черного ореха, который составил 24 месяца.

7. Проведены фармакологические исследования настойки ореха черного: щучена острая и субхроническая токсичность. Доказано, что настойка околоплодника ореха черного является нетоксичным препаратом(Ц>;0) и обладает гипогликемичесютм действием.

8. Исследовано противоожоговое и ранозажявляющее действие масляного экстракта ореха черного, и установлено, что репаративная активность масла ореха черного в среднем на 30 — 35 % выше по сравнению с контролем, и не значительно уступает маслу облепихи.

9. По результатам проведенных исследований составлена и утверждена нормативная документация ТУ и ТИ на сырье, матричную настойку и масляный экстракт околоплодника ореха черного.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Дудников М.Э., Арчинова Т.Ю., Андреева И.Н. Экспериментальное обоснование способа получения настойки ореха черного // Разработка, исследование и маркетинг новой фармац. продукции: сб. науч. тр. — Пятигорск, 2002. - С. 45-46.

2. Дудников М.Э. Технологические аспекты и изучение эффективности суппозиториев с экстрактом черного ореха в комплексном бальнеолече-нии // Мат, б 1-й итог. науч. конф. студентов и молодых ученых ВолГМУ 21-25 апр. 2003 г. — Волгоград, 2003. — С. 171.

3. Дудников М.Э., Арчинова Т.Ю., Андреева И.Н. Сравнительные исследования суммарных фитопрепаратов, полученных из околоплодников некоторых разновидностей орехов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармац, продукции: сб. науч. тр. — Пятигорск, 2003. — С. 203-204.

4. Дудников М.Э., Камова H.H., Степанова Э.Ф. Биологически активные вещества ореха черного и возможности их применения в медицинской практике // Медпайн. - 2004. - - С. 43-44.

5. Дудников М.Э., Арчинова Т.Ю., Андреева И.Н. Комплексная технология переработки околоплодника ореха черного как возможность получения эффективных и экономичных БАД // Медицинская наука и здравоохранение: Мат. 2-й регион, науч.-практнч. конф. молодых ученых и студентов Краснодарского края 21-23 апр. 2004 г.— Анапа, 2004.— С. 142-143.

6. Дудников М.Э., Арчинова Т.Ю., Андреева И.Н. Разработка малоотходной технологической схемы переработки околоплодника ореха черного для получения лекарственных и косметических средств // Разработка, исследование и маркетинг новой фармац. продукции: сб. науч. тр. — Пятигорск, 2004. - С. 81-82.

7. Дудников М.Э., Мелик-ГусеЙнов В.В. Фармако-технологические и ресурсные исследования ореха черного, произрастающего в районе Кавказских минеральных вод // Здоровье и образование в XXI веке: маг. VI между нар. науч.-практич. конф. — Москва, 2005. — С. 333-334.

8. Дудников М.Э., Мелик-Гусейнов В.В. Динамика БАВ в зависимости от сроков и условий храения оклоплодников ореха черного В.В. Мелик-Гусейнов // Владикавказский медико-биологический вестник— Владикавказ, 2005.-С. 189-190.

9. Дудников М.Э. Разработка и фармакотехнопогнческое изучение па-рафармацевтических препаратов ореха черного // Медицинская наука и здравоохранение: Маг. З-ей регион, науч.-практич. конф. молодых ученых и студентов Краснодарского края 21-24 апр. 2005 г.-Анапа, 2005. -С. 312-313.

10. Дудников М.Э., Мелик-Гусейнов В.В. МнкроэлеменгныЙ и фито-химический анализ околоплодника ореха черного (сем. ШОЭАСЕАЕ) // Вестник СГУ. - 2006. - №47. - С. 130-134.

Подписано в печать 22,11.2006 Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 1,05 Уч.-изд.л. 0,89

Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ 422

Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе Ставропольского государственного университета. 355009, Ставрополь, ул.Пушкина, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дудников, Михаил Эдуардович

Введение.

ГЛАВА 1. СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО СОЗДАНИЮ НОВЫХ ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ И ПАРАФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МАЛОИСПОЛЬЗУЕМОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ.

1.1. Современное состояние российского рынка фитосредств.

1.2. Применение растений рода Дщкт в народной и научной медицине.

1.2.1. Использование в медицине ореха грецкого.

1.2.2. Использование в медицине ореха чёрного.

1.3. Технологические аспекты создания фитоэкстракционных препаратов. 18 Заключение по обзору литературы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы исследований.

2.2. Методики исследования.

3.1 .Изучение ареала произрастания ореха черного на Северном Кавказе и его сырьевых запасов.

3.2. Товароведческий анализ околоплодника ореха черного.

3.3. Фитохимический анализ околоплодника черного ореха.

3.3.1. Элементный состав околоплодника ореха черного.

3.3.2. Качественный анализ биологически активных веществ околоплодника черного ореха.

3.3.3. Изучение количественного содержания основных групп БАВ в околоплоднике ореха черного.

3.4. Сравнительный анализ биологической активности извлечений околоплодника ореха черного в зависимости от сушки.

3.5. Определение срока и условий хранения свежего околоплодника черного ореха до его переработки.

ГЛАВА 4. Разработка комплексной биотехнологической схемы производства гомеопатических и парафармацевтических средств на основе околоплодника ореха черного.

4.1. Обоснование параметров экстрагирования свежих околоплодников ореха черного.

4.2. Биотехнологическая схема комплексной экстракции свежего околоплодника черного ореха.

4.3. Стандартизация настойки околоплодника ореха черного гомеопатической

ГЛАВА 5. ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАЗРАБОТАННЫХ ИЗ ОКОЛОПЛОДНИКА ОРЕХА ЧЕРНОГО ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ И ПАРАФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ.

5.1. Изучение общетоксичного действия настойки ореха черного.

5.2. Изучение гипогликемической активности настойки ореха черного.

5.3. Изучение противоожогового и ранозажиавляющего действия масляного экстракта ореха черного.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические исследования по безотходному использованию околоплодника ореха черного"

В последнее время, как в России, так и за рубежом, наблюдается устойчивая тенденция к повышению интереса населения и фирм производителей к парафармацевтическим и гомеопатическим средствам из растительного сырья. Несмотря на особую социальную значимость увеличения производства этих средств, уровень их выпуска в России обеспечивает удовлетворение потребности населения всего лишь на 30-35%. Одной из причин такого положения является сокращение промышленного возделывания лекарственных растений и ограничение возможности заготовки их дикорастущих видов.

Одним из путей решения проблемы расширения ассортимента отечественных гомеопатических и парафармацевтических средств является освоение промышленной переработки растений, зарекомендовавших себя как эффективно используемые в традиционной медицине и одновременно имеющих достаточную сырьевую базу (Яковлев Г.П., 1995; Арзамасцев А.П., 1997).

Таким объектом является орех черный Juglans nigra L. семейства Juglandacecie L. Растение завезено на Северный Кавказ в XIX веке как ин-тродуцент (Мисник Г.Е, 1963; Дюваль-Строев М.Р. 1963; Кулыгин A.A., 1998). Лист и околоплодник ореха черного в Северной Америке издавна использовались в качестве общеукрепляющего, иммуномодулирующего, про-тивопаразитарного средства. На Российском рынке в последнее время появились биологически активные добавки к пище на основе чёрного ореха, производителями которых, в основном, являются иностранные фирмы.

Ранее исследование биологически активных веществ (БАВ) листа ореха черного проводились в Пятигорской фармацевтической академии, была выделена полифенольная фракция и проведен фармакологический скри-нинг.( Шинкаренко, А.Л.,1967). Однако отечественных парафармацевтических и гомеопатических средств на основе ореха черного до сих пор предложено не было.

В литературе сведения о ресурсах этого, несомненно, интересного растительного объекта и о возможностях его использования в медицинской практике и косметологии ограничены (Алентьев А.П., 1988, 1998; Попови-чев В.В., 1998).

Изучение сырьевой базы ореха черного региона Северного Кавказа, выявление оптимальных условий его заготовки, проведение подробных биотехнологических исследований этого растения будут способствовать расширению диапазона использования флоры Северного Кавказа и пополнению ассортимента парафармацевтических и косметических средств полученных из фитосырья.

Поэтому биотехнологические исследования ореха черного, его малоотходная комплексная переработка-вопрос важный и своевременный.

Цели работы - проведение биотехнологических исследований по безотходному использованию околоплодника ореха черного и создание технологической схемы переработки околоплодника ореха черного с использованием селективных экстракционных схем. Задачи исследования:

• изучить с помощью химических и биотехнологических методов основные группы действующих веществ околоплодника ореха чёрного;

• оптимизировать способы стандартизации сырья с помощью физико-химических методов анализа;

• разработать комплексную биотехнологическую схему переработки свежего околоплодника ореха чёрного с учетом характеристик сырья;

• изучить влияние двух независимых биотехнологических процессов -сушки и замораживания на выход основных БАВ ореха черного;

• получить матричную гомеопатическую настойку ореха чёрного и разработать для нее нормы качества;

• получить масляный экстракт околоплодника ореха черного и предложить для него нормы качества;

• провести биологическое исследование матричной настойки и масляного экстракта;

• разработать нормативную документацию на матричную настойку ореха черного и его масляный экстракт.

Научная новизна. Проведены фитохимические исследования околоплодника ореха чёрного. Установлен его элементный состав и подтверждено высокое содержание дубильных веществ, аскорбиновой кислоты, органических кислот и флавоноидов. Показано, что орех черный содержит значительное количество гидрофобных компонентов - хлорофилла и каротинои-дов. Впервые путем сравнительного биологического тестирования спирто-водных извлечений из свежих и высушенных околоплодников ореха чёрного доказана более высокая эффективность извлечений из свежесобранного сырья.

Разработана оригинальная комплексная биотехнологическая схема переработки свежих околоплодников ореха черного с использованием двухфазного процесса экстракции. При этом получены два целевых продукта -матричная настойка и масляный экстракт. Установлены нормы оценки их качества.

Экспериментально доказано что, разработанные парафармацевтиче-ские и гомеопатические средства обладают выраженной биологической активностью: матричная настойка ореха черного достоверно снижает содержание сахара в крови при использовании модели аллоксанового диабета, а масляный экстракт при наружном применении обладает репаративным действием, оба средства не токсичны.

Теоретическая и практическая значимость. Полученный экспериментальный материал послужил теоретическим основанием для разработки комплексной биотехнологической схемы переработки свежего околоплодника ореха чёрного. С помощью разработанных технологических процессов путем последовательной экстракции действующих БАВ получены следующие продукты: матричная гомеопатическая настойка и масляный экстракт.

Определены нормы стандартизации их качества, которые включены в разработанную нормативную документацию (НД). Разработаны ТУ и ТИ на настойку и масляный экстракт. Определена область применения полученных продуктов в качестве гомеопатических средств и средств дерматокосметики. Основные положения, выносимые на защиту:

• разработка технологических процессов экстракции свежих околоплодников ореха чёрного позволяет получить парафармацевтические и гомеопатические средства с заданными фармакотерапевтическими свойствами;

• фитохимические исследования околоплодника ореха чёрного доказывают целесообразность его заготовки в регионах Северного Кавказа (Ставропольский край, Краснодарский край, Ростовская область) в августе;

• Экстракция липофильных веществ околоплодника в двухфазной системе растворителей: спирт - растительное масло дает максимальный выход готовых продуктов;

Апробация работы и публикация результатов исследований. Основные положения диссертационной работы доложены на: 57-ой, 58-ой, 59-ой региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (г. Пятигорск, 2002, 2003, 2004 г.), на 61-ой научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Волгоград, 2003 г.) и на региональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых Краснодарского края «Медицинская наука и здравоохранение» (г. Анапа, 2004, 2005, 2006 г.).

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в которых отражено основное содержание диссертации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста в компьютерном наборе, содержит 17 рисунков и 29 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследований, трех глав собственных исследований, выводов, списка литературы, который включает 127 отечественных и 23 зарубежных источника, и приложения.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Дудников, Михаил Эдуардович

Общие выводы

1. Проведены фитохимическне исследования околоплодника ореха черного и установлен его элементный состав. Обнаружены марганец, медь, фосфор, хром, цинк, бор, молибден. Количественное содержание токсических элементов, оказалось не выше допустимых норм. Идентифицированы основные биологически активные вещества и установлено их количественное содержание: дубильных веществ - 14,1%, аскорбиновой кислоты - 0,44%, органических кислот - до 9%, суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин - 0,04%, а также липидов общих - 1,8%, каротиноидов -32 мг%, хлорофилла - до 6,1 мг%.

2. Установлено, что максимальное количество биологически активных веществ в околоплоднике накапливается в августе. Определены сроки хранения и условия хранения свежего сырья до переработки: при температуре 15 °С в темном месте до 30 дней, в замороженном состоянии при -8°С до 3-х месяцев.

3. Проведен и теоретически обоснован выбор способа экстракции из свежего околоплодника ореха черного на основании базовых технологических характеристик сырья: двухфазная экстракция. Разработана комплексная технологическая схема, позволяющая из свежего околоплодника ореха черного последовательной экстракцией получить матричную гомеопатическую настойку (70%>) и масляный экстракт.

4. Разработана технологии производства масляного экстракта из шрота околоплодника, остающегося после получения настойки. Предложена экстракция липофильных веществ двухфазной системой экстрагентов: смесью спирта 90%о и масла растительного в соотношении 1:2 с последующим удалением спирта этилового при нагревании.

5. Установлены нормы и критерии качества и проведена стандартизация настойки гомеопатической околоплодника ореха черного по следующим показателям: описание, подлинность, сухой остаток, содержание спирта этилового, микробиологическая чистота, количественное содержание дубильных веществ и флавоноидов. Определен срок годности настойки - 2 года.

6. Установлены нормы и критерии качества, проведена стандартизация масляного экстракта околоплодника ореха черного по следующим параметрам: описание, подлинность, числовые показатели, содержание кароти-ноидов и хлорофиллов. Установлены условия хранения и срок годности масляного экстракта околоплодника черного ореха, который составил 24 месяца.

7. Проведены фармакологические исследования настойки ореха черного: изучена острая и субхроническая токсичность. Доказано, что настойка околоплодника ореха черного является нетоксичным препаратом

8. Исследовано противоожоговое и ранозаживляющее действие масляного экстракта ореха черного, и установлено, что репаративная активность масла ореха черного в среднем на 30 - 35 % выше по сравнению с контролем, и не значительно уступает маслу облепихи.

9. По результатам проведенных исследований составлена и утверждена нормативная документация ТУ и ТИ на сырье, матричную настойку и масляный экстракт околоплодника ореха черного.

Заключение

В рамках исследований нами был проведен сравнительный фитохими-ческий и товароведческий анализ образцов околоплодника ореха черного и установлен богатый микроэлементный состав околоплодника ореха черного: марганец, медь, фосфор, хром, цинк, бор и другие эссенциальные микроэлементы. Идентифицированы основные биологически активные вещества, и установлено количественное содержание дубильных веществ (14,1%), аскорбиновой кислоты (0,44%>), органических кислот (до 9%>), суммы флаво-ноидов в пересчете на лютеолин (0,04%>), а также липидов общих (1,8%), ка-ротиноидов (32мг%>), хлорофилла до (6,1 мг%>) в исследуемых образцах ореха черного. Полученные данные были сопоставимы к данным найденным в литературе по околоплодникам черному и грецкому орехам (Hong-Yeng , 1982; Лойко, 1990.)

На биологической модели Paramecium caudatum проведено тестирование извлечений (Степанова, 1999) из свежих и высушенных околоплодников и показано, что свежее сырье в биологическом аспекте более активно, чем после предварительной сушки, что послужило основанием для выбора технологической схемы переработки свежего околоплодника ореха черного.

Теоретически обоснован выбор методики экстракции свежего околоплодника ореха черного с учетом основных технологических характеристик сырья. (Дудников, 2004 )., В соответствии с требованиями к получению настоек гомеопатических, предложена технология, позволяющая из свежего околоплодника ореха черного последовательной экстракцией сначала 96% спиртом этиловым (первая ступень), а затем 70%> спиртом этиловым (вторая ступень) получить матричную настойку по § 3 ВФС 42-2799-96 Настойки матричные гомеопатические. Проведены исследования по разработке технологии масляного экстракта из шрота околоплодника после получения настойки. Предложена экстракция липофильных веществ двухфазной системой экстрагентов: смесью спирта 90%> и масла растительного в соотношении 0,5:1, с последующим удалением спирта этилового при нагревании. Для этого был модифицирован описанный в литературе метод ДСЭ. ( Шиков А.Н.,2004.) Спирт этиловый по окончании экстракции отгоняли, интенсифицировав процесс созданием небольшого разряжения (600 мм рт.ст.). Преимущество данного метода сводятся, прежде всего, к тому, что снижаются затраты на закупку сырья и расходы на производство.

На основании полученных результатов установлены нормы и критерии качества и проведена стандартизация настойки гомеопатической околоплодника ореха черного по следующим показателям: описание, подлинность, сухой остаток, содержание спирта этилового, микробиологическая чистота, количественное содержание дубильных веществ и флавоноидов. Установлены нормы и критерии качества, проведена стандартизация масляного экстракта околоплодника ореха черного по показателям: описание, подлинность, числовые показатели, содержание каротиноидов и хлорофиллов.

Изучена острая и субхроническая токсичность, а также гипогликемиче-ская активность настойки из околоплодника ореха черного, и в результате сравнительной оценки состояния внутренних органов подопытных животных, а также биохимических показателей крови можно сделать заключение о том, что настойка околоплодника ореха черного является нетоксичным препаратом и обладает гипокликемическим действием. Проведены исследования противоожогового и ранозаживляющего действия масляного экстракта ореха черного и результаты исследования доказали, что репаративная активность масла ореха черного в среднем на 30 - 35 % выше по сравнению с контролем, и лишь немного уступает таковой масла облепихи.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дудников, Михаил Эдуардович, Ставрополь

1. Авдеева, Е.В. Изучение некоторых фенольных и терпеноидных соединений, используемых в стандартизации лекарственных растений: Автореф. дис.канд. фармац.наук.-М, 1997.-23 с.

2. Алексеев, БД Орех грецкий / Б.Д. Алексеев // Лекарственные растения Кабарды. -1952.-С. 33-34.

3. Алексеев, БД Орех грецкий / БД Алексеев, Г.А. Коробков, ДА. Муравьева, Р.М. Середин // Лекарственные растения Северной Осетии. -1958. С. 77.

4. Алентьев, ПН. Временные рекомендации по разведению и выращиванию ореха черного на Северном Кавказе / ПН Алентьев -Воронеж, 1988. -26 с.

5. Алентьев, ПН Культуры ореха черного в России / ПН Алентьев, НП Алентьев -ML: ВНИИЦлесресурс, 1998. 51 с.

6. Андреева, Н.Д Справочник по медицинской косметике./ НД Андреева, Н.П Боброва, С.Н. Потапова-Л: Медицина, 1978. -172 с.

7. Асатиани, B.C. Новые метода биохимической фотометрии / B.C. Асатиани. М, 1965.-С. 495-510.

8. И. Афанасьева, ТГ. Исследование ассортимента и потребителей фитопрепаратов / ТГ.

9. Афанасьева, Н.Б. Дремова// Актуальные проблемы медицины и фармации: Материалы 65-й итог. науч. конф. молодых ученых и студентов. Курск: КГМУ, 2000. - С.300-302.

10. Ахабадее, АС. Косметика дня всех/АС. Ахабадзе-М: Знание, 1974.-90 с.

11. Балабьян, ВЮ. Разработка системы скрининга лекарственных веществ аншоксидантного и мембраносгимулирующеш действия: Автореф. дисс.канд. фарм. наук-М., 1998.-22 с.

12. Барабой, В.А. Биологическое действие растительных фенольных соединений / В.А Барабой-Киев: Наукова думка, 1976.-162 с.

13. Барабой, В.А Растительные фенолы и здоровье человека / В.А Барабой М.: Наука, 1984.-160 с.

14. Баранова, ЛИ Биологически активные вещества ароматических растений, перспективных для ароматизации продуктов переработки молока / JIJX Баранова, СВ. Баранова // Новые пищевые и кормовые растения в народном хозяйстве. Киев: 1981. ч. 1. -С. 55-56.

15. Бежуашвили, М. Г. Химическая характеристика перегородок Juglans regia / М. Г. Бе-жуашвили, Н 3. Курашвили // Хим. природных соединений. -1998. № 2. - С. 161164.

16. Беленький, МЛ. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта / МЛ. Беленький-Л: Медицинская литература, 1963. С. 50.

17. Беликов, ВГ. Дифференциальная спектрофогомегрия / ВГ. Беликов Ставрополь, 1970.-136 с.

18. Беликов, ВГ. Лабораторные работы по фармацевтической химии / В.Г. Беликов, E.H. Вергейчик, ВЕ. Годацкий и др. -М: Высш. шк., 1989. 376 с.

19. Биотехнология. Принципы и применение / Под ред. ИХиггинса, Д.Бест и Дж. Джонса М.: Мир 1988.-480 с.

20. Богатырёв, А.Н Использование БАД в пищевых продуктах / АН. Богатырёв, OB. Большаков, НА Макеева. -М: Пищевая пром-сть, 1987.-236 с.

21. Богдаш, АС. Популяция одноклеточных организмов как модель интегральной оценки воздействия вредных факторов // Тез. докл. Всесоюзн. конг. -М, 1989. С. 12-13.

22. Большая медицинская энциклопедия: в 30-ти т. /АМН СССР. Гл. ред. БВ. Петровский.-3-е изд.-М: Советская энциклопедия.-1981.-т. 17-512 с. (т.30.-140 е.).

23. Бреднева, НД Природные вещества плодов боярышника, определяющие их фармакологическую активность // Наука-здравоохранению: тез. докл. науч. конф. м. уч. (9; 3-5 февраля, 1986).-Пяшшрск, 1986.-С. 50-51.

24. Бурковский, И.В. Основы экологии свободно-живущих инфузорий: Автореф. дис. докг. биол. наук. -М., 1986. -43 с.

25. Валь, Е. Препараты из растительного сырья: отраслевая проблема / Валь Е. // Ремедиум. 2001. - №1-2. - С. 38-40.

26. Ветров, ПП. Комплексная технология переработки растительного сырья / П.П. Ветров // Состояние и перспективы создания новых готовых лекарственных средств и фитохимических препаратов: Тез. докл. Харьков, 1990. - С. 38.

27. Ветров, ПП Определение содержания липофильных веществ и суммы каротинои-дов в растительном сырье / ПП Ветров и др. // Хим.-фармац. журнал. -1989. №3. -С. 320.

28. Гаммерман, А.Ф. Дикорастущие растения СССР / А.Ф. Гаммерман, Г.И. Гром. М: Медицина, 1976.-С.48.

29. Гаммерман, А.Ф. Орех грецкий / А.Ф. Гаммерман // Растения-целители. 1963.- С. 337-339.

30. Георгиевский, В.П Физико-химические методы анализа биолошчески активных веществ растительного происхождения / В.П Георгиевский, НА. Казаринов, М.О. Кар-рыев. Ашхабад: «Ылым», 1976.-240 с.

31. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. СанПиН2.3.2.1078-€1.-М, 2001.-168 с.

32. ГОСТ 17.0.0.01-76. Система стандартов в области природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения.

33. ГОСТ 91500.05.001-00. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения. М.: Изд-во МЗ РФ. - 2000. -29 с.

34. Государственная фармакопея СССР / МЗ СССР. 11-е изд. - М: Медицина, 1987. -Вып. 1,2.

35. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа Лекарственное растительное сырье. -М.: Медицина, 1990. -Вьш.2.-397с.

36. Государственный доклад «О состоянии окружающей среды Российской Федерации в 1997 году» //Зеленый мир. -1998. -№26.

37. Государственный peecip лекарственных средств. М., 2001. -1260 с

38. Гринкевич, НИ. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. НИ. Грин-кевич.: М, Высш. школа,-1983. С. 176.

39. Гроссгейм, A.A. Определитель растений Кавказа / A.A. Гроссгейм. М.: Гос. Изд-во Советская наука, 1949-109 с.

40. Гроссгейм, А.А Флора Кавказа / A.A. Гроссгейм.- M-J1: Изд. АНСССР, 1950 Т.4. -79 с.

41. Дадали, В.А. Процессы перекисного окисления в организме и природные антиокси-данты // В сб. «Введение в частную микронутриентологию/ Под ред. Ю.Н Гичева, Э. Огановой. Новосибирск: Наука, 1999. С. 240-263.

42. Дикорастущие полезные растения России / Отв. ред. A.J1 Буданцев, Е.Е. Лесиовская. -СПб.: Изд-во СПХФА, 2001. -663с.

43. Дудников, МЭ. Микроэлементный и фигохимический анализ околоплодника ореха черного (сем. ЮОЬАЮАСЕАЕ) / М.Э. Дуднжов, В.В. Мелик-Гусейнов // Вестник СГУ. -2006. №47. - С. 130-134.

44. Дудников, М.Э. Динамика БАВ в зависимости от сроков и условий хранения оклоп-лодников ореха черного / МЭ. Дудников, ВБ. Мелик-Гусейнов // Владикавказский медико-биологаческий вестник; Владикавказ, 2005. - С. 189-190.

45. Дюваль-Строев, МР. Орех Чёрный в Краснодаре / Бюллетень Главного ботанического сада -1963. -Вып. 50. С. 52-57.

46. Евдокимова, О.В. Изучение липофильной фракции плодов боярышника / О.В. Евдокимова, ИА Самылина, О.В. Нестерова// Фармация.-1992.-Т.41,№3.-С. 60-61.

47. Кабишев, КЗ. Определение экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье при различной технологии получения экстрактов / К.Э. Кабишев, Е.И. Саканян, Б.Л. Молдавер // Раст. ресурсы. 2002. - Т.38, №3. - С. 113-120.

48. Калашникова, НА Протиювоспалительная активность флавоноидов / НА. Калашникова, Г.И. Геращенко // Актуальные вопросы фармации. Ставрополь. - 1974. -Вып. 2.-С. 353-354.

49. Капин, В.В. Структура и состояние защитных лесных насаждений Краснодарского края и перспективы увеличения их площадей / ВБ. Капин, ЕБ. Левченко // Тр. Кубан. ГАУ. -2004. -Вып. 412 (440). С. 5-10.

50. Карагулов, ХГ. Разработка и исследование спиртового экстракта, полученного на основе пелоидов Тамбуканского озера / ХГ. Карагулов, СБ. Москаленко // Традиционная медицина 2000: Сб. материалов конгр. - 27-29 сент. 2000. - Элиста, 2000. - С. 250-252.

51. Каргеев, АА Современное состояние традиционной фитотерапии и фитофармации в России / А А Каргеев, Т. Л. Киселёва // Традиционые методы лечения основные направления и перспективы развития: Материалы науч-пракг. конф. М, 1998. С. 126127.

52. Касумова, ММ. Исследование зеленого околоплодника и листьев грецкого ореха / М.М Касумова // Сб. трудов Азербайджанского гос. мед. ин-та им. Нариманова Баку, 1958.-С. 48-55.

53. Касумова, ММ. Исследование листьев и зеленого околоплодника грецкого ореха на фитонцидные свойства: Сб. трудов Азербайджанского гос. мед. ин-та Баку, 1956. -ВыпЗ.-С. 170-174.

54. Киселёва, T.JI. Эликсиры и бальзамы: некоторые вопросы терминологии и стандартизации (обзор) / Т.Л. Киселёва, АБ. Чаусов, НН Меньшикова // Фарматека -1997. -№5.-С. 51-57.

55. Кит С.М Лекарственные растения в эцдокринологии / С.М Кит, CM. Турчин // Киев: Здоровя, 1986.-80 с.

56. Клышев, Л.К. Флавоноиды растений / Л.К. Клышев, В. А. Бандюкова, ЛС. Алюкина -Алма-Ата: Наука, 1978.-220 с.

57. Колб, В.Г. Справочник по клинической химии / ВГ. Колб, B.C. Камышников -Минск: Беларусь, 1982. -170 с.

58. Кольцова, Э.В. Каротиноиды препараты микробиологического синтеза и их применение в животноводстве, птицеводстве и пищевой промышленности / Э.В. Кольцова, B.C. Минина -М.: ВНИИСЭНЩ 1984.-38 с.

59. Команд, ИГ. Кариологическое исследование видов рода Juglans L. / ИГ. Команц // Бюл. ГБС АНСССР. -1988. -Вып. 125. -С. 73-79.

60. Контроль качества лекарственных средств: Справочник. М.: Медицина, 1986. - 268 с.

61. Корсун, В.Ф. Фитотерапия экземы / В.Ф. Корсун, А.А. Кубакова, С.Я. Соколов // Минск: Наука и техника, 1995. 284 с.

62. Корязова, Л.К. Модификация структуры и функций липидов крови и биомембран при сахарном диабете / Л.К. Корязова, А.К. Гулевский // Биохимия животных и человека 1990.-Вып. 14.-С. 70-79.

63. Кудрин, А.Н Система экспресс-методов интегральной оценки биологической активносги индивидуальных и комплексных препаратов на биологических объектах / Кудрин АН, Ананин ВВ., Балабьян ВЮ. // Рос. Хим. журн. -1997. Т.41, №5. - С. 114123.

64. Кулыгин, АА Культура ореха черного / А.А. Кулыган, ВВ. Поповичев // Научное издание НГМА. -Новочеркасск, 1998.-96 с.

65. Куркин, В. А Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов / В. А. Куркин. Самара: ООО «Офорт», ГОУВПО «СамГМУ», 2004.-1180 с.

66. Сернов, Л.Н Элементы экспериментальной фармакологии / JI.H Сернов, В.В. Гацу-pa.-M.-2000.-351 с.

67. Лойко, Р.Э. Химический состав плодов Juglans regia L. в Белоруссии / Р.Э. Лойко, Т.С. Ширко, Ай Короткевич и др. //Раст. ресурсы. -1990. -Т.26. -Вып. 2. С. 160-169.

68. Медако-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. М., 1990.

69. Медицинская микробиология / Гл. ред. В.Й Покровский, ОХ. Поздеев. М: ГЭО-ТАР МЕДИЦИНА, 1998.-С. 160-162.

70. Международная фармакопея. Общие методы анализа ВОЗ. 3-е. изд. Женева, 1981.— 242 с.

71. Мельникова, В.А. Новые подходы к комплексной переработке травы зверобоя / В.А Мельникова, В.А. Вайншгейн, АН Шиков и др. // Хим.-фармац. журнал. -1999. -Т.33,№12.-С. 27-30.

72. Методика определения запасов лекарственных растений.-М., 1986.-50 с.

73. Методы анализа пищевых сельскохозяйственных продуктов и мед ицинских препаратов / Пер. с англ. МИ. Вольшанского. // Под ред. А.Ф. Наместникова. М: Пищевая промышленность, 1974.-743 с.

74. Методы биохимических исследований / Под ред. МИ Прохоровой. Л.: Изд-во1. МГУ, 1982.-272 с.

75. Методы биохимического анализа растений / Под ред. Полевого и ГБ. Максимова. -Л: Изд-во Ленинград, ун-та, 1978. -С. 97-98.

76. Минаева, В Г. Лекарственные растения Сибири / В Г. Минаева Новосибирск: Наука, 1991.-С. 209-212.

77. Минаева, В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование / В.Г. Минаева-Новосибирск: Наука, 1978.-255 с.

78. Мисник, Г.Е. Орехи дендропарка «Тростянец» и их плодоношение. / Г.Е. Мисник // Бюллетень Главного ботанического сада -1963. Вып. 50. - С. 79-52.

79. Муравьева, ДА Фармакогнозия основами биохимии лекарственных веществ. 2-е изд., стереотип / Муравьева ДА. -М.: Медицина, 1981. - 657 с.

80. Настойки, экстракты, эликсиры и их стандартизация. / Под ред. В. Л Багировой, В. А. Северцева.-СПб.:СпецЛиг,2001.-223 с.

81. Нешта, И.Д Флавоноиды / ИД Нешта, Т Г. Запесочная, НА. Колошина // Хим. природ. соединений -1973. №6. - С. 796-797.

82. Ноздрюхина, ЛР. Нарушение микроэлементного обмена и пути его коррекции / Л.Р. Ноздрюхина, НИ Гринкевич. -М: Наука, 1980. 280с.

83. Орехоплодные / Под ред. Е.В. Вульф М.: Гос. изд-во совхозной и колхозной литературы, 1936.-С. 354

84. Пехов, А В. Экстрагирование растительного лекарственного сырья / АВ. Пехов, НФ. Дюбанькова, Р.С. Мазуренкова//Тр. Краснодар. НИИ пищ. пром.-ти. -1969. Т.5. - С. 224-247.

85. Плановский, А.Н Процессы и аппараты химической технологии /. Плановский АД Рамм В.М., Каган С.В. -М.: Химия, -1986. 847 с.

86. Пономарёв, В.Д Экстрагирование лекарственного сырья / В.Д. Пономарёв М.: Наука, 1976.-202 с.

87. Попов, АП Орех грецкий (Juglans regia L.) из семейства ореховых (Juglandaceae) / А.П Попов//В кн. Лесные целебные растения. М, 1973. - С. 43-44.

88. Попов, АП Орех грецкий / АП Попов // Лекарственные растения в народной медицине. Киев, 1969. - С. 171-172.

89. Поповичев, В.В. Опыт выращивания ореха черного в Ставропольском крае. / ВВ. Поповичев // Лесомелиорация Юга России: Сб. ст. НГМА. Новочеркасск, 1998. - С. 7-10.

90. Поповичев, ВБ. Орехи горного парка г. Кисловодска. / ВБ. Поповичев // Лесомелиорация Юга России: Сб. ст. НГМА-Новочеркасск, 1998.-С. 134-135.

91. Пыжов, В.Х Биологическая активность вещества грецкого ореха и миндаля обыкновенного /В.Х. Пыжов, АА. Ддров // Тр. ГНБС.-1981. Т.83.-С. 61-67.

92. Рощина, ВБ. Биомедиаторы в растениях. Ацетилхолин и биогенные амины. / ВБ. Рощина // Пущинский НЦАНСССР Пущино, 1991 - С. 193.

93. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ//Под редакцией В.П Фисенко.-М. -2000. С. 114-119.

94. СанПиН 2.3.2.1293-03 Гигиенические требования по применению пищевых добавок. -М.: Минздрав России, 2003.-416 с.

95. Северцева, ОБ. Исследование состава облепихового масла и разработка новой лекарственной формы облепихового масла и его заменителя препарата Аекол. Авто-реф. дис. канд. фармац. наук. - СПб. -1997. - 28 с.

96. Селиванчикова, И.Б. Количественное определение флавоноидов в гомеопатических настойках туи методом спектрофотометрии// Фармация.-2001.-№6.-С. 14-16.

97. Сергеев, A.B. Медико-биологические аспекты каротиноидов / АБ. Сергеев, Л.А. Вакулова, МЛ Шашкина, Т.А. Жидкова // Вопр. мед. химии. -1992. Т.38, Вып.6. -С.8-12.

98. Сливкин, А.И. Физико-химические и биологические методы анализа лекарственных средств: Учеб. пособие / АИ. Сливкин, В.Ф. Селеменев, Е.А. Суховерхова / Под ред. В.Г. Арпохова Воронеж: Медицина, 1999. - 368 с.

99. Степанова, Э.Ф. Использование экспресс-методов оценки биологической активности на культуре клеток при разработке фитопрепаратов адаптогенного действия / Э.Ф.

100. Степанова, И.Н Андреева, М.А. Огай, Б.Б. Сысуев // Фармация на современном этапе проблемы и достижения: Науч. тр., т. XXXIX, ч. 1. М, 2000. - С. 299-302.

101. Степанова, Э.Ф. Фармацевтическая фигогехнология / Э.Ф. Степанова, И.Н Андреева // Терминологические аспекты медицинской и фармацевтической деятельности в области традиционной медицины и гомеопатии: Науч. тр. НПЦ ТМГ. М, 2000. - Т.1. -С. 148-150.

102. Стреляева, А.П. Изучение токсичности и фармакологической активности препаратов на основе лекарственного растительного сырья и новых экстрагентов (15.00.02, 14.00.25): Автореф. дисс. докт. фарм. наук. М., 2003. - 50 с.

103. Технология и стандартизация лекарств: В 2тУ Под ред. ВП Георгиевского, ФА Конева. -Харьков: Рирег, 1996. Т. 1. - 778с.

104. Технология и стандартизация лекарств: В 2тУ Под ред. ВЛ. Георгиевского, ФА Конева. -Харьков: РирегДЮО.-Т. 2. -781с.

105. НЗ.Федеральный реестр биологически активных добавок к пище. / Под ред. ТЛ. Пилат. -М.: Изд-во «Когелег», 2001.-421 с.

106. Филатов, В.П. Тканевая терапия (учение о биогенных стимуляторах). / В.П Филатов.-М.: Знание, 1955.

107. Цапалова, ИЭ. Экспертиза дикорастущих плодов, ягод и травянистых растений. / ИЭ. Цапалова, М.Д Губина, ВМ. Позняковский. Новосибирск, Сибирское университетское издательство, 2002. -180с.

108. Чепурной, B.C. Плодоношение ореха черного в разнофункциональных насаждениях Западного Предкавказья / B.C. Чепурной, В.В. Калин, ЕВ. Левченко // Тр. Ку~ бан. ГАУ. -2004. -Вып. 412 (440).-С. 88-107.

109. Шарапов, НИ Закономерности химизма растений. /Н.И Шарапов. -М.-Л: Изд-во АН СССр, 1962.-130с.

110. Швиденко, А.И. Культура ореха черного / А.И. Швиденко, ПА. Цыганков -Львов: Вьпца школа, 1978.-129 с.

111. Шиков, А.Н. К вопросу о стандартизации масел и масляных растительных экстрактов. / AR Шиков // Материалы УП Международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». -СПб.-2003-С. 385-390.

112. Шиков, А.Н. Растительные масла и масляные экстракты: технология, стандартизация, свойстваУ АН. Шиков, В.Г. Макаров В.Е. Рыженков // М.: «Русский Врач». -2004.-264 с.

113. Шинкаренко, А.Д Химическое и фармакологическое изучение флавоноидных комплексов из листьев чёрного и грецкого орехов. / A.JI. Шинкаренко, С.Д. Соколов,

114. B.И. Дороднева Вопросы курортологи, фармации, фармакологии. Пятигорск, 1967.1. C. 365-366

115. Шретер, АИ. Справочник «Природное сырье китайской медицины» (в 3-х томах)./ А.И. Шретер, Б.Г. Валентинов, Э.М Наумова -М.: Теревинв, 2004. -Т. 1. -506с.

116. Экспфиментапьный сахарный диабет/Под ред. В. Г. Баранова,- J1: Наука, 1983-С37.

117. Эрнандес, Е. Новая косметология. / Эрнандес Е., Марголина А., Петрухина А- М.: Косметика и медицина, 2002. -208 с.

118. Яковпев, Г.П. Поиск новых видов лекарственных растений, перспективных для создания лекарственных средств / Г.П Яковлев, К.Ф. Блинова // Человек и лекарство: тез. докл П Рос. нац. конгресс (10-15 апреля 1995, М). -М, 1995. С. 247.

119. Aromaterapie plus./ ПБ. Брандгнер, Д. Слуненко, М. Кадлец и др. Germany: CosmetikKarl Hadek, 1997.-С. 14-16.

120. Autery, A Phanmcodynamics and phannacodnetics of Veliten (rutine, alfa-tocopherol and ascorbic acid) in patients with chronic venous insufficiency. // Int. J. din. Pharmacol. Res.-1994.14(3). P. 95-100.

121. Bader, W. Die Carotinoide/ Bader W. //Chem.unserer Zeit. 1972.-Vol.6, №3.- P.94-96.

122. Beraldo, H. Heavy metals / H. Beraldo, A Garnier-Sullerot, L. Tosi // Biochemistiy. -1985. N.2. - P.284-289.

123. Britton, G. Biosynthesis of carotenoids / Briton G. I I Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments-London, 1976. -P. 51-55.

124. Cao, G. Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids: structure-activity relationships /

125. G. Cao, E. Sofic, R.L. Prior// Free Rad. Biol. Med. -1997. Vol. 22, № 5. - P. 749-760.

126. Cardiotonic flavonoids from Citrus plants (Rutaceae). / Itoigawa Masataki, Taceya Kazumi, Furukawa HizDshi. // Biol, and Pharm. Bull. -1994. Vol. 17. - №11. - P. 1519-1521.

127. Flavonoids from Achillea crithmifolia Waldst and Kit. / Txakou 0., Skaltsa H., Harvala C. // Sci. Pharm. -1996. Vol. 64. - №2,- P. 197-202.

128. Formica, J.V. Review of the biology of quercetin and related bioflavonoids / J.V. Formica, W. Regelson // Fd. Chem. Toxic. -1995. Vol. 33.- № 12. - P. 1061-1080.

129. Garrido Femandes Por.I. Minguer Pigmentos carotenoides/ Garrido Fernandes Por.I., Mosqueio M.I.// Grasas Y aceites.-1983.-Vol.34, №5.-P.197-202.

130. Gester, H. The 11 th International Symposium on Carotenoids, Leiden, 18-23 Aug J Gester

131. H. //J. Nutr. And Environ. Med. -1996. № 3. -P. 197-201.

132. Hanasaki, J. The correlation between active oxygens scavenging and antioxidative effects of flavonoids / J. Hanasaki, S. Ogawa, S. Fukui // Free Rad. Biol. Med. -1994. Vol. 16. - P. 845-850.

133. Hong-Yeng Hsu The chemical constitunes of oriental herbs. /Hong-Yeng Hsu, Yuh-Pan Chen, Mina Hong// Oriental Healing Ants. ints. Los Angeles OUP, 1982-P.1546

134. Itoigawa Masataki. Cardiotonic flavonoids from Citrus plants (Rutaceae). / Itoigawa Masataki, Taceya Kazumi, Furukawa Hizoshi. // Biol, and Pharm. Bull. -1994. Vol. 17. -№11.-P. 1519-1521.

135. Khachik, F. Separation, identification, and quantification of carotenoids in fruits, vegetables and human plasma by high performance liquid Chromatography / Khachik F., Beecher G.R., Goli M.B. // Pure & Appl. Chem. -1991. Vol. 63, № 1. - P. 71-80.

136. Können, M. Red wine derived compounds and their putative antiatherog properties / M. Können, J. Caen. In: Polyphenols 96. Ed. INRA Paris. -1998. - P. 105-115.

137. Myocardial effects of flavonoids from Crataegus species. / M. Schussler, J. Holsl, U. Fricke // Arzneim. Forsch. -1995. - Vol. 45, №8. - P. 842-245.

138. Myocardial effects of flavonoids from Crataegus species. / M. Schussler, J. Holsl, U. Fricke//Arzneim. Forsch. -1995. - Vol. 45, №8. - P. 842-245.

139. Prasad, AS. Zinc and immunity / AS. Prasad // Moll. Cell. Biochem. -1998. -V.188. -N.l-2. P.63-69.

140. Pratt, D.E. Naytral Antioxidants from Plant Material. Phenolic Compounds in Food and Their Effects on Health./ D.E. Pratt Washington, 1992. - 54 p.

141. Remesy, C. Interest of polyphenols in preventive nutrition / C. Remesy, C. Manach, C. Demigne. In: Polyphenols 96. Ed. INRA Paris. -1998. - P. 251-265.

142. Rice-Evans, CA Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids / CA Rice-Evans, NJ. Miller, G. Paganga. // Free Rad. Biol. Med. -1996. Vol. 20. - № 7.-P. 933-956.

143. Seemann, J. High Oleic Sunflower Oil 90plus: Sunflowers Are More Powerful That They Are Thought To Be /J.Seemann, B. Olbrich-Deubner, R.Grob Lannert// SOFW cosmetics-2001.-№1.-P.18-21.

144. Zindone, J. Characterization and dissolution studey of solid despersion of theophylline and indometacin with PVP IVA copolumes / J. Zindone, M. Moneghini, P. Rupeno, D. Voinovic // STP Pharma Sei. -1992. vol. 2. - №2. - P. 186-192.