Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические и физиологические основы клонального микроразмножения Actinidia deliciosa (Chev.) Liang, Ferguson

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические и физиологические основы клонального микроразмножения Actinidia deliciosa (Chev.) Liang, Ferguson"

УКРАИНСКАЯ АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НИКИТСКИЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД

УДК 634.74:581.143.6 На правах рукописи

п Г Л 1

• lo О Л

1 Я и .1 Íf-r"?

I Л !'.■.. Н'З

ВИДЖЕШВАР Паул

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ACTINIDIA DELICIOSA (CHEV.) LIANG, FERGUSON

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ялта 1996

Диссертационная работа выполнена в отделе биотехнологии Государственного Никитского ботанического сада.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук О. В. Митрофанова, член-корреспондент УААН, доктор биологических наук А. И. Лищук

доктор биологических наук А. М. Бутара,

доктор биологических наук,

профессор

М. К. Мананков

Институт клеточной биологии

и генетической инженерии

HAH Украины

Защита диссертации состоится «30•• -и с Л 2996 г. ъЮ чад на заседании специализированного совета Д 32.01.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Государственном Никитском ботаническом саде по адресу: 334267, Республика Крым, г. Ялта, Государственный Никитский ботанический сад.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного Никитского ботанического сада.

Отзывы на автореферат просьба присылать в двух экземплярах по адресу специализированного совета.

Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

ffc. К1МА Т. П. Кучерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди новых субтропических плодовых культур особый интерес представляет актинидия превосходная (Actinidia deliciosa (Chev.) lAong, Fergvson) из семейства Actinidiacene, плоды которой богаты биологически активными веществами, микроэлементами и обладают великолепными вкусовыми качествами. По содержанию витамина С они превосходят плоды лимонов.

В последние годы для удовлетворения спроса на продукцию актинидии во многих странах мира возрастают площади, возделываемые под эту культуру (Новая Зеландия, Чили, Франция, Италия, Китай, Индия и другие). Климатические условия юга Украины, особенно Крыма, позволяют выращивать крупноплодные виды актинидии (киви). Учитывая все это, в Государственном Никитском ботаническом саду с 1989 года проводятся исследования по интродукции и селекции актинидии.

Несмотря на достигнутые успехи, дальнейший прогресс в селекции крупноплодной актинидии по созданию новых сортов и производству посадочного материала должен быть связан с поиском новых способов и технологий, которые позволили бы не только ускорить селекционный процесс, повысить урожайность и улучшить качество плодов, но были бы экономичны и не причиняли вреда окружающей среде.

Одним из таких весьма эффективных и экономически выгодных биотехнологических приемов является клональное микроразмножение растений в культуре in vitro. В основе микроразмножения лежит использование уникальной способности растительной клетки реализовать присущую ей тотипотснтность и дать начало целому растительному организму. Еще недавно этот метод рассматривали как возможность ускоренного клонирования в культуре in vitro вегетативно размножающихся видов растений с целью повышения коэффициента размножения генетически однородного посадочного материала и как один из приемов освобождения растений от патогенов. Однако результаты экспериментальных работ ученых разных стран показали, что значение этого метода существенно возросло, особенно для селекции: экспериментальный мутагенез, расхимеривание, криосохра-нение ценного исходного материала, способность образовывать большие

количества соматических зародышей, получение "искусственных" семян и создание синтетических сортов (Основы сельскохозяйственной биотехнологии, 1990; Атанасов, 1993). Тем не менее широкое внедрение метода кло-нального микроразмножения в селекционный процесс и производство посадочного материала актинидии сопряжено с рядом трудностей как фундаментального, так и методического характера. В связи с этим актуальным является всестороннее изучение биотехнологических и физиологических основ клонального микроразмножения актинидии превосходной в культуре in vitro.

Цель и задачи исследования. Делью настоящего исследования являлось всестороннее изучение морфогенетических потенций различных тканей и органов A. deliciosa в зависимости от биотических и абиотических факторов выращивания в культуре in vitro для разработки биотехнологических основ клонального микроразмножения.

Соответственно в задачи экспериментальной работы входило:

- получить асептическую культуру первичных эксплантов ювениль-ного (зиготических зародышей) и взрослого растительного материала (вегетативные почки, ткани листа, сегменты побега);

- изучить морфогенетические потенции различных органов и тканей in vitro в зависимости от физиологического возраста исходного растения, генотипа и происхождения первичного экспланта;

- изучить влияние трофических, гормональных и физических факторов на морфогенез;

- разработать условия укоренения микропобегов in vitro и адаптации пробирочных растений к условиям in vivo;

- разработать способы и определить этапы клонального микроразмножения актинидии превосходной для ювенильных и взрослых растений.

Научная новизна. Получены новые данные о морфогенезе 4-х сортов и 2-х гибридов актинидии (A. deliciosa) в культуре изолированных органов и тканей растений разного физиологического возраста. Определены возможные пути размножения ювенильных и взрослых растений актинидии в условиях in vitro я на их основе разработаны три способа клонального микрораэмножения: из зародышей, корней, вегетативных почек и листа.

Впервые удалось получить стабильную регенерацию актинидии превосходной из высечек листа с высоким коэффициентом размножения. Модифицирован состав питательной среды МС для разных этапов морфогенеза ювенильного и взрослого растительного материала. Разработан способ укоренения микропобегов и выявлено 4 типа корнеобразования. Определены условия адаптации in vivo пробирочных растений актинидии превосходной.

Практическая значимость работы. Определены физиологические, гормональные и физические условия культивирования первичных экс-плантов ювенильных и взрослых растений разных генотипов A. deliciosa, позволяющие повысить их морфогенетический потенциал и регенерацион-ную способность. Разработаны способы и биотехнологические приемы кло-нального микроразмножения растений из зиготических зародышей, тканей листа, корней и вегетативных почек in vitro, применение которых в 23 раза сократит продолжительность селекционного процесса при создании новых форм и обеспечит размножение в достаточном количестве высококачественного посадочного материала.

На защиту выносятся следующие основные положения:

- особенности реализации морфогенетических потенций ювенильной и взрослой культуры A. deliciosa в условиях in vitro в зависимости от генотипа, типа эксплантов и срока отбора, трофических, гормональных и физических факторов выращивания;

- способ получения растений из зиготических зародышей и сегментов проростка для практической селекции;

- способы прямой регенерации растений из вегетативных почек и листовых дисков взрослых растений для массового получения элитного посадочного материала.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на международной конференции по биотехнологии растений и генной инженерии (Киев, 1994), на международных конференциях молодых ученых по проблемам дендрологии, садоводства и цветоводства (Ялта, 1994; Ялта, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 ,

глав, выводов, перечня цитируемой литературы.

Работа изложена на 158 страницах машинного текста и содержит 31 рисунок и 18 таблиц. Перечень ссылок включает 186 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования служили вегетативные почки, сегменты побега, высечки листа взрослых (3-5-летних) растений Actinidia deliciosa сортов Монти, Бруно, Хайвард, Томури. Для изучения регенера-ционной способности актинидии отбор эксплантов проводили с учетом сезона в течение года. Наряду с этим в экспериментах были использованы семена, ткани и органы проростков, развившихся в условиях in vitro двух гибридов; Монти х Томури и Бруно х Томури. В исследованиях придерживались как общепринятых в биотехнологии методов (Бутенко, 1964; Калинин и др., 1992), так и методов, разработанных в отделе биотехнологии Государственного Никитского ботанического сада.

Условия стерилизации растительного материала, в связи с необходимостью постановки специальных экспериментов, описаны в разделе "Результаты и обсуждение".

В экспериментах по изучению морфогенетических потенций юве-нильных растений (зародышей и частей проростка) использовали питательные среды Уайта (White, 1934), Нича (Nitsch, 1969), Монье (Monnier, 1973), Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962), Пирика (Pierik, 1976) с полной или половинной концентрацией минеральных солей. В зависимости от поставленной задачи к питательным средам добавляли различные биологически активные вещества, сахарозу и 0,7% агара. Было изучено влияние фитогормонов: 2,28 мкМ зеатина, 2,32-4,60 мкМ кинетина, 0,4413,31 мкМ БАП, 0,57-11,32 мкМ ИУК, 0,49-8,90 мкМ ИМК, 0,54-10,74 мкМ НУК, 0,45 мкМ 2,4-Д, а также 0,029-0,146 М сахарозы на регулирование процессов морфогенеза зиготических зародышей. В опытах по изучению влияния различных факторов на регенерацию растений изолированные зародыши и части проростков культивировали на агарнзованной питательной среде при рН 5,6-5,7, с последующим содержанием пробирок

с эксплантами в холодильнике при температуре 5±1°С от 5 до 60 суток. Дальнейшее развитие проростков и растений происходило в культураль-ной комнате при температуре 25±1°С.

Изучение морфогенетических потенций апикальных меристем, пазушных почек, листовой ткани и побегов актинидии проводили на питательных средах Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962), В5 (Gamborg, Eveleigh, 1968), Пирика (Pierik, 1976), дополненных различными веществами цитокининового типа действия: 2,32-9,30 мкМ кинетина, 2,22-8,90 мкМ БАП, 2,28-9,12 мкМ зеатина, 2,46-9,80 мкМ 2ip. При изучении процесса органогенеза высечки листа и сегменты побегов помещали на питательную среду МС с половинной концентрацией макро- и микроэлементов, содержащую 2,22 мкМ БАП и 2,4-Д в различных концентрациях (2,2622,62 мкМ) и культивировали при температуре 25±1°С, 16-часовом фотопериоде с интенсивностью освещения 2000-3000 лк. Субкультивирование тканей и органов осуществляли спустя 3-4 недели. Анатомическое изучение процесса заложения почек "de novo" и соматических зародышей проводили на постоянных препаратах.1'

В экспериментах по индукции прямого адвентивного побегообразования из листовых дисков сорта Монти и двух гибридов использовали питательную среду МС в нашей модификации, дополненную 4,40-44,00 мкМ БАП, 5,71-57,08 мкМ ИУК, 5,37-53,70 мкМ НУК и 4,52-45,25 мкМ 2,4-Д. Экспланты располагали абаксиально и адаксиально к поверхности питательной среды.

Укоренение микропобегов ювенильной и взрослой культуры актинидии проводили на агаризованной питательной среде, содержащей различные комбинации ауксинов ИМК и ИУК (9,80 мкМ и 5,71 мкМ; 9,80 мкМ и 11,42 мкМ), ИМК и НУК (0,49 мкМ и 0,54 мкМ; 0,49 мкМ и 2,68 мкМ; 9,80 мкМ и 5,37 мкМ), а также применяли стерильный перлит, пропитанный растворами ауксинов в тех же комбинациях. Укорененные растения пересаживали на адаптацию в почвенный субстрат.

^ Исследования проводились совместно с кандидатом биологических наук Е. И. Лагутовой, за что автор приносит благодарность.

Каждую серию опытов выполняли трижды с десятикратной повтор-ностью. Субкультивирование эксплантов проводили через 3 недели. В таблицах представлены арифметические средние и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОТЕНЦИИ РАСТЕНИЙ ACTINIDIA DELICIOSA

В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Изучение морфогенетических потенций культивируемых тканей и органов является необходимым этапом исследования для успешной разработки методов клонального микроразмножения. Выбор первичного экс-планта, применение экзогенных регуляторов роста, условия культивирования позволяют регулировать морфогенетические процессы в культуре тканей (см. рис. 1, 2).

Особенности получении асептической культуры тканей и органов растений актинидии. Одной из сложных и трудно преодолимых задач на первом этапе исследования оказалось получение асептической культуры актинидии, семена и почки которой заспорены сапрофитными грибами и бактериями. В настоящее время отсутствует единый метод стерилизации растительного материала, режим стерилизации устанавливается экспериментально для каждого объекта (Здруйковская-Рихтер, 1974; Митрофанова, 1992; Kyte, 1987). Наши эксперименты показали, что использование семян из плодов, собранных непосредственно с растений и обработанных последовательно дезинфицирующими веществами: 70%-ным С2Н5ОН, 1%-ным Thimerosal, 0,8% -ным AgNOg, способствует высокому выходу стерильных (90%) нормально развивающихся зародышей. Эффективность стерилизации при использовании длительно хранящихся семян (12 мес) была низкой и составила 10-20% зародышей. Необходим был поиск оптимальных условий стерилизации для получения большого количества стерильных жизнеспособных зародышей, вегетативных почек, тканей листа, сегментов побега. Результаты последовательной ступенчатой стерилизации в растворах этанола, Thimerosal, AgNOg с добавлением детергента Tween-80 и 3-4-х разовой промывкой в дистиллированной воде (после каждого реагента) обеспечивало развитие 72% эксплантов, свободных от контами-

Рисунок 2 - Морфоп'лотнчкекис потенции пзрослой культуры

аПТИИКДИИ

нации (см. табл. 1). Длл подавления бактериальной инфекции непосредственно в питательную среду вводили различные антибиотики. Культиви-

Таблица 1 - Результаты стерилизации различными способами ночек и сегментов с полуодрсвесневших и неодревесневших побегов актинидии

Способ стерилизации Режим стерилизации, мин Количество зкеплантов, %

инфицированных потемневших развивающихся

90% С2НБОН 3-5 96,0+1,0 4,0±2,9 0

70% С2Н6ОН 0,1% Диацид 1 5 52,4±0,1 20,0+3,2 27,0±3,9

70% С2Н6ОН 1% Т1птегова1 1 10-20 91,7±6,8 8,3+2,6 0

70% С2Н8ОН 4% гипохлорит Са 1 15-20 81,5±10,5 2,0±1,4 10,5±2,2

70% С2НвОН 0,8% ЛвИОз 1 2-3 47,8±2,4 22,014,5 30,2±4,2

70% С2Н6ОН 1% ТЫтегова1 0,8% ЛвКОа 1 10-20 2-3 21,7+0,9 0,3±2,9 72,0+10,5

рование эксплантов на питательной среде с 0,207 мкМ тетрациклина гидрохлорид приводило к 70-80%-ному получению активно растущих почек и побегов.

Юпепмльная культура актинидии (первичный эксплапт • зиготическнй зародыш)

Изолированные зародыши культивировали на различных питательных средах (Уайта, Нича, Моиье, Мурасигс и Скуга) с целью подбора оптимальной для получения проростков. На среде Уайта происходили рост

и

гипокотиля, эпикотиля, корпя и раскрытие семядолей. У зародышей на среде Нича отмечали лишь раскрытие семядолей с последующим образованием каллуса. Нормально развитые проростки были получены на средах Монье и МС.

Способность зародышей к развитию в значительной степени определялась длительностью воздействия низких положительных температур (5+1СС). Продолжительность воздействия 45-60 сут угнетала развитие зародышей у обоих исследуемых гибридов. Оптимальной оказалась экспозиция 15 суток (см. рис. 3). При этом количество развившихся проростков у

^ 90

в" 80

2 70 а

с 60 ¡50 5 40 | 30 с. 20

о 10

Л о

-гибрид Монти X Томури

•гибрид Бруно х Томури

5 15 30 45 60 Экспозиция, сут

Рисунок 3 - Зависимость развития проростков актинидии от длительности воздействия низких положительных температур

гибрида Монти х Томури было меньше, чем у Бруно х Томури и составило 75%. Спустя 4-5 недель развивались нормальные проростки с хорошо развитой корневой системой.

Культивирование зародышей на питательных средах, содержащих минеральные соли по МС и различающихся концентрацией фитогормонов, приводило к разным морфогенетическим процессам: а) на поверхности зародышей на среде, дополненной 13,31 мкМ БАЛ и 1,48 мкМ ИМК, спустя 3-4 недели формировался плотный компактный каллус; б) выращивание зародышей в течение 4-5 недель на средах, обогащенных 2,32-4,60 мкМ

5ь

кинетина или 2,22-4,44 мкМ БАП, приводило к образованию на его поверхности 10-15 адвентивных почек, способных к дальнейшему побегообразованию.

Каллус, полученный из разных частей проростка актинидии, проявлял различные способности к морфогенезу в зависимости от содержания в питательной среде БАП, зеатина и ИМК. Так культивирование каллуса из сегментов гипокотиля на среде МС с 2,22 мкМ БАП, 2,28 мкМ зеатина, 9,80 мкМ ИМК вызывало кориеобразование. Увеличение соотношения ци-токининов:ауксинов (4:1) способствовало образованию меристемоидов по всей поверхности каллуса. На среде, содержащей 6,66 мкМ БАП и 2,46 мкМ ИМК, отмечали формирование почек de novo в каллусе, полученном из высечек листа и сегментов побега.

Изучение влияния соотношений БАП и ИМК на побегообразование микрочеренков с одной или двумя пазушными почками показало, что повышение концентрации БАП в питательной среде от 0,44 мкМ до 8,90 мкМ увеличивало образование адвентивных почек и активизировало рост пазушных меристем. Превалирование в питательной среде МС содержания ИМК над БАП благоприятно влияло на рост основного побега, замедляя развитие адвентивных почек. Определены оптимальные концентрации БАП и ИМК для роста побегов (2,22 мкМ БАП и 1,23 мкМ ИМК), адвентивного побегообразования и активации пазушных меристем (4,44 мкМ БАП и 2,48 мкМ ИМК).

Культивирование апекса проростка в течение 2-3-х недель на среде МС с 2,22 мкМ БАП и 1,23 мкМ ИМК приводило к интенсивному росту основного побега и начальной активации нижней пазушной почки, из которой через 3-4 недели развивался побег длиной 0,5-1,0 см.

Полученные микропобеги из частей проростка актинидии субкульти-вировали на модифицированную среду Пирика, содержащую 0,54 мкМ НУК и 2,46 мкМ ИМК, на которой у 90% эксплантов наблюдали активный ризогенез. Количество корней на одном побеге и их длина варьировали и зависели от генотипа. Повышение концентрации ИМК до 9,80 мкМ приводило к уменьшению количества укорененных побегов (7%) и сопровождалось развитием каллуса в основании побега. Введение в питательную среду МС 9,80 мкМ ИМК и 5,37 мкМ НУК значительно повышало частоту

ризогенеза (93%) и в течение двух недель образующиеся корни полностью заполняли весь объем среды.

В результате проведенных экспериментов был определен наиболее перспективный для клонального микроразмножения способ: а) получение из зародыша нормального проростка; б) последующее его черенкование; в) активация существующих пазушных почек, образование пазушных и адвентивных побегов; г) укоренение микропобегов. Этот способ позволяет получить из одного изолированного зародыша в среднем 105-107 растений в год.

Взрослая культура актнннднн (первичные экспланты -вегетативная почка, лист полуодревесневпгах я зеленых побегов 5-6-летних растеппЗ)

Изучение морфогенетических потенций в условиях in vitro тканей и органов взрослых растений актинидии представляет огромный интерес, связанный с получением генетически однородного посадочного материала, имеющего хозяйственно-ценные признаки.

Введение вегетативных почек A. deliciosa в условия in vitro. Отбор эксплантов и их введение в культуру in vitro проводили в различные фазы вегетации растений (см. рис. 4). Так интенсивность побегообразования из

. 5? ЮО

|с? 80

§11 60 Jf5 40

и 5- 20 0

Рисунок 4 - Интенсивность побегообразования почек актинидии на протяжении года

|~] г

1-

1 - —н- -Н-- _LJ_ ■ п, ,

Г П Ш IV V VI VII VIH EX X XI ХП Время отбора экспланта, мес

почек, изолированных на питательную среду в период покоя (январь-фев-

раль) составила 55%. Наилучший период регенерации побегов in vitro приходился на время цветения. При этом частота побегообразования достигала 90-95%.

Изучение влияния различных питательных сред на побегообразование актппндин. Вегетативные почки культивировали на 4-х питательных средах (Мурасиге и Скуга, Гамборга, Грешоффа и Доу, Пирика). Полученные результаты показали, что во всех испытанных вариантах сред почки развивались и оставались зелеными. Вместе с тем, активное побегообразование отмечали на средах МС и Пирика. Регенерировавшие побеги не имели морфологических отклонений. На питательных средах В5 и ГД в основании побегов формировался каллус, имеющий рыхлую структуру. В процессе исследований среда МС претерпела ряд модификаций. Для побегообразования оптимальным оказался следующий состав среды МС: половинная концентрация NH4NO3 и KNO3, 66,48 мкМ глицина, 1,48-7,40 мкМ тиамина, 554,93 мкМ мезоинозита, 0,087 М сахарозы и 0,7% агара.

Влияние веществ цптокышшового типа действия на активацию пазушных меристем н рост побегов 4-х сортов A. deliciosa. В качестве экзогенных цитокинннов были использованы зеатин, 2ip, БАП и кинетин. Эксперименты показали, что испытанные вещества оказывали различное влияние на активацию пазушных меристем и рост основного побега сортов Бруно, Монти, Томури и Хайвард (см. табл. 2, 3). Наилучшую пролиферацию пазушных меристем наблюдали на среде, содержащей 2,22 мкМ и 4,44 мкМ БАП. При концентрации 2,22 мкМ число развивающихся почек составило 3,6-4,9 шт. на эксплант в зависимости от сорта. Так максимальное их количество было получено на зксплангах сорта Бруно. При этом отмечен хороший рост главного побега (7,2 см). Увеличение концентрации БАП до 8,90 мкМ вызывало аномальное развитие побегов (укороченные побеги, удлиненные листовые пластинки, не характерные для исследуемых сортов). Присутствие в питательной среде зеатина оказывало значительное влияние лишь на рост основного побега. С повышением его концентрации до 4,56 мкМ и 9,12 мкМ увеличивалась интенсивность роста пазушных побегов. Хб-(2-изопентил)аденин (2ip) во всех испытанных концентрациях вызывал активацию только 2-3-х меристем и образующиеся побеги достигали в среднем длины 2,5 см. Кинетин по действию на разви-

тие эксплантов практически не отличался от 21р. В то же время кинетин в концентрации 4,60 мкМ стимулировал рост адвентивных побегов у сортов Монти и Томури.

Таблица 2 - Активация пазушных меристем и рост микропобегов актинидии сортов Бруно и Монти под действием различных цитокининов

Концентрация Бруно Монти

цитокинина, мкМ активация пазушных меристем, шт. средняя длина главного побега, см активация пазушных меристем, шт. средняя длина главного побега, см

Зеатин 2,28 4,3+0,15 6,о±0,09 3,7±0,13 6,9+0,14

4,56 3,9±0,14 6,5±0,06 4,2±0,06 6,6±0,21

9,12 4,8±0,30 5,2±0,24 4,4±0,29 6,7+0,09

2ip 2,46 2,0±0,17 2,4±0,09 1,2+0,24 1,4±0,10

4,90 1,6±0,21 1,9±0,24 1,6±0,21 1,7±0,23

9,80 2,3±0,20 3,0±0,29 2,1±0,11 2,1±0,37

БАП 2,22 4,9±0,13 7,2±0,17 3,8±0,24 7,0+0,11

4,11 4,3±0,05 6,0±0,13 3,2±0,06 7,1±0,15

8,90 5,0±0,32 5,7±0,11 4,9¿0,15 6,4+0,09

Кинетин 2,32 0,9±0,46 2,0±0,29 1,1±0,36 1,6±0,21

4,60 1,4±0,20 3,4±0,17 0,9±0,32 2,9±0,17

9,30 0,б±0,37 2,3±0,22 1,7±0,21 3,7+0,49

Таким образом, на основании экспериментальных данных были выявлены сходства и различил з условиях выращивания различных органов и тканей актинидии. Присутствие в питательной среде 2,22 мкМ БАП, как и в опытах с ювенилькой культурой, приводило к активации наибольшего числа пазушных меристем и росту побегов. Несомненно, сущест-

Таблица 3 - Активация пазушных меристем и рост микропобегов актинидии сортов Хайвард и Томури под действием различных цитокининов

Концентрация Хайвард Томури

цитокинина, мкМ активация пазушных меристем, шт. средняя длина главного побега, см активация пазушных меристем, шт. средняя длина главного побега, см

Зеатин 2,28 3,2±0,17 6,8+0,21 4,6±0,20 6,4±0,35

4,56 3,5±0,15 6,9±0,35 4,4±0,15 6,4±0,11

9,12 4,0±0,11 6,1±0,12 4,0±0,15 5,9±0,20

2ip 2,46 1,2±0,40 2,7±0,11 2,3±0,11 2,0±0,15

4,90 2,3+0,11 2,0±0,30 2,6±0,20 2,2±0,17

9,80 2,1±0,25 2,4±0,23 2,1±0,21 2,6±0,15

БАЛ 2,22 3,6±0,11 7,0±0,21 3,8±0,15 7,5±0,21

4,44 3,4±0,10 6,4±0,15 3,б±0,05 7,0±0,26

8,90 3,4±0,11 '¿,0+0,15 4,0±0,15 6,4±0,11

Кинетин 2,32 1,7±0,10 2,5+0,10 1,4±0,05 2,0±0,10

4,60 2,9+0,35 3,0±0,38 2,0±0,15 1,9±0,10

9,30 2,3±0,15 2,1±0,23 2,4±0,11 1,7±0,10

вует корреляция между поведением сорта в условиях in vitro и его ростом и развитием in situ. Так микропобеги сильнорослых сортов Бруно и Монти развивались in vitro быстрее по сравнению со среднерослыми сортами, такими как Хайвард и Томури.

Особенности получения морфогенного каллуса A. deliciosa. Наши эксперименты были направлены на выявление способности тканей и органов актинидии к каллусообразованию с последующей пролиферацией побегов. При культивировании высечек листа, сегментов побега и корней на модифицированной среде МС, содержащей половинную концентрацию

макро- и микросолей, 7,5 мкМ тиамина, 2,26 мкМ 2,4-Д, 2,22 мкМ БАЛ, спустя 30 суток у всех сортов - Монти, Бруно, Томури н Хайвард - сформировался разнородный каллус двух типов: плотный (глобулярный) и рыхлый. Наиболее морфогенным в условиях in vitro оказался каллус сорта Монти. Так в процессе выращивания каллуса, полученного из высечек молодого листа, апикальной части микропобега и корня, помещенного на питательную среду МС, дополненную 4,44 мкМ БАЛ и 2,46 мкМ ИМК, образовывались эмбриогенные зоны, из которых развивались адвентивные почки. Анатомический анализ этого каллуса показал, что морфогенез реализовался двумя путями: эмбриогенезом и органогенезом. Ранние этапы эмбриогенеза характеризовались наличием многочисленных эмбриоидов на разных стадиях - от двух- трехклеточных до многоклеточных. В дальнейшем наблюдали постепенное развитие и дифференциацию зародыша с последующей его поляризацией. При культивировании каллуса через непрямой соматический эмбриогенез образовывались зародыши. Появившиеся проростки имели различные морфологические отклонения: большое количество воздушных корней, узкие, длинные листовые пластинки светло-зеленого цвета, побеги укороченные или удлиненные.

Наряду с формированием в каллусе соматических зародышей происходил вегетативный геммогенез. Продолжительность развития почки составила 20-25 суток. После субкультивирования эмбриогенного каллуса на свежеприготовленную питательную среду развивались микропобеги.

Прямая регенерация побегов из листовых дисков A. deliciosa. Изучена регенерационная способность листовых дисков трех генотипов актинидии сорта Монти, гибридов Монти х Томури и Бруно х Томури, выращенных в культуре in vitro. На основе проведенной серии опытов выявлены фитогормоны (БАЛ и ИУК), регулирующие прямую регенерацию побегов. Установлены оптимальные концентрации БАЛ (8,90 мкМ) и ИУК (8,56 мкМ), при которых через 3 недели после введения эксплантов на питательную среду формировалось максимальное количество адвентивных почек (см. рис. 5). Интенсивность побегообразования увеличивалась через 8 недель культивирования. При добавлении в питательную среду 8,90 мкМ БАЛ и 5,71 мкМ ИУК, а также 8,90 мкМ БАП и 11,42 мкМ ИУК количество листовых дисков, на которых формировались побеги, достигало 60%

4,40 8,90 8,90 8,90 13,31 22,20 44,00

+ + + + + + +

5,71 5,71 8,56 11,42 17,12 28,54 57,08 Концентрация БАЛ + ИУК, мкМ { 4 недели----8 недель

Рисунок 5 - Зависимость частоты регенерации побегов ■ ' актинидии от комбинации концентраций

БАЛ и ИУК в среде

и 80% соответственно. Повышение концентрации фитогормонов вызывало образование каллуса, что препятствовало получению идентичных исходному генотипу растений актинидии.

Изучение влияния интенсивности освещения на регенерационную способность листовых дисков показало, что при освещенности 2000 лк происходили активное формирование адвентивных почек у 90% эксплан-тов (см. рис. 6).

Выявлена зависимость регенерации побегов от ориентации листовых дисков на питательной среде. Адаксиальное расположение листовых дисков увеличивало частоту регенерации и количество образующихся побегов по сравнению с абаксиальным (см. табл. 4). Меристематические зоны располагались вдоль центральной жилки и по краю экспланта, которые легко распознавались по ярко-розовой окраске вследствие накопления в клетках антоцианов.

Полученные результаты показали, что частота регенерации побегов

• а-

na. ° 2 в § * ё S § I

« О. О ^ в

500 1000 2000 3000 Интенсивность освещения, лк

4 недели ----8 недель

Рисунок б - Зависимость частоты регенерации побегов A. deliciosa, от интенсивности освещения

Таблица 4 - Влияние ориентации листовых дисков на

регенерацию побегов гибрида Бруно х Томури

Расположение листовых дисков на питательной среде Количество листовых дисков, образующих побеги, % Количество побегов/количество листовых дисков, шт.

4 недели 8 недель 4 недели 8 недель

Абаксиально Адаксиально 50+2,28 45±4,33 75±2,38 100±0,0 5,0±0,10 5,7±0,17 Т,2±0,15 10,0±0,58

зависит от генотипа растений актинидии (см. табл. 5). Так у гибрида Бруно х Томури количество пролиферирующих эксплантов было значительно •больше, чем у сорта Монти, гибрида Монти х Томури и через 8 недель культивирования составило 100%. Индекс пролиферации достигал 1:10 от первичного экспланта. У всех трех генотипов адвентивные побеги регенерировали без промежуточной каллусной фазы, что в дальнейшем обеспечивало генетическую стабильность полученных растений. Полученные микропобеги отделяли от экспланта и помещали на питательную среду для вытягивания с последующим укоренением.

Таким образом, впервые была получена эффективная ..рямая регене-

Таблица 5 - Регенерация побегов из листовых дисков трех генотипов A. deliciosa

Генотип Количество листовых дисков, образующих побеги, % Количество побегов/количество листовых дисков, шт.

4 недели 8 недель 4 недели 8 недель

Монти Монти х То- мури Бруно х То-мури 14±6,1 0,0 45±4,33 20±7,9 38±11,0 100±0,0 1,2±0,6 0 5,7±0,17 2,5+0,5 2,7±1,3 10,0±0,58

рация побегов из листовых дисков A. deliciosa. При этом установлена ее зависимость от генотипа, ориентации эксплантов к питательной среде, комбинации концентраций БАЛ и ИУК, а также интенсивности освещения.

УКОРЕНЕНИЕ МИКРОПОБЕГОВ IN VITRO И АДАПТАЦИЯ 4 ПРОБИРОЧНЫХ РАСТЕНИЙ К УСЛОВИЯМ IN VIVO

Укоренение микропобегов и адаптация регенерантов к нестерильным условиям являются необходимыми этапами завершения разработки кло-нального микроразмножения актинидии. В наших опытах для получения регенерантов укореняли микропобеги длиной 2-3 см.

Установлено, что корнеобразование микропобегов, полученных из проростков (ювенильная культура), практически не отличалось от укоренения микропобегов, регенерировавших из почек к листьев (взрослая культура). Однако применение ШЛК и ИУК в концентрациях 9,80 мкМ и 11,42 мкМ соответственно, вызывало активный рост каллуса в основании микропобегов ювенильной культуры, который препятствовал формированию и закладке корней. Наибольшее число укоренившихся побегов (8993%) было получено на питательной срсде, содержащей половинную концентрацию макро- и микросолей по Мурасиге и С к угу, 9,80 мкМ ИМК и 5,37 мкМ НУК (см. табл. 6). В этом случае количество корней составляло 8,5-9,0 шт. на экегглант, а их средняя длина достигала 6,5-7,0 см. При

Таблица 6 - Влияние ИМК, НУК и И УК на укоренение актинидии в условиях in vitro

Концентрация ауксина, мкМ Характеристика культуры Укоренение, % Количест во корней на побег, шт. Средняя длина корневой системы, см Каллус в основании побега

ИМК + ИУК 9,80 + 5,71 ювенильная 80-86 5,0±0,4 6,0+0,1 +т

взрослая 80-85 4,5+0,1 5,8±0,1

9,80 + 11,42 ювенильная 75-79 4,0±0,1 5,0±0,7

взрослая 76-77 4,0±0,1 4,3±0,2 -г-г

ИМК + НУК 0,49 + 0,54 ювенильная 65-68 3,0±0,1 5,0±0,4 -4-

взрослая 65-70 3,6±0,1 5,2+0,1 -г

0,49 -г 2,68 ювенильная 45-50 4,0±0,1 4,0±0,2 Т"Г

взрослая 55-60 4,5=0,1 4,9±0,1 л.

9,80 + 5,37 ювенильная 90-93 9,0±0,2 7,0±0,1 -

взрослая 89-90 8,5±0,3 6,5±0,2 -

Примечание. - отсутствие каллуса в основании побега; + незначительное каллусообразование; -г-г среднее каллусообразование; -г-Н- активное каллусообразование.

концентрациях ИМК 9,80 мкМ и ИУК 5,71 мкМ в питательной среде укоренялось 80-85% микропобегов. Однако количество корней не превышало 4,5-5,0 шт. •

В результате изучения процесса ризогенеза нами было выделено 4 типа корнеобразовання у микропобегов на агаризованной питательной среде: а) выше базальной части микропобега (над питательной средой); б) из базальной части микропобега; в) из каллуса, образовавшегося на базальной части микропсбега; г) смешанный - выше и на базальной части микропобега. Как правило, растения с корнями, образующимися выше базальной части побега (над питательной средой) и из каллуса на базальной части, плохо переносили адаптацию и погибали.

Применение в условиях in vitro альтернативного субстрата - перлита, пропитанного раствором ауксинов, не увеличивало количество укоренившихся микропобегов.

Изучено влияние интенсивности освещения на ризогенез A. deliciosa. При этом установлено, что отсутствие освещения является лимитирующим фактором для корнеобраэования актинидии. При освещении 1500 лк была отмечена высокая степень укоренения микропобегов (93%). Интенсивность освещения 500 лк увеличивала количество аномальных побегов и снижала частоту корнеобраэования до 15% (см. рис. 7). Количество укоре-

о*

Рисунок 7 - Зависимость частоты корнеобраэования от интенсивности освещения

ненных микропобегов уменьшалось при увеличении силы света более 2500 лк.

Адаптацию регенерантов осуществляли в небольших вазонах (0,25 л) со специально подготовленным субстратом. Лучшим из них оказалась смесь торфа и перлита в соотношении 1:3. В этом случае наблюдалась 84%-ная приживаемость ювенильной и 79%-ная - взрослой культуры в условиях in vivo. Период адаптации длился 1,5-2 месяца, а затем растения были высажены в теплицу.

ВЫВОДЫ

1. Проведенные исследования показали возможность эффективного микроразмножения Actinidin deliciosa методами культуры изолированных

органов и тканей, которые способствуют наиболее полной реализации морфогенетических потенций растений.

2. Выявлена зависимость регенерационной активности вегетативных почек от сроков отбора и введения их в культуру in vitro, совпадающих с фазами вегетации растений. Наилучший период регенерации совпадает со временем цветения.

3. Разработан способ получения асептической культуры семян, вегетативных почек, тканей листа и сегментов побега. Поэтапная стерилизация (С0Н5ОН ~> Thimerosal AgNC>3) с последующим введением в питательную среду 0,207 мкМ тетрациклина исключала контаминацию экс-плантов от грибной и бактериальной инфекции.

4. Культивирование зародышей in vitro на различных питательных средах приводило к разным морфогенетическим процессам: а) развитию нормального проростка; б) формированию морфогснкого и неморфогенного каллуса; в) образованию адвентивных побегов; г) развитию пазушных микрспобегов из сегментов проростка.

5. Подобран оптимальный состав питательной среды для индукщш развития почек и образования побегов, отличающийся от среды Мурасиге и Скуга (1902) половинной концентрацией NH4NO3 и KNO®, 60,48 мкМ глицина, 1,48-7,40 мкМ тиамина, 2,22-8,90 мкМ БАЛ.

6. Проведено сравнительное изучение влияния различных цитокини-нов (зеатин, 2ip, БАЛ, кинетин) на активацию пазушных меристем и рост побегов 4-х сортов A. deliciosa (Бруно, Монти, Хайвард, Томури). Показано, что присутствие в питательней среде 2,22 мкМ БАП приводило к активации наибольшего числа пазушных меристем и росту побегов.

7. Получен морфогенный каллус из высечек листа, сегментов побега и корней взрослой культуры актинидии превосходной. Анатомические исследования этого каллуса подтвердили существование двух путей реализации морфогенеза A. deliciosa: органогенез и соматический эмбриогенез.

8. Впервые разработана прямая регенерация из листовых дисков А. deliciosa. При этом установлена ее зависимость от генотипа, ориентации зкеплантев на питательной среде, комбинации концентраций БАП и ИУК и интенсивности освещения.

9. Установлена зависимость ризогеяеза от физиологического возраста

первичного эксплаита, содержания в составе питательной среды разных комбинаций и концентраций ауксинов, интенсивности освещения. Определены условия корнеобразования микропобегов in vitro. Выделены 4 типа корнеобразования у микропобегов актинидии: выше базальной части побега; из базальной части побега; из каллуса, образовавшегося на базальной части побега; смешанный.

10. Разработаны способы клонального микроразмножения in vitro из зародышей, вегетативных почек и высечек листа, состоящие из следующих этапов: отбор экспланта, получение стерильной культуры, собственно микроразмножение, укоренение микропобегов in vitro и адаптация растений in vivo. Применение этих способов представляет большой интерес для селекции и питомниководства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Виджешвар П., Митрофанова О. В., Мязина Л. Ф. Регенерация Actinidia chinensis Planch, из эксплантов, культивируемых in vitro // Проблемы дендрологии, садоводства и цветоводства: Международная конф. молодых ученых, г. Ялта, 24-26 октября 1994 г.: Тез. докл. - Ялта, 1994. - С. 52.

2. Mitrofanova О. V., Lagutova Е. I., Vijeshvar Р., Ivanova N. N. Special features of Actinidia chinensis Planch.'s morphogenesis in vitro cultures // Plant Biotechnology and Genetic Engineering: Intl. Symp., Kiev, October 3-6, 1994: Abstracts. - Kiev, 1994. - P. 101.

3. Митрофанова И. В., Виджешвар П., Мязина Л. Ф. Регенерация побегов из листовых эксплантов Actinidia chinensis Planch. // Проблемы дендрологии, садоводства и цветоводства: Международная конф. молодых ученых, г. Ялта, 25-27 сентября 1995 г.: Тез. докл. - Ялта, 1995. - С. 107.

4. Виджешвар П., Митрофанова И. В. Прямая регенерация побегов из листовых дисков Actinidia chinensis Planch. - Деп. в НИЛ "ДЕНАСТ" ИЗАН Беларуси, 1995. - № 707. - 7 с.

5. Виджешвар П., Лагутова Е. И., Митрофанова О. В. Биологические особенности морфогенеза Actinidia deliciosa Chev. в культуре in vitro. -Деп. в НИЛ "ДЕНАСТ" ИЗАН Беларуси, 1995. - № 709. - 9 с.

ABSTRACT

Vijeshwar Paul. Biotechnological and physiological basics of micropropagation of Actinidia deliciosa (Chev.), Liang, Ferguson.

The thesis submitted for a candidate's degree (Ph. D.) on speciality 03.00.23 - biotechnology, State Nikita Botanical Garden UAAS, Yalta, 1993.

Morphogenetic potential of isolated tissues and organs of 6 genotypes of A. deliciosa of different physiological maturity (age) in in vitro culture has been studied and on the basis of these studies modes of clonal micropropagation of plants by using embryos, vegetative buds and leaf have been workedout, which will allow by 2-3 times reduce the period of genetical breeding process and to obtain highly qualitative planting material.

Key words: Actinidia deliciosa, embryo, vegetative bud, leaf, morphogenesis, regeneration, rhizogenesis, in vitro, adaptation, in vivo.

АНОТАЦШ

Бщжешвар Паул. Бютехнолопчш та ф1зюлопчт основи клонально-го мшророзмноження Actinidia deliciosa (Chev.) Liang, Ferguson.

Дисертащя на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук з специальное™ 03.00.23 - бизтехнолопя, Державний Ншггський бо-татчний сад УААН, Ялта, 1996.

Вивчет морфогенетичш потенщ! 1зольованих тканин та оргашв шести генотитв A. deliciosa pi3Horo фiзioлoгiчнoгo BiKy в Ky.iwypi in vitro i на íx ochobí розроблет бютехнолопчш заходи клонального мжророзмно-ження рослин э зародив, вегетативних бруньок i листа, застосування яких дозволить в 2-3 рази скоротити тривалыисть селекщйного процесу i одер-жати виcoкoякicний посадковий мaтepiaл.

K.7i040ci слова: Actinidia deliciosa, зародок, вегетативна брунька, лист, морфогенез, регенеращя, ризогенез, in vitro, адаптащя, in vivo.