Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические особенности клубеньковых бактерий, способствующих процессу инфицирования растения-хозяина

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические особенности клубеньковых бактерий, способствующих процессу инфицирования растения-хозяина"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи КОРЕЛОВ Василий Елизбарович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ, СПОСОБСТВУЮЩИЕ ПРОЦЕССУ ИНФИЦИРОВАНИЯ РАСТЕНИЯ-ХОЗЯИНА

Специальность 03.00.07 — микробиология, 03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева и в лаборатории солевого обмена и солеустойчивости Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН (г. Москва).

Научные руководители — доктор биологических наук, профессор В. К. Шильникова, кандидат биологических наук Г. Ф. Ханлэва.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук В. И. Романов; кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник Б. И. Голод.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова.

Защита состоится « . » марта 1995 г. в « . '/V. часов на заседании специализированного совета К 120.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49, Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Ц,НБ ТСХА.

Автореферат разослан 1995

г.

Ученый секретарь л

специализированного совета— . кандидат биологических наук Л- В. Мосина

- 1-

ОЕЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Не только по масштабности, но и роли в природе фиксация азота атмосферы относится к важнейшим биологическим процессам. Как источник биологического азота для сельского хозяйства особое значение имеет симбио-тическая азотфиксация. К настоящему времени изучены многие вопросы бобо-во-риэобиального симбиоза (Израильский с ооавт., 1931 г.; Мишустин, Шильни-кова, 1971 г.; Доросинский, 1975 г.; Hardy, Bums, 1988). Вместе с тем многие вопросы, связанные с. процессом инфицирования, регуляцией и возможностями усиления эффективности клубеньковых бактерий в отношении растения-хозяина, до сих пор не решены. Если на основании результатов генно-биологических анализов стало очевидным, что между партнерами симбиоза, прёжде чем они войдут в контакт, происходит молекулярный диалог (Dudiey, Long, 1986; Тихонович, 1991), то все еще остается.неясным, как же влияют биологические особенности клубеньковых бактерий, выработавшиеся в процессе эволюции, на про-

1

цесс инфицирования и на процесс формирования симбиоза.

В связи с.этим для решения данных вопросов было необходимо уточнить возможности синтеза клубеньковыми бактериями гидролитических ферментов, оценить роль флавоноидов растения-хозяина в узнавании партнера симбиоза и роль экэополисахаридов (ЭПС) клубеньковых бактерий в формировании бобово-ризобиального симбиоза.

Цель исследования: с позиции микробиологии и физиологии растений рас-, смотреть роль гидролаз и ЭПС ризобий и роль флавоноидов растительного происхождения .на первых этапах инфицировзния, предопределяющих развитие эффективного симбиоза.

Задачи, исследования;

- изучить способность клубеньковых бактерий люцерны, . люпина, гороха, вики, сои продуцировать гидролитические ферменты (пек.тияолитические и цел- . люлолитич&ские);

- г -

- определить роль флавоноидов в узнавании ризобиями растения-хозяинз;

- выявить роль -ризобиальных ЭПС при образовании клубеньков у растения-хозяина.

Научная новизна. Впервые высокочувствительными методами Хенкина и Ди-нгла показан низкий, но стабильный уровень пектинолитической и целлюлозоли-тической активности у клубеньковых бактерий. Можно полагать, что гидролитическая активность клубеньковых бактерий в природных условиях достаточно•результативна в процессе внедрения клеток в ткань растения-хозяина.Хотя она и невелика у чистых культур на питательных средах, в момент локального контакта ризобий с клеточной стенкой корневого волоска в условиях почвы, она, по-видимому, достигает уровня, вполне достаточного.чтобы клетки смогли проникнуть в ткань растения. Установлена разнокачественная роль растительных флавоноидов с максимумами поглощен™ 215-235 и 255-275 нм. Обнаружено влияние экзопалисахаридов гомологичных штаммов на образование клубеньков у растения-хозяина. ' Не подтвержден ранее установленный факт образования псевдо- • клубеньков у растений при обработке проростков только ризобиальными ЭПС (без клеток). Вместе с тем выявленная стимуляция закладки боковых корней в присутствии ЭПС может служить основанием для предположения о стартовой роли ЭПС в заложении меристемы клубеньков, которая перерождается в меристему боковых корней в отсутствии микрооимбионтд.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на гаоньокой научной конференции МСХА им.К.А.Тимирязева (Москва, 1992) и конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами (Москва, РМО, 1993).

Публикации. Основные результаты исследований представлены в трех печатных работах. .

Объем работы. Диссертация состоит из введения, глав, выводов, " содержит страниц печатного текста, рисунков, таблиц.

В списке литературы наименования ( из них зарубежные).

Автор выражает искреннюю признательность заведующему лаборатории солевого обмена и солеустойчивости Института физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН (г.Москва) кандидату биологических наук, Ю.В.Балнокину., научному сотруднику Т.П.Ларьковой, ассистенту Т.А.Карепиной и всем сотрудникам кафедры микробиологии ТСХА и лаборатории солевого обмена и солеустойчивости ИФР за поддержку и консультации при выполнении данной работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований: штаммы Rhl2obium melllotl 425а, 87, 132, 422 -активные вирулентные, 26 - вирулентный неактивный, 34 - слабовирулентный неактивный, СХМ-1, 1723/425а; Bradyrhizoblum luplni 359а, 368, 610; Bradyr-hizobium Japonlcum 2496, 6340, 2490; R.leguminosarum 245, 250, 0610, 1026 (эффективные для гороха). Получены из ЕКИИ с/х микробиологии Санкт-Петербург, г.Пушкин.

Суммарную пектинолитическую активность определяли интерферометрически (Рухлядьева, Кретинина, 1968). Полигалактуроназную активность определяли по увеличению количества восстанавливающих альдегидных групп методом Лифшица (1967 г.) и вискозиметрически : на вискозиметре Освальда методом Фэреуса (Fahraeus, 1961). Пектинметилэстерззную активность оценивали модифицированным методом Хыобела о соавт. (Hubbell et al, 1978).

Изучение роли ризобиалъных ЗПС во взаимодействии с растением-хозяином проводили на растениях гороха (сорта Норд и Ульяновская). Растения выращивали на безазотной питательной среде Lie (1969 г.) водная или агаризованная (О.бХ агара) культуры. ЭПС R.le^uminosarùm были получены Л.В.Косенка из института микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного.УАИ,Киев. Схема опыта: инкубация трехсуточных проростков гороха в 0,47. растворах ЭПС в течение

1, 2, 4 или 8 ч. Контролем служили проростки, инкубированные в течение тех же отрезков времени в стерильной воде, а также проростки, инокулированны'е эффективными штаммами R.leguminosarum 250 или 10£6.Для изучения ультраструктуры клубенька образцы из центральной части клубенька объемом - 1,0-1,5 мм фиксировали по. Карновскому (Carnovsky, 1967). Ультратонкие срезы делали на ультрамикротоме LKB-8SOO (Швеция). Препараты просматривали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-100CX ("КО" Япония), при ускоряющем напряжении 60 кВ и инструментальном увеличении 300 ОООк.

Наличие фенольных соединений в растениях люцерны, инокулированных R.meliloti (штамм СХМ-1), и ее корневых выделениях определяли спектрофото-ыетрически в областях спектра 220-460 нм. Фенольную природу определяемых спектрофотометрически соединений подтверждали цветной реакцией Фолина-Дени-са (Эапрометов, 1971).

• РЕЗУЛЬТАТЫ ОПЫТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Пектинолитическая активность клубеньковйх бактерий. Пектинолитическая активность методом Рухлядьевой и Кретининой (1968 г.) была выявлена только у контрольных типично почвенных культур (Pseudomonas putida, Erwinia herbi-cola, Agrobacterium). Ни у одного штамма клубеньковых бактерий в возрасте 2-х суток (быстрорастущие)"и 5-и (медленнорастущие) пектинолитическая активность не была установлена. Вместе с тем, у 2-недельных культур R.meliloti (штаммы 87, 123) пектинолитическая активность оказалась равной 15 g.e. Методы Лифшица(1967 т.) и висковиметрический по Фэреусу для определения по-лигалактуроназнай активности и метод Смита для определения пектинметиласте-рааной активности также не дали положительных результатов: у всех 17 культур выявлены нулевые показатели. Подобные данные получены А.Шатта (1975 г.).

Исследования с использованием более чувствительных методов (Henkin et.

al, 1971; Dingle et al, 1963) дали иные результаты. Чашечным методом Хенки-на пектюгалитическая активность выявлялась четко, хотя и была весьма слабой (табл.1).

При выявлении зон гидролиза методом Дингла (Díñele et al, 19бЗ)наивыс-шая активность была обнаружена во фракции, полученной с использованием 60Х концентрации сульфата аммония, в первой фракции ( от 0 до 207. концентрации) она выявлялась лишь в виде следов. Пектинолитическая активность не коррелировала со степенью эффективности штаммов. Малоэффективные штаммы R.mell-lotl 26 и 34 характеризовались практически такой же ферментативной активностью как и эффективные.

Проверка пектинолитической активности в динамике развития культур показала, что усиление активности с возрастом наблюдается не у всех штаммов. Более того, у некоторых она даже снижается (например, у R.melilotl СХМ-1, B.lupiní 368 она снизилась почти в два раза на 10-е сутки у первых и 15-е у вторых).

Целшмюлитическзя активность клубеньковых бактерий. При определении целлюлолитической активности методом Дингла (Dingle et al,1963) ни у одного из исследованных 17 штаммов не выявлено сколь-либо видимых зон гидролиза на чашках с агаризованной средой, содержащей или целлюлозу, или целлобиозу. Аналогичные результаты для R.meliloti получены в опытах Молина с соавт. (Molina et al, 1979).

. Однако, применив методику диализа супернатантов, полученных из центрифугированных культур, обработанных затем УЗ (Molina et al, 1979), у ряда супернатантов гидролитическую активность удалось обнаружить (табл.2).

Влияние ризобиальных ЭПС на образование клубеньков растениями гороха. В исследованиях Л.В.Кссенко (1991 г.) установлено, что инкубация проростков гороха с препаратами ЭПС R.leguminosarum bv.vjceae вызывает образование очейЬ мелких, СЭДЗД клубеньков на корнях неинокулированных растений гороха.

Таблица 1

Пектинолитическая активность клубеньковых бактерий (5 повторностей)

Культура Зоны гидролиза (мм) Культура Зоны гидролиза (мм)

К.шеШоЬ! 26 11,4 ± 2,8 ВДирШ! 610 7,6 ± 1,9 ' ,

1?.П)еН1оИ 132 0 Й. Хеешйпозагит 245 6,8 + 2,2

И.шеШоН 87 5,4 £ 3,0 К. 1еегшпозагит 250 6,6 +2,3

И.теШоИ 422 5,2 ±2,3 Й. 1еЕГШп1Г|0загит 0610 12,4 +1,6

(г.теШоЬ! 34 8,4 ± 2,5 В.зароп1сит 6346 8,0 + 2,0

1?.теН1о1л 1723 11,4 1 1,9 В.]арогисит 2490 . 10,4 ± 2,6

^теШои 425а 7,8 ± 1,6 В.зароШсит 2496 12,0 ± 1,0

Я-теШоИ СХМ-1 8,4 ¿г 1,1 P.putida В-34 24,6 ± 2,7

В.1ирн\1 395 11,4 ¿1,6 Е.ЬегЫсо1а В-73 18,2 1 1,6

В.1ир1п1 368 10,2 ± 1,6

Таблица 2

Целлюлолитическая активность клубеньковых бактерий ( б повторностей)

Культура Зона гидролиза Культура Зона гидролиза

(им) ■ (мы)

Й-теШои 20 7, 8 £ 2,5 В.1ирШ1 368 14,4 ± 1.2

И-теШоН 132 0 В.1ирШ1 610 14,6 ± 1,8

(г.теШои 132 (2-нед) 0 К. 1ееилипозагит 245 4.8 ± 1.1

К.шеШоН 87 п 1 < 8 ± 0,8 Я.1егшипозагит 250 4.6 % 2.3

Й.теШои 87 (2-нед) 7, ,6 ± 1.5 Р. 1еЁ1шипозагит 0610 6,4 ± 2,2

R.melllotl 422 7, ,6 ± 2,2 В.Зарагисшп 6346 15,2 £ 2,0

Я.теШоИ 34 7, ,0 ±•0,5 Воаротсит 2490 4,8 ± 1.7

И-теШоН 1723 7, ,4 ± 1.1 В.;|арогисит 2496 6,4 ± 0.9

1г.теН1оЬ1 425а 6, ,6 + 1,5 В.Зарогисит 2496 (2-нед) 6.8 ± 0.8

К.шеШоН СХМ-1 9, .0 £'2,0 Р.риШа В-34 33,0 ± 3,4

В.1ир1п1 395а 15 ,0 ± 1,9 Е.ЬегЫсо1а В-73 24,2 ¿2,2

Поскольку на растениях, не обработанных ЭПС, клубеньки отсутствовали, а в опытном варианте они имели дефектный вид и не фиксировали азот, было сделано заключение, что экзополисахариды гомологичных клубеньковых бактерий обладают самостоятельной биологической активностью и способны без микросимбионта индуцировать образование псевдоклубеньков. С целью выяснения, какие же структуры образуются на корневой системе растений при действии ризобиальных зкзополисахаридов в отсутствии клубеньковых бактерий были проведены опыты в стерильных условиях, где проростки гороха инкубировали с ЭПС выссковирулен-тных ризобий гороха (штаммы 248 и 97) в течение 4 ч. Образования псевдоклубеньков в этих условиях не наблюдалось, несмотря на то,что в опытах Л.В.Ко-сенко (1991 г.) именно эти препараты ЭПС вызывали обильную нодуляцию в условиях песчаных полустерильных культур. Причиной этому может быть продолжительная (4-часовая) инкубация проростков гороха в растворах ЭПС, поскольку ранее Л.В.Косенко было установлено, что в подобном случае число образуемых клубеньков резко снижзется и составляет всего 5-131 по сравнению с контролем (добавление ЭПС в момент инокуляции). Возможно также и другое объяснение: затрудненность образования клубеньков в агаровом геле. Вместе с тем в этом опыте был отмечен факт усиления образоваия боковых корней (табл.3). Феномен усиленного образования дополнительных боковых корней говорит о том,. что под действием ризобиальных ЭПС ь корнях гороха происходит стимуляция ростовых процессов. При обычной.инокуляции между клубеньковыми бактериями и растеием-хоаяином идет интенсивный обмен сигналами (5о1Ье1т, 1975; ЕИа^а^;, ТоЬтаэ, 1984), в результате которого на первом этапе установления симбиоти-ческих взаимоотношений в корне формируются зоны роста клубеньков.Возможно, усиление закладки боковых корней под действием ЭПС является результатом инициации заложения меристемы клубеньков, которая перерождается в меристему боковых корней в отсутствии микросимбионта; В полустёрильном опыте (водная культура), несмотря на жесткую поверхностную стерилизацию семян, происходи-

Таблица 3

Влияние ЭДС 1е£шл1позагшп на рост Соковых корней растений гороха

Варианты боковые корни масса растений

кол-во 7. к контр. сырая масса,мг 7. к контр.

Контроль 9,4 ± 2,9 100 1378 £ 4,0 100

(вода)

ЭПС.штамм 97 24,1 ± 7,4 256 1163 ± 37 84

Контроль

(вода) 29,1 ± 1,53 100 1713 ± 479 100

ЭПС,штамм

248С 37,1 ± 1,75 128 1646 ± 546 96

Таблица 4

Образование клубеньков у небактеризованных растений гороха, обработанных ЭПС

Показатели Контроль вода-8 ч Вар Штамм 250а и а н т ЭПС-31 1 ч ы ЭПС-31 2 ч ЭПС-31 8 ч

Количество клубеньков на одно растение 57,9 49,6 40,6 49,9 57,2

Масса клубеньков на одно растение, иг 174,3 205,6 140,1 177,0 188,9

Масса одного клубенька, иг 3,01 4,15 3,45 .' 3,55 3,30

ло спонтанное заражение проростков ризобиями (табл.4). Как видно из табл.4, число клубеньков, спонтанно возникающих на корнях гороха, увеличивалось о увеличением экспозиции проростков в растворах ЭПС. При 8-часовой экспозиции в растворе ШС их число приблизилось к контролю, размеры клубеньков также были близки.

Электронномикроскопические исследования клубеньков б-недельных растений показали, что все клубеньки, независимо от варианта,были заполнены сформировавшимися, плотно расположенными .бактероидами.Во всех клетках клубеньковой ткани всех вариантов выявлялись ЭГ1Р, митохондрии, доля бактероидов достигала 90-95% (визуально). В бактероидах четко просматриваются клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, зона нуклеоида, электроннопрозрачная цитоплазма. Во многих бактероидных клетках встречаются электронноплотные гранулы полифосфата. Отличия между вариантами проявляются в отношении степени развития перибактероидных пространств, которые в наибольших размерах характерны для контрольных вариантов (ЭПС-8 ч), в наименьших - в вариантах оо штаммом 250 и с ЭПС-1 ч и ЭПС-2 ч.

Экскреция фенольных соединений как ответная реакция растения-хозяина на инокуляцию Rhlzoblum и солевой стресс. Определение содержания фенольных соединений в корнях и корневых выделениях люцерны показало, чтц в наших объектах содержатся соединения со спектрами поглощения в областях: 215-235, 265-275 и 415-440 нм (в последнем случае в небольших количествах).Известно,что зона поглощения фенольными соединениями находится в пределах 220-460 нм (Залрометов,1971). Содержание фенольных соединений в корнях инокулирова-ниых и неинокулированных растений было практически одинаково и клало изменялось в динамике и под влиянием засоления. В корневых экссудатах неинокулированных растений соединения со спектром поглощения в области 215-235 нм отсутствовали на пресной среде и появлялись при солевом стрессе. У инокули-рованных растений, напротив, соединения с тзкИм спектром поглощения обнару-

живались в корневых выделениях в достаточно заметных количествах и на пресной среде. Их особенно много выделялось в первые 2 ч после инокуляции ризо-биями. Солевой стресс усиливал экскретирование корнями инокулированных проростков соединений, поглошзющих в этой области спектра. Соединения со спектром поглощения в области 255-275 нм обнаруживались лишь в корневых выделениях инокулированных проростков. Особенно интенсивно они выделялись в первые 2 ч инокуляции. Содержание соединений со спектром поглощения в области 415-440 нм в корнях инокулированных проростков было невелико и мало изменялось под влиянием солевого стресса и в динамике, р корневых выделениях их содержалось еще меньше.

Большая скорость выделения соединений со спектрами поглощения в областях 215-235 и 255-275 нм в первые 2 ч после инокуляции по сравнению с последующими сроками заставляет предположить, что растения довольно быстро реагируют . на появление в ризосфере микросимбионта. Это предположение .подтверждается тем, что соединения со спектрами поглощения в областях 215-235 нм и 255-275 нм в корневых выделениях, обнаруживались уже через 30 мин после инокуляции. Степень выделения таких соединений увеличивалась в течение первых двух часов после инфицирования (рис. 1 и 2).

Цветная реакция Оолина-Дениса подтвердила фенольную природу соединений, выделенных корнями. Фенольные соединения с такими спектрами поглощения относятся к группе флавоноидов (Запрометов, 1971 ). Полученные различия в интенсивности выделения флавоноидов с разными спектрами поглощения под вли-* янием инокуляции и засоления позволяют высказать мнение о различных функциях этих флавоноидов. Поскольку выделение флавоноидов со спектром поглощения в области 215-235 нм усиливалось как под влиянием инокуляции, так и под влиянием солевого стресса, надо полагать, что экскреция этих фенолов является ответной реакцией на стресс вообще.. В то же время, выделение соединений со спектром поглощения в области 255-275 нм происходило ,только в вари-

4

I

С 0,51 NaCl

Рис.1 и 2. Действие инокуляции и засоления на экскрецию флавоноидов корнями люцерны. Поглощение в области спектра: 1- 215-235 км, 2- 255-275 нм.

анте с инокуляцией ризобиями." По всей вероятности, эти (это) соединения служат люцерне сигнальными молекулами при ее взаимодействии с ризобиями.

Следует отметить, что усиление экскреции флавоноидов наблюдалось лишь в ограниченный отрезок времени - о 0 до 4 ч пооле инокуляции проростков.Так же как и соя (Sugamuta, Fakanl, 1993), проростки люцерны выделяли флаво-ноиды, содержащиеся в корнях, а не синтезировали их de novo, о чем свидетельствует наличие этих соединений в корнях неинокулированных проростков, и быстрое проявление экскреции после стрессовых воздействий. Очевидно, выделение сигнальных молекул в течениие 4-часоваго отрезка времени было достаточным для узнавания друг друга сшбиотическими партнерами.

Как мы видим, на рис.1, солевой стресс вызывал у инокулировавдодч растений усиление экскреции фенолов со спектром поглощения в области 215-Е35нм, а у неинокулированных эти вещества начинали выделяться при солевом стрессе. В этой связи возникает вопрос, участвуют ли фенольные соединения в процессах защиты растения от засоления. С этой целью было проведено сравнительное изучение содержания фенольных соединений в органах солеустойчивой люцерны и ее исходного сорта (менее солеустойчивого). Растения, инокулированные штаммом СХМ-1, выращивали в течение б недель в водной культуре. В табл.5 приведены данные, характеризующие рост люцерны двух типов и формирование у них симбиотической системы. Как видно из табл.5, клон 124 обладал большей соле-устоичивостью, чем сорт Хивинская, от которого он был получен, о чем свидетельствовало более слабое снижение массы растений, числа и массы клубеньков под действием засоления. При количественном определении фенольных соединений выявлены некоторые различия ? реакции на засоление у солеустойчивой люцерны и ее исходного сорта (табд.б). Так, содержание всех групп флавоноидов в корнях и листьях у солеустойчивой люцерны не изменялось при выращивании на засоленной среде. У сорта Хивинская наблюдалось резкое снижение содержания фенолов в листьях, а также некоторое снижение содержания фенолов с максимумом поглощения в области 215-235 нм и в корнях. Полученные результаты не совпадают с некоторыми данными, имеющимися в литературе (Достанова,1988; Кипшев, 1989). Эти различия, возможно, обвдседютса тем, что в условиях нашего опыта растения подвергались не солевому стрессу; кзк в опытах указанных авторов, а долговременному воздействию соли (в недель), как неблагоприятного фактора внешней среды. И в этих условиях боле«? солеустойчивый тип люцерны поддерживает баланс фенолов, а несолеустойчивый был неспособен поддерживать его на уровне, который характерен для пресной среды.

На'пресной среде количественный и качественный состав фенолов исходного сорта и клона были практически одинаковы. Те и другие растения каракте-

Таблица 5

Влияние засоления среды на рост и формирование симбиотической системы у двух типов люцерны

Вариант Сырая масса Сырая"масса ' Количество Сырая масса

надземной корней, г клубеньков клубеньков

части расте- (суммарная),мг

ния, г

сорт X И В И Н С К А Я

контроль (вода) 2,77- + 0,11 2,81 ¿ 0,18 22*2 96 ±0,16

0,57. N301 0,72 t 0,067 1,03 + 0,062 15*0,7 36 * 0,4

: К Л 0 Н - 1 2 4

контроль (вода) 1,51 0,03 1,86* 0,07 21+5,7 76 ± 0,3

0,5Х-N301 1,67 X 0,03 1,26 X 0,08 20£2 67 ♦ 0,3

Таблица 6

Спектральные характеристики соединений, содержащихся в органах 6-недельных растений люцерны о разной степенью солеустойчивости, оптическая плотность, нм

Вариант 215-235 255-275 « 415-440

сорт ХИВИНСКАЯ

листья

контроль(вода) 3,74 + 0, ,6 3,04 £ 0,20 3,61 0,31

0,57. ЫаС1 1,98 +.0, 20 1,08 * 0,11 1,06 ± 0,1

корни

контроль(вода) 3,00 ± 0, ,30 1,77 + 0,24 0,09 ± 0,01

0,5Х N301 2,48 ± 0, ,25 1,63 ± 0,16 0,09 £ 0,01

К Л 0 Н - 1 2 4

листья

контроль(вода) 3,18 ± 0, ,35 1,93 ± 0,19 2,16 ± 0,21

0,57. N301 3,35 г 0, ,35 0,52 £ 0,20 3,82 ± 0,38

корни

контроль(вода) 2,39 ± 0, ,24 1,36 1 0,14 .0,04 ± 0,01

0,57. ЫаС1 2,46 ± 0, ,25 1,53 * 0,15 0,08 ± 0,01

ризовалисъ ничтожно малым содержанием в корнях фенолов, имеющих максимум поглощения в области 41Б-440 нм, и большим количеством этих соединений в листьях.

Итак, полученные нами результаты дают основание предполагать, что фе-нольные соединения (вероятно, флавоноиды) участвуют во взаимодействии растения-хозяина с клубеньковыми бактериями, играя роль сигнальных молекул. Кроме того, возможно, фенолы (max поглощения 215-235 нм) выполняют, защитную роль при засолении среды. Не исключено, что соединения с максимумом поглощения в областях 215-235 нм и 410-440 нм играют важную роль в метаболизме люцерны, поскольку подавление роста на засоленной среде сопровождается снижением их содержания в листьях люцерны.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что уровень пектинолитической активности клубеньковых бактерий настолько низок, что'выявляется лишь при использовании высокочувствительных методов (Díñele et al, 1963; Henkln et al, 1974). Пектинолити-ческая активность.определяется индивидуальными особенностями штаммов: у R. meliloti (штаммы 26, 132, 87, 422, 34, 1723, 425а, ССХМ-1) эонц гидролиза ( по методу Хенкина) колеблются в пределах 0-11,4 мм; В.luplni (395,368, 610) - 7,6-11,4 мм; R.leffuminosarum (245, 250, 0610) - 6,6-12,4 мм; B.japonicum (6346, 2490, 2496) - 8,0-12,0 мм и зависит от динамики развития культуры.

2. Применение высокочувствительного метода (Molina et al, 1979) позволило выявить зоны гидролиза целлюлозы и целлобиозы у ряда штаммов клубеньковых бактерий. Целлюлолитическая активность зависит от шуаммовых особенностей ризобий и не зависит от возраста культур.' У R.meliloti (штаммы 26,

132, 87, 422, 34, 1723, 425а, СХМ-1) зоны гидролиза целлюлозы варьируют в пределах 0-9,0 им; В.1ир1п1 (395а, 368, 610) - 14,4-15,0 ш; И. 1е^шл1поза-гшп (245 , 250,0610) - 4,6-6,4 мм; В.',)ароп1сшп (6346, 2490, 2496) - 4,8-16,2 им.

3. Установлена возможная роль растительных (на примере люцер;ш) флаво-ноидов (спектр поглощения в области 255-275 нм) в узнавании микропартнера (^теШоИ) симбиоза. Олавоноиды, для которых характерен спектр поглощения в области 215-235 нм, возможно, участвуют в защите растения от засоления.

4. Возможность образования псевдоклубеньков у гороха под действием ри-зобиальных ЭПС в стерильных условиях не подтверждена. Вместе с тем показано, что ЭПС усиливают образование боковых корней на корневой системе растений гороха как в стерильных, так и нестерильных условиях. -

5. Обработка ризоОиальными ЭПС проростков гороха в модельных опытах приводит к уменьшению перибактероидных пространств' в симбиосомах, последнее коррелирует с эффективностью симбиоза.

- 16 -

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Корелов В.Е., Шильникова Е.К.. Гидролааы клубеньковых бактерий. Те-эиси докладов по материалам конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами", 26-27 октября 1993 г., РАН, Российское микробиологическое общество. Москва, 1093, стр.75.

2. Корелов В.Е. Гидролитическая активность клубеньковых бактерий. Известия ТСХА, 1994, вып.1, стр.135-133.

3. Калинина Е.Б., Хайлова Г.0., МаэинВ.В., Корелов В.Е., Шарикова Л.А. Экскреция фенольных соединений кзк ответная реакция люцерны на инокуляцию Р^гоЫит гаеШоМ и солевой стресс. 9-й Еаховский коллоквиум по аэотфиксации.'-Тезисы докладов ОНТИ ПНЦ РАН. Пущино, 1995, стр.41.

Объем 1 п. л.

Заказ 194

Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44