Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ, СПОСОБСТВУЮЩИЕ ПРОЦЕССУ ИНФИЦИРОВАНИЯ РАСТЕНИЯ-ХОЗЯИНА

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ, СПОСОБСТВУЮЩИЕ ПРОЦЕССУ ИНФИЦИРОВАНИЯ РАСТЕНИЯ-ХОЗЯИНА"

Л-з -нчо

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи КОРЕЛОВ Василий Елизбарович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ, СПОСОБСТВУЮЩИЕ ПРОЦЕССУ ИНФИЦИРОВАНИЯ РАСТЕНИЯ-ХОЗЯИНА

Специальность 03.00.07 — микробиология, 03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева и в лаборатории солевого обмена и солеустойчивости Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН (г. Москва).

Научные руководители — доктор биологических наук, профессор В. К. Шилышкова, кандидат биологических наук Г. Ф. Хайлова.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук В. И. Романов; кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник Б. И. Голод.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова.

Защита состоится . » марта 1995 г. в « .

часов на заседании специализированного совета К 120.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49, Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

Л. В. Мосина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

\ - . Актуальность. Не только по масштабности, но и роли в природе фиксация

азота атмосферы относится к важнейшим биологическим процессам. Как источник биологического азота для сельского хозяйства особое значение имеет симбио-тическая азотфиксация. К , настоящему времени изучены многие вопросы бобо-во-ризобиального симбиоза (Израильский с соавт., 1931 г.; Мишустин, Шильни-кова, 1871 г.; Доросинский, 1975 г.; Hardy, Hums, 1988). Вместе'с тем многие вопросы, ■ связанные с процессом инфицирования, регуляцией и возможности-ми усиления эффективности клубеньковых бактерий в отношении растения-хозяина, до сих пор не решены. Если на основании результатов генно-биологических анализов стало очевидным, что между партнерами симбиоза, прежде чем они войдут в контакт, происходит молекулярный диалог (Dudley, Lone, 1986; Тихонович, 1991), то все еще остается неясным, как же влияют биологические особенности клубеньковых бактерий, выработавшиеся в процессе:эволюции, на процесс инфицирования и на процесс формирования симбиоза. '

В связи с этим для решения данных вопросов было необходимо уточнить возможности : синтеза клубеньковыми бактериями гидролитических ферментов, оценить роль флавоноидов растения-хозяина В узнавании партнера симбиоза и / роль экзополисахаридое (ШС) клубеньковых бактерий в формировании бобово-риаобиального симбиоза.. - ' ' "

' .* Цель исследования: с позиции микробиологии и физиологии растений рассмотреть роль гидролаз и-ЭПС рнзобий и роль флавоноидов растительного происхождения на первых этапах инфицирования, предопределяющих развитие эффек-. тивного симбиоза." ",' ' ', ' ; ■

\\ Задачи исследования: - >'• "•■.'...'; •

- изучить способность клубеньковых бактерий люцерны,_ люпина; гороха, вики,• сои продуцировать.гидролитические ферменты' (пектинолитические и цел-. люлолитические);: \''"'.'-..•''•:'■' ■■

I ■ ЦЕНТРАЛЬНАЯ •. I !!АУЧ : -it Ú-'.оЛИОТЕКА • » ■»•оса .ь.:,-i/o: З'ад'Эмии

Ша^А-ШЗЫ

- г -

- определить роль флавоноидов в узнавании риаоЯияии растения-хозяина;

- выявить роль ризобиальных ЭПС при образовании клубеньков у растения-хозяина.

Научная новизна. Впервые высокочувствительными методами Хенкина и Ди-нгла показан низкий, но стабильным уровень пектинолитическои и целлшозоли-тической активности у клубеньковых бактерии. Можно полагать, что гидролитическая активность клубеньковых бактерий в природных условиях достаточно результативна в процессе внедрения клеток в ткань растения-хозяина. Хотя она и невелика у чистых культур на питательных средах, в момент локального контакта ризсбий с клеточной стенкой корневого волоска в условиях почвы, она, по-видимому, достигает уровня, вполне достаточного.чтобы клетки смогли проникнуть в ткань растения. Установлена разнокачественная роль растительных флавоноидов с максимумами поглощения 215-235 и 255-275 км. Обнаружено влияние экзополисзхаридов гомологичных штаммов на образование клубеньков у растения-хозяина.' Не подтвержден ранее установленный факт образования псевдоклубеньков у растении при обработке проростков только ризобиальными ЭПС (бее клеток). Вместе с тем выявленная стимуляция закладки боковых корней в присутствии ЭПС может служить основанием для предположения о стартовой роли ЭОС в заложении меристемы клубеньков, которая перерождается в меристему боковых корней в отсутствии микросимбионта.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на июньокой научной конференции МСХА им.К.А.Тимирязева (Москва, 1992) и конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами (Москва, РМО, 1993).

Публикации. Основные результаты исследовании представлены в трех печатных работах.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, глзв, выводов, содержит страниц печатного текстз, рисунков, таблиц.

В списке литературы наименования ( из них зарубежные).

Автор выражает искреннюю признательность заведующему лаборатории солевого обмена и ^неустойчивости Института физиологии растений им.К. А. Тимирязева РАН (г.Москва) кандидату биологических наук, Ю.В.Балнокияу,, научному сотруднику Т.П.Ларьковой, ассистенту Т.А.Карепиной и всем сотрудникам кафедры микробиологии ТСХА и лаборатории солевого обмена и солеустойчивости ИФР за поддержку и консультации при выполнении данной работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований: от-амш Rhlzoblum mellloti 425а, 87, 132, 422 -активные вирулентные, 26 вирулентный неактивный,■ 34 - слабовирулентный неактивный, СХМ-1, 1723/425а; Bradyrhlzobium luplni 359а, 368, 610; Bradyr-' hizobium Japonlcum 2496 , 6346 , 2490;: R.legumlnosarum 245, 250,' 0610,* 1026 .; (эффективные для гороха)Получены ■ иа ВНИИ с/х микробиологии Санкт-Петербург, г.Пушкин. '.. * • .

. Суммарную пектинолитич&скую активность определяли интерферометрически ■ ' (Рухлядьева,'Кретинина, 1968). Полигалактуроназнув активность определяли по. увеличению количества восстанавливающих альдегидных групп методом Лифшица ' (1967 г.) и вискоэимётрически. на вискозиметре Освальда методом Фэреуоа (Fahraeus, 1961). Пектинметилэстеразную активность оценивали модифицированным методом Хьюбела с соавт. .(Hubbell et al, 1978). -

Изучение роли ризобиальных ЭПС.во взаимодействии с растением-хозяином 4 проводили на растениях гороха . (сорта Норд и Ульяновская). Растения выращивали на безазотной питательной среде Lie(l969 г.) водная или агариэованная (0,6Х агара) культуры. cHC R.leiuminosarum были получены Л.В.Косенко из института микробиологии и вирусологии им.Д.К.Ззболотного.УАИ.Киев. Схема опы-'. та: инкубация трехсуточных проростков гороха в 0,41 растворах ЭПС в течение

1, 2, 4 иди 8 ч Контролем служили проростки, инкубированные в течение тех же отрезков времени в стерильнол воде, а такте проростки, инокулированные эффективными штаммами R leffumincsarum 250 или 10*6 Для изучения ультраструктуры клубенька образцу из центральной части клубенька объемом - 1,0-1,5 мм фиксировали по Карновскому (Сзгго'.зку, 1967) Ультратонкие срезы делали на ультрамикротоме LKB-SS00 (Швеция) Препараты просматривали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-100СЧ ('КО" Япония), при ускоряющем напряжении 60 кВ и инструментальном увеличении 300 ООО"

Наличие фенолышх соединении в растениях люцерны, ююкулированных R.melllotl (штамм СХМ-1), и «е корневых выделениях огределяли спектрофото-метрически в областях спектра £20-460 нм Фенольную природу определяемых спектрофотометрически соединении подтверждали цветной реакцией Фолина-Дени-са (Запрометов, 1971).

РЕЗУЛЬТАТЫ ОПЫТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Пектинолитическзя активность клубеньковых бактерии Пектинолитическая активность методом Рухлядьевой и Кретининои (1968 г ) была выявлена только у контрольных типично почвенных культур (Pseudomonas putida, Ermnia herbi-cola, Affrobacterium). Ни у одного штамма клубеньковых бактерии в возрасте 2-х суток (быстрорастущие) и S-и (медленнорастущие) пектинолитическзя активность не была установлена Вместе с тем, у 2-недельныл к\льт,р R.melllotl (штаммы 67, 123) пектинолитическзя активность окззалась равной 15 у.е. Методы Лифшица(196? г.) и вискоаиметрическии по Фэреуеу для определения по-лигалактуроназнои активности и метод Смита для определения пектинметилэсте-разнои активности также не дали положительных результатов, у всех 17 культур выявлены нулевые показатели. Подобные данные получены А Шатта (1S75 г.)

Исследования с использованием более чувствительных метсдпЕ 'Henkln et

- Б -

al, 1971¡ Díñele et al, 1963) дали иные результаты. Чашечным методом Хенки-иа пектинолитическая активность выявлялась четко, хотя и Сила весьма слабой (табл.1).

При выявлении аон гидролиза методом Дингла (Díñele et al, 1963)наивыо-шая активность Выла обнаружена во фракции, полученной о использованием 60Z концентрации сульфата аммония, в первой фракции ( от О до 20Х концентрации) она выявлялась лишь в виде следов. Пектинолитическая активность не коррелировала со отепеныо эффективности штаммов. Малоэффективные штаммы R.mell-lotl 26 и 34 характеризовались практически такой же ферментативной активностью' как и эффективные. '.

, Проверка пектинолитической активности в динамике развития-культур показала, что усиление активности о возрастом наблюдается не у всех штаммов. Более того, у некоторых она даже снижается (например, у R.melilotl СХМ-1, B.lupinl 368 она снизилась почти в два раза на 10-е сутки у первых и 15-е у вторых).

Целлшолитическая активность клубеньковых бактерий. При определении цедлшолитической активности методом Дингла (Díñele et al, 1963) ни у одного из исследованных 17 штаммов не выявлено сколь-либо видимых зон гидролиза на чашках с агариэованной средой, содержащей или целлюлозу, или целлобиозу. Аналогичные результаты для • R.melilotl■ получены в опытах Молина с соавт. (Molina et'al, 1979). .

, ' Однако, применив методику диализа супернатантов, полученных иэ центрифугированных культур, • обработанных затем УЗ (Molina et al, 1979), у ряда супернатантов гидролитическую активность удалось обнаружить■(табл.2). ' ■ Влияние риаоСиальных ЭПС на образование клубеньков растениями гороха, , В исследованиях.Л.В.Носенко (1991-г.) установлено, что инкубация проростков гороха с препаратами ЭДС R.leeumlnosarum bv.vieeaa вызывает образование очень мелких, С&дых KjyfiefWKOBt на корнях неинокулированных растений гороха.'

Таблица 1

Пектин оптическая активность клубеньковых бактерии (5 повторностеи)

Культура Зоны гидролиза (мм) Культура Зоны гидролиза (мм)

К.теШои 26 11, ,4 * 2.8 В 1ир1п1 610 7.6 *- 1.0

К.теШои 132 0 К! 1еегшипозагит 245 6.8 2|2

й.теШои 87 5, ,4 £ 3,0 К 1егиш1позагиш 250 6,6 + 2.3

■г.теШои 422 6, ,2 И 2.3 1?. 1евит1позагит 0610 12.4 1,6

ЬиШои 34 8, ,4 £ 2.5 В^аропЮшл 6340 8.0 + 2.0

Г?.те111о!.1 1723 и, ,4 1 1.9 В^аропЮит 2490 10,4 X 2.6

Я.теШои 425а 7, ,8 2 1.6 В ЗароШсит 2496 12.0 t Ь,0

К.теШоМ СХМ-1 8, ,4 X 1.1 P.putlda В-34 £4,6 ¥ 2.7

в. 1ирхт : 385 ,4 £ 1,6 Е.ЬегЫсо1а В-73 18,2 ь 1.6

в.1ир1п1 : 368 10,2 * 1.6

Таблица 2

Целлюлолитическая активность клубеньковых бактерии ( 5 повторностей)

Культура Зона гидролиза Культура Зона гидролиза

(мм) (мм)

(г.теШои 26 7.8 £ 2.5 В.1ир1Ш 368 14,4 ± 1,2

Н.теШоЫ 132 0 В 1ир1п1 610 14.6 ± 1,8

(?.л<е111о11 132 (2-нед) 0 1?. 1егшЧпо5агит 245 4.8 г 1,1

Н.теШои 87 7.8 0,8 1?. 1ееш1позагит 250 4.6 х 2.3

К.теШои 87 (2-нед) 7,6 + 1.5 Р. 1ееш1позагиш 0610 6.4 ± 2.2

Я!.те111ои 422 7,6 2,2 В^аропЮшп 6346 15,2 ± 2.0

Я.теШоЫ 34 7,0 +- 0.5 В^аропЮит 2490 4.8 X 1.7

К.теШои 1723 7,4 А 1.1 ВОаропЮит 2496 6,4 £ 0,9

{г.теШои 425а 6,6 1.5 В.}ароп1сит 2496 (2-нед) 6,8 ± 0,8

Й.теШои СХМ-1 9.0 2.0 Р.риийа В-34 33,0 £ 3,4

В.1ир1п1 395а 15,0 £ 1.9 Е.ЬегЫсо1а В-73 24,2 * 2,2

Поокольку на растениях, не обработанных ЭПС, • клубеньку отсутствовали', а в Опытном варианте они имели дефектный вид и не фиксировали азот, было сделано заключение, что экзополисахариды гомологичных клубеньковых бактерий обладают.самостоятельной биологической активностью и способны бее микросимбионта индуцировать образование псевдоклубеньков. С целью выяснения, какие же структуры образуются на корневой системе растений при действии ризобиальных' экаополисахаридов в отсутствии клубеньковых бактерий были проведены опыты в; стерильных условиях, где проростки гороха инкубировали с ЭПС выссковирулен-тных ризобий гороха (штаммы 248 и 97) в течение 4 ч. Образования псевдоклу-бекьков в этих условиях не наблюдалось, несмотря на то,что в опытах Л.В.Носенко (1991 г.) именно эти препараты ЭПС вызывали обильную нодуляцию в условиях перчаных полустерильных культур. Причиной этому может быть продолжительная (4-часовая) инкубация проростков гороха в растворах ЭПС, поскольку ранее Л.В.Косенко было установлено, что в подобном случае число образуемых, клубеньков резко снижается и составляет всего 5-13Х по сравнению с контро-.лем (добавление ЭПС в момент инокуляции). Возможно также и другое объяснение: затрудненность образования клубеньков в агаровом геле. Вместе с тем в этом опыте был отмечен, факт усиления образовали боковых корней (табл.3). Феномен усиленного образования дополнительных боковых корней говорит о том, что под действием ризобиальных ЭПС ь корнях гороха происходит стимуляция" ростовых процессов. При обычной.инокуЛядаи^между клубеньковыми бактериями и растеием-хозяином идет интенсивный обмен сигналами (5о1Ь?1т, 1975; ВЬае*а1, ТоЬтаз, 1984), в результате которого на первом этапе установления симб »этических взаимоотношений в корне, формируются.зоны роста клубеньков.Возможно,' усиление, закладки боковых ' корней под действием ЭПС является результатом инициации заложения меристемы клубеньков,. которая перерождается в меристему боковых корней в отсутствии мккросимбионта. В подустернльном опыте (водная культура), несмотря на жесткую поверхностную стерилизацию семян, происходи-

Таблица 3

Влияние ЗПС Я.1егит1по5агшп на рост боковых корней растении гороха

Варианты Соковые корни масса растении

кол-во X к контр. сырая масса,мг X к контр.

Контроль 9,4 ± 2,9 100 1378 ± 4.0 100

(вода) •

ЭПС,штамм 97 24,1 ± 7,4 256 1163 1 3? 84

Контроль

(вода) 29.1 * 1,63 100 1713 t 479 100

ЭПС,штамм

248С 37,1 ± 1,76 128 1646 -£ 546 96

Таблица 4

Образование клубеньков у небактериаованных растении гороха, обработанных ЭПС

Показатели Контроль вода-8 ч Вар Штамм 250а и а н т ЭПС-31 1 ч Ы ЭПС-31 2 ч ЭПС-31 В ч

Количество клубеньков на одно растение '67,9 49,6 40,6 49,9 57,2

Масса клубеньков на одно растение, иг 174,3 205,6 140,1 177,0 188,9

Масса одного клубенька, мг 3,01 4,15 3,45 3,65 3,30

до спонтанное заражение проростков риаобиями (табл.4) Как видно из тчОл.4, число клубеньков, спонтанно возникающих на корнях гореха, увеличивалось с увеличением экспозиции гроростков в растворах ЭПС. При а-часовой экспозиции в раствора ЗПС их число приблизилось к контролю, размеры клубеньков также были близки.

Электр-^нн-^шкроскопическ/е исследования клубеньков в-недельных растении показ си и, что все кл,беньк/, реаавлсимо ст варианта,были заполнены сформировавшимися, плотно расположенными бактероидами Ео всех клетках клубеньковом ткани всех вариантов выявлялись ЗТР, митохондрии, доля бактероидов достигала 90-55*. (визуально). В бактероидах четко просматриваются клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, зона нуклеоида, электроннопрозрачная цитоплазма Во многих Оактероидных клетках встречаются электронноплотные гранулы полифосфата. Отличия между вариантами проявляются в отношении степени развития перибактероидных пространств, которые в наибольших размерах характерны для контрольных вариантов (ЭПС 8ч), в наименьших - в вариантах со штаммом 250 и с ЗПС-1 ч и ЭПС-2 ч

Экскреция фенольных соединений как ответная реакция растения-хозяин^ на инокуляция гаигоЬ1ит и солевой стресс Определение содержания фенольных соединении в корнях и корневых выделениях люцерны показало, что в наших объектах содержатся соединения со спектрами поглощения в областях: 215-235, 255-275 и 415-440 нм (в последнем случае в небольших количествах).Известно,что зона поглощения фенольными соединениями находится в пределах 220-460 нм (Запрометов,1971). Содержание фенольных соединении в корнях инокударованных и неинокулированных растении было практически одинаково и пало изменялось в динамике и под влиянием засоления В корневых экссудатах неинокулированных растении соединения со спектром поглощения в области 215-235 нм отсутствовали на пресной среде и появлялись при солевом стрессе. У инокули-рованных растении, напротив, соединения с таким спектром поглощения обнару-

живалиоь в корневых выделениях в достаточно заметных количествах и на пресной среде. Их особенно много выделялось в первые 2 ч после инокуляции ризо-. Оиями. Солевой стресо усиливал экскретирование корнями инокулированных проростков соединений, поглощающих в этой области спектра.'Соединения со спектром поглощения в области 255-275 нм обнаруживались лишь в корневых выделениях инокулированных проростков. Особенно интенсивно они выделялись в пе-. рвые 2 ч инокуляции. Содержание соединений со спектром поглощения в области 415-440 нм в корнях инокулированных проростков было невелико и мало изменялось под влиянием солевого стресса и в динамике. В корневых выделениях их содержалось еще меньше. . . ■ « • * '

Большая скорость выделения соединений со спектрами, поглощения в областях 215-235 и.255-275 нм в первые 2 ч посла инокуляции по сравненюо с последующими сроками заставляет предположить, что растения довольно быстро реагируют на появление в ризосфере микросимбионта. Это предположение подтверждается тем, что соединения со спектрами поглощения в областях 215-235 нм и 255-275 нм в корневых выделениях обнаруживались уже через 30 мин после инокуляции. Степень выделения таких соединений увеличивалась в течение пер-' - вых двух часов после инфицирования (рис..1 и 2).

Цветная реакция ■ Фолина-Дениса подтвердила фенольную природу, соединений, выделенных корнями. Февольные соединения с такими спектрами поглощения ' относятся к группе флавоноидов (Залрометов, .1971'). Полученные различия в интенсивности выделения.флавоноидов с разными спектрами,поглощения подвли-; янием инокуляции и засоления позволяют высказать мнение о различных функ--. циях этих флавоноидов. Поскольку выделение флавоноидов со спектром поглощения в области.215-235 нм усиливалось, как под влиянием инокуляции, так и под' влиянием солевого стресса, надо полагать, что экскреция этих фенолов ; является ответной реакцией на стресс вообще.. В то же время, выделение соедине-' ний со спектром поглощения в области 255-275 нм происходило только в. вари-

-ино'улирс.ванные растения, выращиваемые на грсснс й срвде

время, ч *-иной4,лиреванные растения.

ссд-р-«.ицие,и на питательной гр^дн о 0,55 N301 Ьеинок\лиргванные растения, вырициваниыв на пресной среде _неинскулированные расте-время.ч 1—1 ния, выращиваемые на среде

С 0,5Х N301

Рис.1 и 2 Действие инокуляции и засоления на экскреции флзвоноидов корнями люцерны Поглощение в области спектра. 1- 215-С35 нм, 2- £55-275 нм.

1»

опти- Д4 -

ческая О»

плот- &<

ность. а»

км о

□

анте с инокуляцией ризоСиями По всей вероятности, эти (эго) соединения служат люцерне сигнальными молекулами при ее взаимодеиствии с ризоОиями.

Следует отметить, что усиление экскреции флавоновдов наблюдалось лишь в ограниченный отрезок времени - с 0 до 4 ч после инокуляции проростков.Так же как и соя (Sugsnuta, Fakanl, 1993), проростки люцерны выделяли флаво-ноиды, содержащиеся в корнях, а не синтеаировали их de novo, о чем свидетельствует наличие этих соединении в корнях неинокулировзнных проростков, и быстрое проявление экскреции после стрессовых воздействии. Очевидно, выделение сигнальных молекул в течениие 4-часового отрезка времени было достаточным для узнавания друг друга симбиотическими партнерами.

Как мы видим, на рис.1, солевой стресс вызывал у инокулированиык растений усиление экскреции фенолов со Спектром поглощения в овласти 215-235 км, а у неинокулированных эти вещества начинали выделяться при солевом стрессе. В этой'связи возникает вопрос, участвуют ли фенольные соединения в процессах зашиты растения от засоления. С этой целью было проведено сравнительное изучение содержания фёнольных соединений в органа* солеустойчивой люцерны и ее исходного сорта (менее солеустойчивого). Растения, инокулированные штам-' мом СХМ-1, выращивали в течение б недель в водной культуре. В табл.Б приведены данные, характеризующие рост люцерны двух типов и формирование у них симбиотической системы. Как видно иэ табл.5, клон 124 обладал большей соле-. устойчивостью, чем сорт Хивинская, от которого он был получен, о чем свидетельствовало более слабое снижение массы растений, числа и массы клубеньков под действием засоления., При количественном определении фёнольных соединений выявлены некоторые различия в реакции на засоление у солеустойчивой лю-, церны и ее исходного сорта (табл.6). Так, содержание всех групп флавоноидов в корнях и листьях у солеустойчивой люцерны не изменялось при выращивании на засоленной среде."У сорта Хивинская наблюдалось резкое снижение содержания фенолов в листьях, а также некоторое снижение содержания фенолов о максимумом поглощения в области 215-235 км и в корнях..- Полученные результаты не совпадают с некоторыми данными, имеющимися я литературе (Достанова,1986; Кигапев, 1989).' Эти различия, возможно,* объясняются тем, что в условиях нашего опыта растения подвергались не солевому стрессу-,. кчк в опытах, указанных авторов, а долговременному воздействию соли (6 недель),, как неблагоп--риятного фактора внешней среды. И в этих условиях более еоаеустойчивый тип люцерны поддерживает баланс фенолов, а несолеустойчивый был неспособен поддерживать его на уровне, который характерен для пресной среды.

На'пресной среде количественный и качественный состав фенолов исходно-' го сорта и клона были практически одинаковы.- Те и'другие растения характе-

Таблица 5

Влияние засоления среды на рост и формирование симбиотической системы у двух типов люцерны

Вариант Сырая масса Сырая масса Количество Сырая масса

надземной корней, г клубеньков клубеньков части расте- (суммарная),мг кия, г

сорт X И В И Н С К А Я

контроль (вода) 2,77 * 0,11 2, ,81 £ 0,18 22/2 93 *■ 0, 16

0,52 ЫаС1 0,72 £ 0,067 1, ,03 £ 0,062 1520,7 36 + 0, 4

К Л 0 Н - 1 2 4

контроль (вода) 1,51 0,03 1( ,86 ¿г 0,07 2115.7 76 0, ,3

0.5Х ЫаС1 1,67 Л 0,03 1, ,26 X 0,08 20*2 67 0. ,3

Таблица в

Спектральные характеристики соединении, содержащихся в органах б-недельных растении люцерны с разной степенью сслеустойчивости, оптическая плотность, ш

Вариант 215-235 255-275 415-440

сорт ХИВИНСКАЯ

лисья

контроль(вода) 3.74 + 0,6 3,04 £ 0,20 3,61 I- 0,31

0.5Х ЫаС1 1,98 +: 0,20 1,08 * 0,11 1,06 £ 0,1

корни

контроль(вода) 3,00 1 0,30 1,77 * 0,24 0,09 X 0,01

0.5Х N301 2,48 * 0,25 1,63 t 0,16 0,09 г 0,01

КЛОН - 124

листья

контроль(вода) 3,18 1 0,35 1,93 * 0,19 2,16 ± 0,21

0,67. МзС1 3,35 г 0,35 0,52 X 0,20 3,82 * 0,38

корни

контроль(вода) 2,39 1 0,24 1,36 1 0,14 0,04 А 0,01

0,5* N301 2,48 * 0,25 1,53 * 0,15 0,08 *-0,01

ризовались ничтожно малым содержанием в корнях фенолов, имеющих максимум поглощения в области 416-440 нм, и большим количеством этих соединений в

ЛИСТЬЯХ. '*■ • .. . - ■ ■ .'Л - \

Итак, полученные нами результаты дают основание предполагать, . что фе-нольные соединения (вероятно, флавоноиды) участвуют во взаимодействии растения-хозяина р клубеньковыми бактериями, играя роль сигнальных молекул. Кроме того, вовможно, фенолы (шах поглощения 215-235 нм) выполняют защитную роль при засолении среды. Не исключено, что соединения с максимумом поглощения в областях 215-235"нм и 410-440 нм играют важную роль в метаболизме люцерны,поскольку подавление роста на засоленной среде сопровождается снижением их содержания з листьях люцерны.' 4 '

К . . .выводы - - •• , . .

1. Установлено, что уровень пектинолитической активности клубеньковых бактерий настолько низок, что выявляется лишь при использовании высокочувс-' твительных методов (Dingle et al, 1963; Henkln et al,' 1974). Пектинолити-ческая активность.определяется индивидуальными особенностями штаммов: у К.. mellloti (штаммы 26, 132, 87, 422, 34, 1723, 425а, ССХМ-1) зоны гидролиза.( по методу Хенкина) колеблются в пределах 0-11,4 мм; В.luplni (395,368, 610) - 7,6-11,4 мм; R. leßuniinosaruin (245, 250, 0610) - 6,6-12,4 мм; B.japonlcum (6346, 2490, 2496) - 8,0-12,0 мм и зависит от динамики развития культуры.

¡ 2. Применение высокочувствительного метода (Molina et al, 1979) позволило выявить зоны гидролиза целлюлозы и целлобиозы у ряда штаммов клубеньковых бактерий. Целлюлолитическая активность зависит от иуаммовых особенностей; ризобий и не ззвисит от возраста культур., У R.melilotl (штаммы 26,.

132, 87, 422, 34, 1723, 425а, СХМ-1) зоны гидролига целлюлозы варьируют в пределах 0-9,0 мм; В luplnl (395з. Збв, 610) - 14,4-15,0 мм; R.letfumlnosa-rum (245, 250,0010) - 4,6-6,4 мм; В Japonlcum (6346, 2490, 2496) - 4,9-15,2 мм

3. Устансзл- а возможная роль растительных (на примере люцерны) флаво-ноидов (спектр поглощения в области 25<5-2"5 нм) в узнавании микропартнера (R mellloti) гимбисаа. Ялавонслы, для которых характерен спектр поглощения в области 215-235 нм, возможно, участвуют в защите растения от засоления.

4. Возможность образования гсовдскл,'^ньков у гороха под действием ри-зсбиальных ШС в стерильных условиях ни подтверждена Вместе с тем показано, что HIC усиливают образование Соковых корней на корневой системе растений гороха как в стерильных, так и нестерильных условиях.

5. Обработка риэобиальными ШС проростков гороха в модельных опытах приводит к уменьшению перибактероидных пространств в симбиосомах, пооледнее коррелирует с эффективностью симбиоза.

. : • " 16 - • ■. ■ ; По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Корелов В.Е., Шильникова В.К.. Гидролазы клубеньковых бактерий. Те- * зиоы докладов по материалам конференции '"Биосинтез ферментов микроорганизмами", 26-2? октября 1993 г., РАН, Российское микробиологическое общество. Москва, 1993, стр.75. ■ ,

2. Корелов В.Е. Гидролитическая активность клубеньковых бактерий. Известия ТСХА, 1994, вып.1, стр.135-138.

3. Калинина Е.Б., Хайлова Г.Ф., Магкк В.В., "Корелов В.Е., Шарикова Л.А. Экскреция фенолышх соединений как ответная реакция люцерны на инокуляцию иигоЫит те111оМ и солевой стресс. • 9-й Еаховский коллоквиум по; азотфиксации. Тезисы докладов ОНТИ ПНЦ РАН. Пущино, 1995, стр.41.

Объем 1 п т

Заказ 194

Тираж 100

Типография Московской с к академии им К А Тимирязева 127550, Москва И 550, Тимирязевская ул, 44