Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические особенности индуцированного морфогенеза и регенерации растений зизифуса (Zizyphus jujuba MIII.) в условиях in vitro

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биологические особенности индуцированного морфогенеза и регенерации растений зизифуса (Zizyphus jujuba MIII.) в условиях in vitro"

УКРАИНСКАЯ АКАДРМИЯ АГРАРНЫХ НАУК

■'«"УЛЛРСТННШНЙ НИКИТСКИЙ НОТАНИЧЕСКИИ САД

РГ6 од

На правах рукописи

МИТРОФАНОВА Ирина Вячеславовна

•VДК 581.14 3.6:г/31.S2:634.6

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНДУЦИРОВАННОГО МОРФОГЕНЕЗА И РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИИ ЗИЗИФУСА (ZIZYPHUS JUJUBA Mill.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO

03.00.23 - биотехнология 03.00.05 - ботаника

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ялта - 1994

Диссертационная работа является рукописью Работа выполнена в отделе биотехнологии Государственное Никитского ботаническЬго сада УААН.

Научные руководители - академик АН РМ, доктор биологич*

ких наук, профессор

A.А.Чеботарь,

академик РАСХН, доктор биологи ч< ких наук, профессор

B.С.Шевелухп.

Официальные оппоненты - член-корреспондент РАН, академж

РАСХН, доктор биологических науу профессор Р.Г.Вутенко, доктор биологических наук В.Д.Рабогягов.

Ведущая организация - Институт клоточной биологии

и генетической инженерии АН Украины

Защита диссертации состоится . МЛуЛ^ . .1994 г

в^Тчас. на заседании специализированного совета Д 020.76.0 при Государственном Никитском ботаническом саде по адресу: 334267, Республика Крым, г.Ялта, Государственный Никитский бо танический сад.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государст' венного Никитского ботанического сада.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук Т.П.Кучеровг

п

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди субтропических культур большой ин-ерес представляет зизифус (Zizyphus Jujuba Mill.) семейства рушиновые, который одновременно является пищевым и лекарственны растением. В связи с этим наблюдается тенденция к увеличению лощадей насаждения зизифуса в Крыму. Использование традиционных пособов размножения зизифуса (семенное и вегетативное) не может беспечить этих потребностей. Кроме того, указанные способы име-т ряд недостатков. Так, при семенном размножении мы получаем, аще всего гетерогенный материал. Вегетативное размножение в сиу биологических особенностей культуры, трудоемко (Ядров, Синько др., 1990).

В последние несколько десятилетий во многих странах мира ашел широкое применение новый весьма эффективный и экономически ыгодный метод размножения растений - клональное микроразмноже-ие. Известные методы клонального микроразмножения, применяемые ля травянистых растений нельзя использовать без серьезных ис-ледований для древесных пород. При размножении древесных расте-ий In vitro возникает много трудностей. Они встречаются на всех тапах микроразмножения, начиная с получения стерильной культу-а, дальнейшего размножения и особенно на этапе укоренения обра-эвавшихся побегов. В тоже время этот метод позволяет ускорить элекционный процесс, получить генетически однородный высокока-эственный посадочный материал, и сократить длительность юве-яльной фазы. Попытки решения такого рода проблем применительно культуре зизифуса и составили основу данной работы.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы было воз-эжно более полное изучение морфогенетических потенций различных <аней и органов Zizyphus .jujuba в зависимости от гормональных, зофических и физических факторов выращивания, а также физиоло-1ческого состояния первичного экспланта. Для достижения поставкой цели необходимо было решить следующие задачи:

- получить стерильную культуру эксплантов зизифуса;

- изучить морфогенетические потенции зизифуса in vitro в ¡висимости от генотипа, возроста исходного растения и ггроисхож-!ния первичного экспланта;

- изучить влияние трофических, гормональных и физических

факторов на процесс морфогенеза;

- изучить анатомию процесса образования соматических зародышей под влиянием веществ ауксинового типа действия в культур« тканей зародышей зизифуса;

- оптимизировать состав питательной среды и условий культи вирования с помощью статистического анализа полученного материа ла;

- разработать лабораторный способ размножения зизифуса i: vitro.

Научная новизна. Впервые детально изучены морфогенетически потенции растения зизифуса in vitro, определены возможные пут размножения товенильного и взрослого растения. Изучено влияни различных факторов выращивания (состав минеральных солей, гормс нальный баланс среда, консистенция и рН среды) на регенерациок ную способность растений зизифуса. Показано, что с увеличение возраста растений, от которых получены экспланты, снижаются moj фогенетические потенции культивируемых тканей и органов. Уст; новлено, что оптимальным является использование в качестве экс плантов вегетативных почек взрослых растений или зиготичесю зародышей. Показано, что заложение соматических зародышей прот ходит в эпидермальном И субвпидермальном слоях семядолей зарод! ша зизифуса. С помощью статистических методов оптимизированы у ловия индукции развития вегетативных почек. Впервые разработ способ получения растений из соматических и зиготических зарод: шей зизифуса.

Практическая ценность работы. Расширены представления морфогенетических потенциях древесных растений. На основе пол ченных данных о морфогенетических потенциях тканей и органов з зифуоа предложен лабораторный метод получения растений из зар дышей (зиготических и соматических) в условиях in vitro. Эi метод можно рекомендовать для получения новых селекционных гибридных форм.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ и 3 находятся в печати.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докла; вались на II-ом Российском симпозиуме "Новые методы биотехно, гии" в 1993 г. (Пущино), на 2-ой конференции "Регуляторы рост;

развития растений" в 1993 г. ТСХА (Москва), на 2-ой международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" в 1993 г. (Алматы), на конференции молодых ученых и специалистов "Актуальн1 питания ботан!ки 1 екологИ" в 1993 г. (Ялта) и на ежегодных семинарах отдела биотехнологии и отдела дитогенетики и эмбриологии ГНВС УААН.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной часта, заключения, выводов и триложения. Содержит 157 страниц машинописного текста, 37 рисун-<ов, 26 таблиц. Список литературы содержит 2Р56 наименований, из мх 241 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили зародыши и вегетативные почки >-6-и 20-летних деревьев трех сортов зизифуса: сорт Я-цзао- мелкоплодный, сорт Китайский 2А - среднеплодный и сорт Та-ян-цзао -{рупноплодный.

Плода стерилизовали 90-95 % этиловым спиртом и обжигали в ьламени спиртовки. Условия стерилизации вегетативных почек в звязи с необходимостью специальных экспериментов для поиска оптимальных вариантов приводим в разделе Резульаты и обсуждения. 3 работе придерживались принятых в отделе биотехнологии ГНВС финципов стерилизации питательных сред, инструментов и посуды.

В экспериментах по изучению морфогенетических потенций раз-шчных органов использовали питательную среду ПВ, содержащую «кросоли по Пирику (Р1ег1к, 1976), микросоли по Хеллеру (Не1-.ег, 1953) и витамины по Жакио (1953). В зависимости >т поставленной задачи к питательной среде добавляли различные »иологически активные вещества, а также сахарозу в концентрациях ),029-0,146 М. Экспланты выращивали в культуральной комнате при ■емпературе 25±1°С, 16 часовом фотопериоде, освещенности 2000-Ю00 лк и относительной влажности 70 %.

В экспериментах по изучению влияния факторов выращивания на гобегообразование, вегетативные почки зизифуса культивировали [а: 1 - агаризованной ( агар 0,7 % ) и жидкой ( стационарная на шифровальных мостиках в биологических пробирках); 2 - агаризо-¡анной среде с разным рК (4,2-7,2); 3 - средах с различным со-

ставом минеральных солей - соли по прописям Хеллера, В5 (Ca borg, Eveleigh, 1968), Мурасиге и Скуга (MC) (Murashige, Skoo, 1962) и Пирика.

Было изучено влияние веществ цитокининового типа действ (кинетин (6-фурфуриаминопурин), БАП (6-бензиламинолурин)) и а у синового тина действия (УМК (ß-индолил-З-маслянная кислота), И (0-индолил-З-уксусная кислота), КУК (л-нафтилуксуоная кислота на образование побегов из вегетативных почек зизифуса.

Для культивирования зародышей зизифуса были испытаны сре, с различным составом минеральных солей: Уайта (White, 1934)., Н ча (Witsch, 1969), Кнудсона (KnuöLson: , 1925), НС (1962), Мон (Morinier, 1973). Экспланты выращивали «ерьоначально в темно при температуре 5±1°С в течение 30-120 суток, а затем при теш ратуре 25±1°С, 16 часовом фотопериоде, освещенности 2000-3000 , и относительной влажности 70 %.

Эксперименты по изучению образования соматических зародыш проводили в три этапа. На первом и втором этапе использовали n¡ тательную среду MC, на третьем - среду ГШ. Исследуемый матери, первоначально находился в темноте (термостат, температура 26°С На втором и третьем этапе экспланты культивировали при темпер; туре 2б±1°С, освещенности 2000-3000 лк и 16 часовом фотопериод!

Анатомическое изучения процесса заложения соматических з; родышей проводили на постоянных препаратах на микроскопе "Jen; val" (ГДР). Микрофотографии срезов были сделаны с помощью фот« насадки для микроскопа мфн-11. Эта.работа проводилась совмест) с к.б.н. С.В.Шевченко.

Эксперименты по оптиматизации условий культивирования пр< водили с помощью методов математической статистики в соответс вии с рекомендациями В.С.Горя (1978) и Б.А.Доспехова (1985) i ЭВМ IBM-AT.

Миниатюрные растения пикировали в пластмассовые вазоны < смесью торфа и перлита (1:3). Растения содержали при температу] 25±1°С, освещенности 3000-5000 лк и 16 часовом фотопериоде в ti чение 4-х месяцев.

Эксперементальная работа была выполнена в отделах биотехга логии и цитогенетики и эмбриологии Государственного Никитско] ботанического сада.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Изучение морфогенетических потенций зизифуса (Zizyphus jujuba Mill.) в условиях in vitro.

Культивирование изолированных зародышей и вегетативных по-:ек зизифуса на питательных средах, отличающихся по составу митральных солей, концентрациями витаминов, сахарозы, а также 'ормоналышх препаратов и их соотношений, приводило к разным юрфогенетическим процессам.

Культивирование вегетативных почек зизифуса in vitro. Способность почек зизифуса к морфогенезу сильно варьировала в тече-ие сезона (рис.1). Так вегетативные почки, введенные в условия n vitro в середине апреля слабо развивались. В то время как у |Ксплантов, отобранных с растений в период их активного роста in :.itu, интенсивность побегообразования in vitro достигалага 8015%.

Развитие

побегов, %

Время взятия экспланта, месяц Рис. <1. Зависимость развития побегов зизифуса от времени взятия экспланта

Особенности получения асептической культуры. Сравнительное зучение эффективности различных способов стерилизации вегета-ивных почек 5-6-летних деревьев показало необходимость ступен-атой дезинфекции тканей зизифуса, при которой почки с микрощит-

ком погружали на 10 мин в 1% раствор Тшего8а1, 60 сек в 70 '.этанол, 2-3 мин в раствор азотнокислого серебра и триады ироми ьяли стерильной дистиллированной водой в течение 20-30 ми (табл. 1).

Таблица 1

Выход эксплантов после стерилизации различными способами неодре несневших побегов зизифуса

Способ стери- Режим Количество почек, %

лизации стерилизации, мин. инфицированных потемневших развившихся

1 2 3 4 5

70% С^НсОН 4% гшохлорит Па 1 15 72,0+7,88 11,0+5,67 17,0+4,83

70% С„Н,-0Н 0,1% диацид 1 5 55,0+5,27 14,0+5,16 31,0±7,37

70% С0НЦОН 1

0,8% АйЮ 3 3 79,0+7,37 21,0±7,37 0

70% С,,Н^0Н 'Ишегова!

.1

10

94,0+5,16 6,015,16

70% С^Нс-ОН 1% ТХйегова!

0,856 AgN0

3

\% Т1тегова1 70% С^ОН

0,856 АвГЮ-,

"3

1

10 37,0+4,83 47,0+6,74 16,0+5,16 2-3

10

1 4,0+5,16

2-3

9б,0±5,16

Оптимизация гмтательной среды для индукции побегообразования. Первоначально было изучено влияние минеральных солей (п< МС, В5, Хеллеру, Пирику) на фоне константного содержания биологически активных веществ (ВАЛ 4,44 мкМ, ИМК 0,05 мкМ, мезоинозич 554,93 мкМ, сахароза 0,087 М) на мофогенетические потенции куль-

0

тивируемнх почек зизифуса. Через 7-10 суток, с момента начали культивирования почки с микрощитком, на испытанных вариантах питательных сред было отмечено начало роста побегов. В этот период на среде Хеллера образовывались единичные слабые побеги, а в основании микрощитка образовывался рыхлый бесцветный каллус. Рост побегов средней интенсивности был отмечен на среде В5, при этом в течение месяца образовывался только один побег длиной 0,4-0,6 см. Культивирование почек на среде МС не дало положительного результата. Наилучшей оказалась среда, содержащая минеральные соли по Лирику, где интенсивность побегообразования достигала 85%. Однако и в этом варианте опыта образующиеся побеги длиной 0,50,6 см имели светло-зеленую окраску, что побудило нас провести последующие серии експериментов с целью повышения эффективности размножения зизифуса через культуру вегетативных почек.

Анализ полученных данных, с применением методов математической статистики позволил выявить значимые и незначимые различия в развитии побегов различных генотипов на 28 вариантах питательной среды. В результате было установлено, что концентрации витаминов по Жакио, L-глутамина и глицина являются основными факторами, определяющими жизнеспособность почек и их способность к морфогенезу при культивировании в течение 30 суток. Было показано, что увеличение концентрации этих веществ оказывало благоприятное воздействие на развитие побегов. На ряду с этим, повышение концентрации макросолей по Пирику, микросолей по Хел-леру, Са(К0^)2-Д^О, ИаРеЭДТА-2Н20, мезоинозита, ГК, сахарозы и агара отрицательно влияло на морфогенез. В результате всей серии экспериментов была оптимизирована питательная среда (ПВ), отличающаяся от среды Лирика содержанием 2,54 мкМ CatNO.^ -4^0, чикросолей по Хеллеру, витаминов по Жакио, 654,9 мкМ мезоинозита, 6,84 мкМ Ъ-глутамина, 26,6 мкМ глицина, 2,02 мкМ ГК и 0,116 И сахарозы, позволяющая повысить морфогенетический потенциал зизифуса .

Сравнивая по критерию Стьюдента результаты, полученные в процессе культивирования in vitro почек трех сортов зизифуса, выявлены незначимые различия в интенсивности регенерации побегов через 14 и 30 суток культивирования сортов Китайский 2А и Га-ян-цзао. В это же время у сорта Я-цзао интенсивность пролифе-

рации была сравнительно низкой.

Изучение влияния фитогормонов на активацию меристем и рост побегов. При культивировании вегетативных почек в течение 3 недель на оррде ПВ с различными концентрациями веществ цитокинино-вого типа действия БАТ1 (0,88-4,44 мкМ) и кинетина (0,92-4,65 мкМ) были отмочены различия, связанные с активизацией развития почек и роста побегов. Так, при сравнительно низких концентрациях БАЛ (0,88-2,22 мкМ) число активизирующихся почек возрастало до 60 % с увеличением длины побега до 0,12 см. Увеличение концентрации ПАП до 4,44 мкМ приводило к витрификации побегов. Присутствие в среде кинетина тормозило побегообразование и вызывало формирование рыхлого каллуса на поверхности почек. Наиболее хорошо сформировавшиеся побеги были получены в варианте, где в среде первоначально присутствовал ВАЛ в концентрации 0,88 мкМ. По этой причине в последующих экспериментах БАЛ использовался в качестве вещества цитокининового типа действия.

Било изучено влияние генотипа, ВАЛ и ауксинов ИМК, ПУК, ПУК на регенерационную способность почек зизифуса в условиях in vitro. Так, у сорта Я-цзао наилучшее развитие побегов поисходилс при культивировании на среде ПВ с содержанием БАП 0,88 мкМ и ИШ 0,024 мкМ (табл. 2). Образовавшиеся побеги с двумя мевдоузлияш

Таблица 2

Влияние фитогормонов на образование побегов у сорта Я-цзао в условиях in vitro (наблюдение через 42 сут)

Концентрация ауксинов, мкМ Длина побега, см

Концентрация БАП, мкМ

0,0 0,88 2,64 4 44

ИМК

0,024 0.89 г. 0,11 0,43 ± 0,09 0,68 + 0,08 0,65 + 0,05

0,049 0,65 t- 0,08 1,64 ± 0,08 0,72 ± 0,07 0,78 0,07

ИУК

0,028 0,39 + 0,04 0,69 ± 0,07 0,75 ± 0,07 0,76 + 0,09

0,057 0,42 + 0,03 0,95 ± 0,06 0,75 ± 0,07 0,80 + 0,05

НУК

0,026 0,46 + 0,02 1,15 ± 0,06 0,33 ± 0,04 0,77 + 0,07

0,053 1,12 ± 0,07 0,88 ± 0,03 1,61 + 0,11 0,90 + 0,06

*Контроль (К) - 0,52 ± 0,03

достигали в среднем длины 1,64 см. Увеличение концентрации БАЛ и введение в питательную среду НУК и ИУК снижало пролиферационный процесс. Аналогачные результаты были получены у сорта Китайский 2А (табл. 3). Культивирование почек сорта Та-ян-цзао на пита-

Таблицп 3

Влияние фитогорыснов на образование побегов у сорта Китайский 2А в условиях in vitro (наблюдение через 42 оут)

{онцентра- Длина побега, см

дая аукси-юв, мкМ Концентрация БАП, мкМ

0,0 0,88 2,64 !

ИШ

0,024 1,00 + 0,08 1,42 + 0,08 1,06 ± 01 ,07 0,73 0, ,07

0,049 0,75 ± 0,06 1,36 + 0,08 0,83 + 0, ,06 0,73 ± 0, ,07

ИУК

0,028 0,85 ± 0,06 0,58 + 0,09 0,32 0, ,04 0,66 ± 0, ,05

0,057 1,28 ± 0,10 0,89 + 0,08 0,91 + 0. ,06 0,71 + 0, ,00

НУК

0,026 0,72 f 0,08 0,62 + 0,07 0,44 + 0, ,05 1,17 f о, ,13

0,053 0,86 + 0,08 0,90 + 0,05 0,40 + 0, ,07 0,33 ± 0, ,04

'Контроль (К) - 0,82 ± 0,03

Таблица 4

влияние фитогормонов на образование побегов у сорта Та-ян-цзао в условиях in vitro (наблюдение через 42 сут)

Сонцентра- Длина побега, см

1ия аукси-юв, мкМ Концентрация БАП, мкМ

0,0 0,88 2 ,64 I 4 ,44

ИМК

0,024 1,74 + 0,06 0,55 ± 0,04 2,26 ± 0,10 0,45 + 0,05

0,049 0,65 4 0,09 1,41 ± 0,11 1,18 ± 0,07 0,84 + 0.08

ИУК 0,028 0,38 + 0,07 0,48 ± 0,08 1,92 ± 0,09 1,32 + 0,09

0,057 1,49 > 0,09 2,09 ± 0,08 1,72 ± 0,08 1,35 + 0,09

НУК 0,026 0,75 £ 0,08 1,31 ± 0,08 2,06 ± 0,07 0,41 + 0,06

0,053 0,67 ± 0,10 1,77 ± 0,06 0,64 ± 0,09 1.15 ± 0,07

Контроль (К) - 1,07 ± 0,05

тельной среде, содержащей 2,64 мкМ БАП и 0,0?4 мнМ ИМК способе вовало активному побегообразованию (табл. 4).

Результаты проведенного дисперсионного >шала;<а показал что все три фактора (Х^ - сорт, Х? - БАП, Х-, - пукг.чш! и их вз имодействие являются значимыми величинами (табл.

Результаты трехфакторного дисперсионного анали:;.ч чу/горы побег образования зизифуса

Источники из- SS df US = !' Г-.-,.-;. ; F табл

менчивости SS / df ... I.

Оновные факторы сорт 24,21 2 12,11 19,49

БАП 8,21 3 2,73 57,0 4 8,53

аук 19,17 6 3,19 3,67

Взаимодействие факторов

сорт х БАП 16,59 6 2,76 3,67

сорт х аук 19,21 12 1,60 33,37 2,30

БАП х аук 25,73 18 1,43 29,80 1,92

сорт х БАП х аук 52,13 36 1,45 30, !■■) 1,55

НСР<0,5

Влияние физических факторов выращивания на рогонерационну способность изолированных почек Z. ju.1uba в условиях in vitro Эффективность клонального микроразмножения растений зависит только от гормональных факторов питательной среды, но и от физ: ческих факторов выращивания. К началу наших исследований отсу ствовали какие-либо сообщения, касающиеся влияния консистенции рН среды или других физических факторов выращивания на морфог> нез Zizyphus spp.

Результаты, приведенные в таблице 6 показывают, что заме] жидкой среды на агаризованную значительно влияла на процесс п< бегообразования. Так, при культивировании почек зизифуса на жи, кой питательной среде формировались единичные побеги и у основ; ния микрощитка образовывался рыхлый, оводненный каллус. Ин< развитие имели почки на агаризованной питательной среде. 4epi

2-3 недели после введения почек в культуру начиналось активное побегообразование. В зависимости от сорта длина и количество по-

Таблица 6

Влияние консистенции среды на побегообразование почек зизифуса

Консистенция Длина по- Кол-во Среднее Витрификация

питательной бега, см жизне- кол-во %

среды способ- побегов

ных по- на одну

чек, шт почку,шт

Жидкая

Агаризованная

Я-цзао

0,18+0,02 2,0±0,08 1,0±0,04 90,0±7,50

Китайский 2А

0,33±0,03 4,0+0,25 2,.0+0,08 93,0+8,20

Та-ян-цзао 0,3б±0,03 2,0±0,06 1,0+0,04 90,0+7,50

Я-цзао

0,95+0,11 11,0+1,05 2,0±0,06 20,0+3,10

Китайский 2А

1,64+0,09 17,0+1,46 3,5+0,15 15,0+2,50

Та-ян-цзао 2,1б±0,14 10,0±0,95 2,0±0,08 22,0+3,20

бегов отличались друг от друга. В результате проведенных исследований агаризованная среда была принята как основная.

Более существенные различия были получены при культивировании почек зизифуса на средах с разным рН (4,2-7,2). Из таблицы 7

Таблица 7

Влияние рН среды на развития почек и побегобразоание зизифуса

рН Число почек, % Число побегов на одну почку, шт Интенсивность пролиферации

развивающихся образующих побеги

4,2 32,0 ± 1,40 18,0 + 0,90 1,0 + 0,02 -

4,7 36,0 ± 1,80 30,0 + 0,90 1,0 ± 0,02 +

5,2 84,0 ± 6,50 70,0 + 4,50 3,0 ± 0,08 +

5,6 70,0 ± 5,60 50,0 ± 3,50 2,8 ± 0,06 +

6,0 48,0 ± 2,80 29,0 ± 1,70 1,0 ± 0,02 -

6,6 26,0 ± 1,70 0,0 0,0 -

7,2 16,0 ± 0,90 0,0 0,0 -

видно, что наиболее благоприятный рН среды, при котором 10% пс чек образовывало в среднем 3 побега находился в пределах 5,£ 5,6. В этих условиях способность к морфогенезу возрастала пру мерно в 1,5 раза по сравнению с контролем (рН 5,6). Уменьшена рН до 4.2 и увеличение до 7,2 значительно снижало число поче образующих побеги.

Таким образом, консистенция среды и рН среды оказывают зне чительное влияние на морфогенетические потенции культивируемь тканей и органов растений.

Развитие побегов из почек 20-летних деревьев. Проведеннь нами эксперименты полностью подтвердили тот факт, что ткани органы взрослых растений обладают более низкими морфогенетичес кими потенциями. Так, культивируя в условиях in vitro rioчга-изолированные с 20-летних деревьев, не удалось получить стерши ную культуру.

Культивирование, изолированных зародышей зизифуса в условш

in vitro. Известно, что большинство крупноплодных сортов и ГИС ридов зизифуса имеют недоразвитые зародыши. В связи с этим вое никла необходимость изучения условий культивирования изолирован ных зародышей и получения полноценных растений.

Первоначально было изучено влияние различных минеральнь солей (Уайта, Нича, Кнудсона, Монье и МС) на формирование расте ний из зародышей зизифуса. На питательной среде Уайта наблку^ рост гипокотиля и корня. При культивировании на среде МС развк тие и рост зародыша останавливались на этапе образования первь листочков. Хорошо сформировавшиеся растения были получены на ш тательной среде Монье из зародышей размером 6-10 мм.

Для увеличения эффективности формирования растений у зародышей в питательную среду Монье вводили фитогормоны БАГ ИМК, ИУК, НУК в различных концентрациях и сочетаниях. Контроле служила питательная среда без фитогормонов. Полученные результг ты показали, что увеличение концентрации ЕАЛ в питательной ере де значительно снижало число зародышей, образующих растения вызывало их гибель. При сравнительно низких концентрациях Ш (0,44 мкМ) и ИМК (0,049 мкМ) в среде формировались светло-зеле ные растения высотой 5-6 см, которые при адаптации in vivo погк

5али. Из изолированных зародышей зизифуса на контрольной среде (Ыонье) развивались полноценные растения, высотой 8-10 см, с хорошо развитой корневой системой.

Способность зародышей к развитию в значительной степени определялась отсутствием освещенности и длительностью воздействия яа них низких положительных температур (рис. 2). В этих условиях

Кол-во развившихся зародышей, %

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Экспозиция, сут

1 - зародыш сорта Я-цзао;

2 - зародыши сорта Китайский 2А;

3 - зародыши сорта Та-ян-цзао.

Рис. 2. Зависимость развития зародышей от длительности воздействия низких положительных температур

в течение 30 суток происходило раскрытие семядолей. Дальнейшая экспозиция (60-120 суток) низкими положительными температурами (5±1°С) оказывала отрицательное воздействие на развитие зародышей. В результате было установлено, что эффект стимуляции разви-

тия зародыша проявлялся в течение 30 сут. Для обеспечения непре рывности развития зародыша были изменены условия их культивирс ваним (температура 25±1°С, освещенность 2000-3000 лк и фотопер^ од 16 часов). В течение первой недели зародыши окрашивались зеленый цвет и начинался рост гипокотиля. Характерной особен ностью зародышей сорта Я-цзао являлось отмирание главного корь в процессе его развития и формирование 3-4 боковых корней. У зг родншей сорта Китайский 2А образовывался только главный корень Корневая система растений, полученных из зародышей сорта Та-яв цзао формировалась лишь у 20% из них и была очень слабая.

Через 5-6 месяцев миниатюрные растения пикировали в сте рильную смесь. Перед высадкой в условия in vivo фиксировали ос новные характеристики растений (табл. 8). Сравнительное изучени

Таблица 8

Основные характеристики растений, полученных из зародышей перед высадкой в условия in vivo

Сорт Средняя длина корневой системы, см Средняя длина главного побега, см Среднее кол-во листьев главного побега, шт Окраска листьев

Я-цзао 8,58 ± 2,46 5,70 ± 1,52 7,47 ± 1,15 св.зеленая

Китайский 2А 6,27 ± 1,28 5,36 ± 1,43 7,00 ± 1,75 зеленая

Та-ян-цзао 3,80 ± 1,03 5,00 ± 0,81 4,60 ± 0,69 св.зеленая

приживаемости растений, выращенных из изолированных зародыше; показало различную степень адаптивности генотипа. Лучше други: развивались растения, полученные из зародышей сорта Я-цзао. Эт< еще раз подтверждает высокие морфогенетические потенции зародышей мелкоплодных сортов, используемых в качестве подвойного материала. Несколько хуже адаптировались к условиям in vivo растения, полученные из зародышей среднеплодных и крупноплодных сортов. Возможно для их лучшей приживаемости необходимо дополнительное изучение условий адаптации (субстрат, температура, влажность, освещенность).

Исследование соматического эмбриогенеза из незрелых зиго-тических зародышей зизифуса в условиях In vitro. Эффективное^ соматического ембриогенеза зависит от типа и размера вкепланта,

генотипа, гормональных фактор.питательной среды и физических факторов выращивания. Кпк покапли наши исследования, эмбриоиды формировались только на семядолях незрелых зародышей. Установлено, что на первичном экештнте размером 4,1-10,0 мм образовывалось максимальное количество • •'чиггаческпх зародышей. Для индукции соматического эмбриогенез использовали пиательную среду МС с уменьшенным в два раза кол;ч-.ч-тьсм макро- и микросолей на фоне константного содержания 0, 16е> М глюкозы и 3,42 мкМ Ь-глутамина.

Культивирование семядолей ;-ш'отпчеоких зародышей на питательной среде 1/2 МС. содерюви'Я разные концентрации и сочетания веществ ауксинового типа действия 2,4-Д и НУК приводило к разным морфогенетическим процессам о-ябл. 9). На среде 1/2 МС, содержащей 2,6 мкМ НУК и 2,2 мкМ 2,4-Д морфогенетический потенциал реализовался двумя путями: эмбриогенез и каллусогенез. При этом частота образования эмбриоидов была сравнительно не высока (4 эмбриоида на одну семядолю). При сравнительно низких концентрациях 2,4-Д в среде (2,2-2,3 мкМ) способность семядолей зародыша образовывать соматические зародыш возрастала и при концентрации 2,2 мкМ достигала максимума (15,5 эмбриоидов на одну семядолю). Добавление в среду НУК в концентрат™ 2,6-16,1 мкМ способствовало формированию рыхлого каллуса светло-желтого цвета.

Изучены условия культивирования первичных и вторичных соматических зародышей. Установлено, что первичные эмбриоида образовывались в отсутствии освещения, тогда как вторичные эмбриоиды формировались независимо от этого фактора. Показано, что частота образования первичных соматических зародышей достигает максимума при температуре 26±1°С (рис. 3). Воздействие низких положительных температур не оказывало стимулирующего влияния, как в случае с зиготическими зародышами.

В результате проведенных экспериментов, выявлена существенная роль генотипа в формировании соматических зародышей зизифуса. Так, максимальное количество эмбриоидов получено на семядолях зародыша среднешюдного сорта Китайский 2А. Последующее культивирование эмбриоидов на безгормональной питательной среде МС обеспечило прохождение ими всех стадий развития зиготического зародыша (глобулярную, серцевидную, торпедовидную). Добавление в среду МС БАЛ (2,2-6,6 мкМ), кинетииа (2,3-6,9 мкМ) и АБК (0,019-

Таблица 9

Влияние генотипа и различных концентраций ауксинов на процес( эмбрио- и каллусогонез:.!

Сорт

Ауксины

Я-цзао

Китайский 2А

Та-ян-цзао

Коп- Экснлан- Результат Время Время Кол-во сс

нен- ТН сфор- появ- появ- тических

тра- миромв- эмб- кал- ления ления родышей/с

иия, ШН1'1 со- Гпо- луео- сома- кал- МЯДОЛИ 31

мкМ матичес- ге- генез тиче- луса, тическогс

кие за- нез ских сут зародыша,

родыши , заро-

N - 10 див ей сут

2,4-Д о о 1 ^ 10 f - 35 - 7,2 + 1,

4,5 6 - 40 - 3,5 + 0,

13,5 4 + - 40 - 1,5 + 0,

НУК 2,6 - - 4 - 25 -

5,3 - - + - 30 -

16,1 - + - 25 -

2,4-Д о о 9 4 зо 40 2,5 + 0,

ПУК 2,6

2,4-Д 2,2 10 4 _ 30 _ 15,5 + 3,

4,5 10 4 - 30 - 9,5 + 1,

13,5 5 4 - 40 - 2,8 + 0,

¡{УК 2,6 - - 4 - зо -

5,3 - + - зо -

16,1 - 4 - 35 -

2,4-Д О О * ц 4 4 30 30 4,0 + 1,1

НУК 2,6

2,4-Д 2,2 Я 4 _ зо _ 3,0 + 0,<

4,5 5 + - 30 - 2,8 + 0,/

13,5 4 4 - 35 - 1,5 + 0,'.

НУК 2,6 - - 4 - 30 -

5,3 - - 4 - 25 -

16,1 - - 4 - 30 -

2,4-Д о о ,

НУК 2,6 5 4 4 зо 30 2,0 + 0,-

0,075 мкМ) способствовало лишь образованию каллуса на поверхнс ти эмбриоидов.

В результате проведенной серии опытов был подобран опт мальный состав питательной среди для формирования растений, с держащей макросоли по Пмрику, микроэлементы по Хеллеру, витами по Жакио, 0,116 М сахарозы и 6,84 мкМ Ъ-глутамина, на которой

Кол-во образующихся эмбриоидов, %

Температура, °С . § - эмбриоиды сорта Китайский 2А; | - эмбриоиды сорта Я-цзао; § - эмбриоиды сорта Та-ян-цзао. Рис. 3- Влияние температуры на частоту образования первичных соматических зародышей

течение месяца происходило увеличение семядолей ембриоида в среднем до 6 мм. В последующе 30 суток развивались корни. После того, как корни достигали длина 3,0-4,0 см начинался рост побегов. Таким образом, период формирования растений составил 3-4

месяца.

Проведенный анатомический анализ показал, что разрастание семядолей происходило, главным образом, за счет интенсивных клеточных делений, увеличения размера клеток и их вакуолизации. Клетки, расположенные по переферии семядоли были более мелкие, изодиаметрические, иногда округлые. Большая часть клеток в центре семядоли имела дегенерирующее содержимое, цитоплазма отходила от клеточной оболочки, ядро исчезало. Возможно ети клетки использовались на питание и формирование соматических зародышей

Рис. 4- Образование соматического зародыша зизифуса

(рис. 4). Пути дифференциации ткани разные: 1) гистогенез - ф01 мирование сосудистых пучков; 2) соматический эмбриогенез. Зале жение вмбриоидов происходило асинхронно в эпидермальном и сус впидермальном слоях семядолей. Клетки сформировавшегося глоб! лярного зародыша имели изодиаметрическую и округлую формы. I его поверхности наблюдали четкий эпидермальный слой. Клетки рас положенные к переферии эмбриоида были мелкие, а к центру боле вакуолизированные со слабо окрашанными ядрами. Через 3-4 сутс после формирования глобулы на питательной среде MC с 2,2 мкМ 2, -Д начиналось ее разрастание в базальной части но аналогии с 3£ кладкой корешка. Затем происходило образование прокамбиальнь тяжей. Спустя 30-45 суток формировались нормальные эмбриоиды ярко выражеными корешком, почечкой'и семядолями.' Однако такс развитие по пути эмбриогенеза (появление полностью сформировав шихся соматических зародышей) не всегда происходит. Глобулы лип вытягиваются, напоминая собой торпедовидные зародыши.

Таким образом, разработан метод получения растений из семя

долей незрелых зародышей зизифуса путем соматического эмбриогенеза с использованием трех этапов культивирования: 1) индукции образопания эмбриоидов на питательной среде 1/2 MC с 2,,? мкМ 2,4-Д: 2) развитие соматических зародышей на безгормоналышй среде; 3) рост и развитие растений на безгормональной среде J7Ti.

ВЫВОДЫ

1. Изучен морфогенетический потенциал вида Zizyphus tiu.i>)ba Mill, и его зависимость от различных факторов. Установлено, что оптимальным является использование в качестве эксплантов почек взрослых растений или незрелых зиготических зародышей.

2. Показано влияние возраста растения-донора на морфогенетический потенциал при использовании почек в качестве эксплантов. О увеличением возраста растения способность к морфогенезу снижается. Активное побегообразование можно индуцировать из вегетативных почек зизифуса 5-6-летних деревьев. При использовании эксплчнтов 20-летних растений развитие побегов не происходит.

j. Разработан и оптимизирован состав питательной среды для индуклдаи развития и образования побегов. Оптимальной является питательная среда, содержащая модифицированные макросоли по Пи-рику (T'ierjk, 1976), микросоли по Хеллеру (Heller, 1953) и витамины по Жакио (Jaoquiot, 1956). Установлено, что снижение концентрации фитогормонов оказывает благоприятное действие на интенсивность морфогенеза. Лучшие результаты были получены на среде, содержащей БАП и ИМК в концентрации 0,88 и 0,024 мкМ соответственно.

4. Зародыши зизифуса и их части обладают высоким морфогене-тическим потенциалом. Они способны образовывать проростки, соматические зародыши, путем активации клеток тканей експланта, а таете морфогенный и неморфогенный каллус.

5. Установлено, что в зависимости от условий культивирования (состав питательных сред, температура, освещенность) возможна реализация двух путей получения растений из зародыша:

- через образование молодых проростков;

- через индукцию заложения соматических зародышей непосредственно в тканях культивируемых зиготических зародышей.

6. Кратковременная экспозиция низкими температурами (5±1°С)

.индуцирует образование проростков и тормозит соматический вм бриогенез. Дли заложения первичных соматических зародышей необ ходимо культивирование при температуре 26±1°С и отсутствие осве щенности.

7. Анатомические исследования показали, что под действие! оптимальной концентрации 2,4-Д (2,2 мкМ) заложение соматически: зародышей происходит в эпидермалъном и субэпидермальном слоя: семядолей зародыша зизифуса. Полученные эмбриоиды зизифуса проходят все стадии зиготического зародыша.

8. Разработан лабораторный способ размножения зизифуса 1) vitro, который может стать основой производственной технологи клонального микроразмножения этого вида с использованием юве-нильного материала, что особенно важно для селекционных рабо' при контролируемом опылении.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Митрофанова И.В. Влияние ВАП и ауксинов на процесс пролиферации побегов у Zizyphus jujuba в культуре in vitro // Регуляторы роста и развития растений: 2-ая конф., г.Москва, 2$ июня - 1 июля 1993: Тез. докл.- Москва, 1993.- С. 50.

2. Митрофанова И.В. Действие разных фитогормонов на образование проростков из латеральных почек зизифуса // Деп. в ОНГ НПЭЦ "Верас-Эко" ИЗАН Беларуси, 1993.- 10 с.

3. Митрофанова И.В., Синько Л.Т. Соматические зародыши зизифуса в культуре in vitro // Новые методы биотехнологии растений: II Российский симпозиум, г.Лушно, 18-20 мая 1993: Тез. докл.- Пущино, 1993. - С. 156.

4. Mitrofanova I.V., Chebotaru A.A. Special features of ir vitro mioropropagation of zizyphus // Biology of plant cell cultures and bioteelmology: II International Conference, Almaty, Sep. 28- Okt. 2, 1993: Abstract.- Almaty, 1993.- P. 214.

5. Митрофанова И.В., Чеботарь A.A. К вопросу регенерации растений из незрелых зародышей зизифуса in vitro // Актуальн! питания ботан!ки i екологИ: Конф. молодих учених i спец!алис-т1в, Ялта, 19-21 жовтня, 1993: Тез. докл.- Ки1в, 1993.- С. 84.

6. Митрофанова И.В., Шевелуха B.C. Индуцированный морфогенез зизифуса и культуре in vitro // Актуалыа питания ботан!ки i

cojioriï: Конф. молодая учених i спец!алист1в, Ялта, 19 -21 зкоп-1я, 1993: Тез. докл.- Кшв, 1993.- С. 85.

7. Митрофанова И.В. Культивирование незрелых зародышей зи-1фуса в условиях in vitro // УкраХнський ботан!чний журнал. 394.- в печати

8. Митрофанова И.В.. Чеботарь A.A., Митрофанова О.В. Влия-ie генотипа материнского растения и условий культивирования на юсобность вегетативных почек и зародышей зизифуса (Zir.yphus ijuba Mill.) к морфогенезу in vitro // Физиология растений.-)94.- 41, N 6.- в печати

9. Митрофанова И.В., Шевелуха B.C. Соматический эмбриогенез 13ифуса (Z,izyphus jujuba Mill.) в культуре in vitro // Известия ЗХА.- 1994.- в печати

Подписано в печать 13.06.94г. Формат 84x108 1/32 Объем 1.0 п.л., Тирах 100 экз. Заказ

Государственный Никитский ботанический сад, 334267, г.Ялта