Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологическая активность гуминового комплекса различного происхождения и его влияние на рост и развитие растений
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации по теме "Биологическая активность гуминового комплекса различного происхождения и его влияние на рост и развитие растений"
На правах рукописи
г/
Юшкова Елена Ильинична
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГУМИНОВОГО КОМПЛЕКСА РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ
Специальность 03.01.05 - Физиология и биохимия растений
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
2 1 0К7 2010
Воронеж,2010
004611248
Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет», ГНУ ВНИИЗБК РАСХН.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор
Павловская Нинель Ефимовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Попов Василий Николаевич
доктор биологических наук, профессор Корнеева Ольга Сергеевна
доктор биологических наук, профессор Заякин Владимир Васильевич
Ведущая организация: ГНУ Сибирский научно-исследовательский
институт сельского хозяйства и торфа СО РАСХН
Защита диссертации состоится «2» ноября 2010 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Россия, г. Воронеж, Университетская площадь, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет».
Автореферат разослан «уИ» сентября 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
'^г^ Ш■ БРехова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Основной частью гумуса являются гумусовые кислоты (гуминовые кислоты, фульвокислоты, гиматомелановые кислоты). Гумусовые кислоты - аккумуляторы органического вещества почвы: аминокислот, углеводов, пигментов, биологически активных веществ. Кроме того, в гумусовых кислотах концентрируются ценные неорганические компоненты - элементы минерального питания (азот, фосфор, калий), а также микроэлементы (железо, цинк, медь, марганец, бор, молибден и т.д.) (Кононова М.М., 1963; Александрова JI.H., 1980; Орлов Д.С., 1990; Горовая А.И., Орлов Д.С., 1995). Многочисленными исследованиями установлено стимулирующее действие гуминовых веществ, особенно гуминовых кислот и их солей, на рост и развитие растений, повышение их устойчивости к неблагоприятным факторам окружающей среды, стимулирование прорастания семян, повышение продуктивности крупного рогатого скота и птицы.
Гуминовые кислоты, являясь составной частью объектов природного происхождения, находят самостоятельное применение в медицинской практике, фармации, косметологии. Создание оригинальных фармакотерапевтических препаратов с биостимулирующими и репаративными свойствами, средств для косметологии на основе гуминовых и гуминоподобных веществ, остается актуальным направлением исследований (Филов В.И., Беркович A.M., 2000; Солдаткина М.Н., 2006; Федько И.В., Гостищева М.В., Исматова P.P., 2005).
Особого внимания заслуживают адаптогенные свойства гуминовых веществ, обусловленные их способностью связывать радионуклиды, ионы тяжелых металлов, разрушать пестициды по истечении срока их действия, облегчать и ускорять процесс детоксикации культурных растений.
Спецификой гуминовых веществ является их вероятностный характер, обусловленный особенностями образования в результате естественного отбора устойчивых структур. Как следствие, к фундаментальным свойствам гуминовых веществ относятся нестехиометричность состава, нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и полидисперсность. В связи с этим понятие молекулы для гуминовых веществ трансформируется в молекулярный ансамбль. Поэтому к ним не применим традиционных способ описания строения органических соединений, характеризующий количество атомов в молекуле, число и типы связей между ними.
Привлечение новейших физико-химических методов исследования гумусовых кислот, выделенных из различных природных объектов, дает возможность охарактеризовать их качественно и количественно. Полученные данные могут быть привлечены для объяснения строения и функций гумусовых кислот и, в связи с этим, механизмов их влияния на растительные и животные ткани, а также причины изменения иммунного статуса организмов.
Исследования должны идти по пути поисков экологически безопасных биоактивных препаратов, способных влиять на фитоимунные процессы. Изучение механизмов формирования защитных и ростостимулирующих свойств у сельскохозяйственных растений под действием гуминовых препаратов позволит дать научное обоснование практического использования новых средств защиты. Однако следует отметить, что ранее проведенные исследования осуществлялись в различных условиях и на образцах, полученных из различных природных объектов. Это в значительной степени осложняет сопоставление результатов и сравнение физико-химических свойств и физиолого-биохимической активности препаратов на основе гумусовых кислот (Алтунин Д.А., и др., 2000; Ищенко А.Ф., 2004; Кулик А.Ф., Горовая А.И., 1980; Шевелуха B.C., 1990).
Для получения гуминовых препаратов необходимо наличие биогумуса
- первоисточника биологически активных веществ. Однако производство и практическое использование вермикомпостов осуществляется во многих случаях без достаточного научно-технического обеспечения, без надлежащего агрохимического и санитарно-гигиенического контроля. Кроме того, состав и физико-химические свойства гумусовых веществ имеют решающее значение для стандартизации различных видов вермикомпостов. Вместе с тем, до сих пор не разработан регламент получения вермикомпостов и критерии степени их зрелости.
Указанная ситуация определяет актуальность постановки систематических исследований по изучению состава, строения и свойств гуминовых веществ, входящих в состав биогумуса.
Цель исследования - изучить биологическую активность гуминового комплекса различного происхождения и выяснить разнообразные аспекты его действия на рост и развитие сельскохозяйственных растений. В работе были поставлены следующие основные задачи:
- получить биогумус из разных видов компостов;
- исследовать вермикомпосты, полученные из разных субстратов, и определить интенсивность и механизмы гумификации;
- методами ВЭЖХ и сканирующей микроколориметрии провести анализ степени гумификации;
- используя гель-хроматографические методы, определить молекулярные массы белков биогумуса и жирнокислотный состав в исследованных препаратах;
- адаптировать существующие или разработать новые методики анализа для получения достоверных данных о составе, физико-химических и биологических характеристиках вермикомпостов;
- выделить и фракционировать гумусовые кислоты, исследовать их физико-химические свойства;
- провести сравнительное исследование гумусовых кислот, полученных из вермикомпостов различного происхождения;
- исследовать препараты гуминового комплекса разного срока созревания с помощью метода |3С ЯМР спектроскопии для идентификации и количественного определения функциональных групп и молекулярных фрагментов;
- выделить биологически активные вещества вермикомпоста и испытать их действие на устойчивость к биоте и хозяйственно-ценные показатели сельскохозяйственных культур;
- в полевых и лабораторных условиях выявить биологическую активность и сортоспецифичность препарата гуминового комплекса для разработки биологически активных фитоиммуномодуляторов.
Научная новизна.
Работа является комплексным исследованием, посвященным разработке методологии анализа органических объектов нерегулярного строения и анализу полученной информации, позволяющей прогнозировать их свойства.
Установлено влияние сроков созревания и природы субстрата для оценки агрономических, физико-химических и физиолого-биохимических характеристик вермикомпостов.
Разработаны методики выделения гумусовых кислот и их фракционирования. Впервые разработана и применена оптимизированная одноступенчатая методика извлечения гумусовых кислот, позволившая значительно сократить время экстракции.
Для хроматографической характеристики фульвокислот впервые разработан и применен метод ВЭЖХ в обращенных фазах.
Для исследования термодинамических характеристик комплекса гумусовых веществ и гуминовых кислот разработан и применен метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.
Исследована антиоксидантная система гороха при обработке препаратом гуминового комплекса. Усовершенствована тест диагностика иммунизирующих и стимулирующих свойств биологически активных веществ.
Исследована возможность использования препарата гуминового комплекса для индуцирования устойчивости сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям и повышения продуктивности.
Практическая значимость работы.
Получены разносторонние характеристики вермикомпостов на основе различных субстратов, которые могут быть использованы с целыо оценки степени завершенности процесса гумификации.
Данные, полученные при изучении химического, микробиологического состава и ферментативной активности вермикомпостов существенно дополняют представления о закономерностях трансформации органического вещества при участии вермикультуры.
Результаты исследований видового состава микробиологических сообществ вермикомпостов могут быть использованы для разработки
рекомендаций санитарно-микологического контроля соответствующих производств.
Разработан комплекс методик анализа гумусовых кислот, включающий в себя: определение элементарного состава в расчете на безводную беззольную пробу; условия получения количественных 13С ЯМР спектров; гель-хроматографическое определение молекулярных масс. Комплекс данных методик может быть внедрен в практику лабораторий химико-аналитического профиля.
Выделен гуминовый комплекс, обладающий иммунокорректирующим действием на растения, на основе которого возможно создание новых эффективных экологически безопасных средств защиты растений.
Существенный практический выход имеют данные о механизме фитогормонального действия гуминового комплекса, позволяющие диагностировать комплексную устойчивость сортообразцов к патогенам. Метод биотестирования (применения тест-систем) может служить в качестве метки в иммуноферментном анализе и предшествовать испытанию препаратов в полевых условиях.
Представлены рекомендации и разработан регламент применения гуминового комплекса при культивировании сельскохозяйственных культур.
Материалы исследования используются в учебном процессе кафедры общей, биологической, фармацевтической химии и фармакогнозии МИ ОГУ и кафедр физиологии и биохимии растений, биотехнологии и кормопроизводства ОГАУ при чтении курсов «Биотехнология», «Экология и охрана природы», «Физиология растений»; при выполнении дипломных проектов и кандидатских диссертационных работ.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2004), Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2004), Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы современной химии в исследованиях молодых ученых» (Астрахань, 2006), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы химии и методики ее преподавания» (Нижний Новгород, 2006, 2009), VI, VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика - 2006» (Самара, 2006) «Экоаналитика - 2009» (Йошкар-Ола, 2009), II Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием (к юбилею академика Ю.А. Золотова) (Краснодар, 2007), Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (к юбилею профессора О.Г. Ларионова) (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Инновационные технологии обеспечения безопасности питания и окружающей среды» (Оренбург, 2007), I, II Международной научно-практической конференции «Вермикультивирование и вермикомпостирование как основа экологического земледелия в XXI веке:
проблемы, перспективы достижения» (Минск, Белоруссия, 2007, 2010), 55, 56 Всероссийской научно-практической конференции химиков с международным участием «Актуальные проблемы модернизации химического и естественнонаучного образования» (С-Петербург, 2008, 2009), Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик» (Курск, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 работ, в том числе коллективная монография.
Декларация личного участия автора. Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в формировании направления, активном участии во всех этапах исследования, постановке конкретных задач и их экспериментальном решении, интерпретации и обсуждении экспериментальных данных. Положения, выносимые на защиту:
1. Предложенная методология анализа гумусовых кислот методами ВЭЖХ и сканирующей микрокалориметрии позволяют контролировать процесс гумификации.
2. Существуют корреляционные зависимости между структурно-групповым, молекулярно-массовым составом гумусовых кислот и источником происхождения (субстратом), периодом, а также временем вермикомпостирования, подтверждающиеся методами элементарного анализа, спектроскопии ЯМР на ядрах 13С, эксклюзионной хроматографии.
3. Химическая структура и биохимические эффекты могут различаться в зависимости от способов извлечения, очистки и фракционирования препаратов; прогнозирование особенностей их свойств по общим элементам структуры возможно путем экспериментального анализа.
4. Природные компоненты препарата гуминового комплекса обладают иммуномоделирующими свойствами и могут служить основой для создания новых средств защиты растений.
5. Ферменты антиоксидантной системы клеток: супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза являются диагностическим тестом на выявление биологической активности и подбор эффективных концентраций препаратов.
6. Полученный препарат гуминового комплекса усиливает пероксидазозависимый иммунитет и повышает продуктивность сельскохозяйственных культур.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 356 страницах машинописного текста, содержит 121 рисунок, 39 таблиц и состоит из введения, 6 глав, заключения, основных выводов и списка литературы, приложения. Список цитируемой литературы включает 430 наименований, из которых 150 зарубежные.
Настоящая работа представляет собой часть плановых научно-исследовательских работ Орловского государственного университета, Орловского государственного аграрного университета. Исследования
проводились также в сотрудничестве с Всероссийским научно-исследовательским институтом зернобобовых и крупяных культур РАСХН в рамках программы ГНЦ «Разработка методов повышения иммунных свойств, диагностики и интегрированных систем защиты зернобобовых и крупяных культур от болезней и вредителей»; институтом биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обосновывается актуальность исследования, его практическая и теоретическая значимость, сформулированы цель и основные задачи работы, намечены пути их реализации.
ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ РАЗЛИЧНЫХ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТОВ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)
В главе представлен свод основных работ, посвященных общей характеристике биогумуса и гуминовых веществ; рассмотрению состава, функций гуминовых веществ в почвенных экосистемах; физиолого-биохимической характеристике и применению их в медицине. Поскольку основной составной частью гуминовых веществ являются гумусовые кислоты, то особое внимание уделено способам выделения, исследованию состава и свойств гумусовых кислот. Анализ литературных данных дает возможность охарактеризовать качественно и количественно с использованием новейших физико-химических методов исследования гумусовые кислоты, выделенные из различных природных объектов.
ГЛАВА 2. МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ БИОГУМУСА И
ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Биогумус как основа для получения биологически активных веществ произведен в результате жизнедеятельности элитной промышленной линии дождевых (компостных) червей Владимирский гибрид «Старатель». Выращивали червей на различных субстратах (компосты: конский, свиной, птичий; осадок сточных вод). Для исследований получены образцы биогумуса разного периода созревания: с января по апрель - зимний образец, с апреля по октябрь - летний образец; разного срока созревания (1,5 месяца компостирования, 3 месяца, 6 месяцев).
Агрохимические и микробиологические характеристики биогумуса проводили по следующим методикам: определение фосфора и калия по Кирсанову в модификации ЦИНАО, количество аммиачного и нитратного азота в почве методом Корнфильда (Радов A.C. и др., 1985); содержание золы, концентрацию водородных ионов в субстратах и биогумусе по Петербургскому A.B. (1968); аммонифицирующую активность и содержание нитратов по Радову A.C. (1985). Чистые культуры микроорганизмов
выращивали на среде Чапека. Целлюлозоразрушающую активность определяли модифицированным методом Кристенсена (Ежов Г.И., 1981).
Водные экстракты биогумуса получали добавлением к 20 г сухих образцов вермикомпостов и контрольного образца (компоста) 100 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,6). Экстракцию проводили при комнатной температуре и перемешивании магнитной мешалкой. Полученные суспензии центрифугировали в течение 30 мин при 10000 об/мин (центрифуга - Т-24 , ML1II Германия). В супернатантах определяли содержание растворимых веществ.
Спиртовые экстракты получали так же, как описано выше для водной экстракции. Содержание экстрагированных веществ определяли методом высушивания до постоянного веса.
Протеолитическую активность экстрактов исследовали по отношению к гемоглобину, растворенному в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,6). Оптическую плотность супернатантов инкубируемой смеси измеряли спектрофотометрически.
Амилолитическую активность экстрактов исследовали по отношению к 1% суспензии картофельного крахмала в 50 мМ фосфатном буфере с рН 7,6. Методика основана на определении содержания редуцирующих групп путем окисления карбонильной группы moho-, ди-, олиго- и полисахаридов до карбоксильной 3,5 - динитросалициловой кислотой, что приводит к переходу окраски от желтой к красно-бурой.
Выделение гуминовых кислот и фульвокислот. Навески образцов для удаления солей и карбоксигидратов обрабатывали 0,1N раствором НС1, затем перемешивали магнитной мешалкой и центрифугировали. Из полученных осадков методом щелочной экстракции извлекали гуминовые кислоты и фульвокислоты. Процедура экстракции была проведена 11 раз. Полнота экстракции контролировалась методом ВЭЖХ.
Выделение гиматомелановых кислот. Взвешенные препараты гуминовых кислот помещали в виалы и растворяли в минимальном объеме 1N раствора NaOH при перемешивании магнитной мешалкой. После полного растворения проводили спиртовую экстракцию (метанол, этанол и пропанол) в течение 12 часов под аргоном. Полученные суспензии центрифугировали, супернатанты помещали в виалы. Концентрацию ГМК в растворе определяли методом высушивания до постоянного веса за вычетом сухого веса высушенного растворителя (спирт с 0,1 N раствор NaOH). При исследованиях методом ВЭЖХ использовали растворы ГМК с концентрацией 1 мг/мл.
Все используемые реактивы имели марку «х.ч.» и «ч.д.а.».
Хроматографические исследования гуминовых кислот проводили на хроматографе "Gilson", оснащенным компьютером с программой приема и обработки хроматографических данных. Сбор и обработка хроматографических данных осуществляется через программу Мультихром или Gilson Unipoint. Измерения проводили в изократическом, градиентном и обращеннофазовом режимах. Детектирование хроматографических пиков
осуществлялось УФ-детектором при 220 и 280 им. Для хроматографироваиия использовали следующие колонки: Alltima С8 (250x4,6 мм; 5 мкм); Macrosphere RP 300 С8 (250x4,6 мм; 5 мкм); Platinum EPS CI8 (250x4,6 мм; 5 мкм). Все используемые реактивы имели марку «Для ВЭЖХ».
Исследование экстрактов биогумуса проводили методом гель-фильтрации на геле сефадекс G-75 с непрерывной автоматической регистрацией оптической плотности элюата в проточной кварцевой кювете, колонка TSK G4000SW (8x300 мм). Объем аликвоты раствора 100 мкл, скорость элюирования 0,4 мл/мин. В качестве элюента использовали 50 мМ фосфатный буфер с pH 7,6. Детектирование пиков хроматограмм осуществляли при 254 нм.
Определение жирнокислотного состава компостов и вермикомпостов проводилось методом газожидкостной хроматографии на хроматографе «Agilent 6890N», оснащенном масс-спектрометрическим детектором «Agilent 5973N» и капиллярной колонкой HP - 5MS 0,25mm-30m0,25mm. Идентификацию жирных кислот проводили с помощью компьютерного поиска (РВМ) и библиотеки масс-спектров Wiley.
Спектроскопические измерения проводили на спектрофотометре Specord UV/VIS (Carl Zeiss, Jena, Германия). Specord сканирующий UV/VIS спектрофотометр, работающий как автономное устройство со встроенным микропроцессором и в системе с внешним компьютером. Диапазон длин волн 190 - 1100 нм, соответствует требованиям стандарта DAB.
Для спектрофотометрического анализа использовали фотометр фотоэлектрический КФК-3-01.
Спектры ЯМР регистрировались на твердофазном ЯМР-спектрометре Bruker DSX 200 при резонансной частоте 50,3 МГц, с использованием cross-поляризации, magic angle spinning техники с spinning speed 6,8 кГц. Контактное время 1 мсек, pulse delay 400 мсек.
Микроколориметрические исследования гумусовых кислот проводили на адиабатном сканирующем микроколориметре ДАСМ-4А (институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино Московской области, Россия) с объемом рабочей ячейки 0,4672 см3. В каждом эксперименте шкалу теплоемкости калибровали по эффекту Джоуля-Ленца. Диапазон сканирования температур от 20 до 120°С, скорость нагрева - 2°С/мин. Концентрация ГВ в растворах составляла 8 мг/мл в 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 0,4 М хлорид натрия с pH 7,7, гуминовых кислот - 6 мг/мл.
Извлечете биологически активных веществ из биогумуса и компоста (контроль) проводили методом экстракции. Выход активного вещества составлял 3,25 мг на 1 кг биогумуса. Приготовленный препарат гуминового комплекса считали как раствор 1:1. Далее готовили испытуемые растворы разведением дистиллированной водой до концентраций 1,5-10"2, 1,5-10"3,
1,5'ЮЧ.
Для определения каталазы в растениях была использована методика А.И. Ермакова с модификациями (1987).
При определении пероксидазиой активности растений использовали колориметрический метод Бояркина А.Н. с модификациями (1981). Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина до образования синего продукта окисления определенной концентрации, заранее устанавливаемой на фотоэлектроколориметре. Измерение проводили с использованием красного светофильтра при длине волны X =590 нм.
Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) применялась модифицированная методика с использованием фотореактора (Giannopolities С. N.. Ries S. К., 1977; Гринблат А.И., 2007).
Для лабораторных исследований биологической активности гуминового комплекса использовали сорта гороха, обладающие ценными хозяйственными признаками, но разной степенью восприимчивости к болезням и вредителям: горох «Норд» на зерно (ГНУ ВНИИЗБК, 1992), горох «Орпела» (ГНУ ВНИИЗБК, 1994).
Для полевых исследований влияния растворов гуминового комплекса на поражаемость болезнями и вредителями, продуктивность и урожайность использовался следующие сорта сельскохозяйственных растений: горох «Бега» - овощной сорт (ГНУ ВНИИ селекции овощных культур, 1982), горох «Батрак» (ГНУ ВНИИЗБК, 2000), картофель «Жуковский ранний» (селекция ВНИИ КХ), пшеницу «Крестьянка».
Обработку семян (клубней) проводили путем замачивания в течение 2 часов в растворах гуминового комплекса с концентрациями 1,5-10~2, 1,5-10~3, 1,5-1вытяжке из компоста с концентрацией 1,5-102% и растворе «Гумистар», приготовленного промышленным способом (производство ОАО МНПК «ПИКЪ»), с концентрацией 1,5-10~2%. В качестве контроля использовали замачивание семян в растворе дистиллированной воды.
Для лабораторных опытов семена перед использованием обеззараживали 1 % - ным раствором дезолона. Исследовали 7 вариантов. В 3-х вариантах использовали предпосевную обработку семян (клубней) испытуемыми растворами, и в 3-х сочетали обработку семян с 2-х разовым опрыскиванием растений. Площадь делянки составляла 10 м2 (для гороха и пшеницы), 2 м2 (для картофеля) повторность 4-х - кратная. Учёт распространения и развития болезней проводили по методикам H.H. Кирика и В.В. Котовой (1979), В.И. Попова, М.Ю. Степановой (1981). Поражённость корневой системы гнилями определяли по 4-х балльной шкале, поражение пятнистосгями по 5-ти балльной в фазе бутонизации и цветения (период массового заселения растений вредителями) и в фазе плодообразования (во время массовой кладки яиц) (Котова В.В., 1986).
Опытный материал выращивали в условиях нолевого опыта на делянках площадью 10 м2 в 4-х кратной повторности при норме высева 1,2 млн. шт./га размещение делянок риндомизированное. Посадку картофеля производили по схеме: 0,3x0,7 м, густота стояния растений составляла 47619 шт. растений/га.
Обработку семян исследуемыми растворами проводили суспензионным способом, вручную за 1-2 дня до посева гороха. Обработку посевов проводили дважды в период бутонизации и цветения. Анализ семян, обработанных препаратами на всхожесть, заражённость проводили на 4-й, 7-й день после обработки согласно методикам (Методические указания по государственному испытанию фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур, 1985). По сноповому материалу определяли структуру урожая (количество бобов и семян на одном растении и масса 1000 семян) (Методика Госсортсети, 1981).
Обработку экспериментальных данных проводили методом Б.А. Доспехова с помощью компьютерной программы Ехе1 (1985).
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ВОДНЫХ И СПИРТОВЫХ ЭКСТРАКТОВ ВЕРМИКОМПОСТОВ
Для сравнительного исследования физико-химических свойств и ферментативной активности экстрактов вермикомпостов был получен биогумус различного периода созревания.
Анализ биогумуса показал, что его химические свойства зависят от времени культивирования (табл. 1).
Вермикомпостирование приводит к повышению рН-среды, рН приближается к нейтральной; общий азот увеличивается.
Содержание обменного калия КгО незначительно снижается, а содержание Рг05 увеличивается по мере биокомпостирования и находится в пределах величин мирового стандарта. Содержание золы, напротив, значительно возрастает (на 10 - 15%), что обогащает почву необходимыми макро- и микроэлементами. Ключевым показателем при оценке скорости биоконверсии органических отходов и степени зрелости вермикомпостов, по данным международного стандарта, является соотношение С/К По нашим данным, этот показатель снижается при биокомпостировании, что указывает на его зрелость.
Таблица 1
Агрохимический состав биогумуса различного периода созревания
Вид удобрения Гумус, % рн Азот общий, % Зола,% Р205, % К20, % с/ы
Компост 17,3 5,8 2,81 57,1 1,20 0,70 22,1
Биогумус (зимний) 17,8 6,3 1,71 73,2 0,78 0,71 13,7
Биогумус (летний) 26,2 6,3 2,25 65,6 1,13 0,66 17,7
Международный стандарт 20-30 6,57,5 1,0 57,7 1,5 1,0 -
Анализ микробиологических свойств вермикомпоста показал, что это -продукт с достаточно стабильным микробным сообществом. При естественной влажности (около 74%) он характеризуется определенной пропорцией микробной биомассы: 63-71% - грибной мицелий; 21-28% -
споры грибов и дрожжеподобные организмы; 5,6-6,7% - бактерии; 2,3-3,2% -мицелий актиномицетов. В отличие от исходного субстрата в вермикомпосте снижается доля грибного мицелия, но возрастает доля функционально-активного мицелия актиномицетов; в группе бактерий доминируют представители актиномицетной линии; среди грибов преобладают активные целлюлозоразрушающие виды, которые не токсичны и не патогенны для растений, а напротив, обладают антагонистическим эффектом по отношению к фитопатогенным микроорганизмам.
Исследование почвенной микрофлоры образцов биогумуса показало (табл. 2), что аммонифицирующая активность значительно повышается по сравнению с компостом в 2,6 и 1,8 раз соответственно, а нитрифицирующая активность снижается (от 19,2 мг в компосте до 17,8 и 17,6 - в биогумусе).
Таблица 2
Аммонифицирующая и нитрифицирующая
_активность биогумуса_
Образец Аммонифицирующая активность N-NH.T мг/ЮОг образца (при компостировании с люпиновой мукой) Нитрифицирующая активность Ы-ИОз" мг/100г образца (при компостировании с сульфатом аммония)
Компост 5,6 19,2
Биогумус, зимний 14,5 17,8
Биогумус, летний 10,0 17,6
Установлено, что все образцы обладают высокой целлюлозоразрушающей активностью, что положительно сказывается на закреплении азота в органической биомассе целлюлозорарушающих микроорганизмов.
Исследование по выделению и идентификации грибковых сообществ в компосте и вермикомпосте показали, что в компосте доминируют грибы родов Mucor, Fusarium, Penicilium и Trichoderma. Общее количество почвенных грибов составляло до 60 тыс/г образца, количество колоний рода Fusarium составляло 9-11 тыс/г образца, что составляет 15 - 18% от общего
количества (рис. 1 (а)).
...............
а) б) в)
Рисунок 1. Состав грибной микрофлоры в компосте (а), биогумусе зимнем (б), биогумусе летнем (в)
По мере компостирования биогумуса доминирующее положение занимают грибы рода Trichoderma, вытесняя другие виды, в том числе и представителей патогенного рода Fusarium (рис. 1 (б, в)). В последнем образце насчитывалось 3-5 тыс/г образца представителей сапрофитной микрофлоры - грибов рода Penicilium, остальное приходилось на колонии рода Trichoderma. Биогумус по мере созревания обогащается грибами -антагонистами (Trichoderma) и тем самым приобретает свойства оздоравливающего действия.
Знание микробиологических свойств и их связи с полезными и вредными свойствами вермикомпоста необходимы для контроля производства и получения высококачественных продуктов. Методы, основанные на определении видового состава сообщества компоста, эффективны для выявления фитопатогенной микрофлоры и санитарных микроорганизмов. Характеристики такого типа необходимы для определения гигиенических качеств вермикомпостов. Кроме того, изменение функциональной структуры микробиологических сообществ может быть приемлемым для определения степени зрелости вермикомпостов.
Экстракцию водорастворимых веществ компостов и вермикомпостов проводили 0,1 М фосфатным буфером при pH = 7,6. Показано (рис. 2), что из субстрата, не обработанного червями максимально экстрагируется 4 мг/мл вещества, в то время как из образца, полученного с января по апрель (зимний), экстрагируется 1,6 мг/мл, а из образца, полученного в период с апреля по октябрь (летний) - 1,2 мг/мл.
Р=1
о»----- • ------— - • --— • -------------------1
а) б)
Рисунок 2. Динамика экстрагируемое™ водорастворимых веществ (экстракция 0,1 М фосфатным буфером; рН 7,6) - а) из компоста; б) из вермикомпоста: 1 - зимний образец вермикомпоста, 2 - летний образец вермикомпоста.
Из приведенных данных следует, что не менее половины (4/1,6 = 2,5; 4/1,2 = 3,5) водорастворимых веществ после обработки образцов червями, по-видимому, гумифицируется. Следует также отметить, что оставшиеся после обработки компоста червями органические вещества быстрее вымываются водой (3 ч) в сравнении с контролем (16 ч).
Экстракты компоста и вермикомпостов были исследованы методом гель-хроматографии. При существующей неопределенности структуры ГВ возможность создания универсальных ММ стандартов на сегодняшний день
практически исключена. В этой ситуации представляется целесообразным оценить эффективность гель-хроматограммы, приняв во внимание , распределение в хроматографическом профиле отдельных фракций, различающихся по физико-химическим свойствам. Площади, занимаемые максимумами, пропорциональны количественному содержанию фракций.
На рисунках 3(а) и 3(6) приведены гель - хроматограммы для экстрактов зимнего и летнего образцов вермикомпостов. Хроматограммы содержат по одному пику с одинаковым временем удерживания на колонке, что свидетельствует о близких молекулярных массах веществ, содержащихся в образцах. Асимметрия пиков указывает на присутствие двух или нескольких веществ с близкой молекулярной массой.
а) б)
Рисунок 3. Гель - хроматограмма водного экстракта биогумуса: а) образец - зимний, б) образец - летний; детектирование-254 нм.
На рисунке 4 приведена гель - хроматограмма для образца компоста, не обработанного червями (контроль).
Рисунок 4. Гель - хроматограмма водного экстракта компоста контрольного образца,
детектирование - 254 нм.
Время
Приведенная хроматограмма содержит, помимо основного пика, дополнительный пик-1, соответствующий большей молекулярной массе вещества. Этот факт говорит о том, что возможна ассоциация молекул гумусовых кислот и образование в растворе статических клубков. При различных значениях рН конформация молекул может изменяться вследствие
электростатического отталкивания ионизированных карбоксильных групп, приводя к увеличению линейных размеров молекул.
Увеличение доли высокомолекулярной фракции в экстрактах вермикомпостов объясняется, вероятно, тем, что при участии червей меняется природа гумусового вещества, происходит обогащение новообразованными гуминовыми кислотами, возникающими за счет преобразования растительных остатков. Кроме того, усиливается микробиологическая активность, что в свою очередь приводит к усилению процессов гумификации и образованию более зрелых биотермодинамически устойчивых ГК, имеющих большую молекулярную массу и обеспечивающих повышение плодородия почв.
Методом гель-фильтрации определены молекулярные массы белков биогумуса. Молекулярная масса белка из биогумуса вычислена по нижеследующему уравнению:
У = - 0,3829х + 2,083 исходя из К = 0,65 для белка из биогумуса. Она равна »27 кДа.
Для определения жирных кислот в препаратах экстрактов биогумуса и компоста использовали метод газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. В таблице 3 приведены данные жирнокислотного состава в исследованных препаратах.
Таблица 3
Содержание жирных кислот в биогумусе _
№ п./п. Название вещества летний зимний контроль
Содержание в гумусе, нг/г
1 Октадекановая 500 370 200
2 Метилэйказоновая 15 10 5
3 Доказоновая 300 250 150
4 Метилдоказоновая 20 15 5
5 Триказоновая 10 5 -
6 Тетраказоновая 150 100 50
7 Пентаказоновая 5 5 -
8 Гексаказоновая 20 15 5
9 Гептаказоновая 5 - -
10 Метилгептадекановая 120 90 40
11 Октодеценовая 500 400 200
12 Гептадекановая 120 100 100
13 Гексадекановая 400 320 270
14 Пентадекановая 200 170 120
Содержание жирных кислот в контрольном образце и образцах, обработанных червями, неодинаково. Содержание жирных кислот в препаратах летнего образца выше, чем в зимнем образце, а в препарате, не обработанном червями (контроль), оно наиболее низкое. Из литературы известно, что с ростом гумификации содержание жирных кислот действительно возрастает.
Протео лиги ческу ю активность экстрактов биогумуса и компоста исследовали по отношению к 1%-ого раствору гемоглобина. Оптическую плотность супернатантов инкубируемой смеси гемоглобина и экстрактов биогумуса измеряли в 10 мм кварцевых кюветах при 280 нм против 10% раствора ТХУ в фосфатном буфере. Измерения проводили на спектрофотометре Specord UV/VIS(Carl Zeiss,Jena, Германия). Результаты анализа приведены на рисунке 5.
Кинетика Протеализа Кинетко протеопиза
.X*— ...................- 1 —
— f' ... / '........ , .......■: ... :....._
•Х-" ....." 2
//
тттшшштт^тщ
0 5 10 Щ Я Ь
а) б)'""""
Рисунок 5. Зависимость изменения оптической плотности растворов ТХУ (10%) растворимой фракции 1% раствора гемоглобина от времени инкубирования с водными растворами экстрактов а) компоста, б) биогумуса: 1 - зимний образец, 2 - летний образец.
Определено, что препарат биогумуса зимний (1) обладает более высокой протеолитической активностью, чем препарат летний (2) (рис. 5 (б)). Кинетические кривые имеют типичную форму для кинетики ферментативных гидролитических процессов.
Результаты анализа образца компоста, не обработанного червями, приведены на рисунке 5 (а). Видно, что контрольный образец не обладает протеолитической активностью, в отличие от зимнего и летнего образцов.
При исследовании амилолитической активности экстрактов вермикомпостов и компоста по отношению картофельному крахмалу (50 мМ фосфатный буфер, рН 7,6) в течение 24 часов ее обнаружить не удалось. Возрастания оптической плотности от времени инкубирования получено не было. Отсутствие амилолитической активности, возможно, связано с низким количеством амилаз в вермикомпосте и компосте.
ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ МЕТОДАМИ ВЭЖХ И СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ
Углубленное изучение свойств и природы гумусовых веществ возможно при применением современных физико-химических методов исследования. Они позволяют раскрыть генетические особенности гумусовых веществ, развивающихся в разных условиях.
Гуминовые кислоты являются основным гумусовым компонентом. Они не растворимы в кислоте и спирте, у них средний молекулярный вес и темная
окраска. Извлеченные методом экстракции из вермикомпостов разного периода созревания гуминовые кислоты были исследованы методами спектрофотометрии и ВЭЖХ. На основании УФ-спектров установлено наличие в гуминовых кислотах ароматических групп. Отношение оптической плотности при 280 нм к оптической плотности при 220 нм - D2S0/D220, характеризует относительное содержание ароматических групп в гуминовых кислотах. Данные спектрофотометрии не показали значительного изменения относительной ароматичности в образцах компоста и вермикомпостов (гуминовые кислоты компоста - D2R0/D220=0,47; гуминовые кислоты вермикомпостов D280/D220=0,45). Однако следует учесть, что при спектрометрическом исследовании гуминовые кислоты в растворе находятся в агрегированном состоянии, при хроматографии эти агрегаты разрушаются, поэтому данные хроматографического исследования являются более объективными.
Методом ВЭЖХ экстракты гуминовых кислот разделены на три фракции. Фракции 1 и 2 являются гидрофильными, фракция 3 содержит гидрофобные функциональные группы, в основном ароматического ряда, причем содержание этой фракции возрастает приблизительно в 3 раза для гуминовых кислот, выделенных из летнего образца вермикомпоста по сравнению с контролем, т. е. степень гумификации летнего образца более высокая.
Вероятно, одной из причин физиологической активности гуминовых кислот является наличие в их молекулах фрагментов, обладающих свойствами стабильных свободных радикалов, а их содержание, по-видимому, увеличивается с ростом степени гумификации субстратов.
Фулъвокислоты являются водорастворимой частью гуминовых веществ и представляют собой высокомолекулярные азотсодержащие оксикарбоновые кислоты с эквивалентным весом около 300 а.е.м. (Ищенко A.B., 1999). От гуминовых кислот они отличаются более низкой молекулярной массой, более низким содержанием углерода, светлой окраской. Фульвокислоты растворяются в воде, щелочных и кислых растворах, обладают склонностью к кислотному гидролизу.
Наибольшее количество фульвокислот проэкстрагировано из образца, не обработанного червями (контроль). Всего проэкстрагировано фульвокислот: из компоста (контроль) - 980 мг; из образца зимний - 590 мг; образца летний -660 мг.
Анализ хроматографических данных экстрактов вермикомпостов (летний и зимний образцы) выявил наличие 4 фракций фульвокислот. Фракции 1 и 2 сходны по составу, содержат более 70% вещества и, вероятно, наиболее богаты гидрофильными компонентами, этим объясняется лучшая растворимость фульвокислот при различных значениях pH. Содержание гидрофобных фракций 3 и 4 незначительно. Выделенные фракции экстрактов зимнего и летнего образцов вермикомпостов сходны по составу и одинаковому относительному содержанию в исследуемых образцах.
Хроматограмма контрольного образца существенно отличается от выше описанных. На хроматограмме контроля проявляются два дополнительных пика, что указывает на более сложный компонентный состав данного образца. Это обстоятельство может быть связано с гидротермическими и микробиологическими особенностями формирования фульвокислот под действием вермикультуры и без нее.
Для хроматографической характеристики фульвокислот разработан и применен метод ВЭЖХ в обращенных фазах, поскольку в литературе отсутствуют данные о характеристике фульвокислот, исследованных методом ВЭЖХ в обращеннофазовом режиме. Для получения интегральной хроматографической характеристики фульвокислот из экстрактов 1-8 были отобраны апиквоты по 1 мл и объединены, для 3-х образцов (летний, зимний, контроль) в отдельности.
При проведении хроматографического разделения фульвокислот получили 3 фракции. В первых двух преобладали гидрофильные фрагменты, третья содержала гидрофобные радикалы. Сравнительный анализ хроматограмм для исследованных образцов показал, что полученные фракции аналогичны по составу и относительному содержанию компонентов. Установлено возрастание содержания алифатических углеводородов и карбоксильных групп, содержание ароматических колец и полисахаридных фрагментов в фульвокислотах уменьшается с ростом степени гумификации.
Поскольку фульвокислоты обогащены кислородсодержащими фрагментами, то они имеют лучшую растворимость в воде и миграционную способность. Высокое содержание карбоксильных групп (до 27,1%) обусловливает кислотную агрессивность ФК по отношению к почвенным минералам и способность образовывать комплексные соединения с катионами железа, алюминия, меди и других металлов, переводя их в растворимые формы. Высокая подвижность ФК, высокая поглотительная способность позволяют считать их важнейшим фактором, определяющим почвенное плодородие. Оптимизация выделения гумусовых кислот. Ранее использовалась стандартная процедура экстракции гумусовых кислот, рекомендуемая IHSS (Swift R.S., 1999)
Ее использование позволяло извлечь максимальное количество экстрагируемых веществ, однако эта методика включает 11 процедур экстракции по 24 часа для извлечения гумусовых кислот (гуминовые кислоты и фульвокислоты) и столько же процедур по 20 часов для разделения гуминовых и фульвокислот. Используя данные по полноте экстракции гуминовых кислот по ранее используемой методике, оптимизирован одноступенчатый метод выделения гумусовых кислот. В таблице 4 приведены данные по экстрагируемости гумусовых кислот. Из таблицы видно, что при соотношении 1/100 из образцов практически извлекается такое же количество гумусовых кислот как и при 11 экстракциях. На этом основании в дальнейших работах можно использовать для извлечения гумусовых кислот только одну экстракцию
при соотношении биогумус (компост)/экстрагент (0,1 N №ОН; рН 12,5), время экстракции 24 часа.
Таблица 4
Экстрагируемость гумусовых кислот из компоста и биогумуса в зависимости от соотношения масса биогумуса (компоста)/ объем __экстрагента._
Наименов ание образца Экстрагируемость гумусовых кислот, г (%)
Проведение 11 экстракций при соотношении 1/10 Проведение 1 экстракции при соотношении 1/50 Проведение 1 экстракции при соотношении 1/100
контроль 2,08 1,12 1,95
зимний 1,42 0,56 1,51
летний 1,56 0,86 1,49
Гиматомелановые кислоты — группа гумусовых кислот, растворимых в этаноле. Выделяются из свежеосажденной гуминовой кислоты раствором этилового спирта. В растворе имеют вишнёво-красный цвет.
Для сравнительного физико-химического анализа гиматомелановых кислот компостов и вермикомпостов их выделяли из сухих препаратов гумусовых кислот, полученных по выше приведенной оптимизированной методике.
В таблице 5 приведены данные по экстагируемости гиматомелановых кислот различными спиртами.
Таблица 5
Экстрагируемость гиматомелановых кислот различными спиртами
Наименование образца Экстрагируемость спиртами, мг/г (%)
метанол этанол Пропанол
контроль 155(15,5) 200 (20,0) 75 (7,5)
зимний 183(18,3) 215(21,5) 85 (8,5)
летний 155(15,5) 233 (23,3) 60 (6,0)
Из таблицы 5 видно, что максимальное весовое количество гиматомелановых кислот экстрагируется этанолом (от 20 до 23%).
Хроматограммы для исследованных образцов гиматомелановых кислот существенно отличаются друг от друга как количеством пиков, так и интенсивностью поглощения. Для сравнения хроматографических данных были использованы интегральные характеристики пиков, а именно суммарные площади под пиками хроматограмм.
В таблице 6 приведены хроматографические данные по суммарным площадям под пиками хроматограмм при детектировании 220 и 280 нм, а также данные по относительной ароматичности препаратов из 3-х исследованных образцов (контроль, зимний, летний).
Из таблицы 6 видно, что при экстракции метанолом и этанолом уменьшаются площади под пиками хроматограмм в следующем ряду: контроль > образец зимний > образец летний, как при детектировании 220 нм, так и -
280 им, что свидетельствует об уменьшении содержания как карбоксильных и карбонильных групп, так и фенольных групп в гиматомелановых кислотах. В то же время соотношение ££ 280/£8 220 остается практически неизменным.
Последний факт свидетельствует о приблизительно одинаковой относительной ароматичности исследованных образцов гиматомелановых кислот, или другими словами, возрастание степени гумификации гуминовых кислот разного срока созревания не связано с изменением относительной степени ароматичности гиматомелановых кислот.
При экстракции пропанолом экстрагируемость гиматомелановых кислот приблизительно в 2- 3 раза ниже, чем при экстракции метанолом или этанолом (табл. 6).
Таблица 6
Хроматографнческие данные гиматомелановых кислот при экстракции
различными спиртами
Наимено вание образцов Используемые спирты
метанол этанол П ропанол
£S280 j-S^/J-S ш DJj0 £S2so/2S"° £S 2» IS22" Xs^/is22"
контроль 655 4674 0,14 863 5826 0,15 632 5880 0,11
зимний 150 917 0.16 328 3340 0,10 2235 2716 0,82
летний 135 895 0,15 296 2302 0,13 1085 2293 0,47
Гуминовые кислоты и фульвокислоты, выделенные из компостов и вермикомпостов различного происхождения, анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В ходе эксперимента были использованы следующие компосты и вермикомпосты: конский, птичий, свиной, осадок сточных вод. Вермикомпосты получены в течение 6 месяцев с мая по октябрь 2004 года.
Выделение гуминовых и фульвокислот из компостов и вермикомпостов проводили в соответствии с требованиями Международного гуминового общества (Gaffney S., Marley N.A. and Clark S.B., 1996).
Рисунок 6. Гумусовые кислоты, выделенные из вермикомпоста червя «Старатель»: а) гуминовые кислоты, б) фульвокислоты, в) гиматомелановые кислоты.
Из одинаковых по массе сухих навесок была определена влажность препаратов с использованием метода высушивания до постоянного веса. Содержание влаги в вермикомпостах существенно выше, чем в компостах. Разность во влагоемкости между компостами и вермикомпостами составила от 22,6% до 37,9%, таким образом влагоудерживающая способность вермикомпостов существенно выше, чем соответствующих компостов.
В таблице 7 приведены данные по экстрагируемости веществ 0,Ш НС1 из компостов и вермикомпостов. Следует отметить, что наибольшее количество экстрагируемых веществ получено из конского компоста и вермикомпоста. Наименьшее - из осадка сточных вод и вермикомпоста на его основе. Анализ данных таблицы показывает, что экстрагируемость веществ из вермикомпостов ниже по сравнению с компостами на 4-16%.
Таблица 7
Экстрагируемость веществ из компостов и вермикомпостов
раствором 0,Ш НС1
№ п/п Источники компостов и вермикомпостов Концентрация Экстрагируемых веществ, мг/мл Изменение экстрагируемости вермикомпостов и компостов, %
1 Конский компост 7,8 10,2
Конский вермикомпост 7,0
2 Птичий компост 6,7 4,3
Птичий вермикомпост 6,3
3 Свиной компост 6,3 7,9
Свиной вермикомпост 5,8
4 осв 5,5 16,4
Вермикомпост на основе ОСВ 4,6
Для хроматографических исследований использовали растворы гуминовых кислот с концентрацией 1мг/мл и фульвокислот с концентрацией 2мг/мл. В работе использовали колонку - МасгоБрЬеге С8 (300А) (250x4.6). Ион-парную хроматографию проводили в присутствии в элюенте 6 мМ ТБА (тетрабутил -аммоний бромид). Детектирование хроматографических пиков проводили УФ детектором при 280 нм.
Хроматограммы гуминовых кислот содержали по два пика. Вещества пика - 1 гидрофильные, так как элюировались с колонки водой и имели низкие времена удерживания. Вещества пика - 2 гидрофобные, элюировались с колонки ацетонитрилом. Хроматографический пик 1, соответствующий гидрофильным гуминовым кислотам при проведении ион-парной хроматографии исчезает, а площадь под пиком 2 (гидрофобные гуминовые кислоты), соответственно возрастает. Такое поведение характерно для всех образцов гуминовых кислот. Полученные результаты дают основание считать, что различие между пиками 1 и 2 на рисунках 7 (а, б) и 8 (а, б) определяется в основном содержанием в ГК ионизованных групп. Учитывая, что исследование
22
было выполнено при рН=7,6 речь идёт о карбоксильных группах, имеющих для гуминовых кислот рК - 3,6-4,6. По данным Перминовой (2000), содержание этих групп для большого массива гуминовых кислот, полученных из различных источников, составляет 3 -7 мМоль/г. Следует отметить, что карбоксильные группы присутствуют и в гидрофобной фракции гуминовых кислот (рис. 7, пик 2), так как при введении в элюент ТБА время выхода гидрофобной фракции возрастает с 28 до 31 мин, а пик становится более симметричным (рис. 8), что свидетельствует о более высокой однородности гуминовых кислот при нивелировании их зарядов.
а) б)
Рисунок 7. Хроматограмма гуминовых кислот, выделенных из конского компоста (а) и вермикомпоста (б) без ТБА в элюенте. детектирование - 280 нм, режим: изократический 10 мин элюент А; градиент от 100% А до 95% В с 10 до 30 мин; изократический - 95% В с 30 до 40 мин. Элюент-А-10 иМ фосфатный буфер с рН=7,6; элюент-В - 100% ацетонитрил.
а) б)
Рисунок 8. Хроматограммы гуминовых кислот выделенных из конского компоста (а) и вермикомпоста (б) с ТБА в элюенте, детектирование 280нм, режим: изократический 10 мин элюент - А; градиент от 100% А до 95% В с 10 до 30 мин; изократический - 95% В с 30 до 40 мин. Элюент-А 10 мМ фосфатный буфер с рН=7,6 содержащий 6мМ ТБА (тетрабутил-амоний бромида); элюент - В- 100% ацетонитрил содержащий 6мМ ТБА.
Таким образом, в процессе вермикомпостирования наблюдается возрастание влагоудерживающей способности вермикомпостов; снижение экстрагируемости гуминовых веществ 0,Ш раствором НС1; снижение экстрагируемости фульвокислот; возрастание удельной ароматичности суммарных фракций гуминовых кислот; возрастание удельной ароматичности суммарных фракций фульвокислот и существенный рост ароматичности гидрофильной фракции ФК.
Содержание ароматических фракций может служить в какой-то мере показателем степени гумификации вермикомпостов при их качественной оценке. Однако в настоящее время не разработан однозначный параметр для оценки приемлемых уровней стабильности и зрелости компоста. Для компетентного заключения о степени гумификации необходимо рассмотреть как можно больше возможных показателей стабильности вермикомпоста.
ГЛАВА 5. ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ
Для оценки степени завершенности процесса гумификации вермикомпостов был использован метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.
На рисунке 9 приведены термограммы для растворов комплекса гуминовых веществ, выделенных из вермикомпостов различного периода созревания. Термограммы имеют общий вид. Температурные зависимости теплоемкостей (Ср) на участках А-В термограмм возрастают с ростом температуры до ~60°С. Начиная с точки В, температурные зависимости теплоемкостей меняют наклон (участок В-С), то есть, температурные зависимости теплоемкости на участке А-В имеют больший положительный температурный инкремент (дС/дТ > 0), чем на участке В-С. Таким образом, при температуре ~60°С наблюдается некоторое изменение в состоянии гуминовых веществ.
Рисунок 9. Термограммы растворов гуминовых веществ выделенных из вермикомпостов различного периода созревания: 1 - образец-0, 2 - зимний образец, 3 - летний образец.
Тт - температура средины перехода при разрушении мицелл, ДТ- интервал перехода, ДСР- скачок теплоемкости. После точки В при температуре ~60°С температурный инкремент теплоемкости (дС1дТ) уменьшается.
Возможно, излом температурной зависимости теплоемкости связан с возрастанием силы гидрофобных взаимодействий до температуры ~70°С, а при
более высокой температуре она начинают ослабевать, что проявляется на участке В-С в более низком температурным инкременте. На участке С-Д теплоемкости всех образцов гуминовых веществ скачкообразно возрастают в узком температурном интервале.
Учитывая этот факт и то, что гуминовые вещества в растворах образуют мицеллы, наблюдаемый термический переход можно отнести к разрушению мицелл, а скачок теплоемкости (ДСр) связать с площадью гидрофобных групп, экспонированных в водный растворитель при разрушении мицелл.
Установление корреляционной зависимости между термодинамическими параметрами разрушения мицелл гуминовых веществ и спектральными параметрами, полученными из хроматографических данных, показало, что возрастание относительной степени ароматичности приводит к линейному росту АСР (Г12=0,998). Как было отмечено выше, разрушение мицелл сопровождается экспонированием в воду гидрофобных групп гуминовых веществ, ранее не доступных растворителю. Так как ароматические группы гуминовых веществ являются гидрофобными, то наблюдалось увеличение скачка теплоемкости с ростом ароматичности. Другими словами, мицеллы гуминовых веществ, полученные из вермикомпоста более высокой степени зрелости, содержат большее количество гидрофобных групп, не доступных растворителю, которые при разрушении мицелл экспонируются в воду и дают большее значение ДСр.
Рост степени ароматичности гуминовых веществ приводит к линейному росту АТ (И2 = 0,941). Возрастание температурного интервала разрушения мицелл, вероятно, связано с ростом их гетерогенности.
Возрастание суммарной степени ароматичности гуминовых веществ приводит к линейному снижению температуры средины перехода (Тт) (Я2= 0,967).
На основании проведенных исследований можно рассматривать возможность использования термического анализа для контроля степени гумификации и характеристики химических изменений в органическом веществе компоста.
Методом прецизионной дифференциальной сканирующей микроколориметрии и методом ВЭЖХ в обращенных фазах исследовали гуминовые кислоты, выделенных из вермикомпостов различного периода созревания. Концентрация гуминовых кислот в растворах составляла 6 мг/мл.
Термограммы трех образцов гуминовых кислот (1-образец-0 (компост); 2-зимний образец; 3- летний образец) сходны (рис. 10).
Теплоемкости (Ср) на участках А-В термограмм возрастают с ростом температуры до 58°С. Начиная с точки В теплоемкости снижаются (участок ВС), то есть температурные зависимости теплоемкости на участке А-В имеют положительный температурный инкремент (5С/5Т>0), а на участке В-С -отрицательный (с'С/бТ<0). По видимому, при температуре 58°С наблюдается изменение в состоянии гуминовых кислот, которое соответствует термодинамическому переходу 3-го рода (дС/дТ- меняет знак). На участке С-Д
теплоемкости для образцов гуминовых кислот скачкообразно возрастают в узком температурном интервале. Определены термодинамические характеристики этого перехода: ширина перехода - ДТ, середина перехода -Тс и разность теплоемкостей - ДСР.
Ср
ш'дж/к
Тс /Т~~
и ]ЛСр
дт
Рисунок 10. Термограммы растворов гуминовых кислот, выделенных из вермикомпостов различной степени зрелости:
1 - образец-0, 2 - зимний образец, 3 -летний образец.
Тс - температура расстекловывания,
ДТ- интервал перехода
расстекловывания,
ДСР- скачок теплоемкости при расстекловывании ГК. В точке В при температуре 58°С температурный инкремент теплоемкости (дС/бТ) меняет знак с «+» на «-».
В таблице 8 приведены термодинамические характеристики переходов, а также данные для процессов расстекловывания синтетических полимеров. Учитывая этот факт и то, что гуминовые кислоты в растворах образуют ассоциаты, можно предположить, что эти надмолекулярные структуры находятся в растворах в стеклообразном состоянии. В ходе сравнения термодинамических параметров расстекловывания гуминовых кислот выявлено, что значения ДСР для образцов практически одинаковы, однако значения ДТ и Тс различаются.
Таблица 8
Термодинамические параметры расстекловывания гуминовых кислот, полученных из вермикомпостов различной степени зрелости
Наименование образца
Тс,"С
ДТ,°С
ДСР) Дж/гК
*Синтетическне полимеры
АТ,°С
ДСр, Дж/гК
контроль
86,1 ±0,2
1,5 ±0,5
0,28 ±0,02
87,2 ±0,2
7,3 ±0,4
0,32 ±0,03
7-10
0,3 - 0,5
90,2 ±0,2
4,2 ±0,6
0,28 ±0,02
*Данные взяты из монографии: Бернштейн В.А., Егоров В.М. Дифференциальная сканирующая калориметрия в физикохшии полимеров. - Ленинград, Химия, 1990. - С. 248.
Данные хроматографического анализа растворов гуминовых кислот показали наличие двух фракций - гидрофильной и гидрофобной. Выявлено, что процентное содержание фракции-2 возрастает в соответствии с ростом зрелости вермикомпоста в ряду: образец летний > образец зимний > контроль. Содержание фракции-2 (%) определено как отношение площади
хроматографического пика-2 к сумме площадей под пиками 1 и 2 при детектировании пиков 220 нм (S2i20/ £S220). Содержание фракции-2 в образцах в 2 раза превышает ее содержание в компосте.
Относительная алифатичность определена как отношение площади под пиком при детектировании при 220 нм к площади при детектировании при 280 нм (S2220/S2280). Показано, что с ростом зрелости вермикомпоста относительная алифатичность фракции-2 в 2 раза возрастает, В то же время процентное содержание фракции-1 падает и ее относительная алифатичность снижается. Суммарная алифатичность определена как отношение суммы площадей под пиками хроматограмм фракций-1 и 2 при детектировании 220 нм к сумме площадей этих фракций при детектировании 280 нм (IS220/2;S280). Отмечено, что она возрастает с ростом зрелости вермикомпоста.
В настоящее время наиболее объективным критерием зрелости и стабильности компостов считается критерий относительного содержания фракции ядра (core) в общей сумме гуминовых кислот (Adani F., Genevini P.L., 1997; Chefetz В, Adani F., 1998). Эта фракция представляет собой высокомолекулярную алифатическую (гидрофобную) фракцию гуминовых кислот и накапливается в процессе компостирования. В качестве критерия зрелости компостов предложен индекс стабильности компоста, представляющий собой отношение углерода суммарных гуминовых кислот к углероду фракции ядра. В нашем случае фракцией ядра является хроматографическая фракция-2 (алифатическая), рост содержания которой в гуминовых кислотах отражает степень зрелости или степень гумификации вермикомпоста. Однако наиболее подходящим критерием степени зрелости вермикомпоста является критерий роста относительной суммарной алифатичности гуминовых кислот, так как в нем учтены спектральные свойства как фракции-1, так и фракции-2, кроме того, относительная суммарная алифатичность линейно связана с температурой расстекловывания гуминовых кислот. Увеличение содержания фракции-2 приводит к экспоненциальному росту Тс, в то же время температурный интервал расстекловывания - ДТ уменьшается. Эти данные свидетельствуют о росте кооперативности процесса расстекловывания гуминовых кислот, что связанно с количественным возрастанием фракции-2, которая является более высокомолекулярной и алифатичной по-сравнению с фракцией-1.
На основании экспериментальных данных установлено, что степень гумификации вермикомпостов можно контролировать:
1. методом ВЭЖХ в обращенных фазах, используя как критерий относительную суммарную алифатичность гуминовых кислот;
2. методом сканирующей микроколориметрии, используя как критерий температуру расстекловывания и температурные интервалы расстекловывания гуминовых кислот.
Результаты, полученные методом сканирующей микроколориметрии, подтверждаются данными ЯМР-спектроскопии.
Анализ молекулярной структуры препаратов ГК показал, что с увеличением периода вермикомпостирования увеличивается содержание О-алкильных функциональных групп (с 15% до 33%) и уменьшается доля ароматических молекулярных фрагментов (с 34% до 20%).
ГЛАВА 6. ИСПЫТАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГУМИНОВОГО КОМПЛЕКСА ВЕРМИКОМПОСТА
Для выявления особенностей ферментативной активности вермикомпоста были отобраны и проанализированы образцы почвы компоста и вермикомпоста. В исследуемых образцах изучали ферменты класса оксидоредуктаз. В контрольных образцах (неферментативная активность) ферменты инактивировали стерилизацией сухим жаром при температуре 180° С в течение двух часов. За единицу активности (Е) принимали величину оптической плотности, отнесенную к сухой массе навески. Анализ диаграммы (рис. 11-а) показал, что самая высокая каталазная активность наблюдалась в варианте с вермикомпостом. Следует отметить, что активность фермента возрастает по мере созревания вермикомпоста.
Е, у.е.
Е, у.е.
а) 6)
Рисунок 11. Активность каталазы (а), пероксидазы (б) в образцах почвы, биогумуса и компоста.
Пероксидазам присущи процессы окисления органического вещества или косвенного распада гумуса в то время как полифенолоксидазы участвуют в превращениях органических соединений ароматического ряда в компоненты гумуса. Оба процесса взаимосвязаны. Активность пероксидазы в контроле составила 5,5, в почве в воздушно-сухом состоянии 7, в компосте 8,5 условных единиц (рис. 11-6). В образцах биогумуса активность пероксидазы возросла почти в 2 раза и составила 10,5 условных единиц.
Повышенная оксидазная активность вермикомпоста объясняется, вероятно, тем, что копролиты являются центрами микробиологической активности в почве. В каждом грамме биогумуса содержится более 50 млрд.
28
микробных клеток. Поглощая почву и органические вещества, черви выделяют с копролитами большое количество собственной кишечной микрофлоры, ферментов, витаминов, которые в свою очередь обладают стимулирующим действием на активность и биомассу микроорганизмов, являющихся продуцентами различных биологически активных веществ.
Изучение влияния гуминового комплекса, выделенного из вермикомпостов, на активность пероксидазы и каталазы на начальных стадиях развития гороха проводили на контрастных по устойчивости сортах: сорт «Норд», не устойчивый к вредителям и болезням, и сорт «Орпела», обладающий комплексной устойчивостью к неблагоприятным факторам. Ранее установлено, что биологически активную основу гуминового комплекса составляют гуминовые кислоты, фульвокислоты и гиматомелановые кислоты, оказывающие стимулирующее воздействие на растения.
Активность ферментов исследовали в проростках на третий, пятый и пятнадцатый день после замачивания. Контрольные семена замачивались в воде, препаратами сравнения служили раствор вытяжки из компоста и промышленный препарат «Гумистар».
Исследование пероксидазной активности на проростках гороха «Норд» (3-й сутки) показало, что в контроле активность самая низкая (84 у.е.). В образцах, обработанных препаратом «Гумистар» и раствором гуминового комплекса с концентрацией 1,5-10~4%, активность пероксидазы высокая (245 и 216,46 у.е. соответственно). В варианте с вытяжкой из компоста активность повысилась незначительно по сравнению с контрольным вариантом (134,44 у.е.). Активность пероксидазы в проростках гороха в варианте с раствором препарата «Гумистар» была несколько выше, чем в варианте с раствором гуминового комплекса.
Самая низкая активность пероксидазы у сорта «Норд» наблюдалась в контроле и в варианте с вытяжкой из компоста. При обработке семян раствором гуминового комплекса с концентрацией 1,5-10"3 %, отмечено значительное возрастание активности пероксидазы до 4500 у.е. Раствор гуминового комплекса с концентрацией 1,5-10"4 % показал близкие результаты. Это свидетельствует о том, что растворы с низкой концентрацией активного вещества действуют так же эффективно при меньшем расходе препарата.
Активность пероксидазы проростков у сорта «Орпела» различается незначительно по вариантам. Причем, в контрольном варианте эти показатели были самыми низкими. Более высокая активность наблюдалась в варианте с раствором «Гумистар». Растворы гуминового комплекса с концентрациями 1,5-Ю"^ и 1,5-10"3% показали аналогичные результаты. Тенденция по закономерностям аналогична сорту «Норд».
Активность каталазы в проростках неустойчивого сорта «Норд» (3-й сутки) по вариантам изменялась от 0,81 до 2,1 у. е. У сорта «Орпела» наиболее низкая активность фермента выявлена в контроле (7,3 у.е.). Относительно высокая - в варианте с вытяжкой из компоста (10,5 у.е.). Активность образцов,
обработанных растворами гуминового комплекса и препаратом «Гумистар», различалась незначительно.
Таким образом, у сорта «Норд» активность пероксидазы во всех вариантах на несколько порядков больше, чем у сорта «Орпела». А активность каталазы, напротив, во всех вариантах ниже по сравнению с пероксидазой. Снижение активности каталазы, возможно, связано с накоплением активных форм кислорода в форме перекисей и конкурентным действием пероксидазы, активность которой возросла.
В 5-ти суточных проростках прослеживались те же закономерности: у устойчивого сорта активность пероксидазы на несколько порядков выше, чем у неустойчивого.
Активность каталазы в корешках у неустойчивого сорта «Норд» по вариантам исследования изменялась от 2 до 3,62 у.е. У сорта «Орпела» активность фермента во всех вариантах выше, чем у сорта «Норд».
В 15-суточных проростках у сорта «Норд» активность пероксидазы низкая в контроле и в варианте с вытяжкой из компоста. При обработке семян растворами гуминового комплекса отмечено значительное возрастание активности пероксидазы до 2423 у.е. для раствора с концентрацией 1,5-10"4 %. В варианте с препаратом «Гумистар» активность фермента была ниже, чем в вариантах с растворами гуминового комплекса. У сорта «Орпела» наблюдалась та же закономерность: самая низкая активность в контрольном варианте и варианте с вытяжкой из компоста, а самая высокая для раствора гуминового комплекса с концентрацией 1,5-10"4 %. Активность при обработке препаратом «Гумистар» ниже, чем при обработке растворами гуминового комплекса.
Анализ полученных результатов показал, что при обработке растений раствором гуминового комплекса удаётся индуцировать иммунитет у растений, поскольку обработка семян вызывает биохимические изменения в тканях; в обработанных гуминовым комплексом растениях активность пероксидазы увеличивается, а поскольку возрастание пероксидазной активности свидетельствует о повышении иммунного статуса, можно предположить, что гуминовый комплекс выступает элиситором индуцированного иммунитета. Обработка гуминовым комплексом сохраняет уровень пероксидазы в проростках на достаточно высоком уровне, что позволяет растению защититься от болезней на этапе развития, когда иммунитет понижен. Пероксидасомы растительных клеток играют фундаментальную роль в защите от патогенов, усиление их функции с помощью гуминового комплекса может явиться новой формой биологической защиты растений.
Активность супероксиддисмутазы (СОД) исследована на среднеустойчивом сорте гороха «Батрак». Активность ферментов измеряли в побегах и корешках проростков на третий, пятый, седьмой и десятый день после замачивания семян.
На основании проведенных исследований выявлено, что активность СОД во всех вариантах увеличивается на седьмой день развития побега и составляет около 15000 у.е. (рис. 12-а). На третий день прорастания самая высокая
активность отмечена в варианте с раствором гуминового комплекса. На десятый день развития проростка активность СОД падает во всех вариантах. Стимуляция гуминовым комплексом активности СОД, вероятно, связана с его высокой способностью к детоксикации активных форм кислорода.
Исследования активности СОД в корешках проростков гороха «Батрак» подтвердили полученную закономерность, выражающуюся в повышении активности антиоксидантных ферментов под влиянием гуминового комплекса (рис. 12-6).
а) б)
Рисунок 12. Влияние гуминового комплекса на активность СОД: а) в побегах, б) в корешках проростков гороха сорта «Батрак».
Варианты: 1 - контроль (вода), 2 - препарат «Нарцисс», 3 - препарат «Винцит, СК», 4 -препарат гуминового комплекса, 1,5-10"*%.
Применение гуминового комплекса способствует повышению активности пероксидазы и каталазы, как индикаторов увеличения устойчивости к неснецифическим патогенам, а также усиливает ростовые процессы на стадии проростков. При обработке гуминовым комплексом индукционный эффект был более выражен, что делает возможным использование его для создания препарата широкого спектра действия. Одним из наиболее многообещающих способов защиты растений является индуцирование их устойчивости.
Гуминовый комплекс является одним из препаратов природного происхождения, биоактивные вещества которого, попадая в клетку, подают сигнал растению для активации антиоксидантных ферментов, помогающим растению бороться с негативным действием биотических факторов.
Подобное усиление иммунитета гороха под влиянием гуминового комплекса не могло не сказаться на устойчивости растений при испытании в полевых условиях. Устойчивость растений к болезням и вредителям - один из важных факторов, определяющих высокий урожай сельскохозяйственных культур и его стабильность. Разработка путей эффективного решения этой проблемы имеет большое народнохозяйственное значение.
В ходе эксперимента исследовано влияние препарата гуминового комплекса на зараженность семян, развитие корневых гнилей, аскохитоза, а также устойчивость к поражению вредителями. Эксперимент проводился в трех
вариантах: обработка вытяжкой из компоста, препаратом гуминового комплекса с концентрацией раствора 1,5 10"4 %, препаратом гуминового комплекса с концентрацией раствора 1,5-10"3 %, контроль - вариант без обработки.
Сорт «Вега» овощного использования в начале вегетации растёт медленно, поэтому сильнее зарастает сорняками, поражается болезнями и повреждается вредителями, не устойчив к корневым гнилям, средне устойчив к аскохитозу, не устойчив к тле. Результаты лабораторного опыта на бактериальную заражённость показали, что заражённость семян во всех вариантах ниже, чем в контроле (табл. 9).
Таблица 9
Влияние обработки препаратом гуминового комплекса гороха сорта «Вега» на заражённость семян, развитие корневых гнилей, развитие аскохитоза
Вариант Заражённость семян, % Корневые гнили, % развития Развитие аскохитоза, %
Фаза цветения Фаза плодообразования
Контроль (без обработки) 35,0 32,9 45,4 51,0
Предпосевная обработка семян
Вытяжка из компоста 22,5 27,5 42,1 46,4
Препарат гуминового комплекса, 1,5-10 "*% 18,5 25,4 40,8 48,0
Препарат гуминового комплекса, 1,5-10 "3 % 20,0 25,4 43,0 55,1
Предпосевная обработка семян + 2- к ратное опрыскивание
Вытяжка из компоста 22,0 0,0 0,0 0,0
Препарат гуминового комплекса, 1,5-10 ^ % 21,5 0,0 0,0 0,0
Препарат гуминового комплекса, 1,5-10°% 28,0 0,0 0,0 0,0
НСР„5 2,3 12,0 1,8 7,1
Под влиянием предпосевной обработки семян испытуемыми растворами снижается процент развития корневых гнилей как в фазе цветения, так и в фазе плодообразования по сравнению с контролем (без обработки). Предпосевная обработка семян в сочетании с 2- кратным опрыскиванием привела к полному подавлению болезни в вариантах с препаратом гуминового комплекса и вытяжкой из компоста (табл. 9).
Развитие аскохитоза на горохе сорта «Вега» при предпосевной обработке семян по вариантам незначительно отличается от контроля. Это можно объяснить тем, что аскохитоз развивается на всходах и надземных органах взрослых растений. В вариантах с предпосевной обработкой семян и 2-кратным опрыскиванием растений наблюдалось полное подавление болезни (табл. 9).
Развитие тли в культуре гороха сорта «Вега» (на 10 взмахов сачка) в вариантах с препаратом гуминового комплекса с концентрацией раствора 1,5-10° % и вытяжкой из компоста составило 245 и 252 шт. соответственно. А в варианте с препаратом гуминового комплекса с концентрацией раствора 1,5-10"4 % всего 84 шт. Меньшая концентрация раствора препарата гуминового комплекса оказалось более эффективной в вариантах с предпосевной обработкой семян, сочетающейся с двукратным опрыскиванием растений. В этом случае наблюдалось полное подавление развития тли.
При анализе биологической эффективности применения препарата гуминового комплекса на горохе сорта «Норд» рассмотрен показатель развития корневых гнилей в фазе бутонизации и в фазе плодообразования. Сорт имеет среднюю устойчивость к поражению болезнями и вредителями. Наименьший процент развития корневых гнилей в фазе бутонизации был отмечен в варианте с препаратом гуминового комплекса (концентрация 1,5-Ю"4 %) (табл. 10).
Таблица 10
Влияние обработки препаратом гуминового комплекса
гороха сорта «Норд» на поражаемость болезнями__
№ п/п Варианты Развитие корневых гнилей,% фаза бутонизации Развитие корневых гнилей,% фаза плодообразования. Ржавчина, % (¡кпа развития Аскохитоз, % раза развития
1 Контроль (без обработки). 41,8 70,6 57,8 27,5
Предпосевная обработка семян
2 Препарат гуминового комплекса, 1,5-10*3% 38,1 46,8 50,5 20,0
3 Препарат гуминового комплекса, 1,5-10 35,2 46,2 51,8 20,2
Предпосевная обработка семян + 2-кратное опрыскивание
4 Препарат гуминового комплекса, 1,5 • 10"4% 41,5 0,0 51,2 22,0
5 Препарат гуминового комплекса, 1,5 • 10"5% 39,8 0,0 51,8 20,0
6 Контроль (без обработки). 45,8 0,0 57,8 27,5
7 НСР„5 13,08 13,01 10,11 7,11
В варианте без обработки семян развитие корневых гнилей составило 41,8%. Низкий процент развития корневых гнилей наблюдался и при обработке препаратом более низкой концентрации. Заметно повышается процент развития корневых гнилей в фазе плодообразования, но во всех вариантах он ниже по сравнению с контролем (70,6%), в варианте с обработкой семян раствором гуминового комплекса с концентрацией 1,5-10"4 %, развитие болезни составляет 46,2 %. Предпосевная обработка семян в сочетании с двукратным опрыскиванием позволяет снизить заболеваемость растений в фазе
бутонизации и полностью подавить развитие корневых гнилей в фазе плодообразования. Во всех вариантах с применением обработки препаратом гуминового комплекса отмечено снижение развития ржавчины и аскохитоза по сравнению с контролем.
Обработка семян гороха сорта «Норд» препаратом гуминового комплекса отразилась на урожайности культуры. Как и в предыдущих исследованиях, наиболее эффективным оказалось сочетание предпосевной обработки семян с 2-х разовым опрыскиванием растений растворами гуминового комплекса. В варианте с раствором 1,5-10"3 % концентрации прибавка урожайности составила 30,6%, а в варианте с раствором 1,5-Ю"4 % концентрации она увеличилась почти в два раза (на 91,9 %) и составила 2,63 т/га, что превышает среднюю урожайность данного сорта по области.
В полевом эксперименте, поставленном в 2004 - 2007 годах было исследовано влияние гуминового комплекса на развитие и урожай гороха (сорт «Норд»), картофеля (сорт «Жуковский ранний»), пшеницы (сорт «Крестьянка»).
Из данных таблицы 11 следует, что препарат гуминового комплекса оказал положительное влияние на картофель сорта «Жуковский». Так, количество клубней и их вес увеличились, а урожайность повысилась на 3040% (от 18 т/га в контроле - до 25-28 т/га при обработке раствором гуминового комплекса с концентрациями 1,5-Ю"3 % и 1,5-Ю4% соответственно).
Таблица 11
Влияние препарата гуминового комплекса на урожай _сельскохозяйственных культур _
Вариант Картофель «Жуковский ранний» Пшеница яровая «Крестьянка» Горох «Норд»
Кол-во клубней на один куст, шт. Масса клубней 10 смежных кустов, кг Урожа йность, т/га Всходы, шт./м: Масса 1000 семян, г. Урожай, т/га. Масса 1000 семян, г. Урожайно сть, т/га
Контроль 5,0 3,78 18,0 160,0 19,0 1,70 120,7 1,5
Препарат гуминового комплекса, 1,5-10 "2% 6,0 4,20 20,0 194,0 36,0 2,1 5 130,8 1,8
Препарат гуминового комплекса, 1,5-10 -3% 8,0 5,25 25,0 170,0 26,0 1,95 151,3 2,2
Препарат гуминового комплекса, 1,5-10 "Ч 7,0 5,88 28,0 184,0 24,0 1,98 180,8 2,9
Вытяжка из компоста 6,0 3,99 19,0 149,0 20,0 1,75 111,5 1,7
НСР„5 1,67 0,4 0,70 1,38 0,52 0,12 0,49 0,09
Испытание влияния препарата гуминового комплекса на урожайность проводили на яровой пшенице сорта «Крестьянка». В таблице 11 показано, что под влиянием препарата гуминового комплекса с концентрациями 1,5-10"3 % и 1,5-Ю"4 % количество семян на 1м2 увеличивается от 160,О-в контроле (вода) до 194,0 и 184,0 шт. соответственно по вариантам. Под влиянием вытяжки из компоста произошло угнетение развития семян.
Масса тысячи семян возросла в большей степени под влиянием раствора гуминового комплекса с более высокой концентрацией (с 19,0 до 36,0 г.), что отразилось на урожае зерна 1,7 т/га - в контроле и 2,15 т/га в варианте с концентрацией гуминового комплекса 1,5-10~2 %. Однако, более низкие концентрации растворов (1,5-1 О*3 % и 1,5-10"4 %) также сказались на увеличении урожайности пшеницы до 1,95 и 1,98 т/га соответственно.
Следует отметить, что под влиянием препарата гуминового комплекса происходит увеличение всхожести семян пшеницы на 20%, наблюдается увеличение высоты растений.
Обработка гороха препаратом гуминового комплекса проводилось на сорте «Норд» (табл. 11). Из данных следует, что под влиянием растворов препарата с концентрациями 1,5-10"2 %, 1,5 10~3 %, 1,5-10"4 % масса тысячи семян возросла во всех случаях. Лучший результат отмечен в варианте с раствором меньшей концентрации 1,5-10"4 %. Масса тысячи семян в этом случае возросла со 120,7 (контроль) до 180,8. Этот вариант показал наибольшую урожайность - 2,9 т/га (в контроле 1,5 т/га).
Под влиянием препарата гуминового комплекса, в частности, при замачивании клубней картофеля в растворе препарата наблюдалось увеличение высоты растений, увеличение площади листьев до 200 см2, а при опрыскивании растения в стадии цветения до 126,4 см2 по сравнению с контролем 117,5 см2.
Данный показатель у пшеницы и гороха в случае замачивания семян и опрыскивания растений также превышает контроль на 30 и 29% соответственно. Замачивание посевного материала в вытяжке из компоста и опрыскивание этой же вытяжкой показало результат несколько ниже контроля, этот показатель у картофеля составляет 96 см2 и 114,3 см2; у пшеницы 129,0 см2 и 146,2 см2, а у гороха 108,0 см2 и 111,8 см2 соответственно.
Химический состав клубней картофеля в вариантах с использованием растворов препарата гуминового комплекса характеризовался повышением содержания азота. Кроме того, повысилось содержание крахмала. Обработка растений раствором препарата гуминового комплекса положительно повлияла на сохранность картофеля при хранении. Количество клубней, пораженных бактериальной гнилью снизилось в 2 раза относительно контроля. Поражение фитофторозом снизилось на 15%, а фузариозом на 10%.
Таким образом, полученные данные убедительно показывают положительное влияние препарата гуминового комплекса на рост, развитие и урожайность таких культур, как картофель, пшеница, а также горох.
Применение созданных на основе вермикомпоста препаратов для обработки сельскохозяйственных растений способствует улучшению экологической обстановки за счет таких факторов, как снижение использования высокотоксичных и дорогостоящих химических средств защиты, исключение их негативного воздействия на окружающую среду, человека и животных, полезных организмов, составляющих почвенную фауну.
Полученные данные говорят о широком спектре действия препарата гуминового комплекса, в том числе участии в защитных механизмах растений, иммуностимулирующем и координирующем действии на рост и развитие растений. Препараты, созданные на основе вермикомпоста, - биологические аналоги естественных факторов, поэтому они не могут вызвать отрицательных явлений в процессе роста и развития растений при научно обоснованном применении.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ
1. Получен вермикомпост (биогумус) на основе отечественного гибрида дождевого червя «Старатель» из разных видов компостов;
2. Освоена методика выделения гумусовых кислот. Разработана и применена одноступенчатая оптимизированная методика выделения гумусовых кислот. Разработан и применен метод ВЭЖХ в обращенных фазах для хроматографической характеристики ГК, ФК, ГМК.
3. Определен ключевой показатель оценки скорости биоконверсии органических субстратов и степени зрелости вермикомпостов -соотношение С/№ оно снижается от 22,1 - в компосте до 13,7, 17,8 в зимнем и летнем образцах биогумуса соответственно.
4. На основании систематических исследований установлены закономерности изменения микробиологической и ферментативной активности компостов и вермикомпостов:
в процессе созревания вермикомпост обогащается грибами-антагонистами (ТпсИос1егта), приобретая свойства оздоравливающего действия;
аммонифицирующая активность в образцах вермикомпостов значительно повышается по сравнению с компостом в 2,6 и 1,8 раз соответственно для летнего и зимнего образцов;
- нитрифицирующая активность снижается: от 19,2 мг в компосте до 17,8 и 17,6 - в летнем и зимнем образцах вермикомпостов;
- препараты зимних образцов биогумуса обладают более высокой протеолитической активностью, чем препараты летнего, образцы компоста, не обработанного червями, не обладают протеолитической активностью;
- амилолитической активности обнаружить не удалось ни в одном из образцов.
5. Методом гель-хроматографии определены молекулярные массы белков биогумуса («27 кДа) и жирнокислотный состав в исследованных препаратах. Показано, что содержание жирных кислот в препаратах биогумуса выше, чем в препарате, не обработанном червями (контроль).
6. На основании исследований и анализа экспериментальных данных можно заключить, что
- влагоудерживающая способность вермикомпостов по сравнению с компостами возрастает;
- с ростом степени гумификации экстрагируемость гумусовых веществ снижается;
- удельная ароматичность суммарных фракций ГК (гидрофильной и гидрофобной) возрастет;
- удельная ароматичность суммарных фракций ФК возрастет, наблюдается существенный рост ароматичности гидрофильной фракции ФК, содержащей малополярные заместители в молекулах;
- предпочтительным спиртом для экстракции ГМК является этанол; в исследованных образцах гумусовых кислот содержится около 20%(w/w) ГМК;
- относительная степень ароматичности ГМК в процессе гумификации не изменяется;
- с ростом степени гумификации наблюдается снижение содержания карбоксильных, карбонильных и фенольных групп в ГМК.
7. Исследования вермикомпостов, полученных из разных субстратов показали, что процессы вермикомпостирования для различных компостов различаются как по интенсивности гумификации (различия в приросте удельной ароматичности суммарных фракций), так и по механизмам гумификации (различия в приросте гидрофильной и гидрофобной фракций);
8. Исследования методом сканирующей микрокалориметрии показали, что ГК в разбавленных водных растворах находятся в виде «мицелл» и содержат две фракции гидрофильную и гидрофобную; в процессе вермикомпостирования содержание гидрофобной фракции увеличивается и возрастает ее алифатичность.
9. Метод |3С ЯМР-спектроскопии показал, что исследованные препараты ГК разного срока созревания различаются по соотношению ароматических и углеводных фрагментов, входящих в состав углеродного скелета. Были идентифицированы и количественно определены следующие функциональные группы и молекулярные фрагменты: ароматические (Ar), карбоксильные (-СООН), карбонильные (-С=0), алкильные (Alk), О-замещенные алифатические атомы углерода (Alk-O).
10. Разработана общая методология контроля степени гумификации с помощью:
а) метода ВЭЖХ, используя как критерий относительную суммарную ароматичность ГВ;
б) метода сканирующей микроколориметрии, используя как критерий разность теплоемкостей, температуру и температурные интервалы перехода разрушения мицелл ГВ.
11. Разработана методика выделения экстрактов и вытяжек из биогумуса, получения препарата гуминового комплекса. Показано положительное влияние гуминового комплекса на иммунную систему с/х растений, что значительно усиливает устойчивость растений к биотическим факторам и повышает урожайность.
12. На основании систематических исследований в полевых и лабораторных условиях выявлена биологическая активность и сортоспецифичность препарата гуминового комплекса, что дает возможность разработки биологически активных фитоиммуномодуляторов.
Предложения по практическому использованию результатов исследований
1. На основе водорастворимой фракции гумусовых соединений, полученных из вермикомпоста на основе червя «Старатель», перспективно создание нового класса иммуномодуляторов, стимуляторов роста и развития растений.
2. Гуминовый комплекс, полученный путем щелочной экстракции из вермикомпостов, может быть рекомендован в качестве компонента питательных сред для культивирования зародышей с целью селекции новых сортов.
ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
Широкое использование в сельскохозяйственном производстве вермикомпостов (биогумуса), несомненно, будет способствовать оздоровлению окружающей среды, снижению применения химических средств защиты растений, повышению урожайности и устойчивости к болезням и вредителям сельскохозяйственных культур и получению экологически безопасной пищевой продукции.
Предварительные расчеты показали, что производство биогумуса, приготовление на его основе раствора, обработка семян, опрыскивание посевов экономически выгодно в связи с повышением урожайности сельскохозяйственных культур и исключением химических средств защиты.
В качестве контрольного варианта была взята технология возделывания гороха без обработки против болезней и вредителей и технология возделывания гороха с использованием предпосевной обработки семян и двукратной внекорневой обработки растений гороха биопрепаратом гуминового комплекса на основе копролитов дождевого червя «Старатель» в концентрации 1,5-10 '4%. Прибавка к урожайности составила 12,6 ц/га по сравнению с контролем. Валовой сбор основной продукции в контрольном варианте составил 137 т., в опытном - 263 т., что дает возможность снижения себестоимости на 1442,1 руб. на 1т. основной продукции (в ценах 2007 года).
Прибыль от внедрения подобной разработки в сельскохозяйственное производство может составить 12323,07 рублей на гектар посевов бобовых культур (в ценах 2007 года).
Из проведенного выше анализа экономической эффективности контроля и исследуемых вариантов можно сделать вывод, что обработка семян и опрыскивание посевов вытяжкой из биогумуса экономически выгодно.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Павловская, Н. Е. Физико-химическая характеристика и биологическая активность биогумуса [Текст] / Н. Е. Павловская, Е. И. Юшкова, А. Н. Даниленко и др. - Орел : Изд-во ОРАГС, 2007. - 140 с.
2. Юшкова, Е. И. Разработка биологически активных веществ на базе вермикультуры [Текст] / Е. И. Юшкова, А. А. Таканаев, Н. Е. Павловская, М. А. Яроватая // Экология и жизнь : сб. материалов VII Междунар. науч.-нракт. конф. (25 - 26 ноября 2004., Пенза). - Пенза, 2004. - С. 149151.
3. Юшкова, Е. И. Выделение и функциональная характеристика некоторых белков и пептидов из Eisenia Fétida [Текст] / Е. И. Юшкова, А. А. Таканаев, Н. Е. Павловская, М. А. Яроватая // Материалы Второго съезда Общества биотехнологов России. / под ред. Р. Г. Василова. - М. : МАКС Пресс, 2004.-С. 196.
4. *Юшкова, Е. И. Физико-химические свойства экстрактов из биогумуса разной степени зрелости [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская, А. Н. Даниленко, Н. И. Ботуз // Сорбционные и хроматографические процессы.
- 2006. - Т. 6. - № 1. - С. 70-79.
5. *Юшкова, Е. И. Выделение и исследование некоторых физико-химических свойств гиматомелановых кислот методом ВЭЖХ [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская, А. Н. Даниленко, Н. И. Ботуз // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2006. - Т. 6. - № 5. - С. 807-816.
6. *Юшкова, Е. И. Сравнительные исследования гуминовых кислот выделенных из компостов и вермикомпостов различного происхождения методом ВЭЖХ [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская, А. Н. Даниленко, Н. И. Ботуз // Сорбционные и хроматографические процессы.
- 2006. - Т. 6. - № 6. - С. 1358-1364.
7. Юшкова, Е. И. Выделение и исследование некоторых физико-химических свойств фульвокислот методом ВЭЖХ [Текст] / Е. И. Юшкова, М. А. Яроватая II Фундаментальные и прикладные проблемы современной химии в исследованиях молодых ученых : материалы Междунар. науч. конф. (10 - 12 сентября 2006., Астрахань). - Астрахань, 2006. - С. 151152.
8. Юшкова, Е. И. Изучение связывающих и детоксицирующих свойств гуминовых кислот по отношению к различным классам экотоксикантов [Текст] / Е. И. Юшкова // Актуальные проблемы химии и методики ее
преподавания : сб. материалов межрегион, науч.-метод. конф. (15 - 17 ноября 2006., Нижний Новгород). - Нижний Новгород, 2006. - С. 193195.
9. Юшкова, Е. И. Применение метода ВЭЖХ для определения степени созревания гуминовых веществ в процессе вермикомпостирования [Текст] / Е. И. Юшкова // Аналитика России : материалы II Всерос. конф. по аналитической химии с международным участием. - Краснодар, 2007. -С. 68.
10. Юшкова, Е. И. Выделение, фракционирование и исследование некоторых физико-химических свойств методом ВЭЖХ гумусовых кислот полученных на основе вермикомпоста [Текст] / Е. И. Юшкова // Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях: Всероссийский симпозиум: (К юбилею проф. О. Г. Ларионова) (23 - 27 апреля 2007., Москва). - Москва, 2007. - С. 95.
П.Юшкова, Е. И. Перспективы использования вермикультуры для утилизации осадков сточных вод [Текст] / Е. И. Юшкова // Инновационные технологии обеспечения безопасности питания и окружающей среды : материалы Всерос. науч.-практ. конф. (22 - 23 мая 2007., Оренбург). - Оренбург, 2007. - С. 460^61.
12. Юшкова, Е. И. Выделение и сравнительное исследование протеолитической активности экстрактов биогумуса [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская, А. Н. Даниленко, Н. И. Ботуз // Вермикомпостирование и вермикультивирование как основа экологического земледелия в XXI веке: проблемы, перспективы, достижения : сб. науч. тр. Междунар. науч.-практ. конф. ведущих специалистов, ученых, предпринимателей и производственников (4-8 июня 2007., Минск). - Минск, 2007. - С. 71-72.
13.Юшкова, Е. И. Определение средней молекулярной массы белков биогумуса [Текст] / Е.И. Юшкова // Актуальные проблемы модернизации химического и естественнонаучного образования : материалы 55-й Всерос. науч.-пракг. конф. химиков с междунар. участием (9 - 12 апреля 2008., Санкт-Петербург). - СПб : Изд-во РПГУ им. А. И. Герцена, 2008. -С. 282-283.
14.*Юшкова, Е. И. Исследования методом ВЭЖХ физико-химических свойств фульвокислот компостов и вермикомпостов различного происхождения [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская, А. Н. Даниленко, Н. И. Ботуз // Агрохимия. - 2008. - № 3. - С. 67-71.
15. Юшкова, Е. И. Использование метода |3С ЯМР-спектроскопии в исследовании гуминовых кислот, полученных из вермикомпостов различного срока созревания [Текст] / Е.И. Юшкова // Современные проблемы науки и образования. - 2008. - № 6. - С. 134-136.
16.Юшкова, Е. И. Зависимость термодинамических свойств разбавленных растворов гуминовых веществ от их относительной степени
ароматичности. - Орел : ГОУ ВПО «Орловский государственный университет», 2008. - 11с. Деп. в ВИНИТИ 28.11.08. № 908-В2008.
17.* Даниленко Н. А. Взаимосвязь между гидрофобностью гуминовых кислот и термодинамическими свойствами их разбавленных растворов [Текст] / А. Н. Даниленко, Е. Е. Браудо, Н. Е. Павловская, Е. И. Юшкова // Биофизика. - 2010. - №. - С.
18.Юшкова, Е. И. Хроматографическое исследование жирнокислотного состава экстрактов биогумуса [Текст] / Е. И. Юшкова // Экоаналитика-2009 : VII Всерос. конф. по анализу объектов окружающей среды (21 -27 июня 2009., Йошкар-Ола). - Йошкар-Ола, 2009. - С. 239-240.
19.Юшкова, Е. И. Оптимизация выделения гумусовых кислот методом экстракции [Текст] / Е. И. Юшкова, А. Н. Даниленко // Экоаналитика-2009 : VII Всерос. конф. по анализу объектов окружающей среды (21 -27 июня 2009., Йошкар-Ола). - Йошкар-Ола, 2009. - С. 240-241.
20.Юшкова, Е. И. Химический состав и агрохимическая характеристика биогумуса полученного на основе червя «Старатель» [Текст] / Е. И. Юшкова // Актуальные проблемы модернизации химического и естественнонаучного образования : материалы 56-й Всерос. науч.-практ. конф. химиков с междунар. участием (8 - 11 апреля 2009., Санкт-Петербург). - СПб : Изд-во РПГУ им. А. И. Герцена, 2009. - С. 344-345.
21.Юшкова, Е. И. Использование целлюлолитических и легнинолитических ферментов вермикультуры для утилизации отходов с/х производства [Текст] / Е. И. Юшкова, А. А. Таканаев // Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик : сб. трудов Всерос. науч.-практ. конф. - Курск : ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2009. - С. 98-99.
22.Юшкова, Е. И. Вермикультура как источник биологически активных соединений для фармакологии и медицины [Текст] / Е. И. Юшкова, А. А. Таканаев // Ученые записки Орловского государственного университета : науч. журн. / гл. науч. ред. Ф. С. Авдеев. - Орел : ГОУ ВПО «Орловский государственный университет», 2009. - № 2 (32). - С. 109-112. -(Естественные, технические и медицинские науки).
23.Таканаев А. А. Препараты биологической защиты растений на основе вытяжек из биогумуса [Текст] / А. А. Таканаев, Е. И. Юшкова / Ученые записки Орловского государственного университета : науч. журн. / гл. науч. ред. Ф. С. Авдеев. - Орел : ГОУ ВПО «Орловский государственный университет», 2009. - № 2 (32). - С. 112-115. - (Естественные, технические и медицинские науки).
24.Юшкова, Е. И. Влияние активного вещества биогумуса на урожай сельскохозяйственных культур [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская, Н. И. Ботуз // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. работ. - ВГУ, 2009. — Вып. 11. - С. 254-258.
25.Юшкова, Е. И. Исследование некоторых физико-химических свойств фульвокислот, выделенных из образцов биогумуса разного времени созревания [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская, А. Н. Даниленко, Н. И. Ботуз // Актуальные проблемы химии и методики ее преподавания : материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием (10 - 12 декабря 2009., Нижний Новгород). - Нижний Новгород : НГПУ, 2009. -С. 177-180.
26.*Юшкова, Е. И. Сравнительное исследование микробиологического состава компостов и вермикомпостов [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская // Естественные и технические науки. - 2010. - № 1. - С. 133— 135.
27.*Юшкова, Е. И. Испытание активного вещества биогумуса на болезнеустойчивость и урожай гороха [Текст] / Е. И. Юшкова, Г. А. Борзенкова, Н. Е. Павловская, Н. И. Ботуз // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2010. - № 10. - С.
28.*Юшкова, Е. И. Влияние биологически активного вещества биогумуса на рост, развитие и урожай картофеля [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская, Н. И. Ботуз // Сельскохозяйственная биология. - 2010. - № . -С.
29.*Павловская Н. Е. Исследование влияния гуминового комплекса вермикомпоста на ферменты антиоксидантной системы гороха [Текст] / Н. Е. Павловская, Д. Б. Бородин, Е. И. Юшкова // Агрохимия. - 2010. - № 12.-С. 50-56.
30.*Юшкова, Е. И. Исследования методом ВЭЖХ физико-химических свойств гуминовых кислот компостов и вермикомпостов разного периода созревания [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская, А. Н. Даниленко // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2010. - № 3. - С. 409418,
31. Юшкова, Е. И. Получение препарата гуминового комплекса и его влияние на развитие и продуктивность некоторых сельскохозяйственных культур [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская // Вермикомпостирование и вермикультивирование как основа экологического земледелия в XXI веке: проблемы, перспективы, достижения : сб. науч. тр. 2-й междунар. науч.-практ. конф. ведущих специалистов, ученых, предпринимателей и производственников (7 - 11 июня 2010., Минск). - Минск, 2010. - С. 180-183.
32.*Юшкова, Е. И. Изучение влияния активного вещества биогумуса на антиоксидантную систему проростков гороха [Текст] / Е. И. Юшкова, Н. Е. Павловская, Н. И. Ботуз // Вестник ВГУ. Сер. Химия. Биология. Фармация. - 2010. - № 2. - С.
33.Юшкова, Е. И. Количественное определение гумусовых кислот методом экстракции как показатель степени зрелости вермикомпостов [Текст] / Е. И. Юшкова, А. Н. Даниленко // Экстракция органических соединений :
материалы IV Междунар. конф. (20-24 сент., 2010 г., Воронеж). -Воронеж, 2010.-С. 422.
34.Юшкова, Е. И. Исследование ферментативной активности некоторых белков и пептидов, выделенных из биомассы дождевого червя Владимирский гибрид «Старатель» [Текст] / Е. И. Юшкова, А. А. Таканаев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. работ. — ВГУ, 2010. - Вып. 12. - С. 247250.
35.*Юшкова, Е. И. Влияние белков и пептидов, выделенных из биомассы дождевого червя Владимирский гибрид «Старатель» на структурную организацию мембран [Текст] / Е. И. Юшкова, А. А. Таканаев // Ученые записки Орловского государственного университета : науч. журн. / гл. науч. ред. Ф. С. Авдеев. - Орел : ГОУ ВПО «Орловский государственный университет», 2010. - № 2 (36). - С. 102-106. - (Естественные, технические и медицинские науки).
* - работы, опубликованные в изданиях, рекомендуемых ВАК (4-6, 14, 17, 26-30, 32, 35).
Выражаю глубокую и искреннюю признательность научному консультанту профессору, д.б.н. Павловской Н.Е. за неоценимый вклад в формировании теоретического фундамента данной тематики; профессору, д.б.н. Таканаеву А.А. за участие в обсуждении и рецензировании глав диссертации; ст. научному сотруднику института биохимической физики РАН им. Н.М. Эммануэля Даниленко А.Н. за помощь в проведении экспериментальных исследований химического состава биогумуса; к.с.х.н. Ботуз Н.И. за сотрудничество и помощь в работе; к.с.х.н., зав. лабораторией иммунитета и защиты растений ГНУ ВНИИЗБК Борзенковой Г.А. за помощь в проведении полевых исследований.
Подписано в печать 21.09.10. Формат 60x84 V Усл. псч. л. 2,55. Тираж ] 00 экз. Заказ 2006
Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательс ко-пол и графического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3.
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Юшкова, Елена Ильинична
Сокращения и обозначения
Введение
ГЛАВА 1. Общая характеристика и методы исследования гу-миновых веществ различных природных объектов (литературный обзор)
1.1. Образование биогумуса и гумифицирующая активность как основной показатель биокомпостов
1.1.1. История возникновения вермитехнологии
1.1.2. Разведение червей, технология получения и агрохимическая характеристика вермикомпостов
1.1.3. Критерии оценки степени завершенность гумификации
1.1.4. Микробиологическая характеристика вермикомпостов
1.1.5. Ферментативная активность вермикомпостов
1.2. Гуминовые вещества: состав, функции, значение
1.2.1. Общая характеристика гуминовых веществ
1.2.2. Современные представления о составе гуминовых веществ
1.2.3. Функции гуминовых веществ в почвенных экосистемах
1.2.4. Физиолого-биохимическая характеристика гуминовых веществ
1.2.5.Использование биологически активных гуминовых веществ в медицине
1.3. Химический состав гумусовых кислот
1.3.1. Элементарный состав '
1.3.2. Функциональный состав
1.3.3. Физико-химические методы исследования углеродного скелета гумусовых кислот
1.3.4. 13СЯМР -спектроскопия в исследовании структурно-группового состава гумусовых кислот
1.3.5. Попытки построения блок-схем и структурных формул гумусовых кислот
ГЛАВА 2. Методики получения препаратов .биогумуса и гумусовых кислот. Объекты и методы исследования
2.1. Технология получения биогумуса
2.2. Методики определения агрохимических и микробиологических характеристик биогумуса ЮЗ
2.3'. Методики выделения и исследования гумусовых кислот
2.3.1. Методика получения экстрактов биогумуса
2.3.2. Методика определения концентрации сухих веществ в экстрактах биогумуса
2.3.3. Методика определения протеолитической активности'экстрактов биогумуса
2.3.4. Методика определения амшолитической активности экстрактов биогумуса
2.3.5. Методика выделения• гуминовых кислот и фулъво-кислот
2.3.6. Методика выделения гиматомелановых кислот
2.4. Физико-химические исследования экстрактов биогумуса и растворов гумусовых кислот
2.4.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
2.4.2. Гель-хроматография
2.4.3. Газожидкостная хроматография в исследовании жирнокислотного состава компостов и вермикомпостов
2.4.4. Спектроскопический анализ
2.4.5. "С ЯМР — спектроскопия
2.4.6. Дифференциальная сканирующая микрокаллори-метрия
2.5. Методики определения активности ферментов в образцах почвы, вермикомпостов (компостов) и растений
2.5.1. Методика определения каталазы
2.5.2. Методика определения пероксидазной активности почвы
2.5.3. Методика определения пероксидазной активности растений
2.5.4. Методика определения активности супероксид-дисмутазы в растениях
2.6. Методика извлечения биологически активных веществ из компостов и вермикомпостов
2.7. Полевые эксперименты
2.8. Описание сортов сельскохозяйственных культур, используемых в эксперименте
ГЛАВА 3. Исследование состава водных и спиртовых экстрактов биогумуса
3.1. Исследование агрохимического состава компостов и вермикомпостов, полученных на основе червя «Старатель»
3.2. Сравнительный анализ микробиологических свойств компостов и вермикомпостов
3.3. Исследование динамики экстрагирования образцов компоста и вермикомпостов'
3.4. Определение содержания сухих веществ- в экстрактах компоста ивермикомпостов
3.5. Хроматографическое исследование экстрактов<компоста^ и вермикомпостов
3.5.1. Исследование экстрактов компоста и вермикомпостов методом ВЭЖХ 130?
3.5.2. Исследование экстрактов компоста и вермикомпостов методом гель-фильтрации
3.6. Определение средней молекулярной массы белков биогумуса методом гель-фильтрации
3.7. Хроматографическое исследование жирнокислотного состава экстрактов биогумуса и компоста
3.8. Ферментативная активность экстрактов биогумуса
3.8.1. Протеолитическая активность экстрактов биогумуса
3.8.2. Амиллолитическая активность экстрактов биогумуса
ГЛАВА 4. Выделение и сравнительное исследование физико-химических свойств гумусовых кислот методами ВЭЖХ и спек-трофотометрии
4.1. Выделение и физико-химические характеристики гуминовых кислот
4.2. Некоторые особенности аппаратуры ВЭЖХ при идентификации компонентов разделяемой смеси
4.2.1. Спектрофотометрический детектор
4.2.2. Изократический и градиентный режимы элюирования
4.2.3. Качественный анализ (идентификация)
4.3. Идентификация и определения ароматичности с помощью спектральных отношений 158 4.3.1. Зависимость погрешности спектральных отношений хроматографическюс пиков от соотношения сигнал/шум при многоволновом спектрофотометрическом детектировании в высокоэффективной жидкостной хроматографии
4.4. Получение хроматографических и спектральных характеристик гуминовых кислот
4.5. Выделение и физико-химические характеристики фуль-вокислот
4.6. Получение хроматографических и спектральных характеристик фульвокислот
4.7. Оптимизация выделения гуминовых кислот
4.8. ; Выделение гиматомелановых кислот и их хроматографические и спектральные характеристики ' 190'
4.9. Сравнительное исследование гуминовых кислот и фуль-• вокислот, выделешшх из компостов и вермикомпостов различного происхождениям
ГЛАВА 5. Термодинамические;свойства гуминовых веществ
5.1. Зависимость термодинамических свойств» разбавленных растворов гуминовых веществ от их относительной степени ароматичности
5.2. Термодинамические свойства растворов гуминовых кислот полученных из вермикомпостов различной степени зрелости
5.3. Термодинамические свойства растворов гуминовых кислот полученных из вермикомпостов разного срока созревания
5.4. Исследование методом: С ЯМР-спектроскопии гуминовых кислот выделенных из компостов и вермикмпостов разного срока созревания*
ГЛАВА 6. Биологическая активность гуминового комплекса 240 вермикомпоста
6.1. Сравнительный анализ ферментативной активности почв, компостов и вермикомпостов
6.2. Влияние гуминового комплекса на активность ферментов в проростках гороха
6.2.1. Изучение влияния гуминового комплекса на активность пероксидазы и каталазы сортов гороха «Норд» и «Орпела» (2004-2006 г г.)
6.2.2. Изучение влияния гуминового комплекса на активность пероксидазы, каталазы и супероксиддисмутазы сортов гороха «Норд» и «Батрак» (2007-2008 г.г.)
6.3. Влияние гуминового комплекса на устойчивость к биотическим факторам и продуктивность сельскохозяйственных растений
6.3.1. Вредители и болезни гороха, как фактор снижающий урожайность
6.3.2. Испытание влияния препарата гуминового комплекса на болезнеустойчивость и поражение вредителями на сортах гороха с разной степенью устойчивости
6.3.3. Испытание влияния препарата гуминового комплекса на развитие и урожай сельскохозяйственных культур
Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологическая активность гуминового комплекса различного происхождения и его влияние на рост и развитие растений"
Гумификация является важным процессом, протекающим при компостировании и вермикомпостировании органических веществ, при котором гуминовые вещества образуются из органического материала. В процессе компостирования возрастает содержание гуминовых веществ от общей массы сухих веществ или от содержания в компосте органических веществ. Следует отметить, что гумусовые вещества, формирующиеся при участии вермикуль-туры, отличаются по химическому составу от того гумуса, который образуется в почве при участии только микрофлоры.
Основной частью гумуса являются гумусовые кислоты (гуминовые кислоты, фульвокислоты, гиматомелановые кислоты). Гумусовые кислоты являются аккумуляторами органического вещества почвы — аминокислот, углеводов, пигментов, биологически активных веществ. Кроме того^ в гумусовых кислотах концентрируются ценные неорганические компоненты — элементы минерального питания (азот, фосфор, калий), а также микроэлементы (железо, цинк, медь, марганец, бор, молибден и т.д.) [4,43, 108, 157, 248].
Многочисленными исследованиями установлено стимулирующее действие гуминовых веществ, особенно гуминовых кислот и их солей, на рост и развитие растений, повышение их устойчивости к неблагоприятным факторам окружающей среды, стимулирование прорастания семян, повышение продуктивности крупного рогатого скота и птицы [78, 79, 139,140].
Гуминовые кислоты, являясь составной частью объектов природного происхождения, находят самостоятельное применение в медицинской практике, фармации, косметологии. Гуминовые кислоты используются в составе средств, повышающих сопротивляемость организма к действию различных неблагоприятных факторов. Препараты из гуминовых кислот имеют высокую антибактериальную активность и противовирусные свойства. Существует обширная литература об антитоксической функции гуматов. Биостимулирующий эффект гуминовых кислот существенно ускоряет заживление ран. 8
Более того, было показано, что некоторые препараты гуминовых веществ сдерживают развитие злокачественных опухолей, повышают устойчивость организма к различного рода воспалительным процессам [153].
Гуматы рекомендуются для лечения метаболических нарушений в пищеварительной системе, при этом отмечается отсутствие побочных эффектов и полное выведение препарата из организма, что особенно ценно в педиатрической клинике.
Антиоксидантные свойства и гипоаллергенность делают перспективным включение гуминовых кислот и гуматов в состав косметических кремов и мазей. Отрабатываются технологии их включения в липосомные и другие средства. Создание оригинальных фармакотерапевтических препаратов с биостимул ирующими и репаративными свойствами, средств для косметологии на основе гуминовых и гуминоподобных веществ, остается актуальным направлением исследований [153, 214, 234, 422].
Особого внимания заслуживают адаптогенные свойства гуминовых веществ, обусловленные их способностью связывать радионуклеиды, ионы тяжелых металлов, разрушать пестициды по истечении срока их действия, облегчать и ускорять процесс детоксикации культурных растений.
Для получения гуминовых препаратов необходимо наличие биогумуса — первоисточника биологически активных веществ. Однако производство и практическое использование вермикомпостов осуществляется во многих случаях без достаточного научно-технического обеспечения, без надлежащего агрохимического и санитарно-гигиенического контроля. Отечественная научно-исследовательская работа в этом направлении находится на начальном этапе развития, этапе накопления экспериментального материала.
Указанная ситуация определяет актуальность постановки систематических исследований по изучению состава, строения и свойств гуминовых веществ, входящих в состав биогумуса.
Цель настоящей работы состояла в разработке общей методологии сравнительного анализа физико-химических свойств гумусовых кислот, по9 зволяющего оценить степень завершенности процесса гумификации компо-стов и вермикомпостов, а также выделение биологически активных веществ вермикомпостов и испытание их физиолого-биохимических характеристик. В работе были поставлены следующие основные задачи:
- получить биогумус из разных видов компостов;
- адаптировать существующие или разработать новые методики анализа для получения достоверных данных о составе, физико-химических и биологических характеристиках вермикомпостов;
- выделить, фракционировать и исследовать некоторые физико-химические свойства гумусовых кислот;
- провести сравнительное исследование гумусовых кислот, полученных из вермикомпостов различного происхождения;
- выделить биологически активные вещества вермикомпоста и испытать их действие на устойчивость к биоте и хозяйственно-ценные показатели сельскохозяйственных культур.
Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Юшкова, Елена Ильинична
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ
1. Получен вермикомпост (биогумус) на основе отечественного гибрида дождевого червя «Старатель» из разных видов компостов;
2. Освоена методика выделения гумусовых кислот. Разработана и применена одноступенчатая оптимизированная методика выделения гумусовых кислот. Разработан и применен метод ВЭЖХ в обращенных фазах дляхроматографической характеристики ГК, ФК, ГМК.
3. Определен ключевой показатель оценки скорости биоконверсии органических субстратов и степени зрелости вермикомпостов - соотношение С/Ы: оно снижается от 22,1 — в компосте до 13,7, 17,8 в зимнем и летнем образцах биогумуса соответственно.
4. На основании систематических исследований установлены закономерности изменения микробиологической и ферментативной активности ком-постов и вермикомпостов: в процессе созревания вермикомпост обогащается грибами-антагонистами (7Уюкойегта), приобретая свойства оздоравливающего действия;
- аммонифицирующая активность в образцах вермикомпостов значительно повышается по сравнению с компостом в 2,6 и 1,8 раз соответственно для летнего и зимнего образцов;
- нитрифицирующая активность снижается: от 19,2 мг в компосте до 17,8 и 17,6 - в летнем и зимнем образцах вермикомпостов;
- препараты зимних образцов биогумуса обладают более высокой проте-олитической активностью, чем препараты летнего, образцы компоста, не обработанного червями, не обладают протеолитической активностью;
- амилолитической активности обнаружить не удалось ни в одном из образцов. е
5. Методом гель-хроматографии определены молекулярные массы белков биогумуса («27 кДа) и жирнокислотный состав в исследованных препаратах. Показано,.что содержание жирных кислот в препаратах биогумуса выше, чем в препарате, не обработанном,червями (контроль).
6. На основании исследований и анализа экспериментальных данных можно заключить, что
- влагоудерживающая способность вермикомпостов по- сравнению с компостами возрастает;
- с ростом степени гумификации экстрагируемость гумусовых веществ снижается;
- удельная ароматичность суммарных фракций ГК (гидрофильной и гидрофобной) возрастет;
- удельная ароматичность суммарных фракций ФК возрастет, наблюдается существенный рост ароматичности гидрофильной фракции ФК, содержащей малополярные заместители в молекулах;
- предпочтительным спиртом для экстракции ГМК является этанол; в исследованных образцах гумусовых кислот содержится около 20%^Ду) ГМК;
- относительная степень ароматичности ГМК в процессе гумификации не изменяется;
- с ростом степени гумификации наблюдается снижение содержания карбоксильных, карбонильных и фенольных групп в ГМК.
7. Исследования вермикомпостов, полученных из разных субстратов показали, что процессы вермикомпостирования для различных компостов различаются как по интенсивности гумификации (различия в приросте удельной ароматичности суммарных фракций), так и по механизмам гумификации (различия в приросте гидрофильной и гидрофобной фракций);
8. Исследования методом сканирующей микрокалориметрии показали, что ГК в разбавленных водных растворах находятся в виде «мицелл» и содержат две фракции гидрофильную и гидрофобную; в.процессе верми-компостирования содержание гидрофобной фракции увеличивается и возрастает ее алифатичность.
1 "X
9. Метод С ЯМР-спектроскопии показал, что исследованные препараты ГК разного срока созревания различаются по соотношению ароматических и углеводных фрагментов, входящих в состав углеродного скелета. Были идентифицированы и количественно определены следующие функциональные группы и молекулярные фрагменты: ароматические (Ar), карбоксильные (-СООН), карбонильные (-С=0), алкильные (Alk), О-замещенные алифатические атомы углерода (Alk-O).
10. Разработана общая методология контроля степени гумификации с помощью: а) метода ВЭЖХ, используя как критерий относительную суммарную ароматичность ГВ; б) метода сканирующей микроколориметрии, используя как критерий разность теплоемкостей, температуру и температурные интервалы перехода разрушения мицелл ГВ.
11. Разработана методика выделения экстрактов и вытяжек из биогумуса, получения препарата гуминового комплекса. Показано положительное влияние гуминового комплекса на иммунную систему с/х растений, что значительно усиливает устойчивость растений к биотическим факторам и повышает урожайность.
12. На основании систематических исследований в полевых и лабораторных условиях выявлена биологическая активность и сортоспецифичность препарата гуминового комплекса, что дает возможность разработки биологически активных фитоиммуномодуляторов. г
Предложения по практическому использованию результатов исследований
1. На основе водорастворимой фракции гумусовых соединений, полученных из вермикомпоста на основе червя «Старатель», перспективно создание нового класса иммуномодуляторов, стимуляторов роста и развития растений.
2. Гуминовый комплекс, полученный путем щелочной экстракции из вермикомпостов, может быть рекомендован в качестве компонента питательных сред для культивирования зародышей с целью селекции новых сортов.
ЭКОНОМИЧЕСКАЯ 0ЦЕНКА5РЕЗУЦ1ЬТ^ТОВ?ИССЛЩОВМ1ИШ
Широкое: использование в сельскохозяйственном-! производстве: вермит компостов (бйо1умуса), несомненно, будет способствовать оздоровлению окружающей среды, снижению применения химических средств защиты растет ний, повышению? урожайности« и устойчивости к болезням и вредителей сельскохозяйственных культур- и- получению; экологически; безопасной пищевой продукции.
Предварительные расчеты показали, чтошроизводство биогумуса, приготовление на его основе раствора^ обработка семян, опрыскивание посевов экономически выгодно в связи с повышением1 урожайности сельскохозяйственных культур и исключением химических средств защиты.
В качестве контрольного варианта была взята; технология- возделывания гороха без обработки, против болезней и вредителей и технология возделывания гороха с использованием предпосевной обработки семян и двукратной внекорневой обработки растений гороха биопрепаратом гуминового комплекса на основе копролитов дождевого червя «Старатель» в: концентрации 1,5-10 ~4 %. Прибавка к урожайности составила 12,6 ц/га по сравнению с контролем. Валовой сбор основной продукции в контрольном варианте составил 137 т., в опытном - 263т., что дает возможность снижения себестоимости на 1442,1 руб. на 1т. основной продукции (в ценах 2007 года).
Прибыль от внедрения подобной разработки в сельскохозяйственное производство может составить 12323,07 рублей на гектар посевов бобовых культур (в ценах 2007 года).
Из проведенного выше анализа экономической эффективности контроля и исследуемых вариантов можно сделать вывод, что обработка семян и опрыскивание посевов вытяжкой из биогумуса экономически выгодно.
ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ
Автор выражает глубокую и искреннюю признательность научному консультанту профессору, д.б.н. Павловской Н.Е. за неоценимый вклад в формировании теоретического фундамента данной тематики; профессору, д.б.н. Таканаеву A.A. за участие в обсуждении и рецензировании глав диссертации; ст. научному сотруднику института биохимической физики РАН им. Н.М. Эммануэля Даниленко А.Н. за помощь в проведении экспериментальных исследований химического состава биогумуса; к.с.х.н. Ботуз Н.И. за сотрудничество и помощь в работе; к.с.х.н., зав. лабораторией иммунитета и защиты растений ГНУ ВНИИЗБК Борзенковой Г.А. за помощь в проведении полевых исследований.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выполненный комплекс исследований по выделению гумусовых кислот, изучению их физико-химических и физиолого-биохимических свойств- позволяет оценить вермикомпостирование не только с точки зрения-хозяйственного использования, но и как уникальный источник получения биологически' активных веществ. Реализация данного подхода на практике требует контроля за важнейшими физико-химическими и*биологическими параметрами на каждом из основных этапов вермикомпостирования.
Объективная оценка степени зрелости вермикомпостов и завершенности процесса гумификации, в настоящее время, требует использования различных критериев, основанных на содержании гуминовых веществ и закономерностях изменения их физико-химических и биологических свойств. Получение необходимой аналитической информации требует привлечения широкого спектра
13 инструментальных методов анализа (гель-хроматографии, ВЭЖХ, С-ЯМР-спектроскопии, микрокалориметрии и др.). Проблемы, обусловленные специфическим строением, отсутствием регулярной структуры молекул гумусовых кислот и в связи с этим, отсутствием стандартов, потребовали модификации" существующих или создания новых методик анализа.
Комплексный анализ гумусовых веществ позволил сопоставить информацию, полученную разными методами и провести сравнительную оценку свойств гумусовых кислот, полученных из вермикомпостов различного происхождения, различного периода созревания и разного времени компостирования.
Опираясь на результаты проведенных исследований, была доказана и объяснена, с точки зрения биохимических процессов, биологическая активность препарата гуминового комплекса, позволяющего повысить иммунитет сельскохозяйственных растений, что сказалось на урожайности и устойчивости последних к воздействию неблагоприятных условий внешней среды.
Появление такого рода препаратов является залогом широкого практического использования гуминовых материалов природного происхождения для создания нового класса иммуномодуляторов, стимуляторов роста и развития растений, а также БАДов и лекарственных препаратов.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Юшкова, Елена Ильинична, Орел
1. Авакумова Н.П., Катунина М.А., Криволапова М.А., Жданова А.В:, Го-лубкова М.Н. Амфифильность гумусовых кислот как фактор гомеостаза лечебных грязей. // Известия Самарского научного центра РАН. 2009: Т. 11. № 1(6). С. 1253-1255.
2. Азимов Д.А. Вермикомпостирование позволяет оздоровить почву и повысить урожай // Земледелие. 1991. № 7. С. 22-25.
3. Александрова JT.H. Изучение процессов гумификации растительных остатков и природы новообразованных гумусовых кислот и ее происхождение // Проблемы почвоведения. М.: Наука, 1978. 240 с.
4. Александрова JI.H. Органическое вещество почвы и природа его трансформации. Л.: Наука, 1980. 287 с.
5. Алиев С.А. Парамагнетизм органического вещества почв. Новосибирск: Наука, 1987. 20 с.
6. Алтунин Д.А., Титов И.Н., Шишова ТЖ, Трофимов Д.В. Применение гуминового препарата «Гумисол» под различные культуры // Достижения науки и техники АПК. 2000. № 7. С. 9-12.
7. Аммосова Я.М., Орлов Д.С., Садовникова Л.К. Почвенные липиды в системе гумусовых веществ // Сб. Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск, 1973. Т. 4. С. 39-49.
8. Андреева В.А. Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений. М.: Наука, 1988. 128 с.
9. Антонова Е.В., Иванюта Л.А., Мартынова H.A., Утенкова Т.И., Гончарова H.H., Черных H.A., Стом Д.И. Использование дождевых червей для переработки осадков сточных вод // Дождевые черви и плодородие почв:
10. Материалы 2-й,Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир,- 2004. С. 119-120.
11. Арзамазова A.B. Ферментативная активность дерново-подзолистой почвы- при, загрязнении тяжелыми' металлами и< экологические функции удобрений: Дисс. . канд. биол. наук. Mi, 2004, 130с.
12. А'смангулян A.A. Исследование соотношения интегральных и специфических реакций организма при. оценке риска> воздействия регуляторов роста растений // 2-й съезд токсикологов России: тезисы докладов. / М.: МЗ РФ, РАМН, BOOT, 2003. С. 56-57.
13. Баталкин Г.А., Кочанов М.М., Махно М.Ю. Проницаемость мембран для некоторых веществ гумусовой природы и их вклад в физиологическую активность препарата гуматов натрия. // Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. 1983. № 8. С. 117-121.
14. Берим, М.М., Вилкова Н.А Устойчивость гороха к гороховой тле в связи с содержанием в растениях веществ фенольной природы // Билл. ВИЗР. 1998. №78-79. С. 123-128.
15. Бернштейн В.А., Егоров В.М. Дифференциальная сканирующая колориметрия в физхимии полимеров. Ленинград: Химия, 1990. 256 с.
16. Билай В.В. Фузарии. Киев: Наукова думка, 1977. 441 с.
17. Бирюкова О.Н., Суханова Н.И. Характеристика органического вещества вермикомпостов // Дождевые черви и плодородие почв: Материалы 2-й Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир, 2004. С. 167-169.
18. Борзенкова Г.А., Голопятов М.Т. Физиологически активное вещество как средство повышения иммунитета гороха к корневым гнилям// Сб. докл. науч. практ. конф. Орел, 1994. 87 с.
19. Борзенкова Г. А. Обоснование экологически безопасной защиты овощного гороха от корневых гнилей: Автореф. диссканд. биол. наук / Все-:российский? научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур. СПб., 1998. 20 с.
20. Бородин Д.Б. Влияние фитоиммуномодуляторов на устойчивость к биотическим, факторам и продуктивность гороха и пшеницы: Автореф. дис. . канд. с/х. наук / Орловский государственный аграрный университет. Орел, 2009; 23 с.
21. Ботуз Н.И. Влияние вермикомпоста на урожай сельскохозяйственных культур // Регуляция продукционного процесса сельскохозяйственных растений: Материалы науч.-практ. конф. Орел, 2006. С. 412.
22. Ботуз Н.И. Физико-химическая характеристика и биологическая активность биогумуса, полученного на основе дождевого червя «Старатель»:
23. Автореф. дисканд. с/х. наук / Орловский государственный аграрныйуниверситет. Орел, 2007. 23с.
24. Бояркин А.Н. Быстрый метод определения активности пероксидазы // Биохимия. 1951. Т. 16. Вып. 4. С. 352-355.
25. Бояркин А.Н. Биохимия. М.: Наука, 1981. 352 с.
26. Бутюгин A.B., Зубкова Ю.Н: О компонентах стимулирующего комплекса природных гуминовых веществ // Дождевые черви и,плодородие почв: Материалы 2-й Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир, 2004. С. 262-263.
27. Варшал Г.М., Велюханова Т.К., Сироткина И.С. // Гидрохимия материалы. 1973. №59. С. 143-151.
28. Варшал Г.М., Кощеева И.Я., Сироткина И.С. // Геохимия. 1979. № 4. С. 598-607.
29. Варшал Г.М., Буачидзе Н.С. // Ж. Аналит. Химии. 1983. № 38 (12). С. 2155-2167.
30. Варшал Г.М.: Дисс. . докт. биол. наук. М., 1994.
31. Вахмистров Д.Б., Зверкова O.A., Дебеец С.Ю., Мишустина Н.Е. Гумино-вые кислоты: связь между поверхностной активностью и стимуляцией роста растений. // Доклады АН СССР. 1987. Т. 293. № 5. С. 1277-1280.
32. Верещагин А.Л., Куцый В.А., Антонова О.И. Применение гуминовых кислот и их производных // Сб. тез. докл. 55-й науч.-техн. конф. АлтГТУ. Ч. 1. Барнаул, 1997. С. 126-128.
33. Вигоров А.И. Особенности каталазы подзолистой почвы. // Доклады АН СССР. 1958. Т. 122. № 6. С. 1107-1110.
34. Влияние вермикультуры и биогумуса на плодородие почвы и развитие растений // ООО НЛП «Биотехнология» biotehnologya.narod.ru (дата обращения 3.12.2009).
35. Галстян А.Ш. Унификация методов определения активности ферментов почвы // Почвоведение. 1978. № 2. С. 107-114.
36. Гайнулин P.M. Влияние биогумуса на агрохимические свойства серой« лесной почв предкамья. // Агрохимический вестник. 2002. № 6. С. 20-21.
37. Глебова F.H. Гиматомелановые кислоты почв и их место в системе гумусовых кислот: Дис. . канд. биол. наук. М., 1980.
38. Гоготов И.Н. Роль биоудобрений в плодородии // Ин-т фундаментальных проблем биологии РАН. М., 2004.
39. Горовая А.И., Орлов Д.С., Щербенко О.В. Гуминовые вещества. Строение, функции, механизм действия, протекторные" свойства, экологическая роль. Киев: Наукова думка, 1995. 304sс.
40. Городний, Н.М., Ковалёв В.К. Вермикультура и её эффективность. Киев: Наукова Думка, 1990. С. 22.
41. ГОСТ 17644-83. Торф. Методы отбора проб из залежи и обработки их для лабораторных испытаний. Введ. 08.04.83. М;, 1983. 21 с.
42. Гостищева М.В. Химико-фармацевтическое исследование нативных гуми-новых кислот торфов Томской области: Автореф. дисс. . канд. фарм. наук. Пермь, 2008.
43. Григорьева Е.А., Кухаренко Т.А. // Методы анализа и контроля производства в химической промышленности. 1968. Т. 13. С. 10.
44. Даниленко А;Н>, Браудо Е.Е., Павловская Н!Е., Юшкова'Е.И. Взаимосвязь между гидрофобностью гуминовых кислот и термадинамическими свойствами их разбавленных растворов // Биофизика. 2010. № . С.
45. Данченко Н.Н. Функциональный состав гумусовых кислот, определение и взаимосвязь с реакционной способностью: Дисс. . канд. хим. наук. Москва, 1997. 138 с.
46. Девятова Т.А., Щеглов Д.И., Щербаков А.П., Артюхов В.Г. Агрогенная трансформация черноземов центра Русской, равнины // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2004. № 2. С. 128-134.
47. Деревягин В А. и др. Переработка органического сырья // Химизация сельского хозяйства. 1989. № 7. С. 25-27.
48. Дмитриев А.П. Сигнальные молекулы растений для активации защитных реакций в ответ на биотический стресс // Физиология растений. 2003. т. 50. №3. С. 465-474.
49. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта: с основами статистической обработки результатов исследования. М.: Агропромиздат, 1985. 352 с.
50. Духанина И.Я., Верещагин A.JL, Егорова Е.Ю., Степанова Н.В. Влияние состава экстрактов торфа и биогумуса на их физиологическую активность // Химия растительного сырья. 1998. № 4. С. 47-51.
51. Дьяков Ю.М., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология: уч. пособие. М.: Общество фитопатоло-гов, 2001. 298 с.
52. Дьяков Ю.Т., Багирова С.Ф. Что общего^ в иммунитете растений и животных? //Природа. 2001. № 11. С. 1-10.
53. Ежов Г.И. Руководство к практическим занятиям по сельскохозяйственной микробиологии. М.: Высш. шк., 2001.
54. Емельянова И.М., Прокопович H.A. Субстраты для получения биогумуса // Земледелие. 2000. № 3. С. 28-29.
55. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений. М.: Аг-ропромиздат, 1987. 163 с.
56. Ермаков Е.И., Попов А.И. Аспекты управления круговоротом органического вещества в системе почва-растение // Вестник РАСХН. 2001. № 1.
57. Ермаков Е.И., Ктиторова И.Н. Влияние гумусовых кислот на механические свойства клеточных стенок // Физиология растений. 2000. Т. 41. № 4.
58. Жоробекова Ш.Ж., Кудралиева К.А. Ингибирование протеолитической ферментативной активности гуминовой кислотой // Биологические науки. 1991. № 10.,С. 151-154.
59. Жученко A.A. Адаптивное растениеводство (эколого-генетические основы). Кишинев: Штиница, 1990.
60. Зауралов O.A., Колмыкова Т.С., Лукатин A.C. Влияние продолжительности предпосевной обработки семян регуляторами роста на прорастание исодержание в них фитогормонов // Сельскохозяйственная биология. 1997. № 1.С. 80-84.
61. Зайдельман Ф.Р. Процесс глееобразования и его роль в формировании почв. М.: Изд-во МГУ, 1998. 316 с.
62. Зайдельман Ф.Р., Данилова Г.А. Влияние глееобразования на содержание липидов, хлорофилла, зеленого пигмента и углеводов в дерново-подзолистых почвах // Науч. докл. высш. школы: Биол. науки. 1989. № 3. С. 101-105.
63. Звягинцев Д.Г. Микрофлора и охрана почв. М.: Наука, 1989. 206 с.
64. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: МГУ, 1991.304 с.
65. Зотиков В.И., Голопятов М.Т., Борзенкова Г.А. Перспективная ресурсосберегающая технология производства гороха : методические рекомендации. М.: ФГНУ «Росинфрмагротех», 2009. С.25-47.
66. Зубкова Т.А., Карпачевский JI.O. Каталитическая активность почвы // Почвоведение. 1979. № 6. С. 115-121.
67. Иванов Е.М., Юбицкая Н.С. Способ реабилитации больных остеоартро-зом: пат. РФ RU(11)2160079(13) С2; опубликован 12.10.2000.
68. Иванова Р.Г. Гуминовые удобрения резерв повышения урожайности // Сельскохозяйственные вести. 2001. № 1. С.21.
69. Игонин A.M. Живая пашня // Природа и человек. 1988. № 10. С. 2-4.
70. Игонин A.M. Полю поможет биотехнология // Земля и люди: еженед. приложение к газете «Сельская жизнь». 1990. С .4-6.
71. Игонин A.M. Биопереработка навоза с помощью технологии дождевых червей // Международный агропромышленный журнал. 1991. № 5. С. 100-104.
72. Игонин A.M. Вермикомпост. Свойства и назначение // Земля России. 1992. № 5. С. 38-39.
73. Игонин A.M., Титов И.Н. Черви гумус - урожай // Дождевые черви и плодородие почв: Материалы 2-й Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир, 2004. С. 223-229.
74. Игонин А.М. Дождевые черви: как повысить плодородие почв в десятки раз, используя дождевого червя-«старателя». Ковров: ООО НПО «Маш-текс», 2002. 192 с.
75. Игонин A.M. Дождевые черви и плодородие почв. Владимир: ОАО МНПК «ПИКъ», 2004. 147 с.
76. Ищенко A.B. Фульвокислоты: свойства и биологическая активность // -Дождевые черви и плодородие почв: Материалы 2-й Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир, 2004. С. 264-265.
77. Кантерина Н.Ф. Защита гороха от вредителей и болезней экологически безопасными методами (в условиях ЦЧО): региональные рекомендации / под ред. М.С. Соколова. Пущино, 1995. С. 160-162.
78. Карташов A.B., Радюкина A.B., Иванов Ю.В. Роль систем антиоксидант-ной защиты при адаптации дикорастущих видов растений к солевому стрессу // Физиология растений. 2008. Т. 55. № 4. С. 516-522.
79. Касатиков В.Е., Кравченко М.Е. Эффективность вермикомпоста на основе навоза КРС при внесении под полевые культуры // Химия в с/х. 1994. № 4. С. 21-23.
80. Кирейчева JI.B., Хохлова О.Б. Сапропели: состав, свойства, применение. М.: Рома, 1998. 120 с.
81. Кирик, H.H. Методика оценки устойчивости гороха к фузариозу // Селекция и семеноводство. 1973. №2. С. 36-37.
82. Кирсо У.Э., Стом Д.И., Белых Л.И., Ирха Н.И. Превращение канцерогенных веществ в гидросфере. Талин: Валгус, 1988. 214 с.
83. Клив А.Э., Норман К.А. Вермикомпосты могут подавлять насекомых -вредителей и развитие болезней // Дождевые черви и плодородие почв: Материалы 2-й Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир, 2004. С. 219-221.
84. Ковалев В.М. Новое в применяемых в сельском хозяйстве технологиях // Вестник РАСХН. 2001. № 3.
85. Ковалёв В.М., Янина М.М. Методологические принципы и способы применения росторегулирующих препаратов нового поколения в растениеводстве // Аграрная Россия. 1999. № 1(2). С. 9-12.
86. Когут Б.М. Трансформация гумусового состояния черноземов при их сельскохозяйственном использовании: Автореф. дисс. . док. с-х. наук / М., 1996.
87. Козырева Ф.У., Семенова В.В., Сидорин Г.И. Критерии безопасности биологически активных веществ и проблемы их гигиенического регламентирования // 2-й съезд токсикологов России: тезисы докладов. М.: МЗ РФ, РАМН, BOOT, 2003. С. 133-134.
88. ЮО.Колупаев Ю.Е., Карпец Ю.В. Активность супероксиддисмутазы и ката-лазы в колеоптилях пшеницы при действии пероксида водорода и нагрев // Физиология и биохимия культурных растений. 2007. Т. 39. № 4. С. 319-325.
89. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. Структурная схема и моделирование макромолекул гуминовых кислот // Научные труды Тюменского СХИ. 1971. Т. 14. С. 125-131.
90. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. Молекулярная структура и реакционная способность гуминовых кислот // Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993. С. 36-43.
91. Конин С. С. Вермикультура и основные этапы ее развития // Хронометр. Владимир, 2003. №13.
92. Конин С.С. Альтернативы биогумусу нет // Знамя труда. 2003. № 43.
93. Конин С.С. Вермикультура и бизнес // Дождевые черви и плодородие почв: Материалы 2-й Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир, 2004. С. 138.
94. Конин С. С. Как надо хозяйствовать на земле // Пикъ ИНФо. 2005. № 3. С. 2.
95. Кононова М.М., Бельчикова Н.П. Ускоренные методы определения состава гумуса//Почвоведение. 1961. № 10. С. 75-87.
96. Кононова М.М. Органическое вещество почвы, его природа, свойства и методы изучения. М.: МГУ, 1963. 15 с.
97. Конин С.С. Мечта человечества стать реальностью // Пикъ ИНФо. 2005. №3 спецвыпуск. С. 2.
98. Коршун М.О., Гельман Н.Э. // Новые методы элементарного анализа. М.-Л.: Госхимиздат, 1949. С. 19-25.
99. Косолапов И.А. Эффект переработки органических отходов с помощью червей // Экономика сельского хозяйства России. 1994. № 12. С. 1 2.
100. Котов В.В., Стекольников К.Е., Ткаченко C.B., Гридяева Е.С., Селеменов В.Ф., Карпов С.И. Фульвокислоты чернозема выщелоченного // Сорбци-онные и хроматографические методы. 2006. Т. 6. в. 5. С. 722-731.
101. Котова В.В. Корневые гнили зернобобовых культур. Л.: Агропромиздат, 1986. 91с.
102. Кощаев А.Г. Способ получения комбинированного бактериального удобрения?// пат. RU2286974; опубл. 12.06.2004.
103. Кравец А.Ф. Участие фенолов и пероксидаз в проявлении защитных реакций к возбудителю бурой ржавчины // Автореф. дис. . канд. биол. наук/КГУ. Киев, 1979. 20 с.
104. Кулик А.Ф: Горовая А.И. // Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. 1980. № 7. С. 151-158.
105. Куликова H.A. Связывающие и детоксицирующие свойства гумусовых кислот по отношению к атразину: Дис. . канд. биол. наук, М., 1999.
106. Курбатов И.М., Двойняшникова Е.И. Каталазная активность как показатель общей биологической активности почв // Сборник докладов симпозиума по ферментам почвы. Минск, 1968. С. 100-107.
107. Купревич В.Ф. Щербакова Т.А. Почвенная энзимология. Минск, 1966. 275 с.
108. Кухаренко Т.А. О молекулярной структуре гуминовых кислот / В сб. Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993. С. 28-35.
109. Линник П.Н., Набиванец Б.И. Формы миграции металлов в пресных поверхностных водах. Л.: Гидрометиздат, 1986. 268 с.
110. Логинов Л.Ф., Комисаров И.Д. / В кн.: Гуминовые препараты. Тюменский с-х институт. Научные труды. XIV, 1971. 226 с.
111. Лодыгин Е.Д. Строение липидной фракции гумуса подзолистых и тор-фяно-подзолистых почв // Почвоведение. 2003. № 1. С. 48-52.
112. Лодыгин Е.Д., Безносиков В.А. Особенности строения гумусовых веществ подзолистых и болотно-подзолистых почв // Почвоведение. 1998. №9.
113. Лодыгин Е.Д., Безносиков В.А. Изучение полидисперсности гумусовых веществ методом гель-хроматографии // Вестник института биологии Коми НЦ УрО РАН. 2007. № 9. С. 29-33.
114. Лотош Т.Д. Экспериментальные основы и перспективы использования препаратов гуминовых кислот из торфа в медицине и сельскохозяйственном производстве // Биологические науки. 1991. № 10. С. 99-103'.
115. Лунева A.C. Гумусное состояние и коллоидно-химические свойства гуминовых веществ почв Европейской части СНГ, развитых на карбонатных породах: Диссканд с-х. наук. С-Петербург, 2005. 133 с.
116. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1989.456 с.
117. Максимова С.Л. Фауна дождевых червей (Oligochaeta, lumbricidae) в Бе-лору си //' Дождевые черви и плодородие почв: Материалы 2-й Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир, 2004. С. 44-46.
118. Машковский М.Д., Южаков С.Д. Словарь-справочник лекарственных средств. М.: Новая Волна, 2002. 608 с.
119. Медведев C.B., Медведева Е.А. Эффективность биогумуса и гуминовых препаратов на комнатных растениях // Arpo XXI. 2004. № 1. С. 1-3.
120. Мельник И.А., Карпец И.П. Вермикультура и её продукт биогумус // Химизация с/х. 1990. № 10. С. 14-17.
121. Мельник И.А., Ковалев В.В. Влияние вермикультуры и вермикомпоста на плодородие почвы и развитие растений // Защита растений. 1991. № 1. С. 13-14.
122. Мельник И.А., Карпец И.П. Ещё раз о вермикультуре // Химизация с/х.1991. №5. С 73-75.
123. Мельник И.А., Ковалев В.В. Применение вермикомпоста в качестве удобрения под лён // Биоконверсия органических отходов народного хозяйства и охрана окружающей среды: Тез. докл. 2 Международного конгресса. Ивано-Франковск, 1992. С. 6.
124. Мельник И.А., Карпец И.П. Вермикультура и ее продукт биогумус. // Сахарная свекла. 1992. № 1. С. 36-40.
125. Мельник И.А. Биогумус и урожай овощей. // Химия в с/х. 1994. № 4. С. 15-16.
126. Мельник И.А. Вермикультура — новое мощное средство оздоровления окружающей среды и получения чистой сельхозпродукции. // Зерновые культуры. 1997. № 4. С. 9-11.
127. Мерзлая Г.Е., Шорев Ю.Б., Данилкина B.C. Эффективность вермиком-постов // Тез. докл. 2 Международного конгресса. Ивано-Франковск, 1992. С. 61-62.
128. Мерзлая Г.Е., Мишунина О.Л., Паничкина O.JI. Положительное действие биогумуса на дерново-подзолистой почве при выращивании кукурузы // Доклады РАСХИ. 1994. № 6. С. 19-20.
129. Мерзлая, Г.Е. Агроэкологическая эффективность традиционных и новых видов органических удобрений // Химия в с/х. 1996. № 6.,С. 23-26.
130. Мерзлая Г.Е. Методика и результаты исследований эффективности ком-постов и вермикомпостов // Дождевые черви и плодородие почв: Материалы 2-й Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир, 2004. С. 39-43.
131. Методические рекомендации ВНИИСХМ, 1987.
132. Методические указания по государственным испытаниям инсектицидов, акарицидов и молюскоцидов в растениеводстве. М.: Агропромиздат, 1986. 130 с.
133. Методические указания по государственным испытаниям. фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур. М.: Агропромиздат, 1985. 278 с.
134. Методы количественного органического элементарного микроанализа / под ред. Н.Э. Гельман. М.: Химия, 1987. 252 с.
135. МихееваР.И. Аскохитоз гороха. Л.: Колос, 1976. 121 с.
136. Национальная слава «Грин-ПИКъ» // Пикъ ИНФо. 2005. №3 (март), спецвыпуск. С. 1.15 h Озерецковская О.Л. Индуцирование устойчивости растений.// Аграрная Россия. 1999. № 1(2). С. 4-9.
137. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И. При использовании элиситоров для защиты- сельскохозяйственных растений необходима осторожность // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. №3. С. 322-325.
138. Опыт доклинического исследования вещества природного происхождения на примере вновь разработанного препарата Олипифат // под. ред.
139. B.И. Филова, A.M. Берковича. ООО «Лигфарм» НИИ онкологии им. Проф. H. Н. Петрова МЗ РФ. www.humipharm.ru (дата обращения 26.01.2009)
140. Органические удобрения: справочник / под ред. В.И. Хохлова, А.А.Егорова. М.: Агропромиздат, 1998. 207 с.
141. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв. М.: Изд-во МГУ, 1974. 333 с.
142. Орлов Д.С., Лозановская И.Н., Попов П.Д. Органическое вещество почвы и органические удобрения. М.: МГУ, 1985. 97 с.
143. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: МГУ, 1990. 325 с.
144. Орлов Д.С. Химия почв. М.: Изд-во МГУ, 1992. 259 с.
145. Орлов Д.С. Гуминовые вещества в биосфере: сборник. М.: Наука, 1993.1. C. 16-27.160; Орлов Д:С., СадовниковаШЖС, Ладанин Д®; Экономические нормативы на нетрадиционные органические удобрения // Химия в с/х. 1995. № 5. С. 12-15.
146. Орлов Д.С., Аммосова.&М;,Никифоров В^Ю;,.Рудакова'И:П: Изменение; свойств дерново-подзолистой почвы под влиянием органо-минеральных гуминсодержащих удобрений // Доклады РАСХН. 1996. № 2. С. 37-39.
147. Орлов Д.С., Бирюкова О.Н. Гуминовые вещества вермикомпостов // Агрохимия. 1996. №7. С. 60-67.
148. Орлов Д;С. Гуминовые вещества в: биосфере // Соросовский образовательный журнал. 1997. № 2. С. 56-63.
149. Орлов Д.С., Дёмин В.В., Завгородняя Ю.А. Влияние молекулярных параметров гуминовых кислот на их физиологическую активность // Докл. РАН: 1997. Т. 354. № 6. С. 843-845.
150. Павловская Н.Е., Шалимова O.A., Азарова Е.Ф., Методические рекомендации по оценке устойчивости генотипов гороха к возбудителям фузариоза и аскохитоза с помощью биохимических тестов. Орел: Орел ГАУ, 2001. 121 с.
151. Павловская* Н.Е., Зотиков В.И., Ботуз Н.И Новые, биотехнологии — на службу человеку // Физиологические аспекты продуктивности растений: Материалы науч.-метод. конф. Орел, 2004. С. 280-282.
152. Павловская Н.Е., Зотиков В.И., Борзенкова Г.А., Азарова Е.Ф., Ботуз Н.И. Индуцирование устойчивости зернобобовых культур // Защита и карантин растений. 2006. № 10. С. 22-23.
153. Павловская Н.Е., Юшкова Е.И., Даниленко А.Н., Ботуз Н.И., Полозова Е.Ю., Борзенкова Г.А. Физико-химическая характеристика и биологическая активность биогумуса. Орел: Издательство ОРАГС, 2007. 140с.
154. Павловская Н.Е., Бородин Д.Б. Влияние биологически активных веществ на антиоксидантную систему гороха // Защита и карантин растений. 2009. №8. С. 42-43.
155. ПейвеЯ.В. Биохимия почв. М.: Сельхозгиз, 1961. 422 с.
156. Перель Т.С. Дождевые черви редкие животные? // Природа. 1985. № 7. С. 24-27
157. Перминова И.В. Анализ, классификация и прогноз свойств гумусовых кисло: Дисс. . докт. хим. наук. М., 2000.
158. Перминова И.В., Анисимова М.А., Куликова H.A., Холодов В.А. Деградация почв : монография. М.: МГУ, 2002.
159. Перминова И.В. Гуминовые вещества вызов химикам XXI века // Химия и жизнь. 2008. № 1. С. 1-9.
160. Петербургский A.B. Практикум по агрономической химии. М.: Колос, 1968. 495 с.
161. Пивоваров Л.Р. О природе физиологической активности гуминовых кислот в связи с их строением. / В кн.: Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. М.: Россельхоз-издат, 1962. Т. 2. С. 101-121.
162. Покровская С.Ф. Использование дождевых червей для переработки органических отходов и повышения плодородия почв (вермикультура) / Обзорная информация ВНИИТЭИагропром. М., 1991. 39 с.
163. Пономаренко С.П., Гашников Э.Г. Биотестирование растений // Аграрная Россия. 1999. № 1(2). С. 15-16.
164. Попов В.И., Степанова М.Ю. Методы качественного определения Fusarium oxisporium в полевой почве // Микология и фитопатология. 1981. Т. 15. № 1.
165. Просянников Е.В. О значении некоторых неспецифических соединений гумуса в плодородии почвы // Науч. тр. Укр. СХА. 1975. Вып. 146. С. 127-130.
166. Прянишников Д.Н. Агрохимия: избр. соч. Т.1. М.: Изд-во с/х лит., 1952. 691с.
167. Прянишников Д.Н. Агрохимия. М.: Колос, 1964. 527с.
168. Путеводитель почвенной экскурсии. Лесная зона (сезоннопромерзающие почвы). Сыктывкар, 1997. 72 с.
169. Рабинович В.А., Хавин З.Я. Краткий химический справочник. Л.: Химия,1977. 150 с.
170. Радов A.C., Пустовой И.В., Корольков A.B. Практикум по агрохимии / под ред. И.В. Пустового. М.: Агропромиздат, 1985. 312 с.
171. Раковский В.Е., Пигулевская Л.В. Химия и генезис торфа. М.: Недра,1978. 231 с.
172. Раупова Н.Б., Содикова Г.С., Сагдулаева Н. Физико-химические свойства гуминовых кислот типичных сероземов // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2007. № 7 (33). С. 26-27.
173. Роговин В.В., Муштакова В.М., Фомина В.А. Действие некоторых ксенобиотиков на зависимый от пероксидазы иммунитет растений // Известия РАН. Серия биологическая. 1996. № 5. С. 613-617.
174. Роговин. В.В., Муравьёв P.A., Акимов Б.С., Бавыкина И:В. Пероксида-сомы растительных клеток // Физиология растений. 1987. Т. 34. Вып. 6. С. 1181-1185.
175. Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов. СПб.: ГИОРД, 2004. С. 222-230.
176. Розанова И.М., Семенова О.С. Битуминозная фракция органического вещества почв при затоплении в условиях Можайского водохранилища // Взаимодействие поверхностного и подземного стоков. М.: Изд-во МГУ; 1974. Вып. 2. С. 159-162.
177. Рунов Е.В., Терехов О.С. К вопросу об активности каталазы в некоторых лесных почвах // Почвоведение. 1960. № 9. С. 75-80.
178. Савич И.М. Пероксидазы стрессовые белки растений // Успехи современной биологии. 1989. Т. 107. Вып. 3. С. 406-415.
179. Савичева О.Г., Инишева Л.И. Биохимическая активность торфов разного ботанического состава // Химия растительного сырья. 2003. № 3. С. 4150.
180. Самоедов Б.А. Значение почвенных беспозвоночных в процессах разложения растительных остатков и гумусообразования лугово-сероземных почв. // Почвоведение. 1988. № 8. С. 109 114.
181. Семиколенных A.A. Каталазная активность почв северной тайги (Архангельская область)//Почвоведение. 2001. № 1. С. 90-96.
182. Сидоренко В. А., Васильев М.К. Микробиологический контроль при использовании биогумуса и компостов // Химия в с/х. 1995. № 2-3. С. 35.
183. Сиггиа С., Хана Дж. Г. // Количественный органический анализ по функциональным группам. М.: Химия, 1983. С. 132-135.
184. Слободян В.А., Слободян Н.С. Влияние биогумуса на микробиологические процессы в почве // Химия в с/х. 1994. №4. С. 18-22'.210: Смаилова Т. Агрохимические-показатели биогумуса и перегноя // Химия в с/х. 1994. № 4. G. 11.
185. Смирнова Е.Б., Занина М.А. Микробиологические аспекты плодородия почв при внесении вермикомпоста // Естествознание и гуманизм: сборник научных трудов / под. ред. д.б.н: Н.Н; Ильинских. Томск, 2006. Т.З. Вып. 4.
186. Соколов'М.С., Галиулин Р.В. Микробиологическое самоочищение почвы от пестицидов: обзорная информация. М.: ВНИИТЭЙ; 1987. 44 с.
187. Справочник помощника санитарного врача и помощника эпидемиолога. М.: Медицина, 1990. 137 с.
188. Старостин С.П., Котова В.В., Цветкова И.А. Вредители, болезни и сорняки гороха и меры борьбы с ними // Защита растений. 1988. № 3. С. 1415.
189. Степанов K.M., Чумаков А.Е. Прогноз болезней с/х растений. Д.: Колос. 1972. 271 с.
190. Стриганова Б.Р. Питание почвенных сапрофагов. М.: Наука, 1980. 242 с.
191. Стриганова Б.Р. Влияние дождевых червей на динамику почвенных процессов // Биодинамика почв. Талин, 1988. С. 12.
192. Стриганова Б.Р. и др. Пищевая активность дождевых червей и-содержание аминокислот в темно-серой лесной почве // Почвоведение: 1989. № 5. С. 44-51.
193. Сухих A.C. Эпоксимодифицированные полисахаридные гели в химии гуминовых, гуминоподобных веществ и препаратов на их основе: Авто-реф. дис. . канд. фарм. наук / Тюменская государственная медицинская академия. Тюмень, 2007.
194. Тарчевский И. А. Патоген индуцируемые белки растений : обзор // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 5. С. 517-5321
195. Титов И.Н. Новые фармацевтические препараты из дождевых червей // Дождевые черви и плодородие почв: Материалы 2-й Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир, 2004. С. 56-59.
196. Трач В.В., Стороженко В.А. Супероксиддисмутаза как компонент анти-оксидантной системы растений при абиотических стрессовых воздействиях // Физиология и биохимия культурных растений. 2007. Т. 39. № 4. С. 291-302.
197. Третьякова Е.Б., Вызов Б.А., Добровольская Г.Г. Зообактериальные комплексы в вермикомпосте и подстилке // Микроорганизмы в сельском хозяйстве. 1992. Пущино. С. 199.
198. Третьяков H.H., Кошкин Е.И., Макрушин Н.М. и др. Физиология и'биохимия растений. М.: Колосс, 2000. 640 с.
199. Тютерев C.JI. Научные основы индуцированной болезнеустойчивости растений. СПб.: ВИЗР, 2002. 328 с.
200. Федоров Е.К. Экологический кризис и социальный. JL: Гидрометиоиз-дат, 1977. 146 с.
201. Федько И.В., Гостищева М.В., Исматова P.P. К вопросу об использовании биологически активных гуминовых веществ в медицине // Химия растительного сырья. 2005. № 1. С. 49-52.
202. Фокин А.Д., Бобырь Л.Ф., Епишина Л.Е., Кравцова Л., Христева Л.А. О проникновении гумусовых веществ в клетки растений. // Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Днепропетровск, 1975. Т. 5. С. 237-244.
203. Фридланд Е.В. Методика изучения липидной (растворимой в спиртобен-золе) фракции почвенного гумуса // Биол. науки. 1978. № 5. С. 127-133.
204. Фритц Дж., Шенк Г. Количественный анализ. М.: Мир, 1978. 227 с.
205. Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв: метод, пособие. М.: Наука, 1976. 180 с.
206. Хазиев Ф.Х. Системно-экологический анализ ферментативной активности почв. М.: Наука, 1982. 204 с.
207. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. М.: Наука РАН, 2005. 252 с.
208. Хохряков М.К. Вредные и полезные грибы. Л.: Колос, 1964. 103 с.
209. Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адаптации. М.: Мир, 1977. 256 с.
210. Христева Л.С. Роль гуминовой кислоты в питании растений и гуминовые удобрения // Труды почвенного института им. В.В. Докучаева, АН СССР. 1951. Т. 38. С. 108-184.
211. Христева Л.С.Физиологическая функция гуминовых кислот в процессе обмена веществ у высших растений // Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Харьков: Изд. ХГУ, 1957.
212. Христева JI.С. Еще о функции гуминовых кислот в. обмене веществ у высших растений,// Гуминовые удобрения. Теория нпрактика их применения: 1962. Т.2. С. 123-129.
213. Христева1 Л.С. О природе действия физиологически* активных форм гуминовых кислот и других стимуляторов^ роста растений // Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. 1968. Т. 3. С. 13-27.
214. Христева Л.С., Старостин А.Н., Улитина В.П. Еще к природе физиологической активности гуминовых кисло // Гуминовые удобрениям Теория и практика их применения. 1968. Т. 3. С. 136-142.
215. Цыбакова Ю.Н. Особенности протекания почвенно-биологических процессов в целинной и пахотной почве // Научное обеспечение производства зернобобовых и крупяных культур. Орел, 2004.
216. Чекановская О.В. Дождевые черви и почвообразование. М.-Л:: АНСССР, 1960. 23 с.
217. Черников В.А., Черкес А.И. и др. Агроэкология. М.: Колос, 2000. 535 с.
218. Чернова Н.М. Зоологическая характеристика компостов. М.: Наука, 1966. 112 с.
219. Черемисинов Н.Я., Хижняк П.Я. Борьба с ржавчиной и бактериозами гороха и кормовых бобов. М.: Колос, 1964. 8 с.
220. Шаланда A.B. Пионер отечественного червеводства // Дождевые черви и плодородие почв: Материалы 2-й Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир, 2004. С. 9-12.
221. Шевелуха B.C. Регуляторы роста растений. М.: Агропромиздат, 1990. 185 с.
222. Щербакова Т.А., Коробова Г.Я., Волков А.Е., Бородько С.Н., Шимко H.A., Володина М.А. Биологическая активность маломощных торфяных почв и ее изменение под влиянием мелиорации и освоения // Прблемы Полесья. Минск, 1975. Вып. 4. С. 228-247.
223. Шикулина, H.H., Фонтух Ф.С., Науменко В.И Влияние вермикомпоста на воспроизводство плодородия серых лесных почв // Химия в с/х. 1994. № 4. С. 13.
224. Юшкова Е.И., Павловская Н.Е., Даниленко А.Н., Ботуз Н.И. Физико-химические свойства экстрактов из биогумуса разной степени зрелости // Сорбционные и хроматографические процессы. Воронеж, 2006. Т. 6. Вып. 1. С. 70-79.
225. Юшкова Е.И., Даниленко А.Н., Павловская Н.Е., Ботуз Н.И. Выделение и исследование некоторых физико-химических свойств гиматомелано-вых кислот методом ВЭЖХ // Сорбционные и хроматографические процессы, Воронеж, 2006. Т. 6. Вып. 5. С. 807-816.
226. Юшкова Е.И., Даниленко А.Н., Павловская Н.Е., Ботуз Н.И. Исследование методом ВЭЖХ физико химических свойств фульвокислот компо-стов и вермикомпостов различного происхождения // Агрохимия. 2008. №3. С. 67-71.
227. Юшкова Е.И. Зависимость термодинамических свойств разбавленных растворов гуминовых веществ от их относительной степени ароматичности. // ГОУ ВПО Орловский государственный университет, 2008. 11с. Деп. в ВИНИТИ 28.11.08 № 908-В.2008.
228. Юшкова Е.И. Использование метода 13С ЯМР-спектроскопии в исследовании гуминовых кислот, полученных из вермикомпостов различного• срока созревания // Современные проблемы науки и образования. 2008. № 6. С. 134-137.
229. Якименко О.С. Промышленные гуминовые препараты: перспективы и ограничения использования // Дождевые черви и плодородие почв: Материалы 2-й Международной науч.- практ. конф. (17-19 марта 2004 г., г. Владимир). Владимир, 2004. С. 249-251.
230. Яшин И.С. Технологии возделывания зерновых бобовых культур в Центральном регионе России. Орел: Изд-во Орел ГАУ, 2002. 142 с.
231. Adani F., Genevini P.L., Gasperi F., Zorzi G. Organic matter evolution index (OMEI) as a measure of composting efficiency // Compost Sci. Util. 1997. V. 5. P. 53-62.
232. Abbt-Braun G., Schmiedel U., Frimmel F.N. // Vom Wasser. B. 1990. V. 75. P. 59-73.
233. Abbt-Braun G., Lankes U., Frimmel F.N. Structural characterization of aquatic humic substances the need for a multiple method upproach // Aquat. Sci. 2004. Vol. 66. P. 151-170.
234. Ahard F. // Greli s. Chem. Ann. 1981. V. 1786.№2. P.391.
235. Albanell E., Plaixats J., Cabrero T. Chemical changes during vermicompost-ing of sheep manure mixeo with cotton industrial wastes // Biology and Fertility of Soils. 1988. Vol. 6. № 3. P. 266-269.
236. Amir S., Hafidi M., Baily J.R., Revel G.C. Characterization of humic acids extracted from sewage sludge during composting and of their Sephadex gel fractions // Agronomie. 2003. № 23. P. 269-275.
237. Anastasi A., Varese G.C., Marchisio V.F. Isolation and identification of fungal communities in compost and vermicjmpost // Mycologia. 2005. № 97 (1). P. 33-44.
238. Andersen C., Madsen M. Regnormedyrkin // Ugeskrin for jordbrug. 1984. Vol. 129. № 9. P. 227-233.
239. Arumugam G.K., Ganesan S., Kandasamy R., Balasubramani R., Burusa P.R.Municipal solid waste management through anaecic earthworm, Lampito Maauritti and their role in microbial modification // Mycologia. 2004. № 96 (6). P. 48-53.
240. Atallant T., Andreux F., Chone T., Gras F. Effect of storage and composting on the properties and degradability of cattle manure // Agriculture Ecosystems and Environment. 1995. № 54 (3). P. 203-213.
241. Avnimelech Y. // Compost science and Utilization. 1996. № 4 (2). P. 13-20.
242. Baddi G.A., Hafidi M., Gilard V., Revel J.C. Characterization of humic acids produced.during composting of oline mill wastes: elemental' and"spectroscopic analyses (FTIR and 13C-NMR) // Agronomie'. 2003. № 23. P. 661-666.
243. Banaszkiewicz W., Drobnik M. The influence of natural peat and isoleted humic acid solution! on certain indices of metabolism and of acid-base equilibrium in experimental animals // Rocz. Panstw. Zakl. Hig. 1994. V. 45. № 4. P. 353-360.
244. Battin T.J. Dissolved organic matter and its optical properties in a blackwater tributary of the upper Orinoco river, Venezuela // Organic Geochemistry. 1998. V. 28 (9-10). P. 561-569.
245. Belete L., Egger W., Neunhauserer C., Caballero B., Insam H. Can community level physiological profiles be used for compost maturity testing? // Compost Science and Utilization. 2001. № 9 (1). P. 6-18.
246. Bernal M.P., Navarro A.F., Roig A., Cegarra J., Garcia D. Carbon and nitrogen transformation during composting of sweet sorghum bagasse // Beology and Fertility of Soils. 1996. № 22 (1-2). P. 141-148.
247. Bernal M.P., Paredes C., Sancher-Monedero M.A., Cegarra J. Maturity and stability parameters of composts prepared with a wide range of organec wates. Bioresour// Technol. 1998. № 63 (1). P. 91- 99.
248. Beyer L. //Z. Pflanzenernahr. Bodenk., 1996. 159. P. 527-539.
249. Bhattacharya S.S., Chattopadhyay G.N. Increasing bioavailability of phosphorus from fly ash through vermicomposting // Journal of Environmental Quality. 2002. №31. P. 2116-2119.
250. Blanco M.J., Almendros G. Maturity assessment of wheat-straw composts by thermogravimetric analysis // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1994. №42 (11). P. 2454-2459.
251. Brohon B., Delolme C., Gourdon R. Qulification of soils through microbial activities measurements: Influence of the storage period on INT-reductase, phosphatase and respiration // Chemosphere. 1999. № 38 (9). P. 1973 1984.
252. Brookes P.C., Landman A., Pruden G., Jenkinson D.S. Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: A rapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil // Soil Biology and Biochemistry. 1985. V. 17. №6. P. 837-842.
253. Bruce R. Eastman. Achieving pathogen stabilization using vermicomposting. // Bio Cycle Magazine 1999. V. 24. P. 62.
254. Businelli M. et ai. Chemical composition and enzymic activity of some worm casts // Plant and Soil. 1984. № 80 (3). P. 417-422.
255. Calace N., Capolei M., Lucchese M., Petronio B.M. The structural composition of humic compounds as indicator of organic carbon sources // Talanta. 1999. № 49 (2). P. 277-284.
256. Cegarra Y. et al. Study of soluble humic substances from newly prepared organic fertilizers//The Science of the Total Environment. 1989. № 81-82. P. 579-588.
257. Chaney K. and Swift R.S. // Journal of Soil Science. 1984. № 35. P. 223230.
258. Chefetz B. Adani F., Genevini P., Tambone F., Hadar Y., Chen Y. Humic-acid transformation during composting of municipal solid waste // Journal of Environmental Quality. 1998. № 27 (4). P. 794-800.
259. Chen J1., Gu B., Le Boenf E.J1. Spectroscopic characterization of the structural and functional properties of natural organic matter fractions // Chemosphere. 2002. V. 48 (1). P. 59-68.
260. Ciavatta C., Govi M., Pasotti L. Sequi P. Changes in organic-matter during stabilization of compost from municipal solid-wastes // Bioresourse Technology. 1993. № 43 (2). P. 141-145.
261. Clapp C.E., Hayes M.H.B. Sizes and shapes of humic substances // Soil Science. 1999. № 164(11). P. 777-789.
262. Clapp C.E., Hayes M.H.B., Li L., Huang W., Peng P. Sizes and shapes of humic substances // Soil Science Am. J. 2003. V.67. P. 740-746.
263. Clark F.E. and Tan K.H. // Soil Biol. Biochem. 1969. № 1. p. 75.
264. Compagnoni L. Urgentissimo: occorre allevare 18 mila milliardi di lombrichi // Evoluzione Agricole. 1982. V. 27. № 134. P. 140.
265. Davies C.M., Evison L.M. Sunlight and the survival of enteric bacteria in natural waters //J. Appl. Bacteriol. 1991. V. 70. № 3. P. 265-274.
266. Debosz K., Rasmussen P.H., Pedersen A.R. Temporal variations in microbial biomass C and cellulolytic enzyme activity in arable soils: effects of organic matter input//Applied Soil Ecology. 1999. V. 13. № 3. P. 209-218.
267. Dell'Abate M.T., Benedetti A., Sequi P. Thermal methods of organic matter maturation monitoring during a composting process // Journal of Termal Analysis and Calorimetry. 2000. № 61 (2). P. 389-396.
268. Ferreira J.A. // 17 WCSS Symposium, August 14-21, Thailand, 2002.
269. Frigont Y. La lombricomonie: un bon filon? // Agrisept. 1983. № 44. P. 28109-28115.
270. Fleckenstein J., Graff O. Schwermetallaufnahme aus mullkompost durch den regenwurm // Landbauforschung Volkenrode. 1982. V.32. № 4. P. 202.
271. Garbarino J.R., Bednar A.J., Rutherford D.W.,, Beyer R.S., Wershaw R.L. Environmental fate of Roxarsone in poultry litter. I. Degradation of Roxar-sone during composting // Environ. Sci. Technol. 2003. № 37 (8). P. 15091514.
272. Garcia C., Hernandez T., Costa F. Study on water extract of sewage-sludge composts // Soil Science and Plant Nutrition. 1991. № 37 (3). P. 399-408.
273. Garcia C., Hernandez T., Costa F. Changes in carbon fractions during composting and maturation of organic wastes. // Environ. Manage. 1991. V.15. P. 433-439.
274. Garcia C., Hernandez T., Costa F., Ceccanti B., Ciardi C. Changes in ATP content, enzyme-activity and inorganic nitrogen species during composting of organic wastes // Canadian Journal of Soil Science. 1992. № 72 (3). P. 243253.
275. Gaffney S., Marley N.A. and Clark S.B. Humic and Fulvic Acibs: Isolation, Structure and Environmental Role // American Chemical Society. Symposium series. 1996. V. 651. P. 151.
276. Ghosh M., Chattopadhyay G.N., Baral K. Transformation of phosphorus during vermicomposting // Bioresource Technology. 1999. № 69 (2). P. 149-154.
277. Giannopolities C. N., Ries S. K. Superoxid dismutase. I. Occurrence in higher plants // Plant Physiology. 1977. V. 59. P. 309-314.
278. Giusquiani P.L., Patumi-M:, BusinelliM. Chemical composition, of fresh, and composted urban waste // Plant Soil. 1989. V. 116. № 2. P: 278-282.
279. Gigliotti G., Macchioni< A., Zuccaccia C., Giusquiani P.L., Businelli Mi A spectposcopic study of soil fiilvic acid composition after six-year applications of urban waste compost // Agronomie. 2003. № 23. P. 719-724.
280. Govi M., Ciavatta C., Gessa C. Evolution of organic-matter in sewage-sludge A study based on,the use of humification parameters and analytical electro-focusing. //Bioresourse Technology. 1993. № 44 (2). P. 175-180.
281. Haitzer M., Aiken G.R., Ryan J.N. Binding of mercury (II) to aquatic humic substances: influ- ence of pH and source of humic substances // Sci. and Technol. 2003. 1 jun. V. 37. № 11. P. 2436-2441.
282. Hassink J.Density fractions of soil macroorganic matter and microbial biomass as predictors of C-mineralization and N- mineralization // Soil biology-and biochemistry. 1995 V. 27 (8). P. 1099-1108.
283. Hayashi T. and Nagai T. // Soil Sci. Plant Nutr. 1962. 8 (4). P.22.
284. Hennuy B., Gaspar G. Le traitement des dechets par leslombriciens // Bulletin des Recherches Agronomiques Gembloux. 1986. V. 21. № 3. P. 359-367.
285. Hervas L. et al. Chemical and physico-chemical characterization of vermi-composts and their humic acid fractions // The Scienct of the Total Environment. 1989. № 81-82. P. 543-550.
286. Hsu J.H., Lo S.L. Chemical and spectroscopic analysis of organic matter transformations during composting of pig manure // Environmental Pollution. 1999. № 104 (2). P. 189-196.
287. Huffman E. W. D., Stuber Jr. // In: Humic substances in soil, sediment and water /Aiken G.R., McKnight D.M., Wershaw R.L., MacCarthy P. (Eds.). N.Y.: Joh Wiley & Sons, 1985. P. 433-445.
288. Iannotti D.A., Grebus M.E., Toth B.L., Madden L.V., Hoitink H.A.J. Oxygen respirometryto assess stability and maturity of composted municipal solid-waste//Journal of Environmental Quality. 1994. № 23 (6). P. 1177-1183.
289. InsamH., Amor K., Renner M., Crepaz C. Changes in functional abilites of the microbial community during composting of manure // Microbial Ecology. 1996. №31 (1). P. 77-87.
290. Interaction of formaldehyde with soil humic substances: separation by GFC and characterization by 'H-NMR spectroscopy / C.M. Cooke, N.J. Bailey G., Shawet al. // Bull. Environm. Contam. Toxicol., 2003. Vol. 70. P. 761-768.
291. Jeyabal A., Kuppuswamy G. Recycling of organic wastts for the production of vermicompost and its response in rice-iegume cropping system and soil fertility // European Journal of Agronomy. 2001. V. 15. № 3. P. 153-170.
292. Jimenez E.I., Garcia V.P. Determination of maturity indexes for city refuse composts // Agriculture Ecosystems and Environment. 1992. № 38 (4). P. 331-343.
293. Khlebnikov A. Schepetkin A.I.,.Kwon B.S Modeling of the anticancer action-for radical derivatives of nitroazoles: quantitative structure-activity relationship (QSAR) study // Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 2002. V.17. №.2. P. 193-203.
294. Kinchesh P, Powlson D.S., Randdall E.W. // Europian J. Soil Sci. 1995. № 46. P. 125-138.
295. Klamer M., Baath E. Microbial community dynamics during composting of straw material studied using phospholipid fatty acid analysis // Fems Microbiology Ecology. 1998. № 27 (1). P. 9-20.
296. Kleinhempel D. // Albrecht Thaer-Archiv. 1970. V.14 (1). P. 3-14.
297. Kumada K. Chemistry in soil organic matter. Tokyo, 1988. P. 314.
298. Kuwatsuka S., Tsutsuki K., Kumada K. // Soil Sci. Plant Nutr. 1978. № 24. P. 337-347.
299. Lasaridi K/E/, Stentiford E.I. A simple respirometric technique for assessing compost stability // Water Research. 1998. № 32 (12). P. 3717-3723.
300. Le Boenf E.J., Weber W.J. // Journal of Environ. Sci Technol. 2000. V. 34 (1). P. 3623-3631.
301. Lewis Michael, Glaser Rainer The azine bridge as a conjugation stopper: an NMR spectroscopic study of electron derealization in acetophenone azines // J. Org. Chem.- 2002. V. 67. P. 1441-1447.
302. Lowe L.E. Studies on the nature of sulfur in'peat humic acids from Froser River delta, British Columbia // Sci. TotalEnviron. 1992. V.l 13. P. 133-145
303. Lu F.J. Arsenic as a promoter in the effect of humic substances on plasma prothrombin time in vitro // Thromb. Res. 1990. V. 58. № 6. P. 537-541.
304. Mangrich A.S., Lobo M.A., Tanck C.B. Silos di lombrichi per I fanghi // J. Braz.Chem.Soc. 2000. V. 11(2). P. 164-169.
305. Martin J.P., Waksman S.A. Influence of microorganisms on soil aggregation and erosion // Soil. Sci. 1941. № 52. P. 381-394.
306. Mathur S.P., Dinel H., Owen G., Schnitzer M., Dugan J. Determination of compost biomaturity. 1 .Literature-review // Biological Agriculture and Horticulture. 1993. № 10 (2). P. 65-85.
307. Mathur S.P., Dinel H., Owen G., Schnitzer M., Dugan J. Determination of compost biomaturity.2. Optical-density of water extracts of composts as a reflection of their maturity // Biological Agriculture and Horticulture. 1993. № 10(2). P. 87-108.
308. Mba C.C. Vermicomposting and biological N- Fixation // International Symposium on soil Bioligy. 1987. Vol. 1. P. 547-552.
309. Mikki V., Senesi N., Hanninen K. Characterization of humic material formed by composting of domestic and industrial biowastes. 2. Spectroscopic evaluation of humic acid structures // Chemosphere. 1997. № 34 (8). P. 1639-1651.
310. Mondini C., Sanchez Monedero A., Leita L., Bragato G., De Nobili M. Carbon and ninhydrin-reactive nitrogen of the microbial biomass in rewetted compost samples // Communications in Soil Science and Plant Analysis. 1997. № 28 (1-2). P. 113-122.
311. Mondini C., Contin M., Leita L., De Nobili M. Response of microbial biomass to air-drying and rewetting in soils and compost // Geoderma. 2002. № 105 (1-2). P. 111-124.
312. Mustim M. Gestion de la matiere organique. Editions Francois Dubusc. Paris. 1989. P. 243-251.
313. Miiller-Wegener U. Interaction of humic substances with biota // In: Humic substances and their role in the environment, Frimmel F.N. and Christman R.F. (Eds). John Wiiey&Sons Limited, 1988. P. 179-192.
314. Noble A.D., Randall P.G., James T.R. Evalution of two coal-derived organic product in ameliorating surface and subsurface soil acidity // Europ. J. Soil Sci. 1995. V.46. P.424 429.
315. Norwood D.L. // In: Humic substances and their roie in the environment, Frimmel F.N. and Christman R.F. (Eds). John Wiiey&Sons Limited, 1988. P. 133-148.
316. Ogner G. Fractionation of humus hydrolysates by ion exchange resins // Soil Sci. 1970. V. 110 (2). P. 86-92.
317. Orlov D.S. Soil fulvic acids: History of study, importance, and reality // Eurasian Soil Science. 1999. № 32 (9). P. 1044-1049.
318. Ouatmane A., Dorazio V., Hafidi M., Revel J.C., Senwsi N. Elemental and spectroscopic characterization of humic acids fractionated by gel permtation chromatography // Agronomie. 2000. № 20. P: 491-504.
319. Pettinari C., Cingolani A., Lobbia G.G Copper and silver derivatives of scor-pionates and related ligands // Polyhedron. 2004. V.23. P.451-469.
320. Peuravuori J., Pihlaja K. Molecular sise distribution and spectroscopic properties of aquatic humic substances // Analyt. Chim. Acta. 1997. Vol. 337. P. 133-149.
321. Phuong H.K. and Tichy V. Activity of Humus Acids from Peat as Studied by Means of Some Growth Regulator Bioassays // Biologia Plantrum (Praha). 1976. 18 (3). P. 195-199.
322. Prat S. Permeability of Plant Tissues tu Humic Acids // Biologia Plantrum (Praha). 1963. 5 (4). P. 279-283.
323. Polyakov S.V. Study of the relationship between aromaticity of HS and their absorbance at 254 and 280 nm. // Abstract Book of the 2 -nd Ecological Conf. of Young Scientists, Apr. 23, Moscow, Russia: Moscou State Univer., 1998. P. 46.
324. Privalov P.L., Makhatadze G.I. // J. Mol. Biol. 1992. № 224. P.715-723.
325. Provenzano M.R., N. Senesi., Nifhof M. Orgnic geochemistry of natural waters // J.Therm. Anal. Calorim. 1999. V. 57( 2). P. 517-526.
326. Provenzano M.R., Ouatmane A., Hafidi M. Macromolecular properties of soil humic substances: fact // Anal.Calorim. 2000. V.61 (2). P. 607-614.
327. Provenzano M.R., de Oliveira S.C., Santiago Silva M.R., Senesi N. Assessment of maturity degree of composts from domestic solid wastes by fluorescence and fourier transform infrared spectroscopies // J. Agric. Food Chem. 2001. № 49 (12). P. 5874-5879.
328. Provenzano M.R., Albuzio A., D'Orazio V. Spectroscopic and thermal investigations on compost improved by iron salt addition // J. Agric. Food Chem. 2005. № 53 (2). P. 374-382.
329. Reijntjes H.C. Earthworms as converters, of organic waste // Animals as Waste Converters. 1984. P.139-140.
330. Ricca G., Severini F. Structural investigations of humic substances by IR-FT, 13 13 C-NMR of humic substances: pH and solvent effect. C- NMR spectroscopy and comparison with a maleic oligomer of known structure // Geoderma. 1993. №58. P. 233-244.
331. Rice J.A. and Mac Carthy P. Disaggregation and characterization of humin. The Science of the Total Environment// Org. Geochem. 1991. 17 (5). P. 635648.
332. Ritchie J.D., Perdue E.M. Method comparison for evaluating biosolids compost // Geochem.Cosmochem. Acta. 2003. V.67. P. 85-87.
333. Saharinen M.N. Evaluation of changes in CEC during composting. // Compost Science and utilization. 1998. V. 6 (4). P. 29-37.
334. Schaumann G.E., Antelmann O. // J. Plant Nutr. Soil Science. 2000. V. 163(2). P.179-181.
335. Schaumann G. E. Matrix relaxation and change of water state during hydration of peat// Environ. Sci. Technol. 2005. V.39 (3). P.800-806.
336. Schepetkin I.A., Khlebnikov A.I., Shin Young Ah. Characterization and Biological Activities of Humic Substances from Mumie // JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY. 2003. V. 51. Issue 18. P. 52455254.
337. Schnitzer M. and Hansen E.N. Organo-metallic interaction in soils: 8. An evaluation of methods for the determination of stability constants of metal-fulvic acid complexes // Soil Sci. 1970. 109 (6). P. 333-340.
338. Schnitzer M. and Khan S.U. // In: Humic Substances in the Environment. N.Y.: Marcel Decker, 1972. P. 12-17.
339. Schnitzer M. Oxidative degradation of soil humic substances // Soil Sci. 1974. 117(2). P. 94-101.
340. Schulten H.-R. / Senesi N., Miano T.M. (Eds) // In: Humic Substances in the Global Environment and Implications on the Human Helth. Elsevier Science. 1994. P. 43-56.
341. Senesi N. // Analit. Chem. Acta. 1990. V. 232 P. 51-75.
342. Skjemstad G.O., Frost R.L., Barron P.F. // Austr. J. Soil Res. 1983. № 21. P.539.
343. Sotak C.H., Dumoulin C.L., Levy G.C. // Anal. Chem. 1983. № 55. P. 782787.
344. Stevenson F.J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. New York: John Wiley & Sons, 1982. 443 p.
345. Stevenson F.J. // In: Humic substances in soil, sediment and water. Aiken G. R., McKnight D.M., Wershaw R.L., McCarthy P. (Eds.). N.Y.: John Wiley & Sons, 1985. P. 13-52.
346. Stevenson I.L., Schnitzer M.V. // Soil Sci. 1982. V. 133(3). P.179-185.
347. Swift Roger S. Macromolecular properties of soil humic substances: fact, fiction and opinion // Soil Science. 1999. V.164 (11). P. 790-802.
348. Tate R.L. // Adv. Microbial. Ecol. 1980. V.4. P. 169-201.
349. Thurman E.M // Orgnic geochemistry of natural waters. Martinus Nijhof. Dr.W. Junk Publishers. Dordrecht. The Netherlands, 1985. 45 lp.
350. Tiquia S.M., Tarn N.F.Y., Hodgkiss I. J. Microbial activities during composting of spent pig-manure sawdust litter at different moisture contents // Biore-source Technology. 1996. № 55 (3). P. 201-206.
351. Tomati U. Fertilizers from vermiculture as an option for organic wastes recovery // Agrochemica. 1984. V. 27. № 2/3. P. 244-251.
352. Tomati U. Wurmhumus //Agrocemica. 1983. Vol. 26. № 4. P. 126-127.
353. Tomati U., Grappelli A»., Galli E. The alternative "earthworm" in the organic wastes recycle // Processing and use of organic sludge and liquid agricultural wastes. 1986. P. 510-514.
354. Tomati U., Grappelli A., Galli E. The hormone like effect of earthworm cast on plant growih // Biology and Fertility of Soils. 1988. V.5. № 4. P. 288-294.
355. Tomati U. Galli E., Grappelli A. 11 vermicompost, dopo il suo inserimento nella tabella ufficiale della legge 748/84 // L. Informatore Agrario. 1987. V. 43. № 30., P.51-54.
356. Veeken A., Nierop K., de Wilde V., Hamelers B. Characterisation ofNaOH-extracted humic acids during composting of a biowaste // Bioresource Technology. 2000. № 72 (1). P. 33-41.
357. Visser S.A. Effect of Humic Substances on Plant Growth // In.: Humic Substances Effect on Soil and Plants. Italy, Reda, 1986. P. 89-135.
358. Visser S.A. Effect of humic substances on mitochondrial respiration and oxidative phosphorylation // Sci. Total Environ. 1987. V. 62. P. 347-354.
359. Wang S.Y., Lin H.-S. Compost as a soil supplement increases the level of antioxidant compounds and oxygen radical absorbance capacity in strawberries. // J. Agric. Food Chem. 2003. № 51 (23). P. 6844-6850.
360. Wilson M.A., Vassallo A.M., Perdue E.M., Reuter J.H. // Anal. Chem. 1987. № 59. P. 551-558.
361. Wilson M.A. // In: Humic Substances in-Soil and CropSciences, Selected Readings. P. Mac Carthy (Eds.). Madison, USA, 1990. P. 221-260.
362. Wilson M.A., Ellis A.V., Lee G.S.H. Disolved organic carbon fractions formed during composting of municipal solid waste // Ind. Eng. Chem. Res.1999. V. 38(12). P. 4663-4674.
363. Winter J.P., Zhang Z.Y., Tenuta M., Voroney R.P. Measurement of microbial biomass by fumigation-extraction in soil stored frozen // Soil Science Society of America Journal. 1994. V. 58 (6). P. 1645-1651.
364. Worm processing // Horticultural Week. 1986. V. 199. № 6., P. 19.
365. Wu L., Ma L.O., Martinez G.A. Comparison of methods for evaluating stability and maturity of biosolids compost // Journal of Environmental Quality.2000. № 29 (2). P. 424-429.
366. Wu L., Ma L.O. Effect of storage on biosolids compost stability and maturity evaluation // Journal of Environmental Quality. 2001. № 30. P. 222-228.
367. Wu L., Ma L.O. Relationship between compost stability and extractable organic carbon // Journal of Environmental Quality. 2002. № 31. P. 1323-1328.
368. Young K.D., Le Boenf E.J. Use of liquid hydrocarbon // Environ. Sci. Tech-nol. 2000. V. 34 (21). P. 4549- 4553.
369. Wang P., Liu D., Zhou W. et. Al. Direct chiral resolution and its application to the determination of fungicide benalaxyl in soil and water by highperformance liquid chromatography // Analyt. Chim. Acta., 2006. V. 555. P. 210-216.
370. Zanetti M. Treatment of HIV infection with humic acid. // PCT. 1995. № WO 95/08335.
371. Гильмиярова Ф.Н., Агапов А.И., Авакумова Н.П. Способ получения препарата на основе гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей для физиотерапии : патент РФ № 2122414; опубликован 27.11.1998.
372. Барам Г.И., Болванов Ю.А., Грачев М.А. и др. Микроколоночная жидкостная хроматография с многоволновой фотометрической детекцией. Микроколоночный жидкостной хроматограф «Обь-4». Новосибирск: ИЯФ СО АН СССР, 1983. 38 с.
373. Бражников В.В. Детекторы для хроматографии. М.: Машиностроение, 1992. 320 с.
374. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. / под ред. Хеншена А. М.: Мир, 1988. 687 с.
375. Луговник Б.А. Жидкостная хроматография под высоким давлением. Томск: Издательство Томского университета, 1978. 142 с.
376. Мальцев A.A. Молекулярная спектроскопия. М.: Московский университет, 1980. 272 с.
377. Сычев С.Н. Методы совершенствования хроматографических систем и механизмы удерживания в ВЭЖХ. Орел: Орел ГТУ, 2000. 212 с.
378. Сычев С.Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Орел: Орел ГТУ, 2010. 184 с.
-
Юшкова, Елена Ильинична
-
доктора биологических наук
-
Орел, 2010
-
ВАК 03.01.05
- Характеристика гуминовых кислот торфов Среднего Приобья
- Сравнительная оценка эффективности гуминовых удобрений в технологии возделывания яровой пшеницы в условиях Нечерноземной зоны России
- Эффективность препаратов на основе гуминовых кислот торфа под сельскохозяйственные культуры в условиях луговой степи Алтайского края
- Агроэкологические аспекты применения биологических препаратов на основе гуминовых кислот при возделывании ячменя в условиях Центрального Черноземья
- Влияние гуминовых кислот на устойчивость растений и микроорганизмов к воздействию тяжелых металлов
