Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическое исследование преальбумина спермоплазмы при заболеваниях репродуктивной системы мужчин

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимическое исследование преальбумина спермоплазмы при заболеваниях репродуктивной системы мужчин"

На правах рукописи ЛУЦКАЯ АДЕЛЯ МУКМИНОВНА

БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕАЛЬБУМИНА СПЕРМОПЛАЗМЫ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ

МУЖЧИН

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 7 СЕН 2012

Москва - 2012

005047354

Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Николаев Александр Аркадьевич

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор,

заведующий кафедрой биохимии

лечебного факультета

ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова

Минздравсоцразвития России Терентьев Александр Александрович

Доктор биолопгческих наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии

медицинского факультета РУДН Чернов Николай Николаевич

Ведущая организация: ФГБУ «НИИ урологии» Минздравсоцразвития России.

Защита диссертации состоится «19» октября 2012 года в 14.00 на заседанш диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбь народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, Медицински! факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университет дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан « У^г сентября 2012 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета у/ доктор биологических наук,

профессор

Е. В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Заболевания репродуктивной системы мужчин имеют в настоящее время устойчивую тенденцию к росту во всем мире [Тер-Аванесов Г. В., 2008; Nieschlag Е. et al., 2010]. Проблема заболеваний мужской репродуктивной системы не является только медицинской и имеет демографические, а также социально-психологические аспекты [Божедомов В. А., 2006; Oehninger S. С. et al., 2011]. Для пациентов не редко более сильным стрессом является даже не само заболевание, а осознание факта наличия дисфункции органов репродуктивной системы [Михайличенко В. В. и др., 2009; Connors L. Н. et al., 2011].

Качество жизни данной категории больных значительно ухудшается, у пациентов падает творческий потенциал, развивается эмоциональная астения, снижается интерес к жизни в целом, так как состояние репродуктивного здоровья имеет для мужчин огромное психо-эмоциональное значение [Тиктинский О. JL, 2003; Aganval A. et al., 2009]. В то же время мужчинам, страдающим заболеваниями репродуктивной системы, как правило, требуется достаточно длительная терапия до полной реконвалесценции [Евдокимов В. В. и др., 2011].

Своевременная и точная диагностика заболеваний репродуктивной системы и развития их возможных осложнений позволяет в ряде случаев значительно ускорить процесс лечения, избежать длительного периода медицинской и социально-психологической реабилитации.

Одним из перспективных направлений является лабораторная диагностика, основанная на исследовании биохимического состава эякулята на уровне индивидуальных белков [Петрунин Д. Д., 1999; Липатова Н. А. и др., 2007; Baker D. J. et al., 2006]. Изменение молекулярного состава опережает развитие структурно-функциональных нарушений на клеточном и тканевом уровне [Николаев А. А., 2000; Wilson D. et al., 2008; Nieschlag E. et al., 2010]. Диагностика на этом этапе развития патологического процесса позволяет проводить терапию с большей эффективностью и часто предупредить дальнейшее развитие патологического процесса до выраженного нарушения функций.

В то же время некоторые белки спермоплазмы, в частности преальбу-мин, остаются практически неизученными с точки зрения медицинской биохимии [Duncan М. W. et al., 2007; Kruger Т. F. et al., 2009], хотя с высокой вероятностью можно предположить наличие большого практического потенциала для лабораторной диагностики при определении этих белков в спермоплазме.

Цель исследования:

Разработка биохимических диагностических и прогностических методов на основе изучения преальбумина спермоплазмы человека в норме и при воспалительных заболеваниях репродуктивной системы.

Основные задачи исследования:

1. Разработать метод выделения и очистки преальбумина из спермоплазмы.

2. Разработать метод количественного определения преальбумина в спермо-

плазме.

3. Провести экспериментальное исследование биологических функций пре-альбумина в сперме.

4. Количественно исследовать преальбумин, альбумин, С-реактивный белок и аг2-макроглобулин в спермоплазме здоровых фертильных мужчин и мужчин с воспалительными заболеваниями предстательной железы и органов мошонки.

5. На основании исследования уровня преальбумина в спермоплазме разработать биохимические способы диагностики воспалительных заболеваний при лейкоспермии.

Научная новизна исследования:

Впервые установлено, что спермоплазменный преальбумин при воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы имеет более высокую концентрацию, чем в норме.

Впервые доказано, что повышение уровня преальбумина в спермоплазме при воспалении органов репродуктивной системы происходит независимо от выраженности лейкоцитоза в эякуляте.

Впервые выявлена взаимосвязь уровня преальбумина в спермоплазме и двигательных характеристик сперматозоидов.

Впервые установлена способность преальбумина повышать выживаемость сперматозоидов при их повреждении пероксидом водорода.

Практическая значимость работы:

Разработан биохимический способ топической диагностики воспалительных заболеваний при лейкоспермии.

Разработан биохимический способ диагностики воспалительных заболеваний мужской репродуктивной системы при нормальном уровне лейкоцитов в эякуляте.

Разработан биохимический способ прогноза развития астенозооспермии при воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы.

Внедрение результатов работы в практику

Разработанные способы диагностики внедрены в практическую работу: клинико-диагностической лаборатории Центра планирования семьи и репродукции (г. Астрахань), кафедры общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО «АГМА Минздравсоцразвития России», Астраханского областного кожно-венерологического диспансера, диагностической лаборатории «ДИАМЕД-экспресс» ООО МФВФ «Техномед» (г. Астрахань), ООО МФ «Здоровье плюс» (г. Астрахань), ЧМК «Мужская консультация» ИП Выборнов С. В. (г. Астрахань), ООО МФ «Семья» (г. Астрахань), ЧМК «Гинекологический кабинет» ИП Калинина О. А. (г. Астрахань).

Основные положения, выносимые на защиту - Уровень преальбумина в спермоплазме коррелирует с двигательными характеристиками сперматозоидов.

- Уровень преальбумина в спермоплазме отражает вероятность развития асте-нозооспермии при воспалительных заболеваниях предстательной железы и органов мошонки.

- При воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы происходит повышение уровня преальбумина в спермоплазме.

- Преальбумин повышает жизнеспособность сперматозоидов при их повреж-дешш пероксидом водорода.

Апробация работы

Результаты работы представлены и доложены на:

Ежегодных итоговых научных конференциях Астраханской государственной медицинской академии в 2002-2012 годах (г. Астрахань);

Ежегодной Всероссийской конференции «Национальные дни клинической лабораторной диагностики» в 2004,2008 и 2009 годах (г. Москва);

Международных научно-практических конференциях «Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия» в 20032011 годах (г. Астрахань);

Международных научно-практических конференциях «Здоровье и Образование XXI Век» в 2003-2006 годах (г. Москва);

IX International Scientific Conference «Family Health In The XXI Century» in 2005 year (China, Dalyan).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе 12 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 14 — в периодических изданиях, 6 - в материалах конференций, 2 — в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 261 источник, в том числе, 48 отечественных и 213 иностранных авторов. Диссертация содержит 28 таблиц и 16 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были исследованы образцы эякулятов у 221 мужчины с различной фертильностью. В том числе образцы эякулятов 179 мужчин с воспалительными заболеваниями предстательной железы и органов мошонки.

Для исследования спермограмм были использованы стандартные методики в соответствии с рекомендациями ВОЗ.

Хранение образцов биологического материала до исследования проводили при температуре -24°С.

В работе использовали коммерческие наборы и реактивы фирм: «High Technology Inc.» (США), <сAssayPro» (США), «Sigma-Aldrich» (США), «Вектор-

Бест» (Россия), «НиарМедик» (Россия), «Лабдиагностика» (Россия), «BioRad» (Франция).

Определение общего белка проводили биуретовым методом по конечной точке, определение альбумина проводили по конечной точке с использованием бромкрезолового зеленого, определение С-реактивного белка проводили методом иммунотурбидиметрии с латексным усилением. Измерения проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «BioChem SA» (фирма «High Technology Inc.», США).

Определение о^-макроглобулина проводили методом иммунофермент-ного анализа. Для измерения оптической плотности использовали планшетный спектрофотометр АИФР-01 «Униплан» (фирма «Пикон», Россия).

Для проведения статистического анализа, обработки результатов исследования в работе было использовано лицензионное программное обеспечение фирм «Microsoft», «Statsoft», «Cambridgesoft», «Abbyy», «Adobe», «Corel».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и очистка спермогшазменного преалъбумина

Исследование белков спермоплазмы начали с проведения электрофореза в агаровом геле. Окраску электрофореграмм проводили в растворе амидочерно-го.

Полученную электрофореграмму конвертировали в цифровой формат с использованием сканера планшетного типа.

Количественная оценка электрофореграмм была выполнена с применением специализированной компьютерной программы «ПН 5108 вер. 3.05» (свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2003612170 от 17 сентября 2003 года).

На электрофореграмме белков спермоплазмы человека было выявлено наличие достаточно выраженной фракции, имеющей подвижность, превышающую электрофоретическую подвижность альбуминов (рисунок 1).

Рисунок 1. Электрофореграмма белков спермоплазмы человека и ее анализ с применением программы «ПН 5108» (Alb — альбумин).

Для дальнейшего изучения фракции преальбуминов мы использовали препаративный электрофорез в агаровом геле. После накопления достаточного количества материала - агаровые полоски измельчали, размораживали и в дальнейшем использовали для подкожной иммунизации кроликов. Для получения антисыворотки против спермоплазменного преальбумина с достаточным титром антител требовалось не менее 5 реиммунизаций.

Полученная антисыворотка не реагировала с альбумином человека, с трансферрином человека, со скаферрином человека, с простатической кислой фосфатазой человека, с церулоплазмином человека. Частичная иммунохимиче-ская идентичность наблюдалась с преальбумином (транстиретином) человека.

Выделение и очистку спермоплазменного преальбумина проводили в четыре этапа (рисунок 2).

Сперма здоровых ^фертильных мужчин J

Ионообменная хроматография, DEAE-Sepharose CL-6B, колонка 2,5x20 см.

Фракции, содержащие преальбумин

Центрифугирование, 1300хд, 15 мин.

Гель-фильтрация, SephadexG-100 Superfine, колонка 2,5x30 см.

Сулернатант

Центрифугирование, 1850хд, 15 мин.

Супернатант

Осадок

Осаждение, (МН4)230<, 50% насыщения

Рисунок 2. Схема выделения и очистки спермоплазменного преальбумина.

Выделение преальбумина (таблица 1) начинали с фракционирования сульфатом аммония при 50% насыщении.

Очистка преальбумина из спермогшазмы человека.

Стадия очистки

Спермоплазма

Осаждение сульфатом аммония

Гель-фильтрация, Sephadex G-100 Superfine

Ионообменная хроматография, DEAE-Sepharose CL-6B

Аффинная хроматография, heparin-Sepharose CL-6B

<ц ¡Я .из К

а

- СЗ

® & ч Hod

ill

87

и о ч

о

ю «

а

а

\о О

5576

30

300

400

10

3936

794

Таблица 1.

и, S

я" И

о я

5 <о

6 &

о4

fcf О

х 3 РЭ

455

87

267

100

258

96,6

212

79,4

179

67,0

80,5

30,1

При данных условиях преальбумин выпадал в осадок. После ресуспен-дирования осадок подвергали гель-фильтрации на Sephadex G-100 Superfine. Фракции, содержащие преальбумин, сливали, замораживали и хранили при температуре -20°С. После накопления достаточного объема проводили ионообменную хроматографию на DEAE-Sepharose CL-6B. Элюцию проводили линейным градиентом от 0 до 1,0 М NaCl.

Фракции, содержащие преальбумин, сливали, замораживали и хранили при -20°С. На завершающей стадии очистки проводили аффинную хроматографию на heparin-Sepharose CL-6B.

Для подтверждения чистоты полученного препарата спермоплазменного преальбумина проводили диск-электрофорез. По данным электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия, полученный нами препарат спермоплазменного преальбумина имел молекулярную массу около 43 кДа, изоэлектрическую точку 4,9, что отличается от аналогичных характеристик транстиретина.

Экспериментальное исследование биологических функций спермоплазменного преальбумина

Для экспериментального исследования были использованы сперматозоиды здоровых мужчин («=11) в возрасте от 21 до 27 лет (средний возраст 24,6±1,7 лет) с подтвержденной фертильностью, а также препарат преальбумина выделенный и очищенный нами из спермоплазмы по описанной выше методике. Схема эксперимента приведена на рисунке 3.

Рисунок 3. Схема экспериментального исследования биологических эффектов спермоплазменного преальбумина.

При проведении эксперимента достоверных различий между подвижностью сперматозоидов в контроле-1 и контроле-2 (при любых концентрациях альбумина в диапазоне от 1 мг/мл до 8 мг/мл) выявлено не было.

В то же время в опытной группе (концентрация преальбумина 8 мг/мл) двигательная активность сперматозоидов оказалась достоверно (р<0,01) сниженной по сравнению с контролями. Количество сперматозоидов с поступательным движением (категория а+Ь) в опытной группе было в 2 раза более низким, чем в контрольных группах.

Причем снижение произошло в основном за счет сперматозоидов с быстрым поступательным движением (категория а) - более чем в 2,3 раза по сравнению с контролями.

Скорость сперматозоидов в опытной группе по сравнению с контрольными группами была существенно ниже (в среднем на 0,8 мм/мин) (таблица 2).

Таблица 2.

Биологическая активность спермоплазменного преальбумина.

Двигательные характеристики сперматозоидов После 30 минут инкубации

Контроль-1 (с жидкостью Гиние) Контроль-2 (с альбумином, 8 мг/мл) Опыт (с преальбу-мином, 8 мг/мл)

Поступательное движение (категория а+Ь), % 78,0 78,4 39,0*

Быстрое поступательное движение (категория а), % 63,0 62,4 27,0*

Медленное поступательное движение (категория Ь), % 15,0 16,0 12,0#

Непоступательное движение (категория с), % 6,0 3,6 18,0*

Неподвижные (категория с1), % 16,0 18,0 43,0*

Скорость, мм/мин 2,2 2,2 1,4*

Примечание: * - различия с контролем 1 и 2 достоверны, р<0,01; * - различия с контролем 1 и 2 не достоверны.

При снижении концентрации преальбумина выраженность двигательных нарушений сперматозоидов уменьшалась. При концентрации преальбумина равной 6 мг/мл, различия между опытной группой и контрольными группами становились незначительными, а при концентрации 5 мг/мл различия в двигательных характеристиках сперматозоидов в опыте и контролях отсутствовали.

Нами была предпринята попытка конкретизировать механизм действия спермоплазменного преальбумина на сперматозоиды. Для этого следующая серия экспериментов была проведена на демембранизированных сперматозоидах (рисунок 4).

Рисунок 4. Схема экспериментального исследования влияния спермоплазменно-го преальбумина на двигательные характеристики демембранизированных сперматозоидов.

Для демембранизации использовали выделенные в градиенте перколла сперматозоиды, которые затем обрабатывали демембранизирующей смесью. Затем контрольные и опытные образцы инкубировали 30 минут при температуре 37°С. Измерение двигательных характеристик сперматозоидов проводили по

стандартным общепринятым методам до начала эксперимента и после проведения инкубации.

Полученные в ходе проведения эксперимента результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Биологическая активность спермоплазменного преальбумина.

Двигательные характеристики сперматозоидов После 30 минут инкубации

Контроль-1 (интактные сперматозоиды и преальбу- мин, 8 мг/мл) Контроль-2 (демембра-низирован-ные сперматозоиды и альбумин, 8 мг/мл) Опыт (демембрани-зированные сперматозоиды и преаль-бумин, 8 мг/мл)

Поступательное движение (категория а+Ь), % 38,6* 60,8 # 58,5

Быстрое поступательное движение (категория а), % 26,4* 44 # 40,3

Медленное поступательное движение (категория Ь), % 12,2* 16,8 # 18,2

Непоступательное движение (категория с), % 17,4* 10,2* 8,5

Неподвижные (категория с1), % 44* 29* 33

Скорость, мм/мин 1,4* 2,19 2,1

Примечание: * - различия с опытом достоверно, р<0,01; * - различия с опытом не досто верно.

Согласно полученным данным, двигательные характеристики демем бранизированных сперматозоидов под воздействием спермоплазменного пре альбумина (опыт) практически не изменятся (по сравнению с контролем-2).

Вероятно, действие преальбумина, приводящее к снижению подвижно сти сперматозоидов, направлено на изменение свойств мембраны и/или реализу ется за счет взаимодействия с поверхностными рецепторами мембраны сперма тозоидов.

Одной из частых причин нарушения подвижности является повышен® ригидности мембран сперматозоидов [Ка]^а\¥а К., й а1., 2004; ВийГопе М. в., е а1., 2008].

Общепризнанным способом оценки ригидности мембран сперматозои дов, является ЯО^-^/ (тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов [Руководство ВОЗ, 2001]. Применение этого теста было взято за основу при про ведении следующего эксперимента (рисунок 5).

Рисунок 5. Схема экспериментального исследования влияния спермоплазменно-го преальбумина на проницаемость мембран сперматозоидов.

Набухшие сперматозоиды идентифицировали по типичным морфологическим изменениям их хвостов (формы ¿>-£ в соответствии с классификацией ВОЗ [Руководство ВОЗ, 2001]). Для получения среднего процента дважды подсчитывали число набухших клеток на 200 исследованных сперматозоидов.

Полученные результаты представлены в виде гистограммы (рисунок 6). Как видно из полученных данных, воздействие преальбумина приводит к повышению ригидности мембран сперматозоидов, что и может объяснять снижение двигательных характеристик сперматозоидов, которые мы наблюдали в предыдущих опытах.

§ Р

■е- 2

Й- ь О о £ т

го ш £ 2 о. т

90 80 70 60 50 40 30 20 10

Контроль-1 Контроль-2

Экспериментальные группы

Опыт

Рисунок 6. Результаты теста на гипоосмотическое набухание сперматозоидов (различие между опытом и контролем-1 достоверно, р<0,01; различие между опытом и контролем-2 достоверно, р<0,01).

При воспалении наблюдается повреждение клеточных мембран сперматозоидов в результате активации процесса перекисного окисления липидов [Ье-1. е1 а!., 2005; Као Б.-Н. а а1., 2008].

Одним из ведущих факторов повреждения мембран сперматозоидов является пероксид водорода. Представляло интерес оценить эффект воздействия пероксида водорода (в конечной концентрации 0,25% [Кгащег Т. Б. е! а1., 2009]) на интактные и обработанные преальбумином сперматозоиды (рисунок 7).

После воздействия пероксида водорода в контрольной группе произошло ожидаемое снижение количества жизнеспособных сперматозоидов (до 12%).

После воздействия пероксида водорода среди сперматозоидов, предварительно обработанных спермоплазменным преальбумином (опыт), количество жизнеспособных сперматозоидов оказалось более чем в 2,5 раза больше (33%), чем в контроле (рисунок 8).

Рисунок 7. Схема экспериментального исследования влияния пероксида водорода на сперматозоиды ингибированные спермоплазменным преальбумином.

То есть, спермоплазменный преальбумга, вероятно, является протектором клеточной мембраны сперматозоидов в условиях воздействия пероксида водорода.

До воздействия пероксида водорода

После воздействия пероксида водорода

□ Контроль ИОпыт

Рисунок 8. Результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов по метод) Блома (до воздействия пероксида водорода различие между контролем и опытом не достоверно; после воздействия пероксида водорода различие между контролем и опытом достоверно, р<0,01).

Определение преалъбумина, альбумина, С-реактивного белка и а2-макроглобулина в епермоплазме здоровых фертильных мужчин

Нами были обследованы эякуляты 42 здоровых мужчин от 19 лет до 38 лет (средний возраст 27,0±3,5 лет) с подтвержденной фертильностью. У всех мужчин при исследовании эякулята по протоколу ВОЗ [№езсЫа§ Е. а1., 2010]. заключение по спермограмме было — «нормозооспермия».

Далее нами было проведено исследование концентрации преальбумина (для количественного определения спермоплазменного преальбумина нами использовался метод радиальной иммунодиффузии по Манчини) и некоторых других белков спермоплазмы, а именно альбумина, С-реактивного белка и а2-макроглобулина.

По нашим данным в епермоплазме здоровых фертильных мужчин уровень общего белка составлял от 54,40 г/л до 69,00 г/л, что сопоставимо с уровнем белков в сыворотке крови. Средние значения концентраций определенных нами в епермоплазме белков сгруппированы в таблице 4.

Таблица 4.

Концентрация преальбумина и некоторых белков в епермоплазме здоровых фертильных мужчин (и=42). ____

Характеристики Общий белок, г/л Преаль-бумин, г/л Альбумин, г/л С- Реактивный белок, мг/л <22-Макроглобулин, мг/л

Средняя концентрация 64,13 ±3,42 3,08 ±0,63 14,72 ±1,01 1,73 ±0,52 9,15 ±0,57

Исследование эякулятов мужчин с воспалительными заболеваниями предстательной железы и органов мошонки

Всего нами были обследованы 179 мужчин с воспалительными заболеваниями предстательной железы и органов мошонки в возрасте от 21 года до 46 лет (средний возраст 28,5±3,8 лет).

В группе с верифицированным диагнозом хронический простатит (код по МКБ-10: #41.1) было обследовано 133 мужчины в возрасте от 20 лет до 46 1ет (средний возраст 28,0±3,8 лет). У всех пациентов было проведено определение в спермоплазме концентрации преальбумина, а также альбумина, С-эеактивного белка, ог2-макроглобулина и общего белка.

У всех пациентов проводилось исследование эякулята - спермограмма. По результатам спермограммы и с учетом анамнестических данных мужчины зыли подразделены на две основные группы: фертильные с нормозоосперией и ;убфертильные с патозооспермией. В группе фертильных мужчин с нормозоос-пермией было 25 пациентов в возрасте от 21 года до 42 лет (средний возраст 28,8±4,7 лет). Группа субфертильных мужчин с патозооспермией включала 108 пациентов в возрасте от 20 лет до 46 лет (средний возраст 27,9±3,5 лет). В свою очередь в группе субфертильных мужчин были выделены четыре подгруппы в зависимости от типа патозооспермии: 1) олигозооспермия («=34), 2) астенозоос-пермия («=24), 3) тератозооспермия («=13), 4) олигоастенотератозооспермия («=37).

Средние значения концентраций исследуемых белков в образцах спер-моплазмы фертильных и субфертильных больных хроническим простатитом представлены в таблице 5. Как видно из полученных данных, тип патозооспермии существенно не влияет на уровень общего белка, а также на уровни альбумина, С-реактивного белка и а2-макроглобулина. Из особенностей можно отметить только достоверное повышение в спермоплазме уровня преальбумина при астенозооспермии (таблица 5).

В группе с верифицированным диагнозом орхит, эпидидимит и эпиди-димо-орхит (код по МКБ-10: #45.9) было обследовано 46 мужчин в возрасте от 21 года до 41 года (средний возраст 29,7±3,5 лет).

У всех пациентов с воспалительными заболеваниями органов мошонки было проведено исследование эякулята. С учетом результатов спермограммы и анамнестических данных мужчины были разделены на две основные группы: фертильные с нормозооспермией и субфертильные с патозооспермией. Группу фертильных мужчин с нормозооспермией составили 9 пациентов в возрасте от 23 лет до 36 лет (средний возраст 29,2±2,2 лет). Группа субфертильных пациентов с патозооспермией включала 37 мужчин в возрасте от 21 года до 41 года (средний возраст 29,1±3,8 лет). Все они были разделены на четыре подгруппы в соответствии с типом патозооспермии: 1) олигозооспермия (л=11), 2) астенозо-оспермия («=7), 3) тератозооспермия («=6), 4) олигоастенотератозооспермия («=13).

Таблица'.

Концентрация преальбумина и некоторых белков в спермоплазме фертильных

субфертильных мужчин, страдающих хроническим простатитом.

Заключение по спермограмме Общий белок, г/л Преаль-бумин, г/л Альбумин, г/л С- Реактивный белок, мг/л а2-Макроглобулин, мг/л

Нормозооспермия («=25) 61,48" ±7,02 3,83* ±0,89 12,02" ±1,70 12,38* ±4,18 5,45* ±0,66

Олигозооспермия (»=34) 60,15' ±5,78 4,61" ±0,72 12,02" ±1,51 14,62* ±3,93 4,20* ±0,64

Астенозооспермия («=24) 60,21" ±7,07 7,22* ±0,73 12,20" ±1,86 14,41* ±1,86 4,68* ±0,59

Тератозооспермия («=13) 61,54" ±5,42 4,18" ±0,95 12,13" ±1,74 15,0* ±3,05 4,02* ±1,11

Олигоастенотерато-зооспермия («=37) 59,84" ±5,94 5,88* ±0,65 12,05" ±2,03 16,6* ±4,0 3,40* ±0,49

Примечание: * - различие с группой здоровых фертильных мужчин достоверно, р<0,01; - различие с группой здоровых фертильных мужчин не достоверно.

Тип патозооспермии не оказывал существенного влияния на уровен общего белка, а также на уровни альбумина и С-реактивного белка. Следует от метить некоторое повышение в спермоплазме уровня преальбумина при нару шении подвижности сперматозоидов, а также снижение (почти в 2 раза) уровн ог-макроглобулина (таблица 6).

Таблица б

Концентрация преальбумина и некоторых белков в спермоплазме фертильных ]

субфертильных мужчин с воспалительными заболеваниями органов мошонки.

Заключение по спермограмме Общий белок, г/л Преаль-бумин, г/л Альбумин, г/л С-Реактивный белок, мг/л а2-Макроглобулин, мг/л

Нормозооспермия («=9) 62,11" ±4,54 4,06" ±0,81 12,5" ±2,51 15,0* ±4,2 3,27* ±0,83

Олигозооспермия («=11) 60,9 Г ±7,01 5,22* ±1,14 12,32" ±1,76 15,55* ±6,14 2,63* ±0,67

Астенозооспермия («=7) 62,43" ±4,82 7,91* ±1,15 13,27" ±1,82 21,66* ±7,11 2,51* ±0,56

Тератозооспермия («=6) 62,17" ±6,11 5,07* ±0,72 13,65" ±1,53 16,66* ±3,74 2,65* ±0,85

Олигоастенотерато-зооспермия («=13) 63,54" ±6,56 7,02* ±1,19 13,22" ±2,18 17,85* ±4,55 2,05* ±0,49

Примечание: * — различие с группой здоровых фертильных мужчин достоверно, р<0,01; - различие с группой здоровых фертильных мужчин не достоверно.

Биохимический способ топической диагностики воспалительных заболеваний при лейкоспермии При лейкоспермии, то есть при концентрации лейкоцитов, превышаю-1ей один миллион в одном миллилитре эякулята, в ряде случаев, трудно провес-и топическую диагностику воспалительного процесса ex tempore [Fedder J., 004; Sikka S. С. et al., 2008]. Особенно при достаточно распространенных мало-имптомных или бессимптомных формах течения заболеваний [Дмитриев Г. А. и р., 2007; Toth А., 2004; Nieschlag Е. et al., 2010]. В таких случаях экспресс диаг-остика, основанная на исследовании биохимического состава спермоплазмы, казывается весьма актуальной.

Первичный анализ полученных данных позволил выделить два белка, а менно преальбумин и ог2-макроглобулин, являющихся наиболее перспективны-[и для топической диагностики при лейкоспермии. С учетом этого нами был редложен способ диагностики, основанный на одновременном определении в пермоплазме концентрации преальбумина и аг2-макроглобулина с расчетом со-тношения между ними по следующей формуле:

преАЛБ

ктд = ^мГ'

де КТД - коэффтщент топической диагностики,

преАЛБ - концентрация преальбумина в спермоплазме в мг/л, ог2МГ - концентрация ог2-макроглобулина в спермоплазме в мг/л. Расширенный анализ способа топической диагностики воспалительных аболеваний при лейкоспермии основанный на определении коэффициента то-ической диагностики (КТД), показал, что оптимальные пороговые значения оэффициента топической диагностики равны 500 и 2500. То есть при воспали-ельных заболеваниях предстательной железы КТД принимает значения от 500 о 2500, а при воспалительных заболеваниях органов мошонки значение КТД ревышает 2500.

При данных пороговых значениях специфичность способа составила 7,5%, чувствительность - 90,7%, эффективность - 90,0%, прогностическое зна-ение положительного результата - 96,3%, прогностическое значение отрица-ельного результата — 72,4%.

Биохимический способ диагностики воспалительных заболеваний мужской репродуктивной системы при нормальном уровне лейкоцитов в эякуляте Наличие воспалительных заболеваний мужской репродуктивной систе-[Ы при исследовании спермы устанавливают, как правило, по концентрации ейкощггов превышающей 10б в 1 мл [Keck С. et al., 2005; Villarroel V. et al., 008]. Но в ряде случаев воспалительный процесс протекает без повышения онцентрации лейкоцитов в сперме [Nieschlag Е. et al., 2010]. Для лабораторной иагностики воспалительных заболеваний мужской репродуктивной системы, на аш взгляд, представляют большой интерес способы диагностики воспалитель-ого процесса не зависящие от уровня лейкоцитов, но обладающие достаточной

специфичностью.

Первичный анализ полученных данных позволил выделить два белк спермоплазмы, а именно преальбумин и С-реактивный белок, являющихся нан более перспективными для диагностики воспалительных заболеваний мужско: репродуктивной системы.

На основании полученных данных нами был разработан способ диагно стики основанный на одновременном определении в спермоплазме концентра ции преальбумина и С-реактивного белка. При конструировании способа диаг ностики оказалось, что удобнее использовать ранжированные значения, а не аб солютную концентрацию С-реактивного белка в спермоплазме.

С учетом проведенного ранжирования формула для выявления воспале ния органов мужской репродуктивной системы на основе биохимического ис следования спермоплазмы приобрела следующий вид:

КДВ = преАЛБ х СРБ, где КДВ - коэффициент диагностики воспаления,

преАЛБ - абсолютное значение концентрации преальбумина в спермо плазме в мг/л,

СРБ - значение ранга концентрации С-реактивного белка в спермоплаз

ме.

Расширенный анализ способа топической диагностики воспалительны: заболеваний при лейкоспермии основанный на определении коэффициента ди агностики воспаления (КДВ), показал, что оптимальное пороговое значение ко эффициента диагностики воспаления равно 4500. То есть значение КДВ равное или превышающее 4500, свидетельствует о наличие воспалительного процесса: органах мужской репродуктивной системы.

При выбранном пороговом значении специфичность способа составляв' 97,6%, чувствительность - 92,1%, эффективность - 93,2%, прогностическое зна чение положительного результата — 99,3%, прогностическое значение отрица тельного результата - 74,5%.

Мы хотели бы подчеркнуть, что предлагаемый биохимический спосо( диагностики позволяет выявить воспаление органов мужской репродуктивно! системы даже при нормальном уровне лейкоцитов в сперме, что значительго расширяет возможности своевременной постановки точного диагноза.

Биохимический способ прогноза развития астенозооспермии при воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы

Нами было выявлено, что уровень преальбумина, как правило, выше 1 эякулятах с нарушением двигательных характеристик сперматозоидов. Для под тверждения взаимосвязи между уровнем преальбумина в спермоплазме и двига тельными характеристиками сперматозоидов (содержание сперматозоидов с ак тивной подвижностью (категории а+Ь), содержание неподвижных сперматозои дов (категория с/), скорость сперматозоидов (мм/мин)) было выполнено исследо вание и корреляционный анализ 34 образцов эякулятов мужчин с воспалитель ными заболеваниями органов репродуктивной системы.

Полученные нами данные корреляционного анализа представлены в ~аблице 7.

Таблица 7.

коэффициенты линейной корреляции двигательных характеристик спермато-

юидов и уровня преальбумина в спе рмоплазме.

Двигательные характеристики сперматозоидов коррелирующие с уровнем преальбумина Коэффициент линейной корреляции Уровень значимости

Сперматозоиды с активной подвижностью (категории а+Ь) г=-0,757 р<0,001

Неподвижные сперматозоиды (категория с/), г=0,683 /><0,001

Скорость сперматозоидов г=-0,646 р<0,001

Проведенный корреляционный анализ позволил установить достоверную взаимосвязь между уровнем преальбумина в спермоплазме и подвижностью сперматозоидов.

Для разработки биохимического способа прогноза развития астенозоос-пермии при воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы нами был проведен дальнейший анализ, который позволил установить, что уровень преальбумина в спермоплазме отрицательно коррелирует с возрастом (коэффициент корреляции г=-0,409, уровень значимости р<0,01), что необходимо было учитывать.

Анализ полученных данных позволил сконструировать формулу для прогнозирования развития астенозооспермии при воспалительных заболеваниях мужской репродуктивной системы, где учитывалась поправка на возраст пациента, а влияние других факторов частично нивелировалось за счет введения отношения к уровню белка (альбумина), имеющего достаточно стабильный уровень в спермоплазме вне зависимости от характера патологии.

В окончательном варианте формула для прогнозирования развития астенозооспермии при воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы имела следующий вид:

преАЛБ х ^(ВП)

ПКА =-АЛБ-'

где ПКА - прогностический коэффициент развития астенозооспермии,

преАЛБ - абсолютное значение концентрации преальбумина в спермоплазме в г/л,

ВП - возраст пациента (полных лет),

АЛБ - абсолютное значение концентрации альбумина в спермоплазме в

г/л.

Расширенный анализ предлагаемого способа прогноза развития астенозооспермии показал, что оптимальное пороговое значение прогностического

коэффициента равно 0,49. То есть значение ПКА равное или превышающее 0,49 свидетельствует о высоком риске развития астенозооспермии при воспалитель ных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы.

Нами были обследованы пациенты с воспалительными заболеваниям) предстательной железы и/или органов мошонки. Из них был отобран 31 пациен-в возрасте от 21 года до 42 лет (средний возраст 29,1±4,1 лет) с нормозооспер мией. У этой группы пациентов кроме стандартной спермограммы было прове дено определение в спермоплазме преальбумина и альбумина, а затем рассчита! прогностический коэффициент астенозооспермии (ПКА). На основании значе ния ПКА превышающего 0,49 у 7 пациентов был сделан прогноз высокого риск; развития нарушений двигательных характеристик сперматозоидов.

Повторно характеристики спермограммы у пациентов оценивали через ' год. Наличие нарушения двигательных характеристик сперматозоидов у пациен тов с ПКА, превышающий пороговое значение (0,49), расценивали как истиннс положительный результат. Отсутствие признаков астенозооспермии у пациента с ПКА, превышающий пороговое значение (0,49), расценивали как ложно поло жительный результат. Сохранение нормозооспермии у пациентов с ПКА, ш превышающий пороговое значение (0,49), расценивали как истинно отрицатель' ный результат. Развитие астенозооспермии у пациентов, имеющих ПКА ниже порогового значения (0,49), относили к ложно отрицательным результатам. Полученные данные приведены в таблице 8.

Таблица 8

Результаты проверки эффективности биохимического способа прогноза развития астенозооспермии на основании проведения спермограммы через один год.

Интерпретация полученных Количество полученных

результатов проверки результатов

Истинно положительный результат 6

Ложно положительный результат 1

Истинно отрицательный результат 22

Ложно отрицательный результат 2

Таким образом, при пороговом значении КДВ равном 4,9, предлагаемый биохимический способ прогноза развития астенозооспермии имеет достаточно высокие характеристики (специфичность - 95,6%, чувствительность - 75,0%. эффективность - 90,3%, прогностическое значение положительного результата -85,7%, прогностическое значение отрицательного результата - 91,6%), что позволяет рекомендовать его при формировании групп риска развития нарушения двигательных характеристик сперматозоидов при воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы.

ВЫВОДЫ

Спермоплазменный преальбумин имеет молекулярную массу 43 кДа, изо-электрическую точку 4,9, выявляется в епермоплазме здоровых фертильных мужчин в 100% случаев и имеет среднюю концентрацию 3,08±0,63 г/л (от 1,10 г/л до 4,50 г/л).

С-реактивный белок выявляется менее чем в 20 % образцов спермоплаз-мы здоровых фертильных мужчин (максимальная концентрация 3,50 мг/л), но более чем в 75 % образцов спермоплазмы больных хроническим простатитом (максимальная концентрация 60,10 мг/л). Уровень а2-макроглобулина в епермоплазме у мужчин с воспалительными заболеваниями органов мошонки в среднем в 2 раза ниже, чем у здоровых фертильных мужчин.

Спермоплазменный преальбумин в 2,5 раза повышает выживаемость сперматозоидов в условиях воздействия на них пероксида водорода.

Уровень преальбумина в епермоплазме является маркером воспаления органов репродуктивной системы, причем более чувствительным и специфичным, чем уровень лейкоцитов в эякуляте. При воспалении органов мошонки уровень преальбумина в епермоплазме в среднем выше, чем при воспалении предстательной железы.

Практические рекомендации

Определение в епермоплазме преальбумина и ог2-макроглобулина позволяет при их соотношении от 500 до 2500 диагностировать хронический простатит, а при их соотношении 2500 и выше диагностировать воспалительные заболевания органов мошонки.

Определение в епермоплазме преальбумина и С-реактивного белка позволяет при значении произведения концентрации преальбумина и ранга С-реактивного белка равном или превышающем 4500 диагностировать воспаление органов мужской репродуктивной системы даже при пороговом или нормальном уровне лейкоцитов в сперме.

Определение при воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы в епермоплазме преальбумина и альбумина позволяет при значении отношения (произведения концентрации преальбумина на десятичный логарифм возраста пациента) к концентрации альбумина равном или превышающем 0,49 прогнозировать развитие астенозооспермии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1) Николаев А. А., Луцкий Д. Л., Ложкина Л. В., Луцкая А. М. Уровень ингибЕ тора тиоловых протеиназ при различных формах субфертильности у мужчш // Труды АГМА T.24(XLVIII). - Астрахань, 2002. - С. 74-76.

2) Гайнуллина Л. X., Луцкая А. М.. Ефимова А. В., Луцкий Д. Л. Комплексно исследование эякулята при бесплодии у собак. // Труды АГМА T.28(LII). Астрахань, 2003. - С. 150-152.

3) Луцкий Д. Л., Николаев А. А., Луцкая А. М. Уровень спермоплазменног ингибитора тиоловых протеиназ при субфертильности у мужчин. // Мат. Г междунар. науч.-практич. конф. «Здоровье и Образование XXI Век». - Моек ва, 2003.-С. 414-415.

4) Выборное С. В., Луцкая А. М.. Зульбалаева Д. Ф., Николаев А. А., Луцкий J. Л. Нарушение гликозилирования лактоферрина при урогенитальных микс плазмозах. // Фундаментальные исследования. -2004. -№ 2. -С. 173-174.

5) Луцкий Д. Л., Николаев А. А., Луцкая А. М„ Выборное С. В. Особенност: протеома спермы при хроническом урогенитальном трихомонозе. // Фунда ментальные исследования. - 2004. -№ 2. - С. 174-175.

6) Луцкая А. М„ Николаев А. А., Ефимов Т. В., Луцкий Д. Л., Плосконос М. Е Использование программы для ЭВМ «ПН 5108» при количественной оценк электрофореза белков. // Мат. VII междунар. конф. «Эколого-биологически проблемы бассейна Каспийского моря». - Астрахань, 2004. - С. 63-65.

7) Николаев А. А., Луцкий Д. Л., Николаев А. А., Луцкая А. М. Патохимически основы нарушения вязкости эякулята. // Клиническая лабораторная диаг ностика. -2004. -№ 9. _ с. 86-87.

8) Луцкая А. М„ Николаев А. А., Луцкий Д. Л. Метод оценки межмолекуляр ных взаимодействий в системе «белок-ксенобиотик». // Мат. V междунар. на уч.-практич. конф. «Здоровье и Образование XXI Век». — Москва, 2004. — С 272-273.

9) Луцкая А. М.. Николаев А. А., Луцкий Д. Л. Количественная оценка межмо лекулярных взаимодействий в системе «белок-антибиотик». // Мат. VIII меж дунар. конф. «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского мо ря». - Астрахань, 2005. - С. 186-187.

10)Луцкий Д. Л., Тюрина А. А., Луцкая А. М., Николаев А. А., Гончарова Л. А Региональные особенности этиологических факторов заболеваний, передаю щихся половым путем в Нижнем Поволжье. // Мат. VI междунар. науч. практич. конф. «Здоровье и Образование XXI Век». - Москва, 2005. - С. 478479.

11)Николаев А. А., Луцкая А. М.. Луцкий Д. Л., Думченко В. В. Иммунохимиче екая идентификация ингибина-В спермоплазмы человека. // Фундаменталь ные исследования. - 2005. — № 2. — С. 29—30.

12)Луцкий Д. Л., Николаев А. А., Луцкая А. М. Морфологические изменена сперматозоидов при трихомониазе. // Успехи современного естествознания. -2005.-№ 12. — С.83-84.

13~)Луцкая А. М.. Луцкий Д. Л., Николаев А. А. Определение сывороточног

преальбумина и орозомукоида при острых адиекситах. // Современные наукоемкие технологии. — 2006. — № 7. — С. 55—56.

4)Луцкая Л. М., Осипова М. У., Лудкий Д. Л. Методы исследования транспортной функции белков. // Мат. VII междунар. науч.-практич. конф. «Здоровье и Образование XXI Век». - Москва, 2006. - С. 309-310.

5)Луцкий Д. Л., Зульбалаева Д. Ф., Луцкая А. М. Динамика уровня лактофер-рина во влагалищной жидкости. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - № 9. - С. 64-65.

6)Луцкий Д. Л., Выборнов С. В., Луцкая А. М„ Гончарова Л. А., Махмудов Р. М. Влияние химических факторов на состояние мужской репродуктивной системы. Часть I. Металлы. // Проблемы репродукции. - 2009. - Т. 15, № 6. - С. 48-54.

7)Луцкий Д. Л., Выборнов С. В., Луцкая А. М- Гончарова Л. А., Махмудов Р. М. Влияние химических факторов на состояние мужской репродуктивной системы. Часть И. Органические растворители и пестициды. // Проблемы репродукции.-2009.-Т. 15, №6.-С. 54-59.

8)Луцкий Д. Л., Выборнов С. В., Луцкая А. М.. Гончарова Л. А., Махмудов Р. М. Влияние химических факторов на состояние мужской репродуктивной системы. Часть III. Токсиканты в сперме. Экологические и промышленные полютанты в спермоплазме. // Проблемы репродукции. - 2009. - Т. 15, № 6. -С. 59-64.

9)Луцкий Д. Л., Махмудов Р. М., Луцкая А. М. Исследование эякулята и его компонентов в диагностике воспалительных заболеваний мужской репродуктивной системы. // Проблемы репродукции. - 2011. - Т. 17, № 1. - С. 83-87.

:0)Луцкий Д. Л., Махмудов Р. М., Луцкая А. М. Исследование эякулята и его компонентов в диагностике воспалительных заболеваний мужской репродуктивной системы: белки, антиспермальные антитела. // Проблемы репродукции.-2011.-Т. 17,№2.-С. 84-88.

11)Луцкий Д. Л., Махмудов Р. М., Луцкая А. М. Исследование эякулята и его компонентов в диагностике воспалительных заболеваний мужской репродуктивной системы: ферменты, простасомы. // Проблемы репродукции. - 2011. -Т. 17, № 3. - С. 82-84.

12)Луцкий Д. Л., Махмудов Р. М., Луцкая А. М. Исследование эякулята и его компонентов в диагностике воспалительных заболеваний мужской репродуктивной системы: клеточный состав, патогены. // Проблемы репродукции. -2011.-Т. 17,№5.-С. 77-82.

Биохимическое исследование пральбумина спермоплазмы при заболеваниях репродуктивной системы мужчин

Луцкая Аделя Мукминовна (Россия)

В данной работе было проведено изучение преальбумина спермоплазм] человека. Было экспериментально исследовано влияние спермоплазменного пре альбумина на двигательные характеристики демембранизированных человече ских сперматозоидов. Было установлено, что спермоплазменный преальбуми может повышать жизнеспособность сперматозоидов. Проведено исследовани уровня спермоплазменного преальбумина при воспалительных заболевания предстательной железы и органов мошонки. Бьшо установлено, что риск разви тия астенозооспермии был высокий при хронических воспалительных заболева ниях органов репродуктивной системы мужчин, протекающих с повышенны; уровнем преальбумина в спермоплазме. В работе предложен способ топическо диагностики воспалительных заболеваний органов мужской репродуктивно; системы, основанный на определении в спермоплазме преальбумина и а2 макроглобулина.

Biochemical studies seminal plasma prealbumin at diseases of reproductive system of men

Adelya Lutskay (Russia)

The study of prealbumin of human seminal plasma was executed in this work Influences of prealbumin of seminal plasma were experimentally investigated on mo tility demembranated human spermatozoa. It was set that prealbumin of seminal plas ma can increase viability of spermatozoa. Research of level of prealbumin of semina plasma was conducted at the inflammatory diseases of prostate and organs of scrotum It was found that the risk of asthenozoospermia was higher in chronic inflammatory diseases of the male reproductive system that occur with increased levels of prealbu min in the seminal plasma. In this work proposed a method of topical diagnosis o inflammatory diseases of the male reproductive system based on the definition in th< seminal plasma prealbumin and a2-macroglobulin.

ЛУЦКАЯ АДЕЛЯ МУКМИНОВНА

БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕАЛЬБУМИНА СПЕРМОПЛАЗМЫ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ

МУЖЧИН

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 10.09. 2012 г. Тираж 100 экз. Заказ № 3293.

Издательство ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития России 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121.