Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические аспекты патогенности трихинелл

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические аспекты патогенности трихинелл"

**сс»*яе» " 2 ^ 3 9'- 3

^рсг^еим*»

пут*кШНИСТЕЮТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ Я5ССИЙЗКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ^'•^ОСТОВСКИЙ 01ЛЕНА Д ВДОВЫ НАЮДОВ мвдицижшй ИНСТИТУТ

•4-Л¡1;' .к

—в-----

На правах рукописи

СИВОВОЛОВА Ирина Анатольевна БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ШОГЕНЮСТИ ТЙШШЕИ 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кадцидата биологических наук

Ростов-на-Дону ^

1993

Работа выполнена в Ростовском институте микробиологии и паразитологии НЮ "Биопрепарат" Государственного комитета сан-эпиднадзора Российской Федерации

Научный руководитель - доктор медицинских наук,

профессор Шепелев А.П.

Научный консультант - доктор медлцинскях наук,

профессор, заслуженный деятель науки Й Васерии Ю.Й.

Официальные оппоненты- доктор биологических наук,

с.н.с. Бенедиктов И.И, доктор биологических наук, <х.н,с. Микашнович З.й.

Ведущая организация - Московский институт медицинской

паразитологии и тропической медида ш.Б .И .Марциновского

Защита состоится 1993 г. в /^чао. на заев,

нии специализированного совета Д 084.53.01 при Ростовском орде Дружбы народов медицинском институте (344700, г.1Ьстов-ва-Дону пер,Нахичеванский,29).

С диссертацией «окно ознакомиться в библиотеке Роотовског медицинского института.

Автореферат разослан " (3. " хМ^ИЪ Х993 г,

■ Ученый секретарь специализированного совета

доцент ' Н.Я.Корганов

-3-

ОБЦАЛ ХАРАКТЕ Б1СТИКА - РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Т л^ппаллез является одной из важных паразитарных болезней человека и .тавотных л распространен почта повсеместно. Исследования по трихинеллезу ведутся ео многих странах мира. С 1958г. их координирует 1,1евдУнародная трихи-неллезная комиссия.

В последние годы достигнуты определенные успехи по вопросам систематики я биологии трихинелл (Гаркавн Б.Л., 1985; Бессонов А.С. ,1981,1988: Брятоз З.А., Хомутова Т.Н., 19Э2; Нагоршй С.А., 1985, IS89; Дманова Е.А., 1932; Fukuraoto S. et al., 1988-, Posio E. et al., 1969; Albarran E. et al.,1990). Разработаны новые методы п средства специфической диагностики трихинеллеза (Полетаева О.Г. и др., 1988: IS90;clian Ко Roland С., 1988; Chapa-

Rula м.к, et al. т 1989), эффективные схемы лечения данного заболевания в зависимости от многообразных клинических проявлений (Клейн Ю.С,, TSoO; Оэерецксвская Н.Н.. 1988, 1932; Пероверзева З.Б., 1988; Kocíocka V/. et al. , 1990).

По тяжести клинического течения, осложнениям, числу летальных исходов, трихинеллез может быть отнесен к группе наиболее опасных■паразитарных заболевании. Патогенез трихинеллеза складывается из трех основных стадий: кишечной, миграционной и мышечной (Озерецковская Н.Н», I9V8). Многообразие клинических проявлений трихинеллеза связывают с высокий "уровней патогенное тп" Trichinella

gpiroiis. в связи с чем, данный гельминт отнесен к наиболее патогенным видам в гельминтологии (Астафьев Б.Л,, 1975, 1989). Т рлли'жлл;/ обладает ыощ'ШЦ с е}: с т i Í: г.ч 11 з г i p.v зэ";: i г.1 фактором, сдособ-лх'ШЗ к :.¡accobO£ü' о худению очинок в кишечнике хозяина и поранения значительного числа видов животных и человека. Указанные факторы остаются биохимически я пммупологпчеекп нецдентиплциро-гзкгегж. Не изучены механизма, обсспсчлнащпс прикрепление трк-ххнзлл к сэотвсгсгвукщйм морфологическим структурам макр-юрганлз-ма, их проникновение во внутренняя среду организма, интоксикации и другие проявления болезни.

Прямые доказательства наличия-этих факторов у грихинеял ограничиваются выявлением у них фермента гиадуронндазы, баз 'детального изучения се повреддагцего действия. '

Заявление а изучение биохимической природы: различных факторов ласогокяоста трихинелл, определение водудгх факторов, оэтет-стаенных заадгезия, проницаемость, токсичность, bqsíiqsho,налетят НОЕ1ГЗ подходи z поиску этгосрсзязх ерздегз леченая т&хляаллоэз.

и помогут при разработке новых' биохимических или иммунологических гестов диагностирования, данного заболевания.

Цель к задачи доследования. Цель настоящего исследования: выявить и дать биохимическую характеристик.'? биологически активным макромолекулам (БАМ) трихинелл, ответственным за их патогенное м> и определить пути совершенствования диагностики трихинеллеза на основе выявленных факторов патогенности.

Для достижения поставленной дели решались следующие задачи:

- стандартизировать методы выделения и концентрирования новорожденных и инвазионных личинок, половозрелых особей трихинелл;

- разработать и стандартизировать метод получения белкового экстракта из гомогенатов трихинелл разных стадий развития;

- изучить.белковый спектр -трихинелл (инвазионные и новорожденные личинки^ половозрелые особи) на примере "эталонных" штаммов и местных природных изолятов;

- выявить и охарактеризовать адгезивную активность (адгезины, лек-тины-гемаггдютинины), факторы проницаемости (гиалуронидаза), нейраминидаза) и токсичности т. ар1га11в раЗШХ стадий развития;

- разработать и дать оценку специфичности и чувствительности методов диагностики трихинеллеза, основанных на использовании выявленных Факторов патогепности трихинелл.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые у нематоды вида Тг1сМпа11а ар1га11а обнаружены биологически-активные макромолекулы (недраминидаза, гемагглютинин, гемолизин, цитотоксины). Подтверждено наличие гиалуронидазы и определена ее активность как для кутикулярннх, так и водорастворимых белков трихинелл. Дана молекулдряо-бяологическая характеристика гемагглютя-нина трихинелл и определена молекулярная масса остальных выявлена, биомолекул. Среди растворимых белков трихинелл особый интерес представляет группа белков с м.м. 36-38кДа, обладающих темолити-ческой, гемагглютинирующей и цитотокспческоЯ активностью.

Наличие выявленных активных биомолёкул в организме трихинелл можно связать с участием их в процессе возникновения и развития данного заболевания,_т.е. охарактеризовать как бакторы патоген-ности. Данные Факторы патогепности обнаружены у инвазионных личинок и половозрелых особей и не выявлены у новорожденных личинок ' трихинелл.

Выявленные гемагглютинин и цитотоксины трихинелл обладают ан. тпгенкостьэ. Показана принципиальная:возможность использования

очпзсгппл препаратов гемагглгатишша трихинелл для серологической диагностики данного-заболевания. -----

Практическая значимость. Стандартизированы методы выделения и концентрирования личинок и половозрелых особей трихинелл, разработан ойтнмалып;."; метод получения белкового экстракта из гомоге-натов т,у::хинолл разных стадия развития. Данные метода рекомендованы к использовании в научно-исследовательских учреждениях гельминтологического про'иля. На основании анализа белкового спектра трихинелл* выявлены белки, присущие определенно;' стадии их развития, что открш>«ют воз::,отпоить их. применения в диагностических и&лях.

Выявление антигенных свойств у некоторых "акторов патогеннос-ти трихинелл, в частности, у гемагглютпшша, позволяло использовать ого в реакции тормояения гемагглютяпации для обнаружения специфических антител ft сиворотке крови больных трихинеллезом. Полученные знания о наличии и природе факторов патогенноети у трихинелл открывают новые подходы к изучению, диагностике, лечению и Поиску новых .-Гармакологкчссккз: средств при трихинеллезе.

ДрлоаенпА«, шпосимие па защиту:

- разработка и применение сгавдзртлзировашшх методов исследования трихинелл, позголивпкх получать сопоставимые данные по характеристике белгов разлглшх стсглов и фаз развития;

- разработка методики о трогдекия оплодотворенными самками личинок, грпхянеял in vitro » дачцеГ; возможность получать максимальный выход биомассы в первые часы культивирования;

- выявление общности белкового состава "эталонных" штаммой и местных, географически удаленных изолятов трихинелл Ьри использовании метода детергентного электрофореза. У трех стада;" развития Т» spiralis (цоворездеппые, инвазионные личинки, половозрелые особи) установлено наличие общих и- стадиоспецифических белков;

- впервые в составе водорастворимых и кутикулярных белков половозрелых особбй и инвазионных личинок т- spiralis выявлено наличие гемагглютпшша, недраминядазы, гемолизина, штотоксяпов - факторов патогенности;

- установлено наличие антигенных свойств у гемагглзтяяияа■и пито-токспноз инвазионных личинок и половозрелых особей трихинелл.

Апробаш.д работы, матеразлг диссертации долоаеяы па симпозиуме АН СССР "Закторы регуляпал популяционных процессов у гедь-млягрг" (г.Пущгно, 1990), на 5-й а 6-5 Бсесоэзннх по

проблеме человека я ¡»квотных (¡.'.Новочеркасск, 1288; г.К::ра:>,1922).

Диссертационная работа апробирована на заседании: научно-производственного Совета "Паразитарные болезни человека" Ш СЭН E2?, научном Совете НПО "Биопрепарат",

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных patíoi получена приоритетная cnpai3Ka на предполагаемое изобретениеТе-магтлютинирущий антиген нематоды írichinella spiralis" от 29.04.92 г. .'5 5040403.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на /Oí страницах машинописного текста и состоит из введешш, четырех глав, включающих литературную справку и собственные исследования (материалы и методы, результаты и их обсуждение), заключения, еы-водов, практических рекомендаций, приложения и указателя литературы. Вабота иллюстрирована 5 таблицами и 13 рисунками. Библиографический .указатель содержит 132 источника литературы (70 отечественных и £2 иностранных). Цифровой материал диссертации обработан методами вариационной статистики.

СОДШАШЕ РАБОТЫ

I. Стандартизация методов выделения, концентрирования инвазионных и-новорожденных личинок, половозрелых особей трихинелл и получения байкового экстракта из их гомо-генатов, ' *

1.1. Материалы исследования.

Отработку методов выделения, концентрирования трихинелл разных стадий развития и получения белкового экстракта из их гомо-генатов осуществляли на "эталонном" штамме Trichineiia spiralis spiralis » который поддерживали в'лаборатории путем пассирования на неинбредных белых крысах массой 140-160 tí

1.2. Результаты исследования.

Для осуществления поставленной в данной работе цели, на первом этапе исследований были стандартизированы методы выделения инвазионных личинок и половозрелых особей трихинелл. Стандартизация этих методов включала в себя следу ада е процедуры: заражение per os лабораторных животных точно оттитрованной'дозой инвазионных личинок (20 лич./г массы тела для выделения инвазион- ' нкх личинок и ЭО лач./г массы тела для выделения половозрелых ocodeíí); выделение трихинелл из млечной ткани или кишечника (под

оптимальных уток:й); многократная отмывка трихинелл от пря-:..?ео2, э?лпчптэль2-:::л признаками предлагаемых методов

являются: консоль на отсутствие белков хозяина, определение жизнеспособности п концентрашш трихинелл в I мл гпзпологкческого раствора; заморгшизанис л хр-шоия*» трихинелл в шщком азоте;.

А$я получения нов омоете иных личинок трихинелл ln vitro ¿Ыл.з разработана методика, зсклэчащаяся в том, что цзллечегоадх из тонкого ккшечняка зараженных крыс половозрелых особой трихинелл G-?n дневного возраста мпогопратко отмывали стерилыяп сбаланси-ролапшл солевсы раствором Эрла с антибиотиками а помещали в чайки Петри (концентрация 5 особей/мл. среды), который отявш* в мстстэ? при i:r. '1-6 "асов цулынаи^ования в атмосферу "сгорев-uieii" свечи. После культивирования половозрелых особей отделяли от новорожденных личинок фильтрованием через капроновый Фильтр (размер ячейки 200х200мкм). Ко1щетрпроваш1е личинок осуществляли фильтрованием через мембранный упльтр "Владипор" ¡»Щ-ilA В 5. Личинок трихинелл, находящихся в минимальном объеме стерильного (физиологического раствора переносили в пластиковые пробирки и хранили в парах жидкого азота.

Отличит ель ко Г: особо гшостш дяяпоГ. м&ходккп является нсяоль-"оданне солевого раствора Эрла п качестве "голодно;;" питательно:', среж, и торий отполировал ярочеос о гроздония личкнзк :х позголтд поручать в 3-10 раз болыкз личинок за перше 4-6 час;г?.ульткварг!-1.-!"1я, чем при применении среди 'Лгла аля среди с раствором гпдроли за та лак тальбу мяиа.

Для извлечения Еодорастдорнтхгд белков из организма '¿-рщиш^.« разработай метод долучения белкового экстракта из знвих или замороженных трихинелл, основанный на предварительной гомогени-з..:хч'. трихинелл (илго^лондте дн'плн'.н л додорозредыо особи) и дал:-лелдо" обработкой •'егдзоу'ончнх г.ги'монтог.ультразвуком, Новсрсж-денные личинки трихинелл разрушали только ультразвуком. В качестве экстрагирующего и стабилизирующего реагента использовали 0,25?,4 раствор сахарозы. Использование» этто метода позволило пояупть до 69,7-10,66 миг белка от ЮСЗ инвазионных личинок или половозрелых особен и 98,5 ±9,46- мкг белка от 500 тыс. новорожденных личинок трихинелл.

2» ШШВНЗ СОСТАВ .ТЛимСЕЛЛ.

2,1. «¡ате^-палы и методы.

исследование белкового состава трихинелл проводили ¡тс д.,:/.-' "оталоднш:" дтадмпх: Т. spiralis spiralis т. spiral in netlva л тред дзодлтед, "дделет-гд г рдзллчкдд кл&латэ-гсогхр'ддо ;

г. 8 -

зонах oí домашней свиньи (г.Сальск и г.Кацпшшград) и от серо;! крысы (г,Калининград), Белковый состав экстрактов "природных" изолятов трихинелл исследовали на протяжении грех пассадей па неинбредных белых крысах.

Для изучения белкового состава трихинелл ..использовали мето; электрофореза в 10% полйакрилампдном геле с додецилсульфатом uaí рия (/Ц£-на) в трис-глинпновой системе jií 8,6 (Laealli U.K. ,I97C Для выделения отдельных белковых зон из белкового экстракта трихинелл применяли препаративный электрофорез в 10% поллакрилампд, ном геле (Davis "в., 1964). После проведения электрофореза' гелев; пластину разделяли на пять белковых зон согласно величине элек^ форетической подвижности (Bf ). Экстракцию белков из геля проводили 5 мм раствором ¿jaHC03. Регистракцию электрофореграмм осущес вляли на измерительном комплексе, разработанном в НИИ нейрокибei нетики Вэстовского государственного университета.

2.2. Результаты и обсуждение.

Использование стандартизированного метода гомогенизации трк хинелл и экстракции белков из их гомогенатов в сочетании с методом детергентного электрофореза позволило получить воспроизводимую и более четкую информативную картину белкового спектра трех стадий развития Т.spiralis, по сравнению с диск-электрофорезом и В.Davis (1964).

В белковом спектре Т.spiralis выявлено 3D фракций, являющи ся общими для трех стадий развития трихинелл, 45 - общих для инвазионных личинок и половозрелых особей, 36 т общих для инвазиов ных и новорожденных личинок, 32 - общих для половозрелых особей а новорожденных личинок.

Белковый спектр новорожденных личинок трихинелл представлен самым минимальном числом индивидуальных белков - 43, против 54, -для инвазионных; личинок и 50 - для половозрелых особей. Вообще для седкового спектра новорожденных личинок характерно, оравндтел но равномерное количественное содержание отдельных бедков, кроме 12 мэдорных, расположенных в зоне с молекулярной массой от 20,1 до 55 i£a.

Выя глени' стдд;;осдрцн.£ичеокне белки в белковом спектре трех стад;:.'; разритля Т. spiralis , число которых'составило четыре для r.ffií£3iii>}::s:x личинок и три для половозрелых оообей и новоровден-шх лесйкэк.

Akív-hs данных сравнения бе.ткозого состава инвазионных личинок "г.рарэдагх" изолятов ц "эталотаг.." птаммов T.epiralie api rali», Г. spiralis nativa позг-оллл отнести все исследуемые

изоляты к "эталонном}'" нтакму Т. apiralia splralie f-поскольку не било выявлено существенных различий по качественному и количественному составу белков. Это дало возможность проведения исследования ño выявлению факторов патогенности в составе белков из экстрактов трихинелл трех стадий развития на особях вида Т .spiralle. как наиболее распространенного й природе и наиболее значимого с позиции медицинской паразитологии для изучения патогенеза трихинеллеза.

Исследование белкового состава оэдельннх пяти зон экстракта трахинелл методом детергевг'кого электрофореза показало гетерогенность белковых зон, выделенных из цельного экстракта трихинелл препаративным электрофорезом и наличие в определенных зонах общих по молекулярной массе и электрофоретической подвижности белковых фракций. В 1-й зоне имелось 10 общих полос со 2-й зоной» во второй зоне - 4 общие полосы с 3-й зоной а т.д* В 4-й зоне было выявлено всего две белковые полосы, одна на уровне 36-® кДа. вторая более интенсивная на уровне 14,4 tía. В пятой белковой зоне проявилось тг'Гдб гоаьпо две полосы пршлг.рко на уровне 10-14,4 кЕа. Внделоя-бг'л;;л -¿п э-гих яти зон экстракта трихинелл использовали в ис-злэдогаг;;!« aire фракьчй в глюцифгтчзскьх тестах и реакциях по выявления определенных патогенных свойств, ;

3, ХАРАлИВЮТШ АДГЕЗИВНО;! ЛОВКОСТИ ТЕЕСШШ 3.1. .Материалы и методы.

В опятах использовали особей грех стадий развития Т. eplralie выделенных из организма экспериментально зараженных некнбредппл белое крыс методами ошеанюш в гл.1.

Для исследования адгозивной ?хгльнссм1 у трихинелл примени- . ли достаточно инйорматшшуЕ) методику В.И.Врилис и соавт. (1986). В качестве клеток.макроорганизма, как имеющие наибольэее патогенетическое значение, бчли вибрянг* иатнвше к Гормалияязнроэанше эритроциты барана, энтерэцяш слизистой тонкого кишечника крыс и "ибробласш крысиных эмбрионов.

Выделение белков, обладаэдих ге.\:агглптинпрузщей а::тл2нооть:э, аз экстракта трихинелл осуществляла двумя методами аффппной хроматографией с использованием в качестве сорбента М-акетилгэлактз-зачпнилседарозы и препаративным электрофорезом в 10% полиакрала- .' ладном гелэ в трис-глицшгозой буферной системе ¿I 8,6.

Гемагглготпипруювдй активность выделенного гемагглгзтагмла гриханалж определяла в реакции гек-дгглюти капай, а ап?пген'-:::о его4-

ства в "реакции тормовения гемагглютинацяи сыворотками здоровых и больных гельминтозами лвдей.

3.2. Результаты и обсузденпе.

В результате исследования адгезившх свойств у трихинелл, было установлено, что к поверхности инвазионных личинок п половозрелых особей трихинелл прилипали клетки всех трех Исследуемых видов. Полностью отсутствовало прилипание клеток к поверхности новорожденных личинок трихинелл.

Использование аффинной хроматографии на иммобилизованном N-ацетялгалактозаыяне дало возможность выделить из гомогеяатов половозрелых особей и инвазионных.личинок трихинелл две йорыы ге-магглютинирущих N-ацетилгалак то заминпдаз.

Применение препаративного электрофореза для разделения белкового экстракта трихинелл позволяло выяеить белковую фракцию с элекхройоретнческой подвижностью равной 0,90, которая обладала наиболее высокой гемагглюгянирующей активностью в сравнении с остальными белковыми фракциями. Данная белковая фракция состоит из двух белков с м.м. 14,4 и 33-38 -Да. Гемагглятишн из белкового экстракта инвазионных личинок агглютинировал 0,33$ формалинизиро-ванные эритроциты 'барана при минимальной концентрации белка -200 мкг/мл, а для половозрелых особей трихипелл - 100 мкг/мл. Из тестированных moho-, дн-.аминосахаров и сиалоЕОй кислоты, активность гемагглптинина трихинелл ингибировали только 50-100 мМ растворы галактозы, я-ацетилгалактозамина и й-ацетилнейраминовой кислоты.'

Учет результатов реакции тормоаения гемагглютянации с искс~т-зовакясм гемагглютинина трихинелл показал его "выраженную специфическую антдгенность, что открывает возможности применения данного гемагглютинина в серологической диагностики трихинеллеза.

Выявленные гемагглютинирущие н-ацетилгалактозамансвязывающие белка трихинелл являются одним из возможных факторов патогенности Вероятные мишенями для таких факторов могут бить различнее гликоконьагаты, расдолозенные на клеточной поверхности органов и тканей организма ¡животных п человека.

•1., «АКТОШ ШОНИХНОЗЗШ И ТОКСИЧНОСТИ ТЕОЙНШ

4.1, Материалы и методы.

Исследование по выявлению факторов проникновения и токсичнос: претодкдд с белнозымл эксгракгамл л осадком клеточных ¡грегментов кз гетогенг.гов T.spirelis разных стадий развития и с бедками, ' Е2деденпым;: дз отельных белког-'гх зон экстрактоз инвазионных ли-

гинок и-половозрелых особо," трйлГнёлл.

Определение глаадонядазко^ активности осуществляли по авто-цу Г.Б,5рнолпной (1986), непрамянидазпо^ активности по методу • .'•'"Чггеп С1259) в модификации И, А „Черновой и соазт. (198г;), сепо-штвчоскоП агягквяосхс до методу Т.Honda, R.Wnk»l4tein (1979), тгг?&гонс1;чес::ого действия белков, входящих в cocías трихинелл, ¡алвштто-гоксическям тестом (СЦГ-тесг), разработанным О,А.йщь-:овой и соавт. (1991).

I.Z. Результата я обсуждение.

Рьа.удь'гцты.исследования гкадуронядазной активности белков 'ряхинелл показали наличие ее в составе водорастворимых белков : в осадке гомогената половозрелых особей трихинелл 6-ти днезно-'0 возраста, величина которой составила 30,0i2,5<j и 33,0¿I,5£ оответственно. 7 инвазионных личинок трихинелл гиалуронедаэная ктизпость была выявлена только в осадке клеточных фрагментов, еличина ее составила около 40$ (усл.ед.).

"е"\ца:л',н[1д_азная активноеть tíuis обнригяена У оодао» аз гомо-еяага половозрелых особей трихинелл дневного возраста. 3 пытах по выявлению неДраипнидазы в составе пяти белковых ;>од гракта трихинелл было установлено, что нейраминидазной актив-остью обладают только белки из 5-й зоны с Hf-О.ЭЗ. В состав 5-й едковой зоны входят две фракции с м.м, 10,0 и 14,4 кДа. Актйв-эоть яейраыпяядазк зля этих белков составила 25,4%),56 мкг -ецетилнейрамиповой кисло га/мкг бедка; т.о. величина ее примвр-э в 80 раз выше величины общей нейраминидазной активности в бел-55см экстракте половозрелых трихинелл,

В белковом экстракте'инвазионных личинок грихяналл не удалось жаруяить нейраминидазную активность яря содержании белка в про-г 5СО,0±£,00 мйт.

Результаты йсследования по выявлению гемолитической активности :ви:; белков .трихинелл показали, что количество белка из эксграк-i п^оьозрг:..:; особей трихинелл б-ги дневного возраста, вызивао-1005? гемолиз зрятроцктсп барана или кролика составило в средне 1-Ю ц«г, что в 10 раз менкзе .величины белка аэ экстракта иява-юнных личинок трихинелл. При исследовании отдельных белковых л экстракта половозрелых трихинелл, гемолитическая активное:: ла выявлена в белках 2-2 и 4-й белковых зон, ямевдих ñfO.ffi я 90 соответственно. В состав этих дзух белковых зон входят бол, явяящиеся как ойцима (м.м. - 36-38 >Да), гак и-еаегййтазмг

либо для 2-й зоны, либо для 4-й. ups этом абсолютная величина m сы белка, вызывающая 100/' гемолиз эритроцитов, составила в оредн 12,0 мкг для белка из 2-й зоны и 9,0 мкг для белка из 4-й зоны,, т.е« на порядок ниже- величины белка из цельного акстракта полово зрелых особей трихан&лл.

Результаты спденоцитотоксического теста с белковыми экстрак тами из гомогенатов инвазионных, новорожденных личинок и половоЗ' релых особей трихинелл показали, что экстракты белка из гомогёка' тов инвазионных личинок и половозрелых особей трихинелл (3-х и i 6-ти дневного возраста) вызывали лизис спленоцитов (величина токсичности,, составила 40-50$. Количество белка в исследуемых проба: в обеих случаях составило IC-j,0iXs00 ькг. Явление цктогоксичноси не было обнаружено ъ опчтах. о использованием белкового экстракта hosc/csspjîkïcî личинок трихинелл, -полученных, от 450 тыс.особей (nj мерно 50-70 мь;г белка)

Для выяснения болеэ точного распределения белков, обладавдк: цЕТотоксичеокой активностью,. в составе белкового спектра шшазио! кос личинок я ¡/оловоьрашх особа'; 'трихинелл, бшш поставлен опы'. на CIIE-тео? о оадблышмя белковыми зонами, из-дальних экстрактов» Анализ кривых заиюсмооти токсичности белков из-отдельных зон oit? величины исследуемого белка позволил выявить следующие закономерности, >

Во-первых, первоначальная доза исследуемых белков - 2, лкг обладала токсичностью, величина которой составила в среднем околс 45$ для белков из всех 4-х зон экстрактов как половозрелых ccoöcj так а инвазионных личинок трихинелл. Только для белков из 2-й и; 3-3 зон вкстракта половозрелых трихинелл 6-ти дневного возраста, величина токсичности составила всего ц среднем 6,7 и 8,5$ соответственно. . . . , !

Во-вторыхt при увелдчйкдп первоначальной дозы исследуемых бс ков вдвое (4мкг) величина токсичности таете возросла отноептольне порвонзчальшх величин, ко имела значительные колебания для белке аи.разшас белковых зон экстрактов трихинелл. \

• В-тргтхдх, гнела':'«п::с дозы исследуемого deunca от 4 до ISjbiRi и гылс не вызвало значительного изменения величины токсичности* В 6cabrn'.HJTr.ü одучаоь ьта величина оставалась на уровне токсичййс vit для дозы 4 мкг р.о бзлку ила незначительно увеличивалась или ум&яь^злась, т.е. наблюдали насыщение токсин-субстратного t;o;:.ui— лекса.

Из исследуемых белковых зон экстракта инвазионных личинок и половозрелых "особей трихинелл, наибольшей токсичностью обладали белки из 1-й и 4-й зон экстрактов всех исследуемых гомогена-тов трихинелл. В состав белков 1-й и 4-11 зон экстракта этих двух |Тчэрм развития трихинелл входят кроме индивидуальных белков и группа белков с м,м, 36-38 г<Да,

Результата опытов по нейтрализации штотоксической активности белков из 1-й и 2-й зон экстракта половозрелых особей трихинелл 3-х дневного возраста сывороткой от большие трихинеллезом.или эхи-нококкозом выявили определенную анткгеикость исследуемых белков. Сыворотка от трихипеллезних больных в разведении X:ЮОО нейтрализовала на 100% пятотоксическую активность белка йз 1-й зоны и снижала на 50% для белка из 2-й зоны. Сыворотка от больных эхино-коккозом нейтрализовала белок из 1-й и 2-й зон на 40 и 20 процентов соответственно.

Таким образом, использование стандартизированных методов выделения, концентрирования трихинелл и получения белкоЕЫх экстрактов из их гом'огенагов, а также применение методов препаративного и детергентного элегтросгореза_,в данном исследовании, позволило выявить в составе водораотворимых и кутикулярных белков Т. 8р1гаИа следующие факторы патогенности (рис.): адгезины (гем- и штоагглю-

- гиалуронидаза

- цитотоксины

- цитотоксины, гемолизин, гемагглютинян

- не:рамяшщаза гемагглютинин

Рис. Распределение факторов патогенности в белковом спектре инвазионных личинок и половозрелых особей Т.вр1гА11в в зависимости от молекулярной . массы.

+ старт м.м. КДа

94,0 -67,0 -43,0 -

30.0 -

20.1 -14,4 -

тииины), отвечающие за прикрепление трихинелл к клеткам тканей i органов; гиалуронидазу и нейраминидаз'у - факторы инвазивности; гемолизин и цитотоксины, оказывающие токсическое действие на организм инвазированных животных или человека. Результатами проведенного исследования было доказано, что вышеперечисленные фактор патогенности выявляются у инвазионные личинок и половозрелых осе бей Т. spiralis . У новорожденных личинок трихинелл факторы пато1 ности не удалось обнаружить используемыми в данной работе метод?

ми. !

Обнаружение у инвазионных личинок и половозрелых особей Т. spiralis биологически активных макромолекул, оказывающих те или иные воздействия на организм хозяина позволило представить гипотетическую модель участия этих факторов патогенности в раэву тии инвазии, в зависимости от фазы развития данного гельминта в •организме хозяина.

t

ВЫВОДЫ

1. Стандартизированы методы накопления и получения биомассы трихинелл, условий культивирования половозрелых трихинелл в искусственной питательной среде и получения жизнеспособных не вррожденных личинок. Стандартизирован метод'получения белков! экстрактов трихинелл, позволяющий извлекать достаточное для проведения анализов количество белка.

2. Установлена зависимость интенсивности отрождения личинок олл< дотворенными самками трихинелл от времени культивирования в . различных питательных средах. Обнаружено усиление репродуктш ной активности трихинелл при культивировании их в сбалансированном солевом растворе Срла по сравнению с искусственными ш тотальными средами (среда Игла, 0,5$ раствор гидролизата лак-альбумина). Максимальное количество жизнеспособных новброк-дгкн:к ли"инок накапливается за первые 4-6 часов культивиро-

3. Анализ к°чественного и количественного состава белков "этало! ных" штыков (Т. spiralis spiralis , Т. spiralis nativa j) и местных природных изолятов, выделенных в различных климато-ггогрлфичесних зонах России, показал отсутствие четки: итам-мовых различий по данному показателю.

-i. Установлено, что наибольшее число дискретных фракций (50-34) г >:.•.•. от б. до 200 lyla представлено в бглковом спектре полов*

I

- 15 -

зрелых особей п инвазионных личинок, а наименьшее число (43) для новоро::сденн1п: личинок Т. зр1га11а Выявлено, наличие .30 . 'бслкошх"$ракцяТ1, являющихся общими для всех трех стадий Развития трихинелл п определенное число стадиоспецифических бол-ков: четыре для'инвазионных личинок и по три для половозрелых особей и новорожденных личинок.

3. 3 составе водорастворимых и кутикулярных белков Т. яр1ггЛЛп выявлены факторы прикрепления к клеткам-мишеням организма хозяина, факторы инвазии и цитотокснны. " •

6. 7 половозрелых особей и инвазионтгс личичок т„ яр!т«Л1я ии^-. лона боковая йракшя, обладающая адгегиновсй я, в частности, гем- и цитоагглютинирущей активностью. Данная белковая фракция состоит из двух белков с м.м. 14,4 и 33-38 кДа. Наибольшая гемагглютинирущая активность проявляется при концентрации белка из гомогената инвазионных личинок раиной 200 мкг/мл и 100 мкг/мл для половозрелых особей трихинелл. Выявленный ге-магглютишш трихинелл обладает выраженной специфической анти-генноотью, что указывает ¡га перспективность его использования для серологической диагностики трихинеллеза.

7. В составе водорастворимых и к.утикулярнкх белков Т. ар1га11а зыяшгена белки, облагающие гкалуропвдазяой и яейрапшшдазной активностью. Гиаяуронидазная активность обнаружена У кутику-лярных белков инвазионных личинок я в кутикуле и цитозоле клеток половозрелых трихинелл. Нейрамишдазной активностью обладаю? растворимые белки (м.м. Ю-15кДа) половозрелых особей трихинелл,

3. Водорастворимые белки Т. вр1гаИп обладают гемолитической и пи-

готокслческой активностью. Гемолитическая активность выявлена ;/ белков из гомогената половозрелых особой трихинелл о электро-форетической подвижностью 0,35 и-0,90. Наибольшая токсичность для спленоцитов при дозе 4 мкг на пробу отмечена у белков из гсмогспатов инвазионных личинок и половозрелых особей трихинелл с электрофорегической подвижностью 0,17 и 0,90.

а. Выявлена группа белков с м.м. 36-38 кДа, обладающая гемагтлю-тинпрующей, гемолитической и цитотоксической активностью и .Еходяг&я в состав всех четырех белковых фракций (зон), выделенных из экстракта трихинелл препаративным электрофорезом.

ПРАХТЖСлЖ Ш(ШЩА1Щ

В результате проведенных исследований разработаны предложения для внедрения в нра..гику здравоохранения г зрямодаплл в а&уч-

- 1о п

но-ис сл едова тельс к их учревдениях^

1. Ставдартизироваш-} методы выделения и накопления биомас-сц трихинелл, условий культивирования Половозрелых особен в искусственных питательных средах, получения жизнеспособных новорож денных личинок и метод экстракции белков из гомогонатов трихлнел позволяющий извлекать достаточное количество белкб ":.лл проведели биохимических и иммунологических исследований. Эти методы рекоме дованы к использованию резолюциями 5-;: и 6-:; научных конференций по проблеме трихинеллеза человека и яийотных.

2. Нормативно-техническая документация (проекты ВЮ и лабораторного регламента) па гем&гглютишш трихииоллезгшй сухой для использования его в реакции торможения гемагглякшапии при иммунодиагностике трихинеллеза человека (документы утверждены на заседании Совета ШО "Биопрепарат"- - .протокол .'!> 5 ой 9 июня 1992г.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕ,® дИССЕРГАЦЖ

1. Сравнительный электрофоретическип анализ белкоЕ к некоторых изофермонтое эталонных и природных птаммов трихинелл (С.Л, Нагорный), - // Материал!; пятой Всесозн.копф«.по проблеме трихинеллеза человека и гявотяых 14-16 сбйт.1988 Г., г.Новочеркасск.-' ¡Д., 1988 - 0.115-117.

2. Стандартизация методов выделения нематод р. Тг1оМпв11а на разных стадиях развития (С.А.Нагоршй, Й.И.Васерий). - // Факторы регуляций поцуляционных процессов У гельминтов: Тез,'докл. оимп. 3-6 апреля 1990 г., - г.Пущино. -М., 19Э0. ■ - 0.В8-ЗЭ,

3. репродуктивная активность Тг1оМпв11а вр1ге11в на ранних стадиях культивирования в искусственных питательных средах (Ю.И.Васерик, С.А.Кагорный). - //Паразитология.- 19Э1.-еып.1,-С.56-58.

4. Белковый состав половозрелых особей, новорожденных и инвазионных (мышечных) личинок ТИсЫпеПа вр1га11в (С.А.Нагорный, Ю.И.Васерин).- // Тез.докл. шестой неучн.коКф. по проблеме трихинеллеза человека и гашотных 12-14 мая 1992 г. - М., 1992. -

С.185-168.

5. Сезонности отрозденпя личинок трихинелл в опытах (С.А, НагорпиГ., С.П.Засерин). - //Тез. докл. шестой каучн.конф. по проблеме трихинеллеза человека и глвотпцх 12-14 мая 1922 г.- 'Л., 1952.- С.114-115.

6. Осяогкпе итоги разработки методов и средств специфической диагностики трихинеллеза (£.П.Зйсер;:к, А.З.Костсцкий, Н.Г. Прсзлпдяый). - // Тез.докл. с-гтгГ. "аучн.ко.ч". по проблеме три-

иналгеза человека я животных 12-14 мая 1592 г.- М., 1992. -.93-95.

' ' Приоритетная справка на предполагаемое изобретение 5С40403 т 23 ..С4,52 г. ...

|Тк 1НГХ