Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биоэкологическое обоснование применения новых средств биологической защиты картофеля от колорадского жука

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Биоэкологическое обоснование применения новых средств биологической защиты картофеля от колорадского жука"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ГЕТАЧЕУ ТИЛАХУН АЙЕНЕУ

УДК 632.9 : 633.49 : 632.768.12

БИОЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ НОВЫХ СРЕДСТВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ КАРТОФЕЛЯ ОТ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА

Специальность 06.01.11—защита растений от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — кандидат биологических наук, доцент В. В. Гриценко.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. Б. Чернышев; кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник А. П. Твердкжов.

Ведущая организация — Российский университет дружбы народов.

Защита состоится . . . . . . . 1995 г.

в ...... часов на заседании диссертационного совета

Д 120.35.09 в Московской сельскохозяйственной академии имени К- А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 49.

Отдел защиты диссертаций ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан . . . ^ . . г>*><г^'> . . 1995 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

В. А. Шкаликов

: ■ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ * - ■

Актуальность темы - современная концепция интегрированной защиты растении предусматривает, наряду с рациональным ограниче-, нием химического метода, интенсивную разработку биологических и других экологически безопасных средств-защиты.

.. Данная тема связана с разработкой новых направлений биологической защиты пасленовых культур от одного из главнейших и наибо- * лее распространенных в мире вредителей - колорадского жука.

В настоящее время наибольшее применение в биологической за-

• щите растений имеют бактериальные препараты, большинство из которых представляют производные разнообразных вариантов энтомопато-

: генной бактерии Bacillus thuringiensis. Однако, спектр применения большинства препаратов (дендробациллин, энтобактерин, лепидоцид) ■ ограничен, в основном, чешуекрылыми вредителями.

Используемый против более широкого круга вредителей (в том • числе - против колорадского жука) препарат битоксибациллин (В. thuringiensis var. thuringiensis) в качестве одного иэ действующий« начал-содержит термостабильный экзотоксин, что несколько снижает степень его экологической безопасности. Тем же недостатком обладают препараты бактериальных токсинов (турингин и др.).

Возможности применения бактериальных препаратов расширились с использованием нового варианта - В; thuringiensis var. tenebrionis. Препараты на его основе (новодор,- децимид, Колорадо} .' содержат б-эндотоксин, специфичны против жесткокрылых вредителей . и в первую;очередь рекомендуются против личинок колорадского жука. Испытанию .нового препарата децимида посвящена значительная часть данной работы. .-.-.■■

. • Принципиально новым направлением защиты растений от вредите' 'лей стал метод генной инженерии. Идея переноса генов, контролиру-' ющих синтез инсектотоксинов от В. thuringiensis в геном культур. ■'ных растений стала реальной с локализацией таких генов, разработкой ' метода их репликации и переноса с помощью плазмид через микроорганизмы-посредники к растениям. Одной из перспективных программ генной.1 инженерии стали работы по созданию трансгенных форм картофеля/ несущих гены инсектоксина- В.- thurin- giensis var.. - tenebrionis, устойчивых к колорадскому жуку. Один 'из разделов та-

• кой программы, связанный с биотестированием бактериальных токси-: нов и трансгенных,растений, осуществлен в данной, работе.

• Цели и задачи исследований. Целью наших исследований являлось изучение новых направлений биологической защиты картофеля от .колорадского жука, основанных на ■ использований В. thu- . ringiensls. . . - - - . •

. В работе выдвигались следующие задачи: -. ■'. "•. - оценка эффективности нового бактериального препарата деци-. .мид против личинок колорадского жука на картофеле в лабораторных и полевых, экспериментах, в сопоставлении с бактериальным препара-' ' .том битоксибашшшном (БТБ) и химическими инсектицидами;

' - изучение влияния децимида на. жизнедеятельность, развитие и питание имаго и личинок колорадского жука; 1

- первичное испытание децимида на других -видах жуков-листов-■ • доб; "..-•.■■

изучение-влияния децимида и БТБ.на-некоторых., полезных- зн-;',томофагов; . - '•'•.•■"••'..■•'-, : ...

... оценка-эффективности энтомопатогеннои нематоды против • колорадского жука;' . - ; .". '■-'''

- оценка экспрессии генов бактериальных инсектотоксинов в

' процессе их выделения и переноса в программах генной инженерии; '

- оценка степени инсектотоксичнос'ти полученных трансгенных растений.

' Научная новизна. Проведено комплексное исследование влияния нового бактериального препарата децимида на жизнедеятельность ,и ' вредоносность колорадского жука. Помимо непосредственного деталь- , ного воздействия, выявлено антифедантное и хроническое токсичное \ . действие препарата, вызывающее снижение поврежденности растений и . подавление развития вредителя.. Изучено влияние децимида на;некоторые другие виды вредоносных.и полезных хищных жесткокрылых.

Впервые дана энтомологическая оценка действия бактериальных токсинов и трансгенных растений, полученных на отдельных этапах 1 '.-.' биотехнологической программы создания трансгенных форм картофеля, -устойчивых к колорадскому, жуку.

■ Практическая ценность работы. Определены оптимальные нормы, сроки, и условия применения децимида против колорадского жука; рекомендованы системы обработки биопрепаратами и инсектицидами в '.. зависимости от характера развития популяций вредителя. Сравнительная оценка бактериальных токсинов и трансгенных

• растений позволила выделить некоторые аффективные формы, перепек--' пивные для дальнейшего использования в генной инженерии..

. Апробация работы. Материалы диссертации отражены в докладах ■ - на конференции молодых ученых (ТСХА, 1993 г.), II Всероссийском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" £Пущино, 1993), Международном симпозиуме по биотехнологии растений и.генной инженерии (Киев, 1994).. . .

' Объем и ' структура диссертации.- Диссертация изложена на 134 '.'• . страницах машинописного текста и состоит из 3 глав, заключения,.. . выводов и практических рекомендаций. Включает 35 таблицы и 9 рисунки. Список использованной литературы включает 244 источников, . из них 98 работ зарубежных авторов. -. ; ■■ /

I. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ -'Г.

Глава I. Обзор литературы . ' , : . ,

- Рассматриваются данные о современном ареале распространения, ' . биоэкологических особенностях и вредоносности колорадского.. жука. Анализируются сведения о защитных мероприятиях, включающих каран-• -. тинные, агротехнические, селекционные, химические и биологические методы защиты. Наиболее детально рассматривается использование В. ЬЬиг1пе1епз1з в биологической защйте и генной инженерии для соа- .'■- . дания трансгенных форм картофеля. ;

Глада 1Г. Материал и'методика исследований-; ' - \

Исследования проводились в 1992-1994 гг: .: В Московской сель- : скохозяйственной-.академии им. К.А. Тимирязева (ТСХА). Лаборатор- V ные эксперименты выполнялись на кафедре энтомологии. . Опыты на культивируемых растениях проводились в теплице лаборатории защиты -,' растений. Полевые; опыты выполнялись на участке опытной станций лаборатории защиты растений, а также на хозяйственных посадках ' •

• картофеля на опытной станции лаборатории растениеводства.' ' '-.-' •'■' "'

■ Опыты проводились преимущественна на картофеле • сорта Неве-.' ■ кий, а также сортах:' Удача, Диамант, Романе, ,-Дезире.. •"••'■> '<

В качестве основного источника биоматериала использовалась : . популяция колорадского'жука с территории ТСХА, ' а также'популяция- : . звенигородской биостанции МГУ (Московская область).' - -

Для различных опытов собирались личинки, преимущественно младших возрастов (1-1I), а также имаго - половозрелые перезимовавшие жуки и молодые особи нового поколения.

В условиях теплицы длительное время сохранялась и поддерживалась культура колорадского жука. Это позволило значительно увеличить период испытаний препаратов (с мая по октябрь), а также получить более выровненный по развития биоматериал.

Опытные партии децимида получены в НПО "Биомаш". Образцы бактериальных токсинов и трансгенных растений получены из ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

, В лабораторных вегетационных и мелкоделяночных полевых опытах проводилась оценка эффективности .децимида в сопоставлении с БТБи синтетическими препаратами (арриво, децис, каратэ), изучение их влияния на пищевую активность и развитие колорадского жука.

В лабораторных опытах оценка эффективности проводилась на чашках Петри, в которые помещались личинки младших возрастов на листья картофеля, обработанные путем смачивания или опрыскивания препаратами. Опыты велись в 3-5 кратной повторности по 10-20 личинок на 1 чашку.

Оценка пищевой избирательности проводилась в ■ пластиковых кассетах, по периметру которых равномерно размещались обработанные и необработанные листья картофеля. В различных опытах использовались имаго и личинки в количестве от 20 до 100 экземпляров.

В аналогичных опытах по влиянию препаратов на активность питания жуков в каждую кассету помешалось определенное количество обработанных одним из препаратов листьев, затем учитывалась степень их повреждения. . -

Вегетационные опыты проводились в теплице на растениях картофеля, культивируемых в возонах с почвой. После однократной обработки препаратами на растения высаживали по 10 личинок младших возрастов; опыты велись в 3-5 кратной повторности.

В полевых мелкоделяночных опытах проводились испытания различных вариантов пременения биопрепаратов.и инсектицидов. Большинстве вариантов использовались по 20 растений с Невский, размещенных рендомизированно в блоках. На участке создавался искуст-венный фон колорадского жука путем произвольного выпуска самок . (1993г.). или равномерной подсадки личинок I-III возраста, по 20 экз. на растение (1994г.).

Для первичнои оценки возможного спектра действия децимида проводились, ограниченные лабораторные опыты с двумя другими доступными видами листоедов - щавелевым Bastroidea , viridula Deg и калиновым - Galerucella viburni Pk., а также с некоторыми представителями полезной энтомофауны - жужалицами p.p. Pterostichust Pseudoophönus, Harpalus, и др. и с -семиточечной коровкой Coccinella septempunctata.

В лабораторных и вегетационных опытах оценивалось действие промежуточных продуктов генной инженерии и трансгенных ' растений. Изучалосб 3 варианта биотоксинов продуктов инсектотоксичного гена Cry I1IA В. thuringiensis, -■ клонированного в культурах кишечной • паточки Е. coli: Ten k, Ten G, Ten N.

В опытах, аналогичных предыдущим, личинки выкармливались на листьях или. растениях картофеля,', обработанных экстрактом соответствующих белков. Трансгенные растения картофеля, предположительно' несущие инсектотоксичный ген испытовались путем подсадки на них или отдельные их листья личинок I-11возраста. .

Биологическая-эффективность препаратов определялась по формуле Франца: поврежденность-растений оценивалась ; визуально по..

5-Оалльной шкале, с .последующем определения средней (%) степени повржденности.

При статистической обработке данных определялись средние и их ошибки, достоверность различий средних по критерию ЬСтьюден-та, использовались методы хи-квадрат, дисперсионный и корреляционный анализ.- В таблицах приводятся стандартные обозначения статистической достоверности различий опытных и контрольного вариантов: * - р<0,05; ■ - р<0,01; *** - р<0,001.

Ш. Результаты и обсуждение

Б-.1. Испытание нового бактериального препарата децимида.

Определение эффективности различных концентраций и производственных партий децимида

В серии лабораторных опытов определялось влияние различных концентраций и ' производственных партий децимида на жизнеспособность личинок колорадского жука. В чашках Петри личинок, начиная со II возраста, выкармливали-на листьях, обработанных препаратами.

Первоначально оценивалось действие различных концентраций децимида Покровского производства (табл. 1). Результаты, показали умеренную и сходную между собой эффективность 0-, ЬХ. и<0,5Х концентраций децимида, достигая-дую уровня 64^68%.. Значительное увеличение эффективности - до 90% дает 17. концентрация препарата. Дальнейшее увеличение концентрации не имеет эффекта, напротив, вызывая некоторое его снижение (до 81%).

Таблица 1

Влияние различных концентраций децимида Покровского

производства на выживаемость личинок колорадского жука (X) . (1992 г.)

1 Вариант -(концентрация, ! х) \ \ Время после обработки (сутки) Биологическая эффективность на 8 сутки

1 ■ 4 6 8

контроль 96,0+1,9 92,0+4,0 90;2±3,1 90,2+3,1

Децимид 0,1 67,0+154 42,0±199 36,0±112 29,01114 67,8

Децимид 0,5 53,0±8,1 39,0±4,8 31,0±4,8 29,014,3 64-, 4

Децимид 1 50,0±7,9 11,0±Й,7 10,0±7,7 : 9^016,8 90 ;0

Децимид- 2 Б4,0±9,7 23,0±9,4 1. _ .... ... 20,0±8,2 Ц8.0±7,5 81,1

В другом опыте проведено-сравнение 4: различных, производственных партий децимида а.концентрации-. 12.при сопоставлении'с.би- . ." токсибацилином (БТБ) (0.5Х) й инсектицидом арриво (0,02Х}, . Раз- , ные партии децимида оказались.неоднородными по эффективности; .Наг-.' ,«меньшее действие (6Ш. показал децимид производства'.''Степноцорс--'-' кого завода; лабораторная: (НПО Биомаш), и партий Щэбекинского еа-водва имели ..более, высокую и сходную ■ между, . собой - эффективность ■ ■.

(72-74%), a наиболее эффективным (ri 85%) оказался децимид Покровского завода. Биопрепарат БТБ проявил более резкий рост эф-^ек-гивности, достигший в итоге 100%. Эталонный инсектицид аррй'во вызвал быструю и полную гибель личинок.

В целом, в лабораторных экспериментах показано достаточно сильное влияние децимида на личинок колорадского хук2. Удовлетворительно высокая биологическая эффективность достигается с использованием 1л концентрации препарата на 4-6 сутки после обработки. Биопрепарат БТБ по силе действия несколько превосходит децимид. -

Оценка эффективности децимида на вегетирующгх ' растениях в условиях теплицы

В тепличных опытах, помимо влияния децимида на гибель личина: колорадского жука, рассматривалось также воздействие обрабо-. ток на развитие и массу личинок и на повреждение ими растений.

Вегетационной опыт с биопрепаратами проведен в 1993 г. ira трех сортах картофеля с использованием 2 концентраций дещгшща в сопоставлении с БТБ. Данные по смертности личинок обнаруживгют сильное и практически одинаковое на 3 сортак действие препаратов (табл. 2). В отличие от лабораторных опытов 0,5% и 1% концентрации децимида эдесымели очень близкую эффективность, достигая значительной величины на 6 день после обработки и нарастая далее до 87-88%: БТБ показывает более резкое нарастание эффективности, достигнув 100%'. '■-..'■. . ■ . •

Не менее высокий эффект биопрепаратов наблюдается в отношении поврезденности растений. Обработка растений препаратами снижает их поврежденность от весьма высокой (50-80%) до незначительной степени - порядка 3-5% для 0,5% 'децимида и 1-2% для 1% децимида и БТБ. Здесь, очевидно, сказывается не только снижение численности личинок, но и снижение активности их питания. Влияние обработок на разные сорта оказывается сходным, однако, в контроле сорт Диамант повревден заметно менее двух других сортов., Меньшая степень., поврежденности достигается за счет больней кустистости и облистЕенности растений данного сорта. Отсюда, можно заключить, что .сорт Диамант, не обладая истинной устойчивостью, (антибиозом) к колорадскому жуку, относительно более толерантён к его повреж-

дениям.

Сильное, качественное влияние децимида отмечается на развитии и массе личинок (табл. 3). К десятому дню опыта ни одна из выживших после обработки личинок не достигает IV возраста, тогда как все личинки в контроле находятся на этой стадии и начинает уход в почву, на окукливание; масса личинок снижается в 5-10 раз по сравнению с контролем. По этим показателям более, чем по гибели личинок, становятся заметны различия между 0,5Х и 1% концентрациями децимида (Р<0,05). Таким образом, децимид. оказывает яшое угнетающее действие на рост и.развитие личинок колорадского жука.

Таблица £ -

Влияние бактериальных препаратов на выживаемость.

личинок колорадского жука на разных сортах -

картофеля в условиях теплицы (1993 г.)

Сорт Вариант (концентрация, 7.) Количество живых личинок в среднем на 1 растение Средняя потеря / листовой поверхности, %

Дни после обработки

1 3 6. 8

Удача Контроль Децимид 0,5 Децимид 1 ВТБ 0,5 ю,о±о;о 6.7+2,4 б,0±1,2 5,7+0,7 9,7±0,3 3,7+0,7 3,3+0,3 3,3+0,7 9,3±0,7 3,0+1,0 1,0±0,3 0 9,3±0,7 1,3+0,3 1,010,6 0 80,018,5 3,8±0;9 1,7+0,3 .1,210,1

Диамант Контроль Децимид 0,5 Децимид 1 БТБ 0,5 10,0+0,0 5,7+1,8 6,7+0,7 6,011,7 10,0±0,0 5,3+2,0 5,3±0,7 2,0+1,0 10,0±0,0 2,7+1,2 3,0+1,0 0 9,0±0,6 1,0+0,0 1,7+0,9 0 53,5±1,5 3.010.1 1,710,6 2.210.2

Романо Контроль Децимид 0,5 Децимид 1 БТБ 0,5 9,7±0,3 6,7+0,7 5,0±0,6 5,0+0,6 9,7+0,3 5,3±0,3 3,0+0,0 2,3+0,9 8,7±1,1 1,3+0,3 1,0+0,0 0,3±0,3 7,710,9 1,0+0,6 0,3±0,3 0 75,016,2 4,9+2,2 1,3+0,3 1,7+0,6

Развитие и масса Л1 кулюг. ил 30 день поело '

СбрГ.бСТКП биопрепаратами

Вариант Число личинок данного возраста Масса личинок (мг)

11 111 IV

Контроль - ■ - 35 151,7+5,6

Деци.мнд 0,5" з ! - пд ± ^ О * * *

Децимид 1X 7 С - 16,4+3,1*** .

В целом, опыты на гегетнруювдх растениях в условиях теплицы выявили сильное, ¡жмплексного характера действие пстлш&озя биопрепаратов на личинск колорадского куш, вк-тсчгг^ео значительную СМЕРТНОСТЬ, УГИОТОНИе рГ'Т.Н'ГНЯ I! С!ШХ-?!!И0 П1'!';?РСМ гяткзиэзтп

чинок.

Влияние дешмилп на пишевуп избирательность, пшевуо актигнеегь и жизнедеятельность колорадского г.ука

Заселение посадок картофеля г^уком го многем определяется активностью самок перезимовавшего поколения. В зте.ч отношении показателен небольшой опыт по - выбору половозрелыми самками (20 экз.). "обработанных децимидом и необработанных побегов в качестве корма и места откладт яиц. Результаты достоверно (Р<0,001) покатав :етт. что салки при возможности выбора значительно менее посе-;;з:т, повреждают и заселяют обработанные растения. Распределение жуков на обработанных и необработанных растения, составляют, соот-?етстЕРнно - 1:16, а яйцекладок - 1:9.

В опыте;; с тяодши имаго (тгбл.% 4а) сц.ниг^лоя сиЗор отработанны:-; дсц:;-:;:;;а.; и "Та ¡; ^а-ага^ста -.у.-.г/. и.:;'.. 0;;.-.':.. т.:-:., сидпо, что сбрс£стшшш листья I рс.о,г напрягся ил е качсстг/? гссаа. В пссл'пу-аих пгигсгк :.,а1ап:и яретг^гс:. «вдеиуэ с>::т;шь'ость оцоииг&зссь Сса к^едоо^-л-лна ш» ком типе керпц с каздем пгржцгго. Яс-ултати такого скита с П1л,ш ;,гук.тлл ст кдлсльсч^ук.! о с-.ш-исц с:.Слепил а.ааасл

г":.:'о ка сС;:а"сгаааач с.^'иа:а;х; вселил

¡г.;. а;сал • БТБ.

Таблица 4

Елплпи? Гь'опрош-^атоа на пи^.-вую иабИраг.'лмгасп. !! гиамтпеить ::а;а,ь,а-;а;.ого лука та

1 1..-Г,:. [¡аз ссаа^: га лиотл .с.. I-........ наа ¡ч, ааа-

ггаареадек- н ■ ¡юагоадеи -аах

Г.отггро I". ' ¿Х- 1Г.7 •

(V:

Контроль СЗ 10,210,0

БТБ IX •13 се ЮЬУ 7,7+0,8"

Контроль - 45 92,2±1,1

ш Децдазд 2Х - .337 440 43,4±1,7*+*

БТБ 1% , 101 703 1в,е±1,з*>-*

Примечание: 4а - швдьая избирательность молодик жуков ноього пог^олешн! (I).

46 - пищевая активность молодых жуков нового поколения (I)

Далее выяснялась- возможность долговременного влияния питания обработанными листьями на развитие и ¿¡ашнеспособкость колорадского жука. В опыте с личинками III-IV возраста децимид и БТБ выаы-ваот; замедление окончания развития личинок и ухода их в почву на окукливание, значительное на.30 снижение их массы. При этом деци-мид, в. отличие от.БТБ, не оказывает быстрого летального воздействия. на личинок старших, возрастов. Однако, среди жуков,.появившихся . в ходе-развития..этих личинок, никто не выживает в течение

■:■•' -я- ■ ' >".; 'у

К'-'." '.'ПОП!' '■■,:■. n ■ '■

0:<с.™-.гн or. r: ^o",::'"! '. m:\: o"!:>-!T ":mo-vi> до yy.a?->.

э "ГГГ.ГТ.Т,"-'/ (таб.-; "). Г'.п'л.'.гта.» с 1'К1отс.'Ьствуяг о enrr«>:nm ст-?-П'.-!",: пггр^^дешгг;:: пг'.:: :"р!,о дг ^ч', ГР:;,:Е.~Л? некотсрг', ооло^ MÇTrw У снчсж, гн'-г'МП!j- каругг)? подготовь ессОги к дил-

n:v," крс".'"> тогз, •:т":,'сгг1 у: v:;r!~:;:'5 суртлост" ::'/!:сз.

В другом, эдплсггчгс" сп'.'т'5 с лук."":: у оссС'Л сбр?.-

Сот-.Kfдгцкмидс'; и БТБ листами отнечачась 1005 гкб-ггь ? тп?пки ?г,'?п:п, при вихшшии в контроль 24% луков.

Таблица 6

Влияние обработки листьев картофеля биопрепаратами на пипевуп активность и жизнедеятельность молодых луков I поколения, 1994 г.

Вариант Повреаден-ность листьев, %. Масса куков, мг Доля жуков, %

самки самцы активных в диа-паузе мертвых

Контроль 22,9i3,5 177,2+7,3 136,5+3,0 50,0 45,5 4,5

Дегдаад Q.5Z ■¡2,3+2,7" 170,9+4,5: 133,9+5,5 50,0 40,0 10,0

Децимид U . 9,7+2,0"" 163,6+4,1 135,3±4,5 35,0 35,0 20,0

ЕТБ 0,5% . 12,4+2,7" 156,7±7,2 131,0±5,4: 55,0 30,0 15,0

В.целом, 'данные опыты выявили существенное негативное влияние биопрепаратов на основе Васi11 us thurinslensis на пищевую из-оирательность, пищевую активность н физиологическое состояние ко-

лорадстюго гхука. Из вызыгал кемедхевной гибели имаго, они продляют высокий згдитный эффект, вдвое и более сшгсая поврежденность растений,'» способствуют "педопиташюсти" хуков, приводя их к гибели в течение зи;,гавки. В этом, несомненно, проявляется антифн-дантнсе действие и, по-видимому, частичное токсичное действие препаратов, более резкое у БТБ , за счет содержания в нем экзотоксина и более "мягкое" у содержащего эндотоксин децимида. Такое "продленное" действие биопрепаратов расширяет возможности их применения.

Результаты полевых испытаний биопрепаратов

Нолевые испытания децимида и других препаратов ограничились мелкоделяночными опытами 1993-94г.г. Наиболее детальные испытания проведены в 1994г. с использованием равномерного искусственного фона, путем высадки по 20 личинок колорадского кука на каждое растение. Оценивались эффективность 1- и 2-кратных обработок децимидом в концентрации 0,5л и 1% в сопоставлении с обработкой БТБ и инсектицидом каратэ, также использовались комплексные обрабтки децимидом и БТБ с добавкой каратэ в 10-кратно сниженной концентрации.

Вследствие неустойчивых погодных условии обработка проведена в неоптиыальной для биопрепаратов период - при переходе значительной части личинок на 111 возраст. Основные результаты опыта . приведены в таблице 7.

По показателям гибели личинок отмечается невысокое влияние 0,5% децимида, умеренное влияние. .IX-децимида и весьма высокая эффективность 0,5% БТБ. Все обработки с использованием каратэ, в том числе и комплексные,, обеспечили быстрое и польное уничтожение личинок. Двукратные обработки/дециыидом показали также умеренное, но несколько более длительное и стабильное действие.

В полевом опыте 'тагане обнаруживается вызываемый биопрепаратами эффект замедления развития и снижения массы личинок, ; выраженный- нерезкой но вполне систематической тенденцией. >. ;"-'

. Показатели поврежденности растений - в общем дают сходную картину с показателями численности, однако более'.чутко реагируют, нз систему обработки.' Так,', ■ однократные обработки децимидом снижают степень, поврежденности примерно в 1,5 раза, :тогда как двукратные

I- , "

О.С ' v V -Л :

ллллл;:" Л^.-ЛЛЧ^ЛЛ г/.пЦ'-лтр-длл ди^иида

;¡ ucc.

Лд!лл< rr/r лл:л л'ллд .va:.....:ir. ; лгл'ллллл"w :::-

■::¡;:;-¡t: ллтсл ■■:.•<:■>" :мс:гтл1;лдл"л л лгл.к-тс.: глг-

нсси?с-?::о бо.-ьасл ?гееирпг?льиог.ть дгистп'лч и зко.-.огичесгдя •««-:лта. Сллнка тг.лсго ллллнлл л дм.ней pao с т.? сгрлнлчнлл.лл даосра-

T.:pH!':.':t спьтачя с xit^arst : ,y:/.r-j.лц«:-:п и ,«скцииеллидг.ма.

Ь спчлл с :-;у:г:'л:!Ц.""И :'0псльзспа"г.с1 см -сь разных еидсв, полученных с пс;:с»5а лслул";: Рл.ри.ра. Собранные ¡atara ауаелнц нсме-•даяксь в гксикатори с почьсй, псьерхность которых обрабатывалась суслс-игией препаратов. Действие децтанда сопоставлялось с БТБ и синтетическим пиретрсндсч - деикссм, Результаты показали отсутствий действия сбсих бактериальных препаратов и полнее уничтожение яукелиц дрциссм. Следует отметить, что опыт проводился на шаГи-наяыюи фазе, более високоустойчивой к бактериальным препаратам.

В другем подобном опыте использовались личинки II-III вез-растоз семиточечной коровки , собранные на посадках картофеля.

Побеги ксртофели с: кодонияк» тли, н.ч которых содержались личкш::: коровки, предварительно обрабатывали дпцимидом и БТБ. Результаты (таОх. 9) свидетельствует об отсутствии заметного ьвкяния децимл-да, при сильном уничтожении личинок БТБ. Это дает некоторые основания надеяться на большую мягкость децпмида по отношении к полезной энтомофауно.

Таблица 9

Влияние биопрепаратов на выхкшшкз (Z) личинок 7-точечной коровки

Вариант Время опыта, дни

1 2 - 4 .' 7

Контроль . ; 100 100 85 80

Децимид 17. 100 100 70 70

-ВТБ 0,5% 40 20 10 10

U.Z. Оценка эффективности энтомопатогсчшзи нематоды против колорадского :;;yi;a

Помимо изучения действия нови;; бактериальных препаратов в работе попутно оценивались и другие перспективные средства биологической защити от колорадского лука.. Одним из них является применение нематоды SchteinerHema neoaplectana, действующим начале;.: которой-служат инсектотоксичные бактерии Achromobacter nematophi-lus симбионты кишечника нематоды.

В нашей' работе оценка этого средства ограничивается опытом проводившимся на личинках колорадского жука младших возрастов параллельно на вегетирующих растениях в теплицах и на чазках.Петри; эталоном здесь служила обработка 1% децимидом. Нами-использовалась суспензия нематоды с титром 126 зкз./м>.:3, что несколько ниже ■рекомендуемой нормы.. Результаты (табл. 10) показывают резкое раз- " личие эффективности нематоды в зависимости от условий опыта. На вегетирующих растениях действие нематоды оказалось весьма незначительным,, достигну в лишь около .10% биологической эффективности на 7 день опыта. ..В то'же время на чайках Петри на 5 день в вари-/ анте с нематодой отмечена значительная гибель личинок, ' а к 7 дню эффективность достигла 96%. Такое расхождение возможно-объясняет-

ся необходимостью высокой влажности,для успешного развития нематод, что соблюдалось на чашках Петри, но не на вегетирующих в теплице растениях.' Этот эффект особо заметен на фоне высокого и стабильного действия децимида в обоих условиях. Таким образом, использование нематоды против колорадского жука имеет потенциальные перспективы, . однако нуждается-в дальнейшей разработке форм и условий ее применения. ' .

Таблица 10

Влияние энтамонатогенной нематоды на выживание (7.) личинок колорадского жука

Вариант На растениях В чайках Петри

Время опыта, дни

2 5 7 9 о 5 7 9

Контроль 100 98 98 94 100 98 90 82

Нематода 100 92 88 8Q 92 22 4 4-

Децимид 1 X 70 14 6 - 72 14 2 -

аз. ОЦЕНКА ЕИ0Т0КСИН03 И ТРАНСГЕННЫХ <X0FM КАРТОЕЕЛЯ, ' РАЗРАБАТЫВАЕМЫХ НА ОСНОВЕ Bacillus thuringiensis

Виотестирование проведено для -гена Cry 111А В. thu-ringiensis var tenebricnis, продукт которого, токсичный для личинок колорадского жука., В России эта работа выполнена коллективом ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Синтетические гибридные гены и их продукты представлены следующими вариантами:

Теп N - белок cry IIIA'маркированный канамицинфосфотрасфера-зой• ' ' .Теп В - белок cry IIIA маркированный в - глхзкоуронидазой . Белки Ten \N и Ten Q ' наиболее.удобны для экспрессии в Е. •coli, агробактериях и растениях; отличаются по степени растворимости, методам их экстракции и,. вероятно, по степени инсектоток-сичности. ' -

.Окончательным критерием токсичности генопродуктов является биотестирование,' проведенное в данной-работе на личинках коло-.

радского жугл. Следует отметить, что памп дана энтомологичесгля оценка начальных поисковых этапов биотехнологической программы. Поэтому любое, даже небольшое проявление инсектотоксичности на данном этапе заслуживает внимания.

Оценка инсектотоксичности бактериальных продуктов генной инженерии

Оцешсу токсического эффекта белков Теп 11 и Теп 0 испытывали на вегетирующих растениях картофеля с. Невский в теплице путем, опрыскивания с подсадкой по 10 личинок II возраста на растение. В' результате (табл. 11) небольшее снижение численности в вариантах не было достоверным по сравнению с контролем. Однако, по массе личинок отмечается заметное снижение для Теп N и сильное 2-3 Кратное снижение в варианте с Теп Б. Соответственно, происходит тагаг.е некоторое снижение степени поврежденности растений.

■ Таблица И ,

Влияние бактериальных токсинов .на личинок колорадского жука на гэгетируюидах растениях в теплице (1994 г.)

Вариант . Количество личинок/растений Масса личинок, мг Повреж-денность растений (%)

на 11 день на 14 день

2 5 7

Конт-

роль 10,0+0 8,3±0,7 6,7+1,2 48,9±3,3 119,0+38,1 30,7

Теп N 9,7±0,3 7,5+0,5 6,5+0,5 40,9±9,0. 47,2± 4,1 29,3

Теп 6 9,3+0,3 7,3±1,2 6,3+0,7 24,8±2,7*** 39,7+3,9* 22,5

Таким -образом, при испытании белковых продуктов генной инже-' нерии в оптимальном случае (при недефектности партии, стабильности в открытой среде) удается обнаружить умеренное, "мягкое" проявление токсичности, сказывающееся не столько в увеличении смертности, сколько в ухудшении развития и, вследствие этого, - сниже- ■ нии массы личинок. Такое токсическое и антифидантное действие1 аналогично, хотя и менее выражено, влиянию децимида.

Испытание трансгенных форм картофеля. • '• " ' ,.

В опытах с трансгенными растениями главным ограничивающим' фактором являлся небольшой объем материала и нежность, растений, ."

• -г- ■ • V' ■■ •

полученных из меристемной куль тури ткани.

В опыте, проведенном в 1933 г. в теплице на 12 трансгенных растениях, одно из которых несло ген Теп Б, остальные Теп N. На них, а также на 1 контрольном растении сорта Дезире высаживалось по 10 Л1п:;нск младших возрастов. По данным, полученным на 4 день опыта, испытываемые растения условно подразделили на две группы по показателям массы личинск, а тглгсо степени псврежденности растений (табл. 12). В первой группе, не имевшей токсичного эффекта, эти показателе но уступали контролю. В другой группе у 3 растений! (Теп М) по существенному снижению уровня развития и массы личинок и некоторому снижению псврежденности предполагается проявление инсектотсксичнссти.

Таблица 12

Результаты биотестировашш тралсгешшх растений картофеля

Вариант Количество растений Вживание личинок Степень поЕреж-денности раст. на 4 день,% Возраст личинок (доля, X) Масса личинок, мг

I II III

Контроль 1 100 31,5 10,0 90,0 0 29,8±5,2

Растения без токсичного эффекта 9 88,9 40,3 11.7 75,3 13,0 49,712,5

Растения с тосичным эффектом 3 86,7 24,5 ; 38,5 1 61,5 ! о- 1б,4±2,8"

Таким образом, 1/4 трансгенных форм показала некоторые перспективы по влиянию на колорадского жука. По-видимому, токсическая активность некоторых трансгенных форм пока сопоставима с умерен-• ним антибиозом относительно устойчивых сортов картофеля.

Вместе с тем, несомненно, требуется дальнейшая разработка "биотехнологической программы с целью усиления экспрессии инсекто-, токсичных генов и увеличения стабильности их продуктов.

ВЫВОДЫ.

,1. Новый бактериальный препарат децимид в лабораторных испытаниях на личинках колорадского жука проявил высокую биологичес-;. кую эффективность, достигающую уровня 80-90%. Минимальная эффек-

■/;, . „у/- '

тшшость достигается при использовании препарата 1% концентрации, ' основной эффект проявляется на 4-6 сутки. Отмечено варьирование эффективности различных партий изготовления препарата. Стандартно применяемый бактериальный препарат битоксибациллин (БТБ) достигал 100% эффективности.

2. В опытах на вегетирукхцих в теплице растениях с личинками . колорадского жука эффективность децимида достигала' также 87-88% ■ '. при 0,5 и 1% концентрациях препарата, БТБ - 100%. Децимид вызыва- ■ ет сильное подавление развития и роста личинок, снижая их массу в 5-10 раз. Поврезденность . растений личинками снижается от уровня, 50-80% до 1,3-5%. На 3 различных сорта картофеля действие децимида было сходным. ■

3. Опыты.с использованием личинок старших•возрастов и имаго колорадского жука показывают, что децимид, не оказывая быстрого летального действия на эти стадии, сильно подавляет их жизнедеятельность, снижает активность питания и поврежденность растений. Имаго в меньшей степени .заселяют и повреждают растения обработанные децимидом. Поврежденность растений снижается примерно в 2 раза. Снижается масса личинок и имаго,. . замедляется процесс подготовки жуков у диапаузе. В результате, после зимовки отмечается полная гибель имаго, при выживании 1/3 особей в контроле.

4. В полевых испытаниях при неравномерном по развитию фоне. колорадского жука и нестабильных погодных условиях децимид проявляет умеренное.летальное действие, достигавшее в основном уровня 50-60%. Эффективность БТБ достигала 86-94%, а синтетический -пи-ретрид каратэ обеспечивал быстрое 100% уничтожение личинок. Двук- . ратные обработки децимидом дают несколько больший (до 70%) и дли- : тельный эффект. Обработка децимидом (0,5%) в сочетании с пониженной концентрацией карате (0,002%) имеет 100% эффективность. Как и в лабораторных, условиях децимид вызывает замедления развития и' снижение массы личинок. Обработка 1% децимидом обеспечивает сни-, жение поврежденности растений в 1,5-2 раза; двукратная обработка ■• снизила поврежденность в 2,5 раза;. совместная обработка с."каратэ снижала поврежденность в 10 раз, БТБ обеспечивает - 2 -.7 кратное -снижение поврежденности. < .

, Таким образом, умеренная эффективность децимида частично .' компенсируется антифидантным и хроническим токсичным влиянием на .. личинок, обеспечивая удовлетворительный защитный эффект'., : ' ;

Наибольшую прибавку урожайности по сравнению с контролем из вариантов о децимидом проявила двукратная обработка IX препаратом (61,77.). Применение каратэ обеспечило прибавку урожайности 95,52 и БТБ - 112,37..'

. • 'б. Испытания децимида на 2 других видах жуков листоедов по-' казали умеренную (до 59%) эффективность для'щавелевого листоеда Gastroidea viridula и отсутствие заметного летального эффекта, но снижение повреждаемости растений для калинового листоеда Galerur celia viburui'i.

б. Оценка влияния биопрепаратов на некоторых полезных энто-мофагов показала отсутствие действия децимида и БТБ на имаго хищных жужалиц, при поллом их уничтожении инсектицидом децисом. -Де-цимид также- не оказывает существенного воздействия на личинок кокцинеллид, что выгодно отличает его от БТБ, .вызывающего значительную гибель личинок.

' 7. Испытания -энтомопатогенной нематоды Schteinernema neoáp-lectana на дичинках колорадского жука показали ее • ялсокую (более 90%) эффективность в лабораторном опыте и отсутствие существенного эффекта в вегетационном опыте. Эти различия вероятно связаны с необходимостью высокой влажности для развития и действия нематоды.'

8. Проведена энтомологическая оценка некоторых промежуточных этапов биотехнологической . программы "создания устойчивых к колорадскому жуку трансгенных форм картофеля путем переноса инсекто-токсичных генов Bacillus thuringiensis в гены растений.

Испытание продуктов генной инженерии - • биотоксинов в некоторых случаях, обнаружило их существенное подавляющее действие на развитие.и рост.личинок колорадского жука, вызывающее 2-3 кратное снижение массы личинок, что' аналогично действию бактериальных препаратов.

.9. Биотестирование трансгенных форм картофеля таюке показало снижение роста и развития личинок на некоторых растениях (2-3 кратное снижение массы). Паврежденность таких растений снижена примерно в 1,6 раза, что соответствует'эффекту некоторых частично устойчивых к колорадскому жуку сортов картофеля. Растения, проявившие инсектотоксичное действие, составляли около 25% трансген-' ных форм.' Результаты свидетельствуют о потенциальной перспективности, и необходимости дальнейшей разработки данной программы. .

Рекомендации производству .

Новый бактериальный препарат децимид рекомендуется для применения против личинок колорадского жука на картофеле.' Оптимальная концентрация препарата - 1%,.расход.препарата при стандартном расходе рабочей жидкости - 2-4 л/га. Оптимальный период проведения обработки - массовое' отрождение и развитие личинок младших (I-II) возрастов. Основной эффект децимида проявляется . на 4-6 сутки после обработки. При растянутом развитии вредителя и неоднородности их возрастного состава целесообразны двукратные о интервалом в 1 неделю обработки. Высокоэффективны комплексные обра-. ботки, пониженными концентрациями децимида (0,5%) и.:-' каратэ (0,002%). . Децимид снижает активность питания и вредоносность личинок старших возрастов и имаго колорадского жука, что обеспечивает некоторый защитный эффект и при обработках в неоптимальные сроки. Возможно также применение децимида на щавеле против личинок щавелевого листоеда. •

• Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шаденков A.A.', ДридЯе И.Л., .Гетачеу Т.А., Курочкина С.Д., .Узбекова C.B. ' Майсурян A.M./Шемякин М.Ф. Конструирование гена,

токсичного для жесткокрылых ; белка "cry IMA-cry JA (a)-NPTII" и введение его в трансгенные растения, картофеля //II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". - Пущино, 1993, тез. Докл. С. 59.

2. Гриценко В.В.,. Гетачеу Т.Д. Новый бактериальный препарат "Децимид" в борьбе против колорадского жука //сб.Доклады ТСХА,199!

. 3. Uzbekova S.V,;. Shadenkov A.A., Kuzmin E.V., Kovalyova M. V. , Karpov V.A,, Grizenko V.Y,, Getaohew Î.A., Shemyakin M.F. \ Construction of- hybrid genes for antilepidoptera or anticoleo-pteran fusion proteins "B. thuringiensis toxin-enzymatiq marker" . and their expression in transgenic plants.//Int. symp. "Plant : Biotechnology and Genetic Engineering. Kiev, 1994, p.39; . 1 ...

. 4. Шаденков A.A., Дридзе И.Л., Гриценко В.В., Гетачёу ;/Г.А.,; ■: Юрьева Н.О., Расадина Г.В. ,' Узбекова C.B.', Маисурян А.М.;; л/ Шемякин М.Ф., Анализ токсичности для колорадского жука картофеля и экстрактов клеток Е. coli акспрессируюших гибридные производные гена £-эндотоксина Cry I iIA.// тез доклады Рсссискрй • Академии сельскохозяйственной наук. М.. 1995 (в. печате) .■. ; ;• .*