Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БЕЛКИ РИБОСОМ СЕМЯН ГОРОХА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "БЕЛКИ РИБОСОМ СЕМЯН ГОРОХА"



МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО Н СРЩШЕГО СНЩШЬНОГО ОЫ>АЭОВАШЫ РСФСР МосковокиА ордена Трудового Красного знамени Технологический ИНСТИТУТ' ОЕЦВВОЙ ОрСШШЛбБНОС 111

На правах рукописи

МИН! Светлана Кузьминична

Ш£И РИБОСОМ СНЙН ГОРОХА. (Специальность 03.00.04. - Вкодпшя)

. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кащддата Оиологгюоких наук

М о с а в а 1977

министерство высшего и среднего сшишного 4 образования pcícp 1

иооковохяй ордена Трудового Краевого Лиолопгмсюй институт шцевой врошпыэвносга

H« оралах рутошож

дядина с»ниш

шеи ригосоы семи гороха

(Овеоюльвоотж 03.00.0i - Биохимия)

Автореферат диссертация в* соискание учёной отепени кандидат» вжавогжчвеких наук

:-а<5ота выполнена в лаборатории энзишлоти Ордена Ленина к.-rïTyra оиоиглш им. А.Н. Баха Ш СССР.

:агчкае руководители - член-корреспондент АН СССР, ' профессор В.Л.Кретоигч

кандидат Оиол. наук Н.А.1^шлевская

Официальные оппонента:

доктор биологических наук B.lr. Шпииитер; кандидат оиолагнческях наук М.С, Одинцова,

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной молекулярной ополотой и генетики ВШШ

Автореферат разослав AoO^JXj^ 1977 г.

оаамта дассертадан состоится 1977 г,

аь заседания специализированного совета Д 002.96.0Д по присуждению ученой степени доктора биологических наук пра Институте, бдошмии им, А.Н. Саха АН СССР.

2 диссертацией можно ошакомктъса s библиотеке отделения биологических наук АН CCJP (Посева B-7I, Ленинский пр., 33).

Отзыш на автореферат (в 2-х екзекплярах, заверенных гербовой асчатью) просиы направить со адресу; Москва В~71, Ленинский пр., 33. Институт биохимии им. А.Н.Баха АН СССР Ученому секретари.

Ученый секретарь кандидат баоаюгичееяах наук Н.И.Дьячкоъ

ОШЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. Со времена открытая рабосом игвест-но, что 8tu частида представляют собой рибонукдеопротедд л состоят почта на половину из белка. Давно известно, что рибосомы является местом синтеза белка в клетке. И тем не менее, до самого последнего вреиеки было совершенно неясво, что же представляет собой белковая часть рибосом и какова ее роль. Первоначальные представления о рола рибосома в белковой сан- ' тезе сводились к тому, что рибосша - инертшЗ ыатрикс, на поверхности которого происходит взаимодействие растворпшх компонентов, В дальнейшем бшю установлено, что фермент, катали зируиций образована» пептидной связи, является ивтеграль-воЗ часть" рибосомы. Успеха, достигнутые в последние года в изучения белхоеого синтеза, механизма инидаашн, рдонгаши и термивацяи полдпептидной цепи, позволили установить активную л чрезвычайно сложную роль рибосом в этах процессах. Стало очевидным, что для выяснения различных структурно-фушта-оналЬннх взаимодействий, составляющих механизм биосинтеза белка я его регуляции, необходимо знание структуры рабосом, понимание пространственного расположения, взаимодействия и взаимоотношения отдельных комаосентов рабосом. £ля этого, в своп очередь» njzaa полная информация о свойствах к структуре рабосошых белков л рибоссмных РНК.

В настоящее вре*5я очень высокого уровня достигли исследования белковой части бактериальннх рибосом. Шд&денн и ■ охарактеризованы все 55 белков рчбосом Е. coli , установ-лева важная роль рибосомных белков в структуре и $ункцяа рибосомы, успешно изучается топография частиц и фукииокаа— вая роль индивядуалышх белков в образовании активных центров, обеспечивающих связывание рибосома о тРПК, мРНК и белковыми факторами. ^

По сравнению о бактериальными рйбосомамл все еще очень мало известно о белках рибосом высших организмов — яивот-вах и растений. Несмотря на большое функциональное сходство, между рибосомами низших н высиях организмов существуют валшые химические различия: 80 з рибосош шсшх органа чов значительно тяжелее и крупнее бактериальных рибооом, а

юпее содержание ti едка £ них шесто 0*9 млв. даль тон состав-мет 2,0 - 2,5 млн*

Янтенсавное исследование рибосом эукариотов, наметавшееся з последние года после разработки' иетода дассопзадвл втого rana чао тщ ж кетода 2~ыераого адаатрофореэа в пожавриламид-он голе, базируется s основном на рзбосоыах животного нро-а схождения. Имеющиеся в настоящее врет данные свадетельст-ауш о той, что белковая часть рибосом эукарнотов представляет собой очень сложную я шло изученную систему, наочиты-вамцуц в своей составе ев менее 70 белковых компонентов, Крайне скудны сведения о свойствах иядавидуальвых рябосомных белков, не установлено точно число белков в рибосоме, практически нет информация о фунхдаи «тех белков, сложен г противоречив вопрос о кдслкх белках.

"одно сказать, что в изучении белковой часта 80S рибосом дедаыся только первые шага г шогае важные вопросы не мме1.г ответа.

Рибосомы шсдпх растений пока остаются наименее исследованными. К моменту начала вашей работ имелись лишь единичные даяние о часле компонентов в 60s рибосомах растений н она отличалась от результатов, подученных на рибосомах животных организмов; достоверные сведения о белках отдельных субъединиц растительных рибосом отсутствовала. Это побудило нас предпринять изучение белковой части цитоплазматических рабосом высших растений, Представлялось целесообразным про— вести данное исследование на препаратах белка изолированных субъеданиц, поскольку анализ менее сложной системы может дать более точные результаты.

В качестве основных методов исследования рибосошюх белков был* выбраны метод 2-мерного мектрофореза в долиаурад* змщшои.геяе я метод дкск^алехтрофореза в присутствии доце-далсульфата натрия, как*наибодее явфориатквше для анализа алодичх белковых смесей,- Объект он исследования слуэацп рибосома сеыан гороха Pisua sativum , охарактеризованные в лаборатория ранее а представляилде собой структурно полноценные, ведрограишрованные легко, диссощируггае sos рибосомы.

Пади а задачи работа.

Цель работа: X) попытаться определить часл® белковых компонентов в суишрпвд препарате белка, экстрагироваянса из бОЛЬШОЗ к субчастиц тргугагдА ямят1гда'^'тт!г раб ос си »кртат

растений; 2) получать представление о шлекудярно-вессвои распределении этих белков; 3) оценить степень специфичности белкового состава субчастиц исследуеюл рибосом.

На основа яяа этого в задачу исследования входалэ: I) отработать условия выделения и очистки граммовых количеств рибосом ж рибосшнкх субчастнц из сеьсан гороха 2) выделить» охарактеризоватъ к оценить пригодность подучеа-нкг препаратов субчастиц рибосом дом анализа ях белковой части; 3) не годом 3-мерного электрофореза в поАкавдолавддвт геле в сочетании о методом дкамдеятрофореза в присутствие додецадсуяьфата натрия провести анализ сильно .основных (с ЮТ вше в,б) белков рибосом ж рабосомных субчасткц; 4) установить» присутствуют ли относительно вислые (о ТЭТ ниже 8,6) полнпептиды в белке» экстрагированном иэ рибосом к рибосом-енх субчастиц сеыяв гороха. По возможности^олучнть кх^ор-шцип об их числе к степени влектрофоретжчесхоА и мвлекужяр-оо-весовоА гетерогенности; 5) сравнить бедке большой субчао-тида с белками налов субчасткцн, а таксе те я другие о Сел-кэш деднх рибосом ж оценить характер распределения рибоссм-ных белков между двумя субчастицами.

Научная новизна работа. Дяистат работа представляет собав Одну из первых попыток определить возможное число полипеа-тидшх цепей в белке, экстрагированном из большой в малой субьедашц сд тодяазматжчестах рибосом шсшх растений. Показано, что белковая часть исследованных рибосом состоит кг большого числа юлнпедтядных цепей, различающихся по величине молекулярного веса, по и го электрическим точкам х, очевидно, со содержанию в суммарной препарате белая. Около 60 электрофоретичесни различных белковых компонентов даявлезо в белке, вкстраггроваином из большой субчастидо, ж около 40 - в белке, экстрагированном вэ малой с уб час гида. Полж-пелткднае цепи, обнаруженные в препарате белка большой суФ-часткда, как правило, же повторяются в препарате белка на-

доЯ субчастиш. На основании этого сделано заключение о строго* спевдфнчвостя белкового состава й-х субъеддниц. Это означает» что s сршернсм препарате вдтотатзматических рнбосой cestss гороха присутствует около 100 белковых компонентов.3 составе субъединая рибосом высших растенаЛ впервые ойнарудэ-та к частично охарактеризована группа отнооитедъно кислых белков (с ЮТ шхе 8,6)» Получены первые дгшнае о величинах молекулярных весов основной кассы полипедтиданх деггеЗ, вызоленных методом 2-иерного адектрофореза, в сделано заключение о вошоажД величине среда ечислсвого молекулярного веса белков большой и шал ой субчастиц рибосом растительного проио-хождеавя.

Практическая ренность полученных jywr состоит в тем, .что ош являются основой для выяснения структура "рибосом и пошаыяия холекузшрвых ваханнигов биосинтеза бежа у вистах растение. Результаты исследования рибосом семян могут быть иепшьговани хда шявленая причин потери семеваш всхожести при хранении.

. Адробакдя работа. Результат» исследований доложены ев конференция колодах ученых Иосжовского ордена Трудового Крао-ного Знамени технологического института пишевоЗ цроицшяея-аости в мае 1976 г., на научной конференции ордена Лента института биохимии rat. 1.Н.Баха АН СССР в декабре 1ЭТ6 г.

Дрблякадая. Результаты исследований изложат* в 4 публнка-

цеях.

Структура е объйм работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора со белкам рибосом про- и »увариотов и »ксдеркмеатадьноД части, которая включает описание материалов s методов исслеловадвя, изложение полученных результатов и их обсуждение, заюанеше я вывода. Список литератур« насчитывает 231 ссыдку. Объем работы 120 страниц, включая II таблиц и 22 рисунка.

• Ч

экашришахшнАЯ часть

Материалы г методы исследования

Исходвыы' материалом i сдуззда_судте зрела® сешева горохе Flaum sativum L. сорта "Победитель". Сенека икелж 100£-ну*> всхожесть и использовались без какоЗ-дзбо предварительно! ' обработав.

Препаративное виделевау рибосом. Дчя получения 1 г рибосом .600 г семян гороха веиедьшяв в жофешлхе при охлажде-. пия до получении тонкой мука в смешивали о 2 л тряо-став-дартнаго буфера (0,05м трас» 0,01м 1Ц s04, 0,05м Ed, рВ-7,4—7,6)а содержащего 0,25м сахарозу. Гомогенат ценгрдфуга-ровали 20 ива цра 2 500 об/кин ж 20 шн оря 20 000g . £ над-осадочвоЛ жидкости добавляла тритоа х J00 до вонегчноЯ so»» центрацаи ржбосош осаждала центрифугированием при 105 000g в течение 2 ч. Рибосош дважды прошвади отаядарт-шш буфером и один раз Кг44^-буфером (0,05м тряс, 0,Su KCl в 0,01м Uj 304, рН-7,4). Полученные драдаратн использовала ддн экстращин pnöoccusuro белка.

Для выделения субьединиц исдаяьвовали рибосош дважды сро-матые стандартным буфером. Субьеданада, образующиеся при диссоциация рибосом в K-ifcj-буфере^ разделяли с помощь® еоналмо-143 центрифугирования в градиенте концевтращщ сахарозы. Из соответстзуида фракцкй градиента субъеданица подучалз путем удьтрадентрдфугиЕравания в угловом роторе при 60 ОООоб/мин в течение 4,5 i или с помощью стартового осаждения üuule-nas, 1971). Большую субъедзшщу (ВС) дополнительно чистила . от принеси малой субъединидн <ИС) путей центрифугирования суспензии БС через слов 1м сахарозы при 50 ООО об/мив s те-чевае 2,5 ч. Все операции по выделена» ж очистке рибосом и ' субъединиц проведала при 0-4°С.

Плавучую шготность субгедидщ, фиксированных 4JE формальдегидом, определяли методом равновесного центрифугирования в градиенте плотности CaCI. Для атоЗ цеди недольвовади пр^-форйкроваавыЗ градиент» приготовленная ва тривта-

иодашш (ТЗА)-стандартном буфере, содержащей 4% фориальде--

s.

Елавучук плотность растворов СэС! я яештусмьи частиц рассчитывали ВО ¿оответствующему, уравиеш» (Vtaograd, Eearat, 1972) с учетом поправки да показатель прехсцдеЕия буфера, содержащего формальдегид.

Саддцентапаонний анализ рзйосом а субъедсвга, & таете FHK 8 составе рлбосом и субъеддакц проводили в аналитическое узйтрецентрй^угв Spinco Е, используя Шлирев-опткческую сио-тез^-.

Су^ашршД белок рабосом g стбъединад аадгчали девротеани-saipiea рябосом в субъеданая За iiCIe присутсгЕгн 4м иочеидкы (spitnit- zisoo , 1965) яля екстракизеЗ 6731 уксусной КИСЛОТОЙ В жрлсутзтыш ЕС KÍÍ (Kflltecbmldt, Witt mann ,1372).

g-адердД алеятроФорез в ИАГ ргбосоишх белков граводада в системе Кальтшиидта s Витманна (Kaltecbnidt, ffjttaaim»1970) с некоторыми кэдкфакадидаа, направленный^ на достазетаа луч-саго разреиенгя» Нодафикадак метода касались pasuepa трутЗок а концентрация геля при электрофорезе в I направлении , вре-кгпа элэхтрсфореьа в обоях направлениях я способа нанесшая бедаа. См ютевика была запенена на Сы.

Злзкгрсфорез в I направлении проводила на холоду при рВ-0*6 в геле, содержащем 6% акридамдда в 0,2% кетилоабясаярдл-акада. Анализ белков, шгрЕрутвдсс я катоду г аноду проводила з раздельных гелгх. Epeü-ч влектрофореза яра схле тока 4-5 на/гель варьировало от 15 до 20 ч.

При электрофорезе во 2 направлении рабосодаые бедкз разделяли ща {Д 4,2 в гедевых пластинах (20x20x0,4 ш)» содер-аадах ISí акрилвдггда и 0,5£ меткленбисакриламвда. Электрофорез проводили sa холоду при 80т в течение 42 - 64 ч.

Гели ократавадя 0,5? раствором аыидового черного в 10? уксусной кислоте, содержаний 505~ниа иаталол. Избыток краска удалял» 7% уксусной кислотой.

Электрофорез в ШТ. содержащем додедилстдьфат ватрвдСДСЙ), проводили по методу Вебера и Осборн (Weber, oebom ,1969). Образец белка дли анализа получали согласно процедуре, опасаа-рс2 Говардсы К др. (Howaxd et al., 1975). ащченин молекулярных весов исследуемых- бще&ов находили по кривой зависают-ти относительной подвижности 7 стандартна! белков от догариф-№ ях молекулярного веса.

Результаты исследований

I* Препаративное выявление субъелрххп рибосом и характеристика полученных препаратов

Для исследования рибосокных белков требуются большие количества васокоочзщевкмх препаратов рибосом и рибосомных субьеданиц. Повтоцу первая задача данной работы состояла г тем, чтобы выделить из семян гороха в граммовых количества; указанные структуры и оценить пригодность полученных препаратов. В основу предпринятой препаративной работ были положены сведения о рибосомах семян гороха, полученные в лаборатория ранее (Гумилевскаяи др., 1971, 1972, 1975; ^ушшсаа, Еретович, 1974),

Препарата цитоплазматичеоких 60 S рибосом, предназяачен-ше для анализа их белковой части, а т£_хже для выделения субьединиц, не должны содержать частиц другого типа. Поэтом:. Все препараты рибосом, выделенные при выполнении данной работы, подвергали соответствующему анализу. СедииестационныЙ анализ дрчдпр пере осажденных рибосом ж их рРНК показал (рис1), . что они , действительно, содержат только один тип частиц -ца то плазматические 80 S рибосош и, следовательно, могут, быть использованы в качестве источника рибосомных субъедави^ к рибосомного белка.

Обратимая диссоциация 80s рибосом семян гороха дегк;> достигается путем интубацяп рибосси в буфере, содержащем О,Sit KCl z 0,01м Ugs 04; диссоциация не сопровождается структур-иттд изменениями образувдкхся субъедишщ (Гуыилевскзя и др., X97S). в данной работе для достижения полной диссоциации 1г рибосом в объеме 100 мл К-W^ -буфера простая инкубация оказалась недостаточной и была заменена диализе« ка холоду в течение ночи. СедимеятадаонныЙ анализ показал (рис. 1в), что в результате этой операции мы получили расгвор, содержащий только два вида частиц с яоэффвднентаиа оедамавтадак 3t_37s и 54-S7S , соответствуйте большой в малой субь-

»m.mm^M Q0S pEÖOCW.

Для разделения субъедивщ рибосом методам зодальксго центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы был исаоль-«шад poTopjci-t (зональный), дагдай возможность работать

Jt

большим объемом образцам Sbe г ton et al., 1974 iEifcentieiy^et^

Существенным моментом при разделешш субьеданиц является выбор ионных условий. В среде»вызывающей изменение седашен-тационшх свойств разделяемых компонентов, ыохет происходить взаимное загрязнение субъевика в результате соосажденид части* различного происховде тя. Субъедешицы рибосом семин гороха относительно устойчивы в В-И^-буфере, поэтему препаратав-вое разделение субъеддняц в данной работе проводили в тех же ионных условиях. В результате било получено удовлетворительное распределение суОъедиввд в сахарозном градиенте (рас. 2). Количество компонентов, присутствующих в исходной суспензии двссоцизровашасс рибосом (ряс. 1в), находится в хорошем соответствии с числом компонентов, обнаруженных в сахарозном . градиенте.

Осаждение субъединиц из фралдай сахарозного градиента было проведено 2 способа«)!: X) путем ультрацентрифущроваяия в угловом роторе разбавленных растворов, содержащих каадус гтз субъеддащ; 2) с ешощьо спиртового осаддения после удаления избытка сахарозы ж яоиов гадал диализом (:Kauienae<,X97I, ¿asг'.он et al. ',1974). Известно, что первый способ дает структурно неповрежденные субчастиды, но связан с рядом тех-.нлчссках трудностей. Второй способ прост г удобен, однако на исследуемых рибосомах не исшивался.

Анализ полученных таким обрйзом препаратов показал, что легкий компонент свободен от примеси тяжелого компонента, се— тузгентирует с коэффициентом 36, имеет в своем составе I вид высокомолекулярной РНК (рис. 1г,е), в градиенте плотности CsCI дает I полосу в зоне плотности 1,52 г/см3 (рис.3). Изолированный тяжелый компонент седлментяровал с коэффициентом 56-57s , содержал одан вид высокомолекулярной FÍGC и в ■ градиенте плотности CeCI распределялся в зоне плотности 2,56 г/Ък3 (рис. 1д,х; рис. 3). Аналошчнюет характеристиками обладают структурно н функционально полноценные субьеди-Еанц SOS рибосом высших растений (Гумнлевская и др., 1972, 1975; ijtiLhoztin «t al., 1972; Беклемипев и др., 1976; Садеа-

гапо et

Tomas образа», изолированные препараты субчастиц сходни по своим седимеитацаоньым и плотноьтвум характ ерястипам с

[и

36 55 36 ре

—|

Рас. I. Седдиенгадал рдоосс* х суйьедакщвавали твческоЗ

К-Шо

ре; г.я) _____

|е,ж) ш а ВО » 0.01 и *ВЛ0|

И ЕС В

, ---Л В 0,0__-е-—,

буфере, содержалем дСН.

1507., .

в кии В

[ентрдфугяровааая

---интервал съемк.-.

" в остальных

*>0 фракции

Рис.4. Распределение в сахарозном градаенте суочас— т*щ рибосом семзн гороха.

Врема центрифугирования 17 чае, скорость 17000О6/Ш' ротор зо|аль0ыа

градиент концентрации сахарозы 7^4—38? на К-Ыо буфере.

о? 1.0

0.5 '

11 52 1,56

л \ 1.6.

\ ч 1 40 60

т К 1,6' 1 1

л

о

1.5

С^ Рис. о. Расяре-деление в градиенте плотности СгС1 ^.-уОчастгЕ рибосом се»яв гороха.

Условии цевтр*-

1.5 1.4

Футерования: 53000 ой/мал. ХВчас, 5»с, ротор

ТО

10 20

10.

субъединицвмп, входавдми в состав 80s рибосом. Это свидв-тедьстзует о том, что процесс выделения, предпринятый в дав-вой работе» по всей видимости, не нарушает структурной целостности частиц и изолированные субъеданида мохно исполъзс^ вать для исследования их белковой части. Однако, учитывая то обстоятельство, что при спиртовом осаждении может произойти селективное вымывание некоторых кислых белков из большой cyö-ь единицы рибосом {stоfileг et al, 1974i Wool, Stöfiler, 1974}, препарата, "полученные даншш методом, при анализе кис-дах балков .не использовали. При анализе основных белков' были исследоваш оба варианта полученных препаратов.

2. Диализ основных белковг

Приступая к исследована» белковой часта рибосом оекян гороха методом 2-мерного алектрофореза в ШГ, мы сочли пзлесо-образшш анализ основных а кислых белков (т.е. белков, ведущих себя как катионы и аниона при pH 8,6) проводить раздельно. При анализе основных белков особое внимание било уделено достижению максимально полного разделения белковых компонентов.

Многочисленны? ошти с препаратом белка целых 80s рибосом доказали, что удовлетворительное разделение данной смеси белков трудно достиалмд; при всех испытанных условиях электрофореза выявлялось не более 50-55 компонентов, многие белковые пятна цродолкагс»! занимать значительную площадь в геле, оставались интенсивно оьрзшеннцмр и, очевидно, сод ерзали лее одного компонента. По всей видимости, в исследуемых 80s. рибосомах присутствует большое чпсло долкпептидов со сходными или близкими алектрофоретическиш свойствам.

Релта 60s стбчастап/а. Анализ основных белков 60s суб-тастииу методам 2-мерного электрофоре за при условиях, дающих наилучшее разделение, позволил выявить следующее характерные особенности данной снеси белков. Суммарный препарат белка ЕС електрофоретичесзя чрезвычайно гетерогенез (рис. 4). При Электрофорезе в I направлении белки распределяются равномерна по всему гелевоыу столбику. При электрофорезе во 2-ом направлении найивдается менее равномерное распределением

Fio, 4. Распределен« освооди Свяюв 605 40-? отйчастяц дрв 2-мрвоя ьштрэ-Фор«м ь шГ,

fê

о

основная касса белков располагается в верха ев половине т»* вой пластины. Удовлетворительное разделение еткх белков достигается лишь севсЛ потери бистро движущихся компонентов. ТаяоД характер мехтрофоретхчесхаЗ гетерогзнноотв не позволяет выявить все белхоше компоненты одновременно при одном разгоне.

Следувдая характерная особенность белков ВС состоят в той, что они окрашиваются с различно! степень» интенсивности. Ое» ряду с очень яркими пятнами наблвдаютоя слабоокраяенвне. Некоторые пятна удается выявить только при увеличении количества авализдруемого бедка. Эта особенность белков ЕС не позволяет выявить вое компоненты одаовременно в одной пробе Обратив* i

Наличие ярких пятен мокет быть обусловлено локалхзадаев в вих нескольких белков с близка меетрофоретической подвид-еостью. Адализ гомогеЕноатибелхов, локализовавшее в ярких иатнах, о помощью «ектрофореза. в гелах, содержащих ДСН, показал, что в некоторых случаях, действительно, в I пятне присутствуй 2 белковых компонента с разным юлекулярним весом ( 16, 129-30, L27-28). Однако белок остальных ярках пятен оказался гошгеннш.

В отношения очень слабых пятен можно было предположить, что их присутствие является результата! примеси.белков UC (например, белки L 21,22 ж s 13,14). Однако при джжтель-всм електрофорезе сыеса белков 605 ж 40S оубчаотиц удавалось разделить етв.компонента. При анализе белков штат SOS рибосом в »том месте голевой платины мы также обнаружили 4 пятна - 2 ярких ж 2 очень слабых. Дан очень слабых пятен i 35, L 36, ь 14, L 15,1.18 в L19 вообще вет эквивалентов среди белков ИЗ. Тагам образом, происхождение слабоокра-веннмх пятен нельзя объяснить примесью белков Ш.

Далее, поскольку янтенаквяость окрашивания пятен же kqjh-радирует о ввлнчивов молекулярного веса белков кхи величиной заряда, то кажется более вероятным, что неравномерность опрашивания рвбосомных белков обусловлена их разлнчнкц содержанием в суммарном препарате бедка. Сдабоокраяенные бедковке компонента, возможно, присутствуют ве в каддсА частице, а ивтеясявно окраяевнае - в нескольких копиях . Это мокет коо-

J.O,

©___

" о L2<

140 ,. i м<

Tío

L9° Licb 041 Í.12®

Uío ОЦ9 tífg.otts

л Jé- «.

LS50 is*©

L39

t-ro

t4sO L4i©

I otoвкачены баш, Jtst которых l<»lO

оаределялк мол. вес

©Т23——-

Pie. Скека распределения основных белков 605 суй часта.

вевко указывать ва во глохнув гетерспшость 80S реооосм в отношении белкового фстава.

Для всех достаточно хорошо окрашенных белковых жомаове»-тов ВС белков) были определены авячекхя моивхуалркт .._-... весов. Доя его2 пела каждое хссдедуаиое белковое пятно шре-вали в после соответствуйте оОрвботкш подвергай хмсх-мект-

в

. 14.

ш.

$i О

szo SS^ JS 3&<psno s«o

SJ90

зго©

W' *28°

© Й^Ри^™ »тор« ззг^

, p определяли мол. вес

02í> ,яс.

Рис. 5 б. Схема распределения основных Сехков 405 субчао-гида.

рофорезу в присутствии ДСН. При в тон были аналиаароваяи белки, расположенные в различных участках гедевой гсдастжны а о<Ьидапцив всеми возможными вариаятаыи алектрофоретнческих подвшшостеЛ Сряс. 5а). .По»тому нам кахется, что полученные^ данные в определенной' мере отрадаютоОдайхарактериолену-" дярно-весовой гетерогенности белков большой суйъедкшщы я дзот основание сделать предварительное заключение о не среднечисдового молекулярного веса (Я чцсд,).

»

Таблклд

иолекудярные seca белков рибосом

семаа города.____ , ,

Белок. БС (№) Белок БС Белок НС (SS^ Белок MC

1 1 53,0 L 29 21,5 s 3 31,0 3 г? 16,0

¿ 2 54,0 L 30 19,8 S 5 32,5 3 18 18,0

Í 8 30,0 L 32 27,0 S 6 29,8 3 20 17,0

L So- 28,0 Ь 33 Г?. 4 s 7 30,2 s 23 18,8

Ы2 28,0 Ь 37 20,0 3 6 23,5 s 24 14,8

Ь 20 24,0 l 38 18,8 3 9 20,8 3 26 15,7

Ъ 23 19,0 L 39 18,8 310 24.0 3 29 28,0

18,5 L 41 16,5 3 п 29,2 3 30 10,0

L25 IS.0 L 42 14,4 SI3 21,5 S зс 25,6

L 26 15,0 Ь 44 21,0 3 14 17,4 s 32 12,3

Ь 27 18,0 Ь 45 21,0 3 15 17,0

L 28 19,7 L 46 21,0 S16 17,8

На основания проведенного анализа я давних по иолекуляр-но-гесовому распределению суммарных препаратов бедка БС рибосом семян гороха можно сказать, что исследуемые белки гете-рогекны по величине и представляют собой относительно ниеко-молекудярше полняептеды, среда которых нет белков с мод. весом выше 60 ООО и очень мало белков с мол* весом вше 50 ООО и кике 15 ООО. Основная масса белков ЕСимеет молекулярный вес в'интервале 15 ООО - 30 ООО. Приблизительно такие же данные полуяеи: для белков БС рибосом аияотньсг. Различие состоит в том, что иол. вес ocko&ho& массы белков в hex несколько выше (Твгао, Ogata, 1975| Lin.Woól, 1974t Howard •t all, 1975).

Tsjom образом, при анализе основных белков в'сушарком •белке БС обнаружено 4? белковых компонентов, ведутах себя как катионы при pH 8,6: 16 в виде ярко ж хорош окрашенных пятен, 12 - в виде среднвокраиеяннх пятен ж I? в гиде слабых пятен. Сходные данные были получек* Гуадерзи к др. ял ВО рибосом проростков гороха (Cualerei et al.,19174 ). ЧИСЛО основных белков, обнаруженных в БС животных рибосом пока во превылало 38 (sherton, 1

додка 40 з стбчастит. Анализ основных белков 1С показал, tro для данной белковой смеси характерны те же черты, что и для белков БС; «лектрофоретическая гетерогенность, которая лучше выражена при электрофорезе в I направлении, чем во 2-й, и различная степень интенсивности окрашивания белковых пятен. Все «то приводит х тому, что разделить все белковые компоненты одновременно в одной пробе при одном разгоне не представляется возможным. Однако меньшее число белковых компонентов, зо сравнению с БС,и большая юс електрофоретическая гетерогенность облегчают разделение »той белковой смеси. Трудность состоит в »6наружешш слабоокрашенных пятен и в сравнении белков КС о белками ЕС.

Картина распределения белков МС очень характерна и непохожа вд карткну распределевия белков БС. Белки, расположен-iüt в центральной части гелевой пдаотины{рис. 4 и 56), образует характерную дкя распределены белков UC фигуру в виде полукруга,Различия в интенсивности окраски пятен, отмечавшиеся выше в отношении белков БС, в еще большей степени характерны доя белков UC. Наряду о большими и чрезвычайно яркими датяамк (38, 13, 14, 20) есть такие, которые одыы плохо (3 4, 12, 25 , 26, 27, 28, 31) (рис. 4, 56). Показано, что в некоторых ярких пнтнах ( 3 8 и 3 23) присутствуют 2 белковых компонента с различными молекулярными весами ( з 8-9 и з 23.4). Другие яркие пятна, как и в случае о белками 603 cyt5-чаотищ:, оказались гомогенными при электрофорезе в присутствии ЖШ. Для КС, жал и для БС, ш ве наблюдали видимой корреляции иезду степенью окрашенности белков и их алектрофоре-тической подвижностью или величиной их молекулярного веса, lo всей видимости, содержание белковых компонентов в суммарном препарате белка UC различно.

Определение моя. веса (таблица) основной массы белков, ¿снаружеинкх при 2-мерном электрофорезе, показало, что в аосташ40э субчастипы нет белков в мол. весом выше 40 ООО и зиже ХО ООО, мало белков о мел, весом выше 00 ООО и виже 15 QG0.Вольная часть белков имеет мол. вес 15 ООО - X ООО. Саражтер иолегсулярно-весового распределения белков UC рибо-:эм растений и хивотных очень близок, хотя дола белков в мо-.гзхулнркым ?евсм 20 ООО - 30 ООО а животных субьеднницах ве-

иного Еше.

В результате анализа основных белков в сугсларном крепараг-те белка МС нами обнаружено 32 белковых компонента, ведущих себя как катаода при рН б.С: 15 в виде ярко и хорошо окрашенных пятен, в — в виде среднеократенных и 9 слабых пятен. Эти данные находятся в хорошем соответствии с результатами, .

СОДуЧеННЫМИ рИбОСШ ПРОРОСТКОВ ГОрОХа ( Gunlerzi »t al.,

1Э74). По числу обнаруженных белков Ш рибосом семян гороха мало отличается от соответствующей субчастицы животных рибосом.

СраБнеете электрофореграмм белков ЕС я МС дсследугаягг рибосом шсшюс растений показало, что все полияеатвда, обнаруженные в суммарном препарате белка МС ве совпеьают по элект-ропоретическоЭ подвихкости с бедками J3C, Исклотение составляют 2 пары белков - зю к ¿ТО, а татске SI9 и ь 2S-30. Решить вопрос о том, являются ли эта редки обоими для обеих субчастиц пли не разделяются при данных условиях иссдедова-штЯа пока затруднятельно.

Однако характерно. Что дачтк'-кялдоиу белку ус соответствует близкий со подвижности белковый компонент В2, т.е. наблюдается большое сходство алектрофоретических свойств меж-*ду многими белками ЕС а ЬК. Возможно, это связано с тем, что мол. веса основной массы белков обэих субьедаыгц находятся в одинаковых пределах. Очевидно, ато является причиной не- . удовлетворительного разделения белксз -целых 80з рибосом и затрудняет их идентификацию. Тая, например, белки з 17, з le к l 23 при электрофорезе смеса белков БС а ЫС дают одно очень большое пятно, а'белка 3 20 в L 33 - одно вытянутое пятно. Близко расположены белки L 5,7 в 3 5,7, Для кх разделения требуется значительное увеличение временя алектро-фореза, как и два белков L 21, 22 И 3 13, 14.

Таким обратом, проведенный нами сравнительный анаххз основных белков доказал, что сочти все белки ИС, за небольшим ястшченаеы, отличается по своим свойствам от белков ЕС. Это указывает на высокую степень следифгчностя белгово-ро набора субчаст.щ исследо ваннах -рибосом растений.

Следует заметить, что препараты субъедгпид, выделенные

методами (осаздшше путем ультракентрнфугироьанвя zjBi г помощи» спирта) дали однотипные результата при анализе основных белков. На основаны втого метод осаядения субъ-адшпт спирт см колет быть рексмендовав для препаративного наделения суоъединлц с целы) анализа основных балков.

3. Анализ киолкх белков

-ледухщая задача предцринятаго вами изучения белковой •шсти рибосом семян гороха состояла в том, чтобы выяснить, присутствуют ли в препаратах исследуемых рибосом высших pao-гений полидептиды с ЮТ кале 8,6. Для этой цели шли исполь-ьовани препараты рибосом, дополнительно простые солевым буфером для максимально полного удаления кислых белков цитозо-ля.

Белки 80S рибосом. При одномерном алектрофорезе в слабо-аелочннх условиях (pH 8,6) в суммарном белке КИ-промытшс 80 s рибоссн семян гороха помимо основных белков , двигающихся к катоду, выявляется ряд белковых компонентов, мзгра-рурцах к аноду (рас. 6). ату группу дедков, имевших ЮГ ниже 8,6, удслось наблюдать только при наресении на гель больших количеств белка. Среди всей массы белков, мигрирующих при данных условиях к аноду, нохво выделить грушу белков с наибольшей «дектрофоретнческой подвижностью (pite. 6, зона 5), несколько интенсивно окрашенных зон с-меньшей подвижностью (зовы 2-4) и материал, остающийся на1 старте {зона I). Зона 5 предстазадяет наиболее кислые белки, входящие в состав 805 рибосом семо гороха. Однако полно сказать, что az ИЗТ не должна быть ниже 4,2, тек как ни один белковый компонент яе двггалса в геле к вводу, если электрофорез проводили при pH 4,2. Материал, расположенный на старте ш вблизи него, может быть обусловлен агрегатами или белками с ЮТ около 6,6.

Цря 2-hçphou электрофор? sc киелнх белков 80 s рибосом ' ухалось выявить около 20 слабоокрашенных белковых компонентов (рис. 7). Следует отметить, что препараты рибоссашого белка, полученные разними методами екстракции, дали одинаковые результат.

i

( \

■ ** . Л* ! и I | +

I -

2 +

а-.

Рас. 6. Эдзктрофоретическое распределена в при рН белков НС1-проштШ£ 802рибосом. I - 0.1 мг; 2 - 9 1гг.

ф)

¿Г о

ч-.

О

А

зЖ

Ш

^ 1

ЛВ

о

о

О

2Ь

г (/-I

— 1-Х

пш тт

эд

— ь-ЕГ

' Рис. 7. Распределение анзоно-подшхнкх белков Ш2 риоосои ., пра 2-кернш электрофорезе: ; элежтрофорегрсмиа Та) и сдеиа

Рис. в. Злектро$оретяческое распределение в ПАТ при рН 8,6 ашгоноподБишшс балкон 60$ и 405 суочастяа риСоссы.

¿b.

tajwe, интерес редставдяло выяснить, присзтствуют ли от^ зоситедьно кислые белки, обнаруженные в недассощирсшанйих сСЯ-промытмх 80S рабосомах.в каждой из субъедяшщ. Анадаз з э»ом случае проводили метод он одномерного электрофореза.

" Э^е^трофоретичесхий анализ ври рН 8,6 показал, что в со* »таве каждой из субъединиц. как г в недиссоциированных 80S рибосомах, кроме основной кассы положительно заряженных белков, присутствует несколько белковых компонентов, двиталсда.— ся в геле к аноду (рис. 8). Иохно видеть, что картина распределения анионоподвижЕых белков ЕС а 1С! совершенно различна. Наибольшей подшжностью, а, следовательно, ш наибольший отрицательным зарядам, обладай1 белки^ принадлежащие БС. Эта группа белковых компонентов (зона Щ-JV pax 8) выявляется в виде 2 хорошо окрашенных белковых полос в 5 минорных. Бед-ков о аналогичной подвижноегью в состава 1С пет. Остальные анионоподвижные белки, очевидно, обладапг менее выраженным отрицательным зарядом. В случае БС ока дают 3 интенсивно ■ окрашенные белковые полоса я 4-5 слабых, а в случае ДО -2 главных а 4 слабых. При этом янтовелвво окрашенные белковые полосы НС в БС не совпадал по подвижности.

Таким образом, методом одномерного электрофореза при нанесении на гель нескольких иг бедка можно обнаружить около х5 белковых полос в случав ЕС и 6 белковых полос в случае Ш, мигрирующих к аяоду при pfl 8,6.

Затем мы попытались получить хотя бы ориентировочные представления о степени молекудярно-весовой гетерогенности ално^7 но-подвикных белков субчастиц рибосом семян гороха, исполь- "*' эуя упомянутый выае метод (Howard et al., 1975). К сожалению, белковые полосы после алеатрофореза в присутствии ИРЕ бшп* очень диффузными, что в значительной мере снижало точность определения ведячив моледуэшряого веса.

Группа наиболее кислых белков БС, состоящая из 5 минорных слебоскрапешшх компонентов (рис. 8, зона IL-1V) дает в геле, содержащем ÍGH, одну даффуспус широкую полосу в зоне балков с молекулярным весом от 14 ООО до 17 500. Два других хорошо окрапенных кислых белковых компонента БС (зова LÜI ) давали 2 широкие полосы в зоне белков с молекулярным весом 22 ООО и 17 ООО. Группа балков с низкой злектрофоретнческой подвгк-

востыо (зона l-I, i-Ш давала 5 главных полос, распололев-ных в области белков с молекулярным весок 48 500, 34 ООО, 31 ООО, 2S 500 в 25 500. Для кислых белков 1С Шли получеш. следующие значения ыолеку^лршх весов образующих' их полг-пептвдных цепей: 25 ООО, 23 ООО, 14 500 и 13 ООО - для балков зовы 3—1 и 20 ООО — для минорных (зона S-H, рис. 9>. За исключением одного белка, чей молекулярный вес составив 48 500, группа кислых быков ЕС и УС состоит яэ яшяпептид-вых цепей с молекулярным весом от 13 ООО до 31 ООО. Следует заметить, что характер молекудярно-весового распределения кислых и основных белков исследуешх рибосом сешв гороха весьма сходен.

Величина S ШСл , рассчитанная ¿в данных по анализу основное а кислых белков ЕС и UC, составила 2А 800 и 21 100 соответственно. В этом отношении раститч-чь-ше рибосомы существенно отличаются от бактериальных рибосом ж достаточно близки к рибосомам животных.

Таким образом, в суммарном препарате белка рибосом сешв гороха нами обнаружена группа относительно кислых белков, душах себя как анионы сра рН 8,6. Ориентировочно можно внде-, лить около 1 главных н 14 минорных компонентов, которые различат ся как по молекулярному весу, так к по величине заряда. Эти данные хорошо согласуются с результатами исследования 80 S рибосом других видов высших (üagabhuaban et al., 1974; Ч Грина, Одинцова., 1974) и шзшх (Bruggeг, Boechetti , 1975; f Grankowem. et si 1976) растений. Нам удалось показать, что наличие кислых белков в 603 рибосомах обусловле-

но присутствием спегафвчеокого набора относительно кзслых полипептидных цепей в суммарном препарате белка БС х 1С. Отрицательные результаты, полученные ва суйьадхнхцах рябоесм проростков гороха (Gualerzl et «1 .. 1974) обусловлены, по-вшему мне потерей кислых белков при технике мектро-форетаческого анализа. В исследованных вами суОгедкнюах рибосом выссих растения кислые белки были об&арукены аеоосрес-ственко в суммарном препарате белка при его адектрофоретячес-ком анализе. Б рибосомах печени крысы 16 кислых белков удалось выявить только после применения метода группового даоиированая препаратов рибосокного белка < Coiuti «t

1^76). По воей видимости, содержание.относительно кислых'по-.шпептидов s суммарном препарате белка рибосом высших рао-гегай существенно шше, чем в рибосомах животных. Тем не мене:, трудность обнаружения кислых белков в рибосомах 80s типа, по сравнению с рибосомами в, coli , несомненна. Причина этого явления пока остается неясвоЭ.

Известно, что в БС рибосом некоторых видов аукариотов присутствуют 2 кислых бедка, гомологичные 2 наиболее кислым бедкам БС рибосом Е.colli staffier et al., 1974* Malier et si.,1975t wool, Staffier, 1974 ) . Подученные кама данные показывают, что наиболее кислые.беляи'в рибосомах с&-как гороха такхе. локализованы в БС. По всей видимости, белки, подобные упомянутым^ выше, следует искать в зоне белков БС, обозначенной L ' (рис. 9). Причины низкого содержания этих белков в рибосомах 60 s,типа в отличие от рибоссы г. coli , в которых они присутствуют в нескольких копиях и играют важную функциональную роль, остаются непонятными и

требуют дальнейших исследований.

В заключение можно сказать, что белковая часть исследованных рибосом высших растений очень сложна. Среда 100 белковых компонентов, выявленных методом 2-мерного электрофореза, многие белки обладают сходными влектрофоретическима свойствами, некоторые'Присутствуют в минорных количествах. В результате этого полное разделение подобной смеси белков представляет собой чрезвычайно сложную задачу в требует /' прлыенекзя•новых методов. \

Сложный белковый состав рибосом вукариотов и сложная природа факторов белкового синтеза ( Sundfcvist, Staeheim, 1975; Benne, Herahey, 1976; Barrieuv, Bosenfeld , 1977), обнаруженные y. вукариотов, очевидно,' представляют собой явления взаимосвязанные и свидетельствуют об усложнении структурной организация рибосом я аппарата белкового синтеза у высших организмов.

выводы

. Для изучения белковой части цитопд&зматических эиоосом высших растений выделены э гр&ишовцх количествах, очизее» -и охарактеризованы препараты субъединнц 8QS рибоссм семян гороха.

. Показано, что белковая часть исследованных рибосом сост*-1-ит из большого числа полипептидных цепей, различающих ел . по величине молекулярного веса, по пэоэлектрическим точкам и, очевидно, по содержанию в суммарном препарате белка.

I. В составе субъединиц рибосом висшлх растений впервые обнаружена и частично охарактеризована группа- относит<±льно . кислых белков, ведущих себя как анионы ори рН 8,6. Кислые бедка имеют молекулярный вес в пределах 48 ООО - 13 ООО, присутствуют в' значительно менъшоа числе, чем основные а дают очень слабое окрашивание. Наиболее кислые белки локализованы в 60 э еубчатзще.

4. В суммарном препарате оелка 60 з суочастиш рибосом семян гороха обнаружено около 60 белковых компонентов: 47 из них имеют изоалеэтрические точки выше значения рЯ 8,6 и относятся к сильно основным бедкам; около 15 белков имеют изоалектрические точки в зоне значений рН ниже 8,6 и являются относительно кислыш бедкаж, Белковые пятна €03 субчастица существенно различаются по интенсивности окрашивания*

5. В суммарно! препарате белка 40з субчастши обнаружено около 40 белковых компонентов: 32 из них относятся к сильно'ос л овккм белкам, а 6 - к относительно кислым, белковые пятна 40з еуОчастица резко различаются по интенсивное та .окрашивания.

6, Полипептидаыв цепи, обнаруженные 5 препарате белка осль— пой субъединпвд, как правило, не повторвютсл з пупьргти белка малой субъедзяищ. Это говорит о строгой специфичности белкового состава Л-х субъедааиц.

7, Исследуемые белки гетерогешш ко величине и имеют молекулярный вес от 10 ООО до 58 ООО; белков с иолекуляракм je-

ссм вше X ООО а ниже 15 ООО мало и они локализованы' преимущественно в большой и малой субчастяцах соответственно; основная масса белков обеих субчастиц имеет молекулярный вес в интервале 15 ООО - 30 ООО. Величины Я ^^ дли анализированных белков 60 з и 40 s субчастяц составили 24 800 и 21 100 соответственно.

Совокупность тутдыт со общему содержанию белка в субчао-тицах исследованных рибосом, числу обнаруженных белковых компонентов, величинам среднечислового молекулярного веса, неравномерности окрашивания белковых пятен, трудности обнаружения кислых белков дают основание думать о возможной гетерогенности исследованной популяции рибосом в отношении белкового состава.

9. Подученные данные показывают, что в рибосомах растений, также как а в рибосомах животных, увеличение общего содержания бедка, до сравнению с бактериальными 70s рибосомами, обусловлено не только некоторым увеличением молекулярного веса основной массы белков, но и значительным увеличением числа белков-ь рибосоме. Это свидетельствует о существенном усложнении структурной организацидтрибосш В XQSe 8ВОШЩЕИ.

10. Результаты лналшза бедховоЗ части рибосом сеиян гороха, даат основание полагать, что 60 S субчастипа рибосш растительного, происхождения отличается от большой суб-чаотипы животных рибосом не только меньшим размером своей рРНК и большим относительным-содержанием белка, наибольшим числом основных и кислых белков, что указывает на гетерогенность типа 80з рибосш.

список]^

работ, опубликованных по материалам диссертации

I. Алехина С .К., Чуыакхна -I.B., Гуиилевсзая H.A., 1977. Ыето* дика работы в зональным ротором при выделении субъедпшц рибосом семян гороха. Прикладная биохимия и микробиология, 13, * 2, 310 - 314. ,

2. Алехина O.K., Чушдаша Л.В., Гумадевская H.A., iipen-вич В. Д., 1977. Оре&аративное выделение субъеданш: into, сом семга гороха. taaeoa. растенаЛ, 24, Л 4, 874 - Г4

3. Гумилевская H.A., Алехина С.К., Чумикива Л.В,, Крето-вич В.Л., 1977. Основные (Зелии 60s н 40s субчастш рибосом семян гороха, изученные методом 2-х мерного электрофореза в полиакржламидном геле. Вгохнихя, 42, Jé 10.

4. £умалевокая H.A., Алехина С.К., Чуюшта JLB., Крето-вич В.Л., 1978. Балки субъеданиц риоосом семян гороха pi sum sativum i. , ведущие себя как анионы при pH Бвоааоюя, 43 (в печати).

3AK34S.THP.130.aU вниикс». т -iei&9.30.iai»77p.