Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бактериальная уриказа: свойства и применение

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Бактериальная уриказа: свойства и применение"

РГ6 од

. ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНЛ'ЕШ

£. I Лгл! мЦ^СУДАГСТВЫШИ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ТАТИКЯН СТЕПАН ШАГЕНОВИЧ

БАКТЕРИАЛЬНАЯ УРИКАЗА: СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ

03.00.04 Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН V 1993 ;;

Работа выполнена в лаборатории Сиосенсоров Ереванского физическог института.

Научный руководитель

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник А.Л.СИМОНЯН

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, старший научный сотрудник К.А.Маркосян

кандидат биологических наук ведущий научный сотрудник Л.С. А.САТРЯН

Ведущая организация Институт микробиологии

АН РА

Зашита состоится "«^Г" ишя 1993 г- в _часов на заседай

специализированного совета К 055.01.08 в по присуждению учеи степени кандидата биологических наук при Ереванском Государстве ном Университете (375049 Ереван, ул. А.Манукяна 1, биологическ факультет, кафедра биохимии).

С диссертацией ксшо ознакомиться в библиотеке Университета. Автореферат разослан " мая 1993 г.

Ученый секрерарь спайшшзЕрованного совета,

кавддаг бвшюпиеских наук — Л.Г.АНАНЯН

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пурины, входящие в состав нуклеиновых кислот, являются одной из важнейшее групп соединений для организма человека. Различные патологш могут привести к серьезным нарушениям обмена веществ, и в частности, пуринов. Известно, что у человека конечным продуктом деградации пуринов является мочевая кислота. Б М'.'ишшской практике известен целый ряд заболеваний. порой оч^нь серьезных, затрагивающих обмен нуклеспротеи-дов и пурилоз. При таких нарушениях, к к правило, значительно повышается содер:к;н;1о мочевой кислот'' :.. крови. Причиной этого могут быть гематологические заболевай»!», инфаркт миокарда, сердечная недостаточность. Несмотря на очевидную диагностическую ценность, определение молевой кислоты применяется в клинической практике не очень широко. Это связано с низкой специфичностью существующих методов и трудоемкостью процесса определения. В связи с этим очень актуальной является разработка быстрого, специфичного и простого метода определения мочевой кислоты. Им монет быть ферментативный метод, однако обычный анализ с применением растворимого фермента достаточно дорог из-за высокой стоимости уриказы.

Подробное изучение ферментов, занимающих ключевые позиции в метаболических путях, имеет значительную научную ценность для понимания жизнедеятельности всей сложной системы обмена веществ в целом. Уриказа для некоторых микроорганизмов является начальным ферментом метаболизма. Для ряда высимх организмов показана зависимость состояния урюсазы в организме от этапов развития. Из сказанного становится очевидной ценность изучения свойств этого фермента. В последнее десятилетие все шире ведутся исследовния в области использования иммобилизовнных и инкапсулированных ферментов в качестве лекарственных препаратов. Детальное изучение свойств уриказы поможет успешной реализации проблемы ее использования для удаления почечных камней нехирургическим прутем.

Цель, и задачи исследований. Целью настоящей роботы являлось исследование свойств уриказы и создание специфического, быстрого и эффективного метода определения концентрации мочевой кислоты. Для решения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1.Выбор источника фермента и получение высокоочииенного препарата уриказы: 2.Исследование физико-химических свойств фермента: 3.Наладка методики и изучение процесса иммобилизации:

4.Исследование характеристик иммобилизованного препарата; 5.Разработка аналитической стстемы для проведения анализа.

Научная новизна работы. В результате наших исследований показано, что уржаза бактериального происхождения функционирует по упорядоченному механизму с образование;,! тройного ког/ллекса, причем первым субстратом является кочевая кислота. Обнаружено активирующее влияние низких концентраций конов меди на активность нативпой урпказц. Показано, что проведение к^.юбпдкзаик: в присутствия ионов меди, в зависимое«! or их концептращгь привода* к поенгйнку или понижении» активности иммобилизованного 1фепарата. Определени констант термокнактиващз! ур;;кгзг.! при разных рн ir температурах. Впервые показана созиошосгь онредэлс-nur. мочевой кислоты урс<азно-перо:-сс1щазя:-1М 6ïyisp;,'3r.2nt.v. злектро-:Г'-\ i 3-oKtpo::;r.Enecicoii ячз^че. Последовала va:;o-

г*с o>;v-p.'«3UiKoro элекгрода. Показана еозлоглгос^ь опрзде&лкгк шчеьоП кислоты в биологически пм^с^п:...

с копользовннам кмо&кяязовашБ на ckikkcpojw; ^ixi-i'-^Xii.. Lo;w.'j:ihq , что такой реактор обладает ввеокдкк гкепзуага-'^■■м :гл..:; xapan^epns'acca.vn.

.ппетучоское ^li^vr.rno. райо-гп. В результате прэжцдогах рг-•ioc j.;:xyroii шгамл-пролуцек" урккази, обладающей Г"оог.ой цслезо* OîtTi'juKUïXb». нала;,зна методика получения го:.:огеИ2-ог,о препарата •jo:i£Sixa. Разработана кетоджа быстрого и спещг.^яеского опреде-ур-л<зза бкферкептным электрода:: и тю-хтшш фзрконтше.: ¿жшгзагорси «а оиноьи ;a.?.ioûj.uii»3o:;aHiioxi на сидккагелс уриказа. ".со ухо иовдззг кирокому внедре-л^ъ ,„; ггидашкису» практжу кето-'.,oîj окспресе-анализа кочевой кислоты, вершит колит найти opras-лв.чко для нехлрургкческог'о удаления почечных камней уратного лроисховдепия.

Апробации рсГущ. Результаты работы доложены на IY симпозиуме по медицинской энзимологии, Алыа-Ата, 1983г., I Республик, конференции по проблемам физ.-химической биологии и биотехнологии, Ереван, 1984г., -I Всесоюзной конференции по кинетике и механизму электронного переноса в белковых системах и их моделях, ' Вильнюс, 1905г., III Республиканской конференции "Достизкения физико-химической биологии и биотехнологии и пути их внедрения, Ереван, 1989г., Международном симпозиуме по биохимической инженерш, Штуттгарт "(ФРГ), 1990,. Международном симпозиуме по биоаналитическим методам, Прага (ЧССР), 1990.

- 3 -Публикации. По теме диссертации опубликовано i 1 работ, в том числе Z авторских свидетельства.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и их обсуждения, выводов к списка литературы. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками и 8 таблицам!. Библиографам содержит 81 ссылку.

ЭКСПЕРШЖНГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы Уриказу из Вас. fastidiosas получали выращиванием культуры микроорганизмов в хшдкой синтетической среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота мочевую кислоту при температуре 30° С в течение 18-20 часов. Биомассу получали центрифугированием культуральной яидкости при 5000 g 15 мин. Гомогенизацию биомассы проводили озвучиванием суспензии ультразвуком частотой 22 кГц при 14° С в течение 7 мин. Фермент выделяли осаждением сульфатом аг.иония (35-65% насыщения), гель-фильтрацией на колонке с Тойопарлом HW-60, двукратной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ Тойоперла 650М.

Исследование характеристик нативной и иммобилизованной ури-казы проводили в амперометрической ячейке с кислородным электродом, регистрируя убыль концентрации кислорода в результате ури-казной реакции. За единицу активности принимали количество фермента, потребляющего 1 мкмоль кислорода в минуту.

Еиферменгный электрод (БЭ) готовили фиксацией глутаровым диальдегидом смеси растворов уриказы и пероксидазы на диализной мембране, после чего мембрану прикрепляли на горце стеклоугле-родного электрода. При исследовании свойств БЭ регистрировали каталитический ток, протекающий в системе в присутствии ферроци-анида калия в качестве медиатора при напряженки 0 в.

Иммобилизацию уриказы проводили на силикагеле. Силикагель аминировали т-аминопропштриэтоксисиланом, после чего активировали глутаровым диальдегидом. Исследование свойств уриказного реактора проводили в-проточном ферментном анализаторе "Мульти-Ферми> разработанном в лаборатории биосенсоров Ереванского физического института.

При интерпретации данных рассчитывались стандартное откло-чение и коэффициент корреляции.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Выделение фермента и исследование его свойств Нами было проведено сканирование ряда культур микроорганизмов с целью выявления уриказной активности. Показано, что один из штаммов Вас. Гая^сЛозиБ проявляет очень высокую уржазную активность на грамм биомассы. В дальнейших работах была использована эта культура. На штамм-продуцент урикгзы получено авторское свидетельство СССР К 1482196 от 22 января 1939г.

П

8 г

'230

Е/мл

[ЫаС1]. М

г 30

О!--6Ь

0-О

и

0. )

V ..

О

•■' Л' - т \

«»А !

\0 -1 ч*

/

100

200 V, мл 300

]Рис . 1. Элюция ферментного препарата на ДЭЛЭ Тсйоперле 650М линейным гшлиенто:^ ■ Я концентрации йаС1 в 0,05 И Сорно-боратном буфере, а -рН 8,5; б - 9,6. Раз;юр колонки 2,5x30 см. 1 - Оптическая плотность при 260 ни, 2 - Урнхазкая активность в ед. на мл, 3 - Про-ф;кь концентрации МаС1. Начало и конец выхода каталазной активности показаны стрелка:®.

>0

о

Культура Вас. /аз11сИозив, используемая для получения ури-казы, обладает также высокой каталазной активностью. Нри выделении и очистке уриказы наиболее трудоемким является освобождение уриказы от каталазной активности. Процесс осложняется тем, что эти два фермента элшруются из колонок очень близко друг к другу. С целью улучшения разделения каталазной и уриказной активностей мы варьировали условия проведения ионообменной хроматографии. Заметное влияют на процесс ионообменной хроматографии

оказывет рН рабочего буфера.

На рис.1 показан профиль элюции ферментного препарата на колонке с ДЭАЭ Тойоперлом 650М при разных рН. Повышение рН рабочего буфера от 8,5 до 9,6 приводит к значительному улучшению процесса очистки фермента. После проведения повторного хромато-г~афирсв1Ш1я в тех же условиях был получен элекгрофоретически гомогенный препарат фермента, свободной от каталазной активности. Изменение характеристик фермента при очистке приведено в таблице 1.

Таблица 1. Процесс очистки уриказы из Вас. fastIdtosus.

Этап очистки

Суммарная активность, Ед

Удельная активность, Ед/мг

Соотношение поглощений при 230 и 280 нм

Выход

фермента,

%

Клеточный гомогенат

После сульфата аммония 35'' насыщения

Посте сульфата аммония 65"- насыщения

Гель - фильтрация

Ионообменная хроматоргафия:

первый этап

второй этап

5372

4178

3447

3102

2255 1504

0,31

1 ,14

3,14 5,7

19.8 26,3

1.9

1.94

2,94 4.67

5,2 6,15

100 78

64

58

42

38

Молекулярный вес уриказы определяли с помощью гель-фильтра -иш на колонке с Тойоперлом Ш-55 с применением белковых маркеров. Он оказался равным 125000 кДа. Как показывает электрофорез в ПААГ в системе дояеидлсульфата натрия. 'молекула уриказы из Вас. /оагЫ'озшз состоит из одинаковых субъединиц с молекулярным весом около 33000 кДа.

Урикаэа не обладает поглощением в видимой области спектра из-за отсутствия-в составе молекулы хромофорных групп. Спектр уриказы имеет максимум при 280 нм и минимум при 250 нм. С пош шением степени очистки фермента соотношение оптических плотно стей при 230 и 280 нм повышается от 1.9 для грубого гомогената до 6,15 для высокоочишенного фермента.

По нашим данным, рН оптимум для уриказы равен 8,9. В трис-НС1 буфере активность фермента несколько ниже, чем в борат-ном, однако общая картша зависимости активности от рН и оптимум рН одинаковы в разных буферах.

15 t, мин

Рис.2.Термоинактивация уриказы в боратном буфере при разных температурах и рН. а - 60°С, Значения рН при инкубации: 1- 7,5; 2- 7,7; 3- 8,4; 4- 8,8; 5- 9,3. б - 64°С, Значения рН при инкубации: 1-8,1; 2-8,4; 3-8,8.

При использовании фермента в аналитических системах очень важной характеристикой является термостабильность. Мы определяли константу термоинактивации в борно-боратном буфере при двух температурах - 60 и 64°,(рис.2). Данные зависимости активности фермента от времени инкубации хорошо линеаризуются в полулогарифмических координатах при всех значениях рН и температур. Процесс 'термоинактивации уриказы является процессом первого порядка до глубины превращения В0~90%. С повышением рН инкубационного буфера константа инактивации при 60° уменьшается. Значения констант термоинактивации уриказы в зависимости от температуры и рН при-

ведены в таблице 2. При температуре 64° наблюдается минимальное значение К1 при рН 8,4.

Таблица 2. Зависимость констант скорости инактивации (мин-1)

уриказы из Вас. fastiйioзus от рН раствора.

Темпера- рн

тура, С 7,5 7,7 8,1 8,4 8,8 9,3

60 0,40 0,37 - 0,1 0,07 0,05

64 - - о,.:э 0,13 0,16 -

Была определена зависимость скорости уриказной реакции от концентрации кислорода при фиксированных концентрациях мочевой кислоты. Концентрацию мочевой кислоты изменяли от 5 до 1 мМ. Эти данные не линеаризуются в обратных координатах (рис. 3).

1/^, мин-мкмоль1

20СН

100 [

I

!

Рис.3. Зависимость скорости реакции от концентрации 10 20 30 1 кислорода. Концентрация

мочевой кислоты 5 мМ, 0,05 М боратный буфер, рН 8,8.

Такое отклонение ог прямой линии наблюдается для всех концентраций мочевой кислоты. При концентрации 02 ниже 30 - 40 мкМ реакция практически прекращается. К^ для кислорода при концентрации мочевой кислоты 5 мМ равна 0,9-10~3 М. Мы исследовали таюке влияние концентрации мочевой кислоты на скорость ферментативной реакции при ряде фиксированных концентраций кислорода. Эти данные хорошо линеаризуются в обратных координатах для всего диапа-

зона концентраций мочевой кислоты (рис. 4), пр.лем прядме пересекаются в одной точке над оси абсцисс. Км уриказы для мочево! ¡си-лоты при концентрации кислорода 0.235 мМ равна 0.22 10"^ М. Исходя из предположения, что наблюдаемая картина является результатом кооперативного характера взаимодействия кислорода t ферментом м:.; определяли коэффициент кооперативности или коэффициент Xiuuut. к.^Ф^щиент Хилла. рассчитанный графически, оказался равен 2,6. Расчет коэффициента Хилла по методу Курганова дае' значение 2,8.

1/N- мин-мюшль"1

•:оо f

Р

á

114» ' Л

Рис.4. Зависимость скорос ти реакции от концентраци мочевой кислоты в борно боратном буфере, рН 8,8 Концентрация 02 равна с с ответственно- 1- 0,23 мМ;

[) 1 г, ' 2-0,2 мМ; 3- 0,15 мМ.

I />• мМ '

Отклонение от прямой линии зависимости скорости реакции с концентрации субстратов в обратных координатах наблюдалось такг при проведении реакции при постоянном соотношении концентрат субстратов. Начальные участки графиков обратных величин для кис лорода при ряде фиксированных концентраций мочевой кислоты, п зависимость относительно линейна, представлены на рис.5. Труд сказать, насколько существенно влияние кооперативного характе] взаимодействия фермента с кислородом на форм/ графиков, одна! область пересечения этих графиков лежит достаточно близко к ос 1 /V. Все вышеприведенные данные свидетельствуют в пользу упор: •доченного механизма с образованием тройного комплекса.

Мы исследовали также кинетическое поведение иммобилизова; ной на силикагеле уриказы. График обратных величин иммобилиз ванной уриказы для мочевой кислоты, как и в случае -нативно:

- И -

фермента, хорошо линеаризуется в обратных координатах. После им-

1. /Л , МПН-МКМОЧЬ

'го

6 10 1./[0,],мМ"

Рис.5. Графики обратных величин для кислорода при ряде фиксированных концентраций мочевой кислоты. Концентрация мочевой кислоты равна: 1-5 мМ: 2 -3 мМ; 3 - 1 мМ.

мобилизации К^ по мочевой кислоте меняется очень незначительно и составляет 0,18-10"^ М. Данные зависимости скорости реакции от концентрации кислорода для иммобилизованной уриказы, в отличия от нативкого Фермента, хорошо линеаризуются в обратных координатах до глубины превращения кислорода по крайней мере 85-90%. К^ по кислороду оставляет 0,43-10 М.

Било после юванс влияние ряда двухвалентны:: катионов на уриказу в дозочьно широком диапазоне концентраций. Данные этих экспериментов приведены в табл.3. Во всех случаях использованы сульфаты соответствующих металлов. Ионы кобальта и марганца практически не действуют на активность уриказы. Довольно значительно ингибируют активность уриказы ионы никеля и железа. Особенно :штэоесным является влияние ионов меди на фермент. Низкие концентрации ионов меди приводят к заметному повышению активности уриказы. Дальнейшее повышение концентрации Си:>04 в реакционной среде приводит к сильному ингибированию.

В отличие от нативного фермента, иммобилизованная на сили-кагеле уриказа теряет чувствительность к ионам меда до концентрации Ю-1 М (рис. 6). Исчезает также активирушее влияние низких концентраций Си2+. Инкубация фермента с ЭДТА, или ее наличие в реакционной среде не приводят к инактивации фермента.

Таблица 3. Влияние двухвалентных катинов на активность уриказы

из Вас. fast tdtosus

Концентрация, U

О

Ю-6

Внесенный кагион

N1

Со1

2+

Ре

2+

Мл'

2«-

Си1

2+

100,0±0,9 100,Oil,2 100,0±2,1 100,0±1,6 Ю0,0±1,3

95,6±1,7

5 ■ 10" -6 - 100,Otl,1

Ю-5 89,3±2,3 98,3±2,1

ю-4 60,2±1,8 88,8tl,3

ю-3 33,9±1 ,6 83,3±1,4

2-10" -3 21,7±1,3 82,7il,5

5 10' -3 15,5±1,4 83,3±1,7

95,1±1,6 99,3±0,9 110,9±2,3

90,0±1,4 98,7±1,3 104,5±1,8

82,5±1,2 95,3±1,4 102,3±1,9

93,2±1,1 95,1±1,3

75,4±2,3 91ЛИ,7 78,2±1,5

47,5±1,1 - 64,4±1,1

В2,Ш,1 42,8±1,0

Р<0,01

Акт, %

1001т

i

XI

50 (■

Акт, Ед/Г

10

- -зну:^

t^'if

5« т? Ьзг

Ш

1 2 3

К Ю"" 10"4 lCf4 10 540 10"

Рис.6. Рис.7.

Рис.6. Зависимость активности нативной (светлые столбики) и иммобилизованной (темные столбики) уриказы от концентрации СиБ04 в реакционной среде.

Рис.7. Влияние присутствия разных концентраций ионов меди при проведении иммобилизации на активность полученного препарата. 1 - контроль; 2 - 2-Ю"6 М; 3 - 5-Ю-3 М.

Однако наличие ионов меди в иммобилизационной среде" оказывает существенное влияние на активность иммобилизованного препарата (рис.7). Мы параллельно проводили иммобилизацию уркказы в ;тандартных условиях и в присутствии различных концентраций ио-юв меди. Активность препарата, полученного в присутствии низких сонцентраций ионов меди (2-10"6 М), выше активности контрольного 1репарата. Иммобилизация уриказы в присутствии 5-10~3 М сульфата 1еди приводит к значительному снижению активности иммобилизован-юго фермента. Это не связано с инактивацией фермента, поскольку щительная инкубация урикдзы с ионами меди не приводит к дополнительной инактивации.

Исследование свойств биферментного электрода Эксперименты показвают, что в присутствии мочевой кислоты и зерроцианида калия в качестве медиатора в электрохимической гаейке с биферментным электродом при напряжении 0 в возникает лталитический ток, величина которого зависит от концентрации ючевой кислоты. В качестве электрода сравнения использовали :лорсеребрянный электрод. При отсутствии в среде мочевой кислоты ¡иферментный электрод обладает достаточно маленьким остаточным ■оком - порядка 1 - 2 нА. Максимальное значение скорости нарас-■ания тока наблюдается через 12-15 сек после введения в среду аствора мочевой кислоты. Как для величины стационарного тока, •ак и для максимальной скорости изменения тока наблюдается ли-[ейная зависимость от концентрации мочевой кислоты до 0,35 мМ рис.8 а). В борно-боратном буфере изменение рН от 8,0 до 9,2 рактически не влияет на величину стационарного тока электрода рис.8 б). Для буферных растворов мочевой кислоты уравнение трассировочного графика для определения концентрации мочевой кисло-ы в интервале концентраций 5-100 мкМ имеет следующий вид: 1=(1,8±0,03)-с+(0,3±0,02) (г=0,9999), где с -концентрация в микромолях, I - ток в наноамперах. Градуировочный график проходит практически через начало коор-инат. Поскольку реальные биологические растворы, где необходимо пределять мочевую кислоту сильно различаются по содержанию как очевой кислоты (в крови 0,6-1,5 мМ, в моче 5-6 мМ), так и ос-альных компонентов, мы определяли аналогичную зависимость для рови, сыворотки и мочи. При этом также, как и для буферных ра-творов, величина остаточного тока не превышает 2 нА. Уравнение

градуировочног" графика для этих жидкостей практически совпадае: с таковым для модельных растворов мочевой кислоты.

цП/<Шми. мкЛ /мни

1, мкА

0.1!

о.оГ)!

I, мкА о.-1 ! I 0.2

НО .У а о-'

20

I, ДНИ

40 60

" . 2

0.2 0.4 0.6,

^0 0й

М.К.], иМ

9 рН

г

1

* »

Рис.8. а)Зависимость величины стащюнарного тока (1) ; максимальной скорости изменения тока электрода (2) от концентра ции мочевой кислоты; ОВлияние рН среды (1) и времени эксплуата ции (2) на величину стационарного тока электрода при концентра ции мочевой кислоты 0,2 мМ.

Биферментный электрод обладает значительной стабильностью. . течение 40-50 дней эксплуатации ток электрода остается достаточ но высоким, что позволяет использовать такой электрод для опре деления концентрации мочевой кислоты в течение довольно длитель ного времени (рис.8 б). Кроме того, такой электрод обладает вы сокой специфичностью, что обусловлено специфичностью уриказы . отсутствием остаточного тока в системе, не содержащей мочеву кислоту. На описанный выше способ получено авторское свидетель ство 1236376 от 8 февраля 1986г.

Иммобилизация уриказы на силикагеле и исследование свойств проточного реактора Мы исследопали также процесс иммобилизации уриказы на сили кагеле и свойства иммобилизованного фермента с целью его исполь зования в разработанной нами проточной аналитической систем "МультиЗерм" для определения концентрации мочевой кислоты. Был

роведена иммобилизация уриказы в разных условиях. Результаты тих экспериментов приведены в табл.'!. Увеличение соотношения ермент/носитель приводит к значительному увеличению удельной ктизности иммобилизованного препарата. Существенное влияние на ктивность иммобилизованного препарата оказывает размер носите-я. Так, активность препарата, ш-мобилкзованного на силикагеле азмером 1-0,6 мм, равна 7,7 ед/г, размерам! 0.32-0,2 км - 21,6 л/г. Однако необходимо учитывать, что мелкие фракции силикогсля еудобны для применения в проточных реактора;:.

Таблица 4. Влияние условий г^вгабютгзации на активность иммобилизованного препарата.

словия проведения иммобилизации Соотношение фермент/носитель, кг/г Активность, ед ко. г носителя Процент сохранения активности

рН 7,5 10 25,2±0,С 34±2,2

plí G,5 10 21,6±0,7 30±1,4

рН 9,5 10 13,0±!,1 26±1,5

t.'M раствор to- 10 37,4+1,1 37í1,7

bo" КИС Л 0151, рН 8,5

1/5 ¿ Н, 5 1 ñ,0í0,7 51±2,1

рБ 9,5 20 23,2Ü ,4 25±l,í

СК 8,5 40 2-i ,9il ,6 19±0,5

рН 8,5* 10 7,7±0,4 13±0,6

рН 8.5** 10 Í6,2i0,5 21±0,8

Размер зерен силикагеля - * - 1-0,6 мм; ** - 0,6-0,4 мм; ; всех остальных случаях - 0,4-0,32 мм. р<0,02

игимум рН действия фермента при иммобилизации не меняется. Од-1КО определенное влияние на рН зависимость активности оказывают :ловия проведения иммобилизации (рис.9 а). При проведении иммо-шизации при рП 9,5 профиль зависимости активности от рН прак-гчески совпадает с аналогичной зависимостью для нативного фер-;нта. Иммобилизация уриказы при более низких рН приводит к тог, что фермент становится менее чувствительным к изменениям рН юды. Изменение рН от 8,0 до 9,8 практически не оказывает вли-ме на активность иммобилизованной при рН 7,5 уриказы.

На рис.9 б представлен пример градуировочного графика для

определения концентрации мочевой кислоты в анализаторе "Мульти-Ферм". Растворы кочевой кислоты были приготовлены на основе рабочего буфера. Наблюдается линейная зависимость величины сигнала от концентрации мочевой кислоты во всем исследованном диапазоне концентраций - ог 0,1 до 6 мМ. Он охватывает практически всю интересную с биологической точки зрения область концентраций и позволяет определять концентрацию мочевой кислоты как в плазме крови, так и в моче без дополнительных процедур (разбавление и др.). Кроме того, способ обладает высокой специфичностью, что обусловлено, как и в случае биферменгого электрода, специфичностью действия фермента. Реактор с иммобилизованной уриказой в течение 5-6 мзсяцев эксплуатации сохраняет достаточно высокую каталитическую активность (рис.9 б). Важно отметить то обстоятельство, что в ходе этих исследований реактор постоянно находился в комнатных условиях, при температуре 25 - 35° С. При хранении иммобилизованной уриказы при 8 - 10° С в течение более одного года сохраняется не менее 50 % начальной активности.

Акт, %

100

я .-/

Сигнал, мВ 50 4 600

100

I, ДНИ 150

рН 0

4 г , 6 [М.К.], мМ

Рис.9. а) Зависимость активности иммобилизованной уриказы от рН среды при иммобилизации. 1 - нативный фермент; 2 - рН 9,5; 3 - рН 8,5; 4 - рН 7,5. б) Зависимость величины сигнала проточного реактора от концентрации мочевой кислоты (1) и от времени эксплуатации (2) при концентрации мочевой кислоты 2,5 мМ.

Pite. 10. Влияние компонентов среда па величину сигнала, í - раствор мочевой кислоты ;з буфере; 2-з присутствии альбумина с концентрацией 10 г ¡г/мл; 3-20 гаУмл: ■1 - раствор мочевой кислоты :з сыворотке. Концентрация кочевой кислоты равна: с.) 0,5 мИ: б) 1 мМ.

что и составе клаг^ »еэвк присутствует большое хекпес.-ло кселядов^лк юани* •• состава проба на волэткну

сгындх-х Как показах* :;"г.товгмеитн, кхтлик в пробе

5елксв пказг/ч пр'-геолкг г. зкчягежьно-г тгяиьпоико сигнала. Это •зэкглаот, что леи 1®сде,псвешя1 согегсаиия моченой кислоты и ьтазке кротят могут еоягьсг/ть опрея^лештв трудности, связакнче ■ гт-гдуагроэгтс'Л .-нгшйея'ота. Эдга кз - ссптоишк вариантов режеияа -г-гя:- посоха-п - •'Гло^го^лкс "я тъчупревюг ггодольннх раство-¡»»-.его.; гптгмяа. Гч ••.•:с?«лочалш лткгимость величин.: сшила я- ксгщептрзцг'^ яичного .¡льбукйга л крсСЗе. При наличии альбумина ! «робах с ."оедягграцией 20 гг/мл, ;;(злочины «а-лалаов, получен-!ых при анализе таких модельных растворов и растворов мочевой :кслоты, приготовленных на основе плазмы, выравнивались (рис. )). Анализ содержания мочевой кислота в моче не связан с такими рудпостяш. Эксперименты показывает, что компоненты мочи не называют. влияния на величину сигнала анализатора.

ВЫВОДЫ

1.Выявлен штамм Вас. /азИсИозиз - продуцент уриказы, с ак-ивностью 350 ед/г биомассы, что значительно превосходит известие из литературы .источники.

Сигнал, мВ

(30

30

□ - 1

П - 2

□ - 5

□ - 4

М

i:jlFi

2.Налажена методика получения высокоочвденной бактериаль уриказы с удельной активностью не менее 25 ед/мг.

3.Обнаружено, что уриказа бактериального происхожде функционирует по упорядоченному механизму с образованием трой го комплекса, первым субстратом является мочевая кислота.

4.Сделан вывод о том, что ионы меди не являются обязате ними для уриказного катализа, однако они в зависимости от к центрацш могут привести к повышению или понижению активнс фермента.

5.Разработан биферментный электрод на основе совместно мобилизованных уриказы и пероксидазы. Показано, что такой 3J трод может бать использован для определения концентрации коч{ кислоты.

6.Показано, что иммобилизованная на силикагеле уриказа кет быть использована в проточной аналитической системе определения концентрации мочевой кислоты. Подробно исследог характернотики такого реактора. Показано, что иммобилизова! препарат сохраняет работоспособность при эксплуатации в теч( более 5 мес.

7.Обнарушено, что проведение иммобилизации уриказы на ci кагеле при рН 7,5 значительно расширяет рН диапазон работы и билизованного препарата.

8.Разработана проточная аналитическая система для опрез, ния различных метаболитов с применением иммобилизованных на ликагеле оксидаз.

9.Разработана методика определения концентрации моч кислоты проточным анализатором в плазме крови.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1.Симонян A.JI., Татикян С.Ш., Хачатрян Г.Э., Сейранян Выделение, очистка и иммобилизация уратоксидазы. Тезисы ТУ позиума по медицинской энзимологии, Алма-Ата, 1983г., с.47.

2.Симонян А.Л., Тагикян С.Ш.. Хачатрян Г.Э., Авакян Ферментные электрода на основе иммобилизованных оксидаз. Те I Республик.конференции по проблемам физ.-химической биолог биотехнологии. Ереван, 1984г., с.28.

3.Кулис Ю.Ю., Песлякене М.В., Лауринавичюс, Симонян t Татикян С .111., Хачатрян Г.Э., Авакян Ц.М. Способ определения чевой кислоты. А\с J£ 1236278 от 8 февраля 1986г.

4.Стоили А.Л., Татикян С.Ш., Кулис Ю.Ю..Кинетические свойства и термоинактивация бактериальной уриказы. Биохимия, том 50, № 5, 1985г., с.782-785.

5.Татикян С.Ш., Стоила А.Л., Хачатрян Г.Э., Авакян Ü.M. Перенос электрона в ургказном катализе. Тезисы I Всесоюзной конференции по кинетике и механизму электронного переноса в белковых системах и их моделях.Вильнюс, 1985г., с.191.

6.Кулис В.Ю., Песлякене М.В., Лауринавичюс ■ В.А., Татикян С.Ш., Симонян А.Л. Определение мочевой кислоты с использованием бифермеягаых электродов. Журнал аналитической химии, том 40, № 11, 1985г., с.2077-2080.

7.Симонян А.Л., Хачатрян Г.Э, Татикян С.И. Применение ижгоби-лизованной глюкозооксвдазы и уратоксидазн в аналитических системах. Прикладная биохимия и кчкробшлолгкя, той 22, & 5, 1986г., с.675-678.

8.Симонян А.Л., Хачатрян Г.Э., Татикян С.И. Авакян Ц.И. Перспективы использования анализатора "АРЗА" в медицине и микробиологической промышленности. Тезисы докладов III Республиканской конференции "Достижения физ.-химической биологии и биотехнологии и пути их внедрения. Ереван, 1989г., с.76.

Э.Сейранян .В., Африкян Э.Г., Скэоиян А.Л., Татикян С.И., Мкртчян Н.И., Авакян Ц.М. Шгаым бактерий Bacillus fastidlosus -продуцент уратоксидазн. А/С СССР й 1482196 от 22 января 1989г.

10.Татикян С.Ш., Симонян А.Л.Влияние шнов металлов на урика-зу из Bacll.iastldlosus. Биолог.згс.Ариенш, том 42, № 11, 1989г., с.985-991.

11.Tatlklan S.Sh., Khachatrlan G.E., Badallan I.E., Avaklan Ts.M. .Slmonlan A.L. Multipurpose analyser "ABFA" In clinical Investigation and microbiological Industry. Ahstr. Slnp. on bloa-nalytlcal isethods. Prague, 1990, p.65.