Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ассоциация НАДФ-малатдегидрогеназы (декарбоксилирующей) и ферментов фазы карбоксилирования кукурузы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ассоциация НАДФ-малатдегидрогеназы (декарбоксилирующей) и ферментов фазы карбоксилирования кукурузы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА

РГБ ОД

1 3 ДЕ!( 1ВСЗ

ПАВЛОВЕЦ ВЯЧЕСЛАВ ВИКТОРОВИЧ

АССОЦИАЦИЯ НАДФ-МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ (ДЕКАРБОКСИЛИРУЮЩЕЙ) И ФЕРМЕНТОВ ФАЗЫ КАРБОКСИЛИРОВАНИЯ КУКУРУЗЫ 03.00.04- биохимия АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи УДК 577.151.

Пущино -1996

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор А.К.Романова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор М.Н.Кондрашова

кандидат химических наук, И.Р.Прохоренко

Ведущее учреждение: Институт биохимии им.Баха РАН

Защита диссертации состоится "24" декабря 1996 г. в час. На заседании специализированного совета Д.200.29.01 в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН по адресу: 142292, Пущино, ИПФС РАН, конференцзап.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИПФС РАН

Автореферат разослан^?'/ноября 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

Б.Н.Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Надмолекулярные комплексы ферментов являются необходимым уровнем организации метаболических последовательностей, осуществляющих интенсивную трансформацию и проток метаболитов, энергетическое сопряжение каталитических процессов. Наиболее полно исследованными на сегодняшний день являются надмолекулярные ас-социаты ферментов цикла Кребса, синтеза ароматических аминокислот, жирных кислот, ка-ротиноидов, транскрипции РНК и ДНК. Белок-белковые взаимодействия между ассоциированными ферментами дают возможность комплексам быть более доступной мишенью для регуляции конкретного метаболического направления как целого и осуществлять туннелиро-иние метаболитов вдоль последовательности ферментов минуя стадию диффузии, (см.обзор Згеге, 1987).

В течение последних десяти лет было показано, что ферменты восстановительного Лнтозофосфатного цикла (Кальвина) у высших растений с фотосинтезом по Сз-типу, неко-орых водорослей и фотосинтезирующих микроорганизмов организованы в надмолекуляр-1ые структуры, состоящие из двух, трех и более ферментов (см.обзор Романова А.К., Павло-■ец В.В., 1996). Существование этих ассоциатов было доказано как in vivo, так и in vitro. Наибольшее число работ посвящено исследованию комплекса ФФК цикла Кальвина - РБФК/О ( :Ф 4.1.1.39), РФИ ( КФ 5.3.1.6) и ФРК (КФ 2.7.1.19) (Sainis and Harris, 1986; Persson and Jo-ansson, 1989; Романова и др. 1973; Gonteroet al, 1988, 1994; Susset al, 1993;Бабаджанова и [асыров 1992, и др.). Для этого комплекса были показаны эффекты коэлюции ферментов во ремя хроматографической очистки (напр. Sainis & Harris, 1986); туннелирования Р5Ф в 3-осфоглицериновую кислоту, сопряженного с фиксацией СОг (Sainis & Jawali, 1994); in situ элокализация ферментов в хлоропластах (Suss et al, 1993); также были получены и охарак-физованы кристаллы комплекса (Hosur et al, 1993).

Комплекс Ф.ФК растений с Сэ-типом фотосинтеза исследован достаточно полно, од-1ко, его особенности при С,гфотосинтезе не изучены вовсе. При С4-фотосинтезе атмосферой СО: сначала с участием первого карбоксилирующего фермента - фосфоенолпируват кар-жсилазы фиксируется на фосфоенолпирувате в клетках мезофилла с образованием щавеле-(уксусной кислоты и затем восстанавливается до малата. Затем малат транспортируется в юропласты клеток обкладки проводящих пучков, где происходит его окисление и декар-|Ксилирование с помощью НАДФ-малатдегидрогеназы (декарбоксилирутощей)(МЭ). Таким ■разом, осуществляется "накачивание" С02 в строму хлоропластов, где второй карбоксили-

кращения: МЭ-малик энзим; ФФК-ферменты фазы карбоксилирования; РБФК/О-булозобисфосфат карбоксилаза; ФРК-фосфорибулокиназа; РФИ- рнбозо 5-фосфат змераза; РБФ-рибулозо 1,6-бисфосфат; Р5Ф-рибозо 5-фосфат; ПЭГ- полиэтиленгли-»ь; ГАФДГ- глицеральдегидфосфат дегидрогеназа; КФБ- К-фосфатный буфер.

рующий фермент - РБФК/О вовлекает его в восстановительный пентозофосфатный путь (цикл Кальвина-Бенсона)

Растения, проявляющие фотосинтез по С4-типу, являются важной экологически и эволюционно продвинутой группой, их физиолого-биохимические свойства адаптированы к существованию в условиях повышенной температуры и пониженной влажности (Пьянков, 1993). Представителем этой группы является кукуруза - одна из важнейших сельскохозяйственных культур.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было доказательство существования ассоциата ФФК цикла Кальвина и НАДФ-малатдегидрогеназы (декарбоксилирующей) (НАДФ-МЭ, КФ 1 1 1 40) кукурузы. Основными задачами являлось:

1) Выделить и очистить ассоциат ФФК и НАДФ-МЭ.

2) Синтезировать отсутствующую в продаже Ь-[4-иС]-яблочную кислоту и с ее помощью исследовать совместную активность ФФК и НАДФ-МЭ - туннелирование субстрата НАДФ-МЭ в продукт функционирования полного ассоциата.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые из проростков кукурузы был выделен и очищен ассоциат ФФК цикла Кальвина и НАДФ-МЭ, определена его молекулярная масса. Исследована коэлюция рассматриваемых ферментов в процессе хроматографической очистки. Получены данные об устойчивости ассоциата в присутствии мочевины. С помощью специально синтезированной Ь-[4-14С]-меченой яблочной кислоты было показано, что ассоциат является функционально-активным.

Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты могут иметь существенное значение в понимании организации, функционирования и регуляции процесса ассимиляции углекислоты при С,гфотосинтезе НАДФ-малик энзимного типа. Предложенный подход выделения и очистки ассоциата ферментов может быть использован для получения подобных надмолекулярных структур из других объектов растительного и микробиального происхождения. В процессе исследований был разработан оригинальный способ синтеза Ь-яблочной кислоты, меченой по углероду в четвертом положении, для научных, медицинских и промышленных целей.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на первом и втором симпозиумах ОФР "Физико-химические основы физиологии растений" (Пущине, 1994; Пенза, 1996) и Первой городской конференции молодых ученых г.Пущино (Пущино, 1996). „ -

Публикации. По теме диссертации опубликовано и принято к публикации 8 печатных

работ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (объект и методы исследования, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования нами была выбрана кукуруза - типичный представитель растений с С4-фотосинтезом малатного типа. В экспериментах использовали среднюю часть четвертого и пятого листа здоровых растений в фазе шести листьев, выращенных в теплице при естественном освещении. Все процедуры выделения и очистки ферментов, выполняли при 4-6 °С.

Выделение ассоциата.Фрагменты листьев измельчали и гомогенизировали со стеклом в ступке с двукратным объемом 0,1 М Трнс-НС1 буфера рН 7,5 (значения рН даны по измерению при 25°С), содержащего 1 мМ ЭДТА, 30 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,5% (в/о) ПЭГ-6000, 2% (в/о) поливинилпирролидон-25000, 0,1 мМ фенилметилсульфонил фторид. Гомогенат фильтровали через ткань, центрифугировали и доводили до 11% по ПЭГ-6000 и 10 мМ по У^СЬ. Через 15 минут смесь центрифугировали, и осадок растворяли в минимальном объеме 5уфера А, содержащего 10 мМ Трис-НС1, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанол и 0,5% ПЭГ->000 (в/о), рН 7,5. Препарат центрифугировали 60 мин при 18000g. Далее супернатант ис-юльзовали для:

) дальнейшей очистки ассоциата методами ионообменной и адсорбционной хроматографии,

') гель-фильтрации (после добавления концентрированного раствора №С1 до 0.1М и инкубации (30 мин)) на колонке с Тоуорег1-Т№-65 (90x1.5 см), предварительно уравновешенной буфером А, содержащим 0.1М ЫаС1.

Для дальнейшей очистки ферментный препарат наносили на колонку с ионообменни-эм Тоуорег1-ЭЕ-650М (10x4.5 см), уравновешенную буфером А, промыли тем же буфером (5 эъемов колонки) и элюировали линейным градиентом №С1 от 0 до 200 мМ в буфере А. 'ракции, содержащие совместную активность НАДФ-МЭ и ФФК объединяли и сразу нано-1ли на колонку с гидроксиапатитом (10x5 см), уравновешенную КФБ, содержащим 10 мМ -фосфат (рН 7,8), 0.5% ПЭГ-6000 (в/о), 1 мМЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанол После про-ывки тем же буфером (3 объема колонки), препарат элюировали линейным 'градиентом К-эсфата в КФБ 10 - 100 мМ. Фракции, содержащие одновременно активности РБФК/О, ФФК НАДФ-МЭ, объединяли и концентрировали в течение ночи против буфера А, содержащего !% ПЭГ-40000 (в/о).

Все операции по выделению и очистке ассоциата занимали не более 2 суток. Препарат 1чти полностью сохранял свои характеристики после хранения при -70 °С в присутствии

20% (в/о) глицерина в течение как минимум 4 месяцев, однако, даже после кратковременного замораживания терялась совместная активность НАДФ-МЭ и ФФК.

Активность ферментов и ассоциатов исследовали при 30 СС в буфере Б: 50 мМ НЕРЕБ-КОН, 0.5% ПЭГ-6000, 20 мМ МвС12, 5 мМ ДТТ (рН 8,0, если не оговорено особо) после предварительной инкубации (10 мин). Активность НАДФ-МЭ определяли в присутствии НАДФ (1 мМ) и малата N8 (5 мМ) по приросту Аз« на спектрофотометре Зресогё ЦУ-УК> (Германия), за единицу активности принимали количество образовавшегося НАДФН /шоль/мин.

Активность ассоциатов ферментов вычисляли по скорости накопления продукта реакций в диапазоне линейного участка кинетической кривой - от 1 до 2-3 минут. Суммарную активность ФФК оценивали по скорости включения 14СОг в кислотоустойчивый продукт. Для этого ферментный препарат активировали в течение 2 мин. в присутствии 10 мММаН14СОз (0;2 мКи/ммоль), реакцию инициировали добавлением Р5Ф и АТФ до 1 мМ каждого. Так же определяли активность РБФК/О. но вместо Р5Ф и АТФ добавляли РБФ до 0,3 мМ.

Активность ассоциата НАДФ-МЭ и ФФК исследовали в тех же условиях, но КаНмСОз был заменен на №Н12СОз, а реакцию инициировали добавлением Р5Ф, АТФ, НАДФ (до 1 мМ каждый) и Ь-[4-14С]-малата (до 1 мМ, 0,1 мКи/ммоль). Реакцию останавливали добавлением двух объемов 6Н муравьиной кислоты, выдерживали 10 мин при 0 °С и отделяли белок центрифугированием 2 мин при 10000 Супернатант упаривали при 50 °С и хроматографи-ровали на бумаге в системе этанол : аммиак : вода (80:4:16), непрореагировавший малат в этих условиях двигался с 0,25. Участок старта, содержащий фосфорилированные соединения вырезали и исследовали на радиоактивность.

Синтез Ы4-'"С1 -малата проводили двумя способами по оригинальным методикам в сопряженных ферментных системах на основе выделенных в нашей лаборатории высоко-очищенных препаратов фосфоенолпируват карбоксилазы из листьев кукурузы и НАД-малик фермента из листьев АтагапАт ге!го/1ехиз. [4-иС]-малат был выделен из реакционной смеси и очищен методами ионообменной хроматографии или хроматографии на бумаге. Полученный препарат обладал удельной радиоактивностью 1.7 мКи/ммоль и более чем 97%-ной гомогенностью.

Электрофорез в присутствии ББЭ проводили по Ьаегшп1у (1970), неденатурирующий электрофорез - по той же методике, но без ЙОЗ. Активность НАДФ-МЭ в геле оценивали по окрашиванию тетранитротеразолиевого синего в присутствии феназинметасульфата, НАДФ, малата, MgCl2 в К-фосфатном буфере (рН 7,8).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и очистка ассоциата. Из обзора литературы видно, что структурно-функциональные свойства комплексов ферментов цикла Кальвина зависят от условий тестирования, выделения и очистки. Как правило, авторы использовали буферы с низкой ионной силой. Добавление глицерина (до 20% о/о) и ПЭГ (при фракционировании в системе ПЭГ-декстран-фосфатный буфер) в некоторых случаях стабилизировало ассоциаты, содержащие, помимо ФФК, другие ферменты цикла Кальвина, активазу РБФК/О, ферредоксин/НАДФ редукгазу и белок теплового шока-60. Поэтому на первом этапе исследований мы проверили присутствие комплекса ФФК в экстрактах из кукурузы и изучили влияние на его активность ПЭГ (Рис. 1). Как видно из рисунка, ПЭГ е концентрации от 0,5% до 2% стабилизировал функционирование ФФК и РБФК/О, поэтому дальнейшие манипуляции с ассоциатами проводили в присутствии ПЭГ-6000. Поскольку фракционирование ферментных комплексов сульфатом аммония приводит к их разрушению (Suss, 1993), концентрирование препарата гомогената листьев кукурузы проводили щадящим белок-белковые связи осаждением ПЭГом + MgCh.

На рисунке 2 представлен профиль элюции раствора белка, полученного осаждением ПЭГ-6000, при гель-фильтрации на Toyoperl HW-65. Видно, что суммарный белок элюируетс; широкой полосой от 900 до 300 кДа. Пик белка, проявляющий суммарную активность

Рис.1 .Влияние ПЭГ-6000 на активность

100-1---1-■-г

0 12 3 4

концентрация ПЭГ, %

0.11 0.10 0.08 0.06 0.05 0.03 0.02 0.00

10 20 30 40

нсмерфгшцж

50

Рис.2. Профиль элюции при гель-фильтрации на колонке с Toyoperl HW-65 препарата белка из листьев кукурузы, полученного осаждением в присутствии ПЭГ и MgCl2 1-поглощение при 280 нм; 2 и 3 - фиксация ИС02 в присутствии РБФ и Р5Ф+АТФ, соответственно; 4-активность НАДФ-МЭ. Буквами а - д указаны положения элюции стандартных белков с молекулярными массами 670 кДа - тиреоглобулин, 450 кДа - ферритин, 210 кДа - миозин, 150 кДа -апкогольдегидрогеназа и 67 кДа - БСА, соответственно.

30 28 26 24 ¡^2 20 гв

8Э 90 Ю0 1Ю 12D 133 К) 193

Оащмп

Рис. 3. Калибровочная кривая для определения молекулярной массы белков на колонке с Toyoperl HW-65. 1-димер ферритина (900 кДа), 2-тиреоглобулин (670 кДа), 3- ферритин (450 кДа), 4- DNP-аланин (255 кДа), 5-каталаза (240 кДа), 6- миозин (210 кДа), 7- алкоголь дегидрогеназа (150 кДа), 8- БСА (67 кДа). Параметры калибровки: Lg (М) = А + В*V, где V - объем элюента, А = 4,32 ± 0,10, В = -0,016 ± 0,001.

3

4

8

30. 32. .34^ 36^ 38^

Ш0 ЪмЛ ЪтШ

кДа

■ 900

■ 450

134

67

трех ферментов фазы карбоксилирования в целом совпадает с положением основного максимума суммарного белка и соответствует молекулярной массе 380+50 кДа. Активность МЭ проявилась в виде четырех пиков, первый из которых полностью совпал с пиком активности комплекса ферментов цикла Кальвина (380+50 кДа). Остальные три пика МЭ соответствовал1 положению белков с кажущимися значениями молекулярных масс 250 кДа; 140 кДа и 60 кДа (предположительно тетрамерная, димерная и мономерная формы фермента, соответственно). Нативный гель-электрофорез фракций белка с 30 по 38 выявил единственную мажорную полосу,

соответствующую молекулярной массе 590 ± 80 кДа (Рис.4А). Из рис.4Б также видно, что МЭ (64 кДа) коэлюируется с РБФКУО (53 кДа и 12 кДа). Очевидно, что МЭ, проявляя необычную для фермента из кукурузы молекулярную массу = 380+50 кДа, ассоциирован с каким-то компонентом комплекса ФФК (около 40% от общей активности МЭ) или нами обнаружена неизвестная ранее форма фермента, судя по массе, это может быть гексамер. В последнем случае высокомолекулярная форма фермента должна находиться в динамическом равновесии с низкомолекулярными, чего не было обнаружено при исследовании олиго-мерных форм НАДФ-МЭ (Iglesias, 1990)

Следует отметить, что совместную активность НАДФ-МЭ и ФФК в препаратах на стадиях гомогената и осаждения ПЭГом+MgCb зафиксировать не удалось.

Чтобы доказать существование ассоциации НАДФ-МЭ с ФФК или высокомолекулярной олигомерной формы МЭ, мы провели очистку ассоциата с помощью ионообменной и адсорбционной хроматографий. Из рис 5А видно, что профиль активности НАДФ-МЭ имеет область перекрывания с профилем активности ФФК, элюция которых происходит

- 65

- 45 -36 -24 -20

"14,2

Электрофорез в нативных условиях (,А, АГ) и в присутствии SDS (Б, И,5% фракций 30-38 после гель-фильтрации •2).

10 15 2 2 30 36 4) нэмерфтни

31 5 Ш

37 38 39 40 41 42 43 44 45 шё Ш0'

кДа — 900

"•"•450

-134 -67

! «8 ¥ *

* -х» »»'-О

-24 -20

•14.2

■ИКР

Рис.5. Совместная очисп НАДФ-МЭ и ФФК при ионообменной хроматографии на Тоуор' Н\У-650М. А: Профиль элюции линейным градиентом ЫаС1: 1-поглощение при 280 нм; активность комплекса ФФК; 3- активность НАДФ-МЭ. Электрофор« в нативных условиях (Б, 7% ПААГ) и в присугств

(ВД1% ПААГ) фракций 37-45 (А)

В

при 150 мМ NaCl. При этом основная часть МЭ элюируется ранее, по-видимому это его свободная форма, т.к. элюция белка с молекулярной массой около 250 кДа (Рис.5Б) коррелирует с элюцией этого фермента (Рис.5А и 5В), состоящего из субъединиц с мол.массой 64 кДа.

Полученный на этой стадии препарат был способен переносить углеродную метку от [4-14С]-малата в фосфорилированный продукт в присутствии Р5Ф, АТФ и НАДФ со скоростью 0.0021+0.0003 мкмоль/мин"'*мгбелка"1. Мы предполагаем, что в процессе ионообменной хроматографии произошли структурные перестройки белкового аггрегата, хорошо заметного в виде мажорной полосы на рис.4А и 5Б. При этом произошла активация ассоциата МЭ и ФФК, природа которой неизвестна. Можно предположить, что эффект активации связан с отделением от упомянутого аггрегата активазы РБФК/О, которая была единственным белком во фракциях 13-16 (рис.5А)(идентифицирована по активности и полипептидному составу, данные не представлены), или свободной формы самого МЭ.

Фракции, соответствующие активности ФФК и МЭ, объединяли и хроматографирова-ли на колонке с гидроксиапатитом (рис.не представлен). При этом часть активности МЭ перекрывалась с активностью ФФК (50,мМ КФБ), хотя основная масса фермента - свободная форма - элюировалась,позднее (90 мМ КФБ), что согласуется с экспериментами по очистке малик энзима с применением фракционирования сульфатом аммония при хроматографии на гидроксиапатите, когда был отмечен только один пик активности фермента, элюировавшего-ся при 100 мМ фосфатным буфером (Iglesias et. al, 1989). Замена КФБ на Na-фосфатный не влияла на поведение белков при элюции.

На рисунке 6 представлены электрофореграммы препаратов, полученных после каждого шага очистки и полипептидный состав выделенного ассоциата. Видно, что РБФК/О (малая - 12 кДа и большая - 50 кДа субъединицы) составляет основную часть ассоциата. Полоса, соответствующая МЭ (64 кДа), была обнаружена при электрофорезе более чем 30 fir образца. Минорная полоса, соответствующая массе 43 кДа может принадлежать как Р5Ф-киназе, так и а-субъединице ГАФДГ. Почти такая же электрофореграмма была получена Suss et.al (1993) при исследовании эффекта коэлюции ФФК при гель-фильтрации из хлоропластов шпината. Поскольку мы не тестировали активность других ферментов цикла Кальвина, нельзя исключать возможность их присутствия в полученном препарате. Конечный препарат проявлял совместную активность НАДФ-МЭ и ФФК = 0.0122^.0003 мкмоль/мин"'*мг белка' '(Таблица 1). Это значение, по-нашему мнению не является показателем истинной скорости функционирования ассоциата, поскольку исследование его активности осуществлялось в присутствии (на фоне) немеченного бикарбоната, необходимого для активации как РБФК/О, так и комплекса ФФК.

Таблица 1

Очистка ассоциата ферментов фазы карбоксилирования и НАДФ-малик энзима из проростков кукурузы.

Объем, мл Концентрация белка, мг/мл Количество белка, мг РБФК/О Ферменты фазы карбоксилирования НАДФ-малик энзим Ассоциат НАДФ-МЭ -ФФК

уд. акт., Е/мг белка Выход, % уд. акт., Е/мг белка Выход, % уд. акт., Е/мг белка Выход, % уд. акт., Е/мг белка

Гомогенат 105 5,20 546,0 0,29 100% 0,50 100% 0,46 100% 0

Осаждение ПЭГом 125 3,11 388,9 0,20 49% 0,23 33% 0,93 144% 0

ДЭАЕ-хроматография 550 0,24 134,2 0,27 23% 0,40 20% 2,09 112% 0.002

Хроматография на гидроксиапатите 132 0,39 51,5 0,58 19% 0,39 7% 0,13 3% 0.012

12 3 4

кДа

кДа

Л i

*900

"450

Молекулярная масса ассоциата. Из рис.7 видно, что НАДФ-МЭ коэлюируется как с основным пиком РБФК/О (400+50 кДа), так и с ФФК (350+50 кДа), однако, свободных оли-гомеров фермента конечный препарат не содержит (сравни с рис.2). Следовательно, МЭ ассоциирован с РБФК/О и с комплексом ФФК. В свою очередь, эти ассоциаты (имеющие раз-\ g ные молекулярные массы), гетерогенные

по своему составу, могут быть частями более сложно организованного ассоциата ферментов, разрушенного при выделении и очистке, или находятся в равновесном состоянии друг с другом, испытывая структурные перестройки. Профили элюции белка и активностей ферментов не изменялся при хроматографии в присутствии NaCl в концентрации до 0,5М.

Масса ассоциата, определенная с помощью электрофореза в нативных условиях, составляет 490+50 кДа (Рис.8). При проявлении пластин геля на ферментативную активность МЭ помимо полосы, соответствующей ассоциированной с ФФК формой (совпавшей с полосой белка ассоциата), проявилась полоса, соответствующая молекулярной массе = 300+50 кДа (не выявленной при гель-фильтрации), что несколько больше, чем масса гомотетрамера фермента (4x62+1 кДа), определенная с помощью -ель-фильтрации, нативного электрофореза и первичной структуры кДНК НАДФ-МЭ Thorniley & Dalziel, 1988; Asami, et.al, 1979; Rothermel & Nelson, 1989). Этот факт можно объ-юнить деградацией ассоциата при электрофорезе в отсутствии ПЭГ и при рН более 9,5, так ;ак рН-стабильность комплекса ФФК находится в области рН 6-9 (Suss, 1993). Полученные 1езультаты не позволяют утверждать, что эта форма МЭ ассоциирована с ФФК и соответствует пику активности комплекса ФФК на рис.2.

-134

"67

-65 -45

-36

-24 -20

"14

Рис.6. А: Нативный электрофорез в 6% ПААГ препаратов,полученных в ходе очистки ассоциата: 1-3 после адсорбционной, ионообменной хроматографии и осаждения ПЭГом, соответственно, 4- гомогенат. Б: ЗОв-электрофорез в 11% ПААГ конечного препарата ассоциата НАДФ-МЭ и ФФК (Ю^г).

номер фракции

Рис.7. Гель-фильтрация на колонке с Toyoperl-HW-65 ферментов фазы карбоксшшрования и НАДФ малик энзима очищенного препарата ассоциата. 1- белок; 2- НАДФ-малик энзим; 3 и 4 - фиксация Н"С03" в присутствии РБФ и Р5Ф+АТФ, соответственно. Стрелками я - е обозначены положения маркерных белков: а- бычий тироглобулин (670 кДа); Ь- ферритин (450 кДа); с- миозин (210 кДа); d алкогольдегидрогеиаза (150 кДа) и е- бычий сывороточный альбумин (67 кДа).

А

1 2 3

Н

I Л Н

Рис.8. Нативный электрофорез в 6,5% ПААГ ассоциата МЭ и ФФК. А: Образцы наносили после предынкубации (30 мин) в присутствии 2.0; 1.5; 1.0; 0.5 M мочевины, соответственно дорожки 1 - 4; 5- контроль, Гель окрашен на активность МЭ. Б: Гель окрашен Кумасси G-250.

20 4»40

0.000

60 80 в р е м я , с. ^

г н

Рис.9. Кинетические кривые активности комплекса ФФК (1) и ассоциата МЭ и ФФК(2) (левая и правая ординаты, соответственно). рН реакционной смеси 7,5; концентрация белка 0,1 мг/мл.

Выделенный ассоциат не изменял своей электрофоретической подвижности после предынкубации с мочевиной до 1,5 М, и аггрегировал при концентрации мочевины 2 М (Рис.8 А-Б).

Кинетические эффекты ассоциатов.

На рисунке 9 представлены кинетические кривые комплекса ФФК и ассоциата НАДФ-МЭ и ФФК. Видно, что после некоторого лаг-периода, характеризующегося временем (I), необходимым для туннелирования метаболитов вдоль последовательности ферментов, наблюдается стационарный режим функционирования ассоциата.

Математическая оценка эффекта туннелирования. Предположим, что ферменты не ассоциированы друг с другом и функционируют независимо. Рассмотрим две системы реакций: 1- функционирование ФФК и 2- МЭ и ФФК (схема 1). Пусть время 12 соответствует времени прохождения метки по цепи МЭ - РБФК/О (ФФК), а 11 - от иС02 до ФГК (схема 1).

Тогда . _ КЕ(РБФ) + Кт(СОг) . К^ГРБФ) КщССОз)

1 ~У„(РБФ)-Уо> У„(С02)' 1 У„(РБФ)-У01 У„,(СО2)-У02

поскольку активность МЭ-ФФК измеряли в присутствии немеченного бикарбоната, (Е^егЬуД'Ш) где К„(РБФ) и У„(РБФ)- константа Михаэлиса и максимальная скорость по РБФ для РБФК/О, Км(С02) и У„(С02) - то же

по С02, Уогсовместная активность РФИ и ФРК, У02-активность МЭ ассоциата. Выполним некоторые вычисления: ^-11= =Уо2Кт(С02) / (Ут(СО2)[Уга(СО2)-У02], после замены У„(С02) на Уоз-активность РБФК/О в ассоциате, т.к. Уоз ¿Ут(С02), то

Схема 1.

манат'

С<-,ЧС] З-ФГК

РБФК/О

рнбозо-5-фосфат

trt! -Vo2Km(C02) / (Vm(CO2)[Vm(CO2)-V02].

Подставим численные значения для V02 и V03 из табл.1 (0.13 и 0.58 мкмоль/(мин*мг)). Значения К^С02) для РБФК/О варьируют от 0.2 до 10 мкмоль. Имеем: 9.96*E'3^t2-ti^4.98 мин для концентрации белка 1 мг/мл. Было вычислено, что для не ассоциированных ФФК из шпината ti=98,4 мин (Sainis & Jawali, 1994); из наших рассуждений следует, что для ассоциата МЭ и ФФК не превышает ti более чем на 5 мин. Действительно, из рис.9 видно, что t для ФФК и ассоциата МЭ и ФФК равно, соответственно 25 и 30 с, что противоречит сделанному предположению. Таким образом, совместная активность ФФК и НАДФ-МЭ происходит по типу туннелирования метаболитов, характерного для ферментов, связанных белок-белковыми взаимодействиями (Холоденко, 1993).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предположение о существовании в строме хлоропластов белковых комплексов возникло вследствие трудностей разделения некоторых из них с применением общепринятых методов очистки. Образование организованных структур в жидкой фазе хлоропласта представляется возможным в первую очередь ввиду того, что концентрация белка в этом компар-тменте достаточно высока и составляет 40%-50% (по весу) (Ellis, 1979) В таком концентрированном растворе белок может находиться в состоянии, близком к кристаллическому, существенно отличающемуся от его состояния в разбавленном растворе. На сегодняшний день достаточно полно изучен комплекс ФФК цикла Кальвина из Сз-растений. Однако, особенности его организации и функционирования у растений из других экологических групп не исследованы.

Основным итогом этой работы является открытие особенностей молекулярной организации и кинетических свойств ферментов ассимиляции СОг при С4-фотосинтезе - ассоциации НАДФ-МЭ и ФФК цикла Кальвина. Исследована активность ферментов и комплекса ФФК в присутствии кофакторов и субстратов ФФК и МЭ. Исследованы процессы коэлюции изучаемых ферментов при гель-фильтрации, ионообменной и адсорбционной хроматографи-ях.

По-нашему мнению, исследования подобных надмолекулярных образований становятся перспективным направлением как в классической биохимии, где изучают свойства живой материи по свойствам отдельных элементов, так и в физиологии, где оперируют интегральными характеристиками объектов, во многих случаях упуская из вида исходные молекулярные причинно-следственные события.

выводы

1. Впервые разработан способ выделения и очистки ассоциата, содержащего ферменты фазы карбоксилирования цикла Кальвина и НАДФ-мапик энзим из кукурузы.

2. Определена молекулярная масса ассоциата с помощью электрофореза в нативных условиях (490 кДа) и гель фильтрации (400 кДа - коэлюция с РБФК/О и 350 кДа - с комплексом ФФК).

3. Разработаны два ферментативных способа синтеза Ь-[4-14С]-яблочной кислоты. С ее помощью было продемонстрировано туннелирование метки через ассоциат, характерное для функциональных молекулярных ансамблей.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Pavlovets V.V., Prusakova O.V., Lomonova N.A., Gubanov S.I., Romanova А.К. A complex containing Calvin cycle enzymes and NADP-malic enzyme functions in maize leaves. Abstr. of Annual Symposium "Physical-chemical basis of plant physiology", Penza, 1996, p.33.

2. Prusakova О. V., Romanova A.K., Pavlovets V. V, Muzafarov E.N. The influence of quercetin on activity of PEPCase from maize. Abstr. of Annual Symposium "Physical-chemical basis of plant

physiology", Penza, 1996. p.36.

3. Павловец В.В., Ломонова Н А., Прусакова О.В. Ферментативные способы введения меченного углерода в четвертое положение L-малата. Городская научная конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино. 1996 С.66.

4. Романова А.К., Павловец В В. Надмолекулярные комплексы ферментов автотрофной ассимиляции углекислоты при фотосинтезе.//Физиология растений. 1997. Т.44,№.3.

5. Павловец В.В., Романова А.К. Межмолекулярные взаимодействия NADP-малик-энзима и ферментов фазы карбоксилирования в экстрактах из листьев кукурузы.// Физиология растений. Принята к публикации.

6. Павловец В.В., Прусакова О.В., Ломонова Н А., Романова А.К. Ассоциаты НАДФ-малик энзима с ключевыми ферментами цикла Кальвина у С4-растения малик-энзимного типа // Доклады РАН. Принята к публикации.

7. Павловец В В. Система сопряженных реакций для ферментативного синтеза L-малата.// Прикладная биохимия и микробиология. Принята к публикации.

8. Павловец В.В., Романова А.К. Два способа ферментативного 4-14С-мечения L-малата.// Биоорганическая химия. Принята к публикации.