Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ассоциации Enterobacteriaceae и Candida слизистых родовых путей женщин с нормальным течением беременности и с угрозовй невынашивания

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ассоциации Enterobacteriaceae и Candida слизистых родовых путей женщин с нормальным течением беременности и с угрозовй невынашивания"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК 576.861.49:616.76:618.1

ГОЛУБЕВ Алексей Валерьевич

АССОЦИАЦИИ ENTEROBACTERIACEAE И CANDIDA СЛИЗИСТЫХ РОДОВЫХ ПУТЕЙ ЖЕНЩИН С НОРМАЛЬНЫМ ТЕЧЕНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ И С УГРОЗОЙ НЕВЫНАШИВАНИЯ

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск — 1994

Работа выполнена в Ивановском научно-исследовательской институте материнства и детства МЗ Р.Ф.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор С.Г. Смирнов

заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор В.Н. Городков

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАЕ1Г, доктор медицинских наук, профессор О.В.Бухарин

доктор медицинских наук, профессор З.Н.Кондрашова

Ведущая организация:

Московская медицинская Академия ым.И.М.Сеченова

Защита состоится "_" _,_ 1994 года в __ часов

на заседании Специализированного Совета К.084.04.03 при Челябинском государственном медицинском институте по адресу: 454092, Челябинск, ул.Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинского государственного медицинского института.

Автореферат разослан ' Мбсцм 1994 г.

Ученый секретарь Сиециалнзнронашшго Совета,

канд. мед. наук Н.И.ЖИГАЛОВА

Общая характеристика работы

Актуальность. Проблема микробных ассоциаций и, п частности, • ассоциаций Enterobacteriaceae и Candida остается одной из наиболее важных в связи с большой распространенностью заболеваний этой этиологии. [Башмакова М,А. и др.,1980, Носов С.Д., 1982, Кулаков В.И., ЗаК Й.Р., Куликова H.H., 1984, Ульянова Н.Ф., 1985, Gibson М.,1980, Сидельникова В.М., Слепцова С.И., Чаклин A.B., 1988, Анкирская A.C., Гуртовой Б.Л., Елизарова И.П., 1989]

Еще в семидесятые годы [С.Г.Смирнов, 1978] была поставлена и обоснована необходимость изучения поведения микроассоциаций, как открытых периодических систем. С тех пор в практику микробиологических исследований внедрено множество методов оценки разнообразных физических параметров микроорганизмов и культур. Многочисленными исследованиями {Иванов В.Н., Угодчиков Г.А., 1984, Беляков В.Д. и др., 1986, Варфоломеев С.Д., Калюжный C.B., 1990] Накоплен большой материал по изучению закономерностей роста и развития микробных культур И ассоциаций, существенной модернизации подверглась техника обеспечения й проведения эксперимента.

До сих пор ис создано полностью эквивалентных органам и системам Человека биологических и физических моделей [Шлегель Г., 1987], отсутствуют и адекватные способы представления и оценки результатов тестирования биохимических возможностей

микроорганизмов, до сих пор остающиеся на уровне качественной оценки их как "наличие/отсутствие усвоения" соответствующего субстрата [Готтшялк Г., 1982, Арутчева A.A., 1984, Покровский В.И., 1985], Поэтому разработка и совершенствование техники измерений и собственно параметров жизнедеятельности развивающихся ассоциаций микроорганизмов, использование их для углубленной характеристики штаммов иа каждом этапе развития представляет весьма сложную задачу.

Введение в научно-исследовательскую й практическую деятельность врача-микробиолога информационных характеристик, представленных в виде формализованных показателей и позволяющих оценить биохимические возможности изучаемого микроорганизма, позволит полнее выявить сложный комплекс взаимодействий развивающейся совокупности культур микроорганизмов и макроорганизма-хозяинп. Такая возможность Приблизит нас к получению достоверной информации о характере процесса адаптации развивающейся ассоциации культур микроорганизмов к меняющимся условиям макроорганизма, как среды обитания.

Все вышеизложенное позволяет нам следующим образом обосновать цель и задачи настоящею исследования.

Цель работы-- исследовать принципиальную возможность и целесообразность разработки и применения формализованных информационных показателей для биохимической характеристики культур микроорганизмов (на примере ассоциаций энтеробактсрий и кандида), существующих на слизистых родовых путей женщин с разной степенью выраженности невынашивания беременности, оценить их теоретическое и практическое значение.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие -задачи:

1. Выявить культурально-биохимические особенности, разработать и дать комплексную количественную оценку энтеробактерий и грибов рода Candida на протяжении гестационного периода;

2. Разработать и отобрать наиболее информативные формализованные показатели для характеристики микроорганизмов из группы энтеробактерий и грибов рода Candida;

3. Произвести теоретическую оценку возможности применения формализованных показателей в практике работы;

4. На основании полученных данных сделать попытку обоснования возможности использования разработанных формализованных показателей для описания ассоциаций энтеробактерий и кандида При • неосложненном протекании беременности и при угрозе невынашивания и для совершенствования комплексной оценки здоровья беременной женщины.

Научная новизна

В результате проделанной работы впервые показано, что для количественного биохимического описания микроорганизма применимо использование биокода, как интегральной метахарактеристики, дающей возможность не только выразить в краткой форме, в виде одного семизначного числа все основные биохимические особенности исследуемого микроорганизма, но и использовать полученную числовую характеристику для дальнейшей математической обработки, позволяя перейти к количественным методам оценки культурально-биохимических особенностей микроорганизма.

Показано, что для интерпретации результатов биохимического исследования микроорганизма целесообразно использование размерных информационных' величин и предложен комплекс формализованных

показателей На, Hk и Hu, обозначаемых соответственно как мера биохимической активности микрофлоры изучаемого биотопа в определенный период времени (На), мера биохимически обусловленной гетерогенности микрофлоры изучаемого биотопа в определенный период времени (Hk) и мера удельной биохимической гетерогенности микрофлоры изучаемого биотопа в определенный период времени (Ни); что позволило перейти от чисто описательной оценки состояния микропссоциации любой степени сложности к информационному аиплизу ее.

Показано, что' большим преимуществом использования информационных параметров является их логарифмический характер, позволяющий еще На этапе первичной обработки материала абстрагироваться от случайных значений изучаемых параметров, одновременно позволяя нагляднее выделить имеющиеся тенденции в их изменении.

Показано, что Hk, На и Ни более полно отражают динамику приспособления микроассоциаций к изменившимся в результате беременности условиям внешней • (для микрофлоры) среды (макроорганизма), позволяют устранить погрешности, возникающие в результате накопления случайных ошибок и артефактов, выделить тенденции в изменениях этих факторов и, следовательно, могут быть использованы Для формализованной оценки степени приспособления ассоциации микроорганизмов.

Установлена взаимосвязь Между содержанием ряда гормонов (кортизол, SHBG, пролактпи) и факторов иммуноиифскционного статуса (иммуноглобулины IgG к возбудителям цитомегаловирусной, токсоплазменной и краснушной инфекций) в организме женщин с различным течением процесса гестации и выявляемой у этих же беременных микрофлорой.

Установлено отсутствие зависимости микрофлоры от уровней иммуноглобулинов IgM К возбудителям цитомегаловирусной, токсоплазменной и краснушной , инфекций, от антигенов Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeas и Streptococcus серогруппы "A". .

Показано, что предложенный комплекс показателей позволяет п условиях макроорганизм« полнее оценивать результаты других методов исследования, в частности таких, как определение иммупо-инфекциоиного и гормонального фона и поэтому может применяться в клинической практике.

Практическая ценность 1. Разработана модификация метода определения теста GormTube для

грибов рода Candida.

2. Разработан метод прямого посева аналитического материала с использованием ц чепортно-кучьтивициошюй кассеты.

3. Разработан комплекс программных средств для лаборатории иммунофермеитного анализа.

4. Разработаны формализованный информационные показатели, которые могут быть использованы для количественной биохимической характеристики культур микроорганизмов и для совершенствования комплексной оценки одоровья беременной женщины.

Внедрение результатов в практику

Разработанные в результате настоящего исследования методы внедрены в практику работы лаборатории АВВОТТ-СЕЬИА и Перинатального Центра Ивановского НИИ материнства и детства М8 РФ с положительным эффектом.

Обучение специалистов проводилось на семинарах и в виде подготовки специалистов на рабочих местах в 4-й женской консультации (сентябрь 1091 г.), в 1-й детской клинической больнице г.Иваново (февраль-март 1993 г.), в перинатальном центре ИвНИИмид (февраль 1900 г., март 1991 г., январь 1992 г.).

Материалы диссертации используются в учебной программе по курсу микробиологии в Ивановском государственном медицинском институте им.А.С.Бубнова.

Изданы информационно-методические документы:

1. информационное письмо "Критерии диагностики внутриутробных инфекций но данным иммунофермеитного анализа";

2. информационное письмо "Критерии диагностики инфекций передающихся половым путем по данным иммунофермеитного анализа".

Апробация работы и публикации

результаты работы доложены на совместной конференции Ивановского НИИ материнства и детства МЗ РФ, кафедры микробиологии и вирусологии- Ивановского медицинского института им.А-С.Бубнова и кафедры акушерства и гинекологии Ивановского медицинского института им.А.С.Бубнова. •

Материалы диссертации доложены на 46-й Ивановской областной научно-практической конференции . врачей дермато-венерологов, акушеров-гинекологов и работников СЭС (ноябрь 1992 г.), на научно-практических конференциях в перинатальном центре ИвНИИмид, в том числе: "Лабораторная диагностика внутриутробной инфекции плода" (январь 1993 г.), "Методы иммунофермеитного определения

s

внутриутробных инфекций" (март 1990 г., февраль 1993 г.). "Правила подготовки аналитического материала для ИФА-исследования" (сентябрь 1991 г., март 1993 г.).

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, Выводов, списка литературы, включающего 94 источника отечественной и 146 источников иностранной литературы н приложения. Работа иллюстрирована 48 таблицами и 54 рисунками.

Диссертация является самостоятельным трудом. Все исследования По ее теме выполнены автором самостоятельно.

Результаты исследований и их обсуждение Содержание работы Характеристика групп обследуемых Для решения поставленных задач под наблюдением находилось 183 женщины, из них 108 беременных и 75 небеременных. Комплектование групп обследуемых (пебеременные с Наличием и отсутствием угрозы невынашивания в предыдущих беременностях (т.е. с наличием и отсутствием привычного невынашивания) и беременные - с клинически нормальным течением данной беременности и с угрозой невынашивания) проводилось совместно с врачами акушерами-гинекологами и педиатрами-неонатологами. В Частности, были выделены следующие группы: Пебеременные женщины

А - практически здоровые на момент обследования небеременные жешциня (первая контрольная группа, п=40), не имевшие в анамнезе выкидышей и/или иных отклонений от нормального течения гестаЦиИ);

В - группа небеременных (п=35), имевших в анамнезе выкидыши в ранних сроках беременности и/или иные выраженные отклонения от нормального течения гестационного процесса, беременные женщины

С1 - практически здоровые на момент обследования беременные (вторая контрольная группа, п=>17), беременность у которых закончилась своевременными родами с рождением здорового ребенка; С2 - практически здоровые на момент обследования беременные (вторая контрольная группа, п*=10), беременность у которых закончилась своевременными родами с рождением ребенка с перинатальной патологией;

«

D1 - женщины с угрозой прерывания настоящей беременности, закончившейся сБ оврсменными родами с рождением здорового ребенка (п=19);

D2 - женщины с угрозой прерывания настоящей беременности, закончившейся своевременными родами с рождением ребенка с перинатальной патологией (п=34); D3 - с ранним самопроизвольным выкидышем (п-=15); D4 - с поздним самопроизвольным выкидышем (п=7).

Все 108 беременных были выявлены врачами акушер-гинекологами в ранних (до 12 недель) сроках беременности и активно вызывались для последующего динамического обследования с целью наблюдения за течением гестационного процесса в сроках 8-12, 14-18, 20-24, 28-32 недель гестации. В исследуемые группы взяты только женщины, обследованные не менее, чем три. раза. Своевременными родами завершилось 86 из 108 беременностей, т.е. у всех женщин из групп CI, С2, D1 и D2.

Все небеременные женщины (группы А и В) также обследованы врачами акушер-гинекологами поликлиники ИвНИНмид МЗ РФ в соответствии с фазами менструального цикла. Все вызовы для каждой пациентки обязательно приходились на один и тот же менструальный период. Отсутствие беремешюсти На момент обследования было верифицировано путем объективного осмотра и определения уровней сывороточных гормонов.

Методы исследования

Микробиологические исследования включали изучение микрофлоры в трех биотопах: в заднем своде влагалища (Vg), цервикалышм канале (Сх), зеве (Рх). Взятие материала производилось методом "прямого посева" стерильными тампонами на обычные бактериологические среды (Левина, Сабуро), в разработанные нами транслортно-культивационные кассеты, с дальнейшим выращиванпем в термостатах при температуре 37оС й 30°С для бактерий И грибов соответственно. При обнаружении грам-негативной флоры и/или псевдомицелия делался посев на диагностические кассеты производства фирмы ABBOTT Laboratories - Bid (для бактерий) или Yeastld (для грибов) для дальнейшего стандартизованного выращивания на субстратах, содержащихся в этих кассетах (см табл. 1) в соответствии с рекомендованными фирмой методиками. Кассеты Bid выдерживались в термостате при температуре 37<С б часов, а кассеты Yeastld - 12 часов при 30°С.

Оценка результатов культивирования на кассетах проводились на микробиологическом блоке (программный модуль "F") диагностического Центра QUANTUM-11-EIA-Universal.

В составе диагностического протокола, распечатываемого для каждой тестируемой в приборе диагностической кассеты, содержатся сведения о степени усвоения соответствующих субстратов, вариант идентификации (название наиболее вероятного микроорганизма) и biocode (биокод) - специфическая характеристика, соответствующая номеру вариационной матрицы п программном модуле "F" для данного варианта Идентификации.

Биокод каждого микроорганизма представляет собой семизначную формализованную цифровую характеристику, соответствующую набору биохимических параметров, определяющих исследуемый микроорганизм й рассчитывается из положительных или отрицательных результатов 21 биохимического теста. Для практических целей нами использованы стандартные наборы биохимических тестов, входящие в состав диагностических кассет Bid и Yeast Id (см. табл.1).

Таблица 1.

Номер лупки B Id Yenst Id

01 Glucose Urea

02 L-Lysine monohydrochloride P-hydroxybenzoic acid

03 L-Ornitine mono hydrochloride Carbohydrate negative control

04 Sodium citrate Glucose

05 Malonic acid Galactose

08 Esculln Sucrose

07 Urea Maltose

08 Adonitoi Cctlobiose

09 Arabinosc Trehalose

10 Inositol Lactose

11 Lactose Meiibiuse

12 Mannitol Kaffinose

13 Rhamnose Mclczitose

14 Sorbitol Xylose

15 Sucrose Arabinosc

10 Xylose Khamnose

17 L-Argininc hydrochloride Iirythritol

18 L-Tryplophan Unlcitol

1!) Arelantidn Inositol

20 Polymyxin "H Potassium nitrate

Примечание: в качестве 21-го теста используются проверки на цитохромокендазу п феномен СеппТиЬе для бактерий и грибов соответственно, пролпдимые вне диагностических кассет.

Для расчета биокодд в анализаторе <5ипп1ит-П производится автоматическая группировка результатов 21 теста на 7 триад, каждая из которых рассматривается как одна цифра в двоично-взвешенном коде

в

(например, сочетание "+++" соответствует 7, "---" - нулю, "+ — +" -

пяти и т.п. (см. таблицу 2.)

Таблица 2.

■ Интерпретация результатов тестирования кассет в двоично-• _ взвешенном коде.

цифры триады

1-я 2-я 3-я интерпретация

- - - О

+ _ - 1

- + 2

+ + _ 3

- - + 4

+ - + 5

- + + в

+ + + 7

Проведенные у всех женщин исследования включали также оценку гормонального и иммуно-инфекционного - фона но содержанию в периферической крови комплекса гормонов н специфических иммуноглобулинов IgG и IgM к возбудителям ряда инфекций (cytomegalovirus, toxoplasma gondii, rubellavirus). При первичном взятии на обследование мы определяли исходный уровень всех факторов. В дальнейшем проводились исследования микробиологического фона с динамическим наблюдение^ за содержанием р сыворотке крови с всех факторов гормонального и иммуно-инфекционного фона и проверкой на наличие антигенов Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae и Streptococcus серогруппы "А". Забор материала производился практически одновременно, максимальный интервал между взятием крови, тест-систем для определения антигенов И Микробиологического посева составлял не более двадцати минут.

Концентрацию сывороточных гормонов определяли методом DELFIA на системе ARCUS-1230 Fluorometer по технологии фирмы LKB-WALLAC (Финляндия). Для определения иммуноинфекцнонного статуса применен метод ELISA с использованием диагностического центра QUANTUM-II-EIA-Universal и технологии фирмы ABBOTT Laboratories (USA).

Результаты исследований

Для решения поставленных задач нами было идентифицировано и изучено 1884 культуры 50 видов, из них бактерий 1527 (81.05%, 33 вида) н грибов 357 (18.95%, 17 видов).

Во всех трех биотопах было выявлено разное (см. табл. 3) количество микроорганизмов.

Учитывая большое количество и высокое разнообразие выделенных культур и значительную сложность неформализованной обработки и

■ч

сопоставления данных, нами были разработаны и введены дополнительные характеристики и коэффициенты, расширено и углублено применение такой технической характеристики, как биокод (Ыособе), которая впервые была Использована нами в качестве интегральной метахарактеристики, отражающей биохимическое своеобразие каждого микроорганизма. Чем больше сумма цифр конкретного биокода, тем более активным в биохимическом плане (в смысле способности к утилизации брльшего количества субстратов) является данный микроорганизм. В связи с этим возможно, йо-первых, условно подразделить анализируемые микроорганизмы На "пассивные" и "активные" и, во-вторых, ввести такую характеристику ассоциаций микроорганизмов, как "утилизационная активность" (далее - 1Га), определяемую как отношение суммы цифр биокодов к числу этих биокодов. Пределы колебания значений этого Показателя как для одного микроорганизма, так и для

микроассоциации, вполне очевидны: от 0 ("-" во всех семи триадах

субстратов, т.е. "минимальная активность") до 49 ("+++" во всех семи триадах* т.е. "максимальная активность"), т.к. каждая из семи цифр биокода может, в принципе, принимать значение от "О" до "7" (20+21+22, где 20=1, 21=2, 22=4, а 1+2+4=7).

Таблица 3.

Количество микроорганизмов, выделенных в разных бнотопах.

Небе ременные Беременные Всего

Vff Сх Рх V* Сх Рх V& Сх Рх

энтеробактерии 288 223 260 264 231 261 552 454 521

грибы 36 27 21 101 81 90 137 108 111

всего 324 250 281 365 312 351 789 562 632

В пределах одного вида может быть выявлено несколько вариантов биокодов (для Ac.calcoaceticus - 25, для Morg.morganii - 7), при этом для одного и того же микроорганизма в пределах одного биотопа и периода времени возможны как "пассивные", так и "активные" варианты (например для Morg.morganii от "0110000" (Ua=2) до "7710421" (Ua=22), расцененные соответственно как "пассивный" и "активный" варианты). Для удобства сравнения микропссоциацнй с разным количеством биовариантов нами вяеден коэффициент "Кр" - "коэффициент разнообразия", определяющийся как отношение общего количества биокодов к общему количеству видов и отражпющнй степень проявления в данной микроассоципции биохимической гетерогенности.

В группе А были выявлены микроорганизмы 26-ти видов и 159 биокодов (Кр=б,12), в группе В - 27 видов и 173 биокодоп (Кр=в,41). Для обеих групп биохимическое разнообразие микрофлоры (Кр) в зепо заметно

снижается в второй * фазе менструального цикла, причем в большей степени за счет энтероблктерий, во в.лагалище это снижение происходит на протяжении всего цикла, а в цервикалыюм канале изменений практически нет. По отдельным биотонам обращает на себя внимание отсутствие грибов в зеве и цервикалыюм канале в третьей фазе с одновременным уменьшением гетерогенности бактерий. Гетерогенность всей микрофлоры постепенно уменьшается по фазам цикла и во влагалище. Различий утилизационной активности не найдено.

В группе С1 были выявлены микроорганизмы 23-х видов и 52 биокодов (Кр=2,26), в группе С2 - 34 видов и 96 биокодов (Кр=2,82). Для контрольной группы С1 характерно, что гетерогенность стабильиа практически на всем протяжении беременности и лишь в сроках 3 и 5 месяцев для влагалища, 3 месяца для цервикального канала и в 3, 5 и в месяцев для зева умеренно (не. более, чем в полтора раза) повышается, причем исключительно за счет бактерий. В группе С2 ни в одном биотопе в конечном периоде (девятый месяц) беременности не достигается Кр, равный единице. Максимальная гетерогенность (Кр) отмечена в 5 и 7 месяцев, при этом для большинства микроорганизмов, выявленных у женщин из группы С1 в зеве преобладали т.н. "пассивные", а во влагалище - "активные" варианты; для группы С2 - наоборот - было больше "пассивных" во влагалище и "активных" в зеве. Микрофлора цервикального канала в обеих группах занимала среднее положение.

Биохимическое разнообразие в группе 1)2 в сравнении с группой 01 было выше (25 видов и 49 биокодов (Кр=1,9б) для группы Ш и 20 видов и 59 биокодов (Кр=2,95) в группе 02). Для группы 01 гетерогенность практически на всем протяжении беременности была весьма вариабельной, но к моменту завершения (восьмой-девятый месяцы гестационного периода), оказывалась такой же, как и в группе С1. Другими словами, к концу беременности в группах С1 и Ш достигалось равновесие между макроорганизмом беременной и совокупностью исследуемых микроорганизмов. В сроках 2-4 и 6 месяцев для всех биотопов гетерогенность умеренно (не более, чем в 2 раза) повышалась во влагалище и зеве главным образом за счет бактерий, а в цервиксе доля участия бактерий и грибов в изменениях Кр примерно одинакова. В группе 02 ни в одном биотопе в конечном периоде беременности не достигается Кр, равный единице или меньший двух. Максимальные значения Кр отмечены в сроках 3 и 7 месяцев, причем эти значения существенно выше, чем в группе 01. Среди бактерий, выделенных у женщин групп 01 и 02, преобладали "пассивные" в зеве и "активные" во влагалище. Дня грибов картина существенно разнилась: если для 01

группы преобладали в зеве "пассивные" и во влагалище "активные", то для группы Т)2 п зеве было больше "активных", а во влагалище -"пассивных". Микрофлора цервикпльного канала во всех случаях занимала промежуточное положение без явного преобладания какой-либо из групп микроорганизмов.

Так как в группы 03 и 04 объединены женщины, беременность у которых завершилась самопроизвольным выкидышем в ранние и поздние (соответственно) сроки, то анализировались изменения только до окончания гестации в каждой группе (т.е. до выкидыша).

Для группы 03 примечательно, что гетерогенность достигала максимума к началу выкидыша. Изменения в цервиксе и влагалище обусловлены бактериями в большей степени, чем грибами, в отличие от зева, где на Кр одинаково влияли и грибы и бактерии. В группе О4 к началу выкидыша на также отмечены резкие пики Кр, но динамика этого эффекта различна для каждого биотопа. Если для влагалища и цервикального канала характерен постепенный подъем значений Кр от единицы в начале беременности к высоким цифрам (до 4.00 во влагалище И до 6.00 в цервиксе), то для зева более характерным оказалось большее Значение Кр (преимущественно за счет бактерий) в самом начале процесса гестации с нормализацией к третьему месяцу и резким подъемом до Кр=4.00 к четвертому. Грибы были весьма сходны - преобладание "пассивных" во влагалище и "активных" в зеве. Для бактерий картина существенно разнилась: если для 03 группы преобладали в зеве "пассивные" и во влагалище "активные", то для группы 04 в зеве было больше "активных", а во влагалище - "пассивных". Микрофлора цервикса во всех случаях занимала промежуточное положение без преобладания какой-либо из групп микроорганизмов.

Резюме: В разных совокупностях исследуемых микроорганизмов (выделенных либо в разных группах обследуемых женщин, либо в разных биотопах в пределах одной группы, либо л разных периодах исследования в пределах одного биотопа и/или группы) «вйдсны существенные отличия в количествах биокодов, в утилизационной активности и в биохимической гетерогенности выявленных микроассоциаций. Особую значимость применение Кр и Ш, как факторов, способных к отражению и количественному представлению мгновенного состояния исследуемой микроассоцнацни, приобретает в условиях длительного исследования, особенно при возможности быстрого изменения определяющих существование и деятельность микроассоциаЦин параметров. Легко рассчитываемые и простые в интерпретации коэффициенты 1Га и Кр могут быть применены для прогнозирования биохимических возможностей

микроорганизмов в конкретных условиях. Несомненным преимуществом этих параметров являетгя применимость их для описания биохимических (утилизационных) возы .кностей как отдельного микроорганизма так и микроассоциации любой степени сложности всего двумя числами с возможностью дальнейшей математической обработки.

Микрофлора в цервикальном канале относительно менее обильна по сравнению с другими биотопами. Влагалище лидирует по обсемененности как энтеробактериями, так и грибами, зев занимает промежуточное положение, хотя и более близок по обилию микрофлоры к влагалищу.

Распределение микрофлоры но количеству выделенных видов для всех биотопов показано в таблице 4.

Таблица 4.

Количество видов микроорганизмов в разных биотопах.

Небеременные Беременные Всего

Vg Сх Рх Vff Сх Рх Vfi Сх Рх

энтеробактерии 23 22 20 27 29 28 28 31 29

грибы 9 7 S 8 12 9 11 13 11

всего 32 20 25 35 41 37 39 44 40

Резюме: Видовое разнообразие выделенной микрофлоры практически полностью зависело от грибов, та« как видовой состав бактерий был относительно стабильным для всех женщин. Количество видов (и бактерий и грибов) в цервикальном канале, и зеве у небеременных меньше, чем у беременных, а во влагалище существенных отличий нет.

В целях достижения более углубленного анализа на основе Кр и Ua нами разработаны и применены формализованные информационные показатели:

На - мера биохимической активности микрофлоры изучаемого биотоца в определенный рериод времени, определяемая как. бинарный логарифм конкретного значения Ua

log2(l/o)

Hk - мера биохимически обусловленной гетерогенности микрофлоры изучаемого биотопа в определенный период времени, определяемая как бинарный логарифм конкретного значения Кр

log j (КР)

Ни - мера удельной биохимической гетерогенности микрофлоры изучаемого биотона в некоторый период времени, определяемая как бинарный логарифм отношения значений Кр и Ua

logj (Kp/Ua)

С микробиологической точки зрения Нк, На и Ни более полно отражают динамику приспособления микроасс'оциации к изменившимся в результате беременности условиям внешней (для микрофлоры) среды, т.е. к состоянию макроорганизма беременной женщины на фоне общего "унифицирующего" характера действия приспособительных к гестационному периоду факторов.

Динамика изменений коэффициента Ни по группам обследуемых представлена на рис. 1, 2, 3 и 4.

В группах А и В нет явного параллелизма в изменении Ни для бактерий и грибов по фазам менструального цикла во всех биотопах. В группах беременных женщин (С1, С2, 01, 132, 03 и 04) он есть (изменения Ни и бактерий и грибов в любом из биотопов сопоставимы с аналогичными в других биотопах в любом сроке беременности).

В принципе, картина приспособления видится примерно такой: на сравнительно сбалансированную и приспособленную к условиям вне беременности микроассоциацию начинает оказывать свое действие беременность - через посредство, например, изменений гормонального фона как результат запуска нового, ранее не существовавшего, органа -сначала плацентарного, а затем, с 3-го месяца беременности, фето-плацентарного комплекса и, следовательно, изменяются многие параметры среды обитания этой микрофлоры. Приспособление микроассоциации к измененным условиям наиболее вероятно происходит в виде индукции большого количества клонов с разными ферментарно-• утилизационными способностями.

Этим, видимо, можно объяснить тот факт, что значения Ни наиболее велики в ранние сроки беременности с постепенным снижением значений Нц (только в группах, закончившихся родами (С1, С2, 01 и 02)) до близких к нулю (только в группах, закончившихся нормальными срочными родами (С1 и С2), более крупные размахи Ни в периоды завершения органогенеза (3 месяца) и др., возможно, могут объяснить рождение детей с разной степенью физиологической незрелости (^недоношенности) и разной степенью проявления некоторых патологических состояний). Для исследованных групп основной неонатологической патологией были различной степени выраженности нарушения со стороны центральной нервной системы, что в принципе, может быть объяснено большей чувствительностью нервной ткани, особенно в процессе закладки ее у плода. При анализе заключений врачей-неонатологов, наибольшая выраженность этой патоцогии была установлена для детей, у матерей которых были наибольшие

Рисунок 1.

Динамика изменений коэффициента Ни по фазам менструального цикла в группах небеременных женщин. .

антеробактерии

I—»— Huw"

«9 К Vg ti VgSI

С« 11 сиг CxJI

P*ií Рх Jf PxJt

4.1 «

и i ».«

1

1.« 1

м

I

-НМ|А).

грибы

Vg 1f Vg H Vg II

Cxir CiH Cxif

Px« Р*И P» Jf

-Ф— Hu(A) •

m)

энтеробактерпи + грибы

VIIП Уд21 Уд» Сх 11 Си21 СхЗ! Р* 11 Рх21 Рх)Г

Примечание: по оси ординат указаны величины значений коэффициента Ни в битах, по оси абсцисс • биотопы и периоды исследования (\^-влагалище, Сх-цервикальный канал, Рх-оев, Н,2Г,ЗГ-фазы менструального цикла)

Рисунок 2.

Динамика изменений коэффициента Ни 'по месяцам беременности для практически здоровых беременных женщин (группы С1 и С2)."

грибы

внтеробактерии + грибы

Примечание: по осц ординат указаны величины значений коэффициента Ни в битах, по оси абсцисс - биотопы и периоды исследования (\^-влагалище, Сх-цервикалъный канал, Рх-аев, 2т,3ш,4ш,5ш,6ш,7т,8ш,9т-месяцы беременности)

Рисунок 8.

Динамика изменений коэффициента Ни по месяцам беременности для женщин с угрозой прерывания беременности (группы О! и 02).

-Ни |Р1) ■

-Ни (Ш)|

эятеробактёрин

Уд Уд Уд Уд Уд Уд Уд Уд

Ят Зт <т вт вт 7т вт вт

Сх Сх Ся Сх Сх Сх Сх Сх 1т 1т 4т вт вт Ут |т вт

Рх рх Рх Р* Рх Рх Рх Рх

2т }т <т вт вт Тт вт вт

энтеробактерии + грибы

Примечание: по оси ординат указаны величины значений коэффициента Ни в битах, по осп абсцисс - биотопы и периоды исследования (У^-влягалпще, Сх-цервикальный канал, Рх-зев, 2ш,3т,4т,бт,6т,7п1,8ш,9т-месяцы беременности)

Рисунок 4.

Динамика изменений коэффициента Ни по месяцам беременности для женщин с самопроизвольными выкидышами (группы ОЗ и Ш).

энтеробактерии

грибы

энтеробактерии + грибы

Примечание: по оси ординат указаны величины значении коэффициента Ни в битах,. по оси абсцисс - биотопы и периоды исследования (Уд-влагалшце, Сх-цервикальный канал, Рх-зев, 2т, Зш, 4т, 5т, 6т, 7т, 8т, 9т - месяцы беременности)

-те

несоответствия Нк, На и, особенно, Ни в сравнении с контрольными группами.

Известно в частности [Виктор В.Х.Ю, Вуд Э.К., 1991], что для недоношенных процессы приспособления микрофлоры идут более долго и с большим количеством патологических эффектов, чем для нормальных доношенных детей, получивших от матери уже сбалансированную и весьма активную в плане 11а к моменту родов микроассоциацию. Действительно, в группах Ш и 04 снижение значений Нк не наступает вовсе, отражая вплоть до момента аборта продолжение "попыток приспособления" к имеющейся среде, а На заметно йиже, Чем в контрольных группах.

Анализ изменений Ни в контрольных группах А и В показал, что наиболее характерным для этих групп является существенное повышение значений Ни в 3-й фазе менструального цикла для Всех биотопов независимо от характера микрофлоры. Индивидуальные колебания значений Ни для всех женщин укладывались в ¿15%. Во всех случаях значения Ни для грибов были выше, Чем для бактерий. Изменения Ни в разных фазах цикла различны дЛя обеих групп и во всех случаях Ни в группе А превосходит соответствующее значение в группе В.

Наибольшие отличия Между микрофлорой в группах • А и В выявлены для каждого периода цикла в ином биотопе. Так например, с точки зрения выявления этих наибольших отклонений, наиболее рационально оценивать величину Ни для влагалища в 1-й, дЛя цервикалыюго канала во 2-й и для зева - в 3-й фазе менструального цикла.

Во всех группах беременных женщин (С1,С2,01,02,03,04) Ни Иа третьем месяце беременности снижается до минимума и наиболее сильно этот эффект выражен во влагалище, наименее - в зеве. Сходная картина (для групп С1,С2,01,02) обнаружена в сроке 8 месяцев, но эффект снижения Ни наиболее выражен в зеве. Именно на эти периоды приходится максимальная частота выявления таких микроорганизмов, как хламидшг, гонококки, р-гемолитнческне стрептококки. Это же время соответствует периодам резких колебаний гормонального фона, на которые микропссоциация соответствующего биогопа, по-видимому, реагирует увеличением гетерогенно-тн и в виде Нк и просто в виде разнообразия видолого состава, но в каледэм случае по-разному, хотя есть общие тенденции.

Для групп С1 (в большой), СЯ (в несколько меньшей степени) и VI, 02 определяется разная степень подверженности Ни изменениям на третий месяц беременности. Для С1 и С2 значения Ни на 4-м месяце были

выше, чем во 3-м (т.е. до снижения в 3-м) с некоторым снижением затем в 5-м, 6-м и 7-м месяцах и заметным повышением в конце беременности. В группе Ш снижение Нц в 3-м месяце выражено наименьшим образом, а в группе Б2 снижение Ни "растянуто" на 3-й и 4-й месяцы. В это же время (3-й месяц) происходит накопление в организме женщины максимального количества [!ХГ и начинается активная выработка аРР; заканчивается органогенез плода и происходит активация фето-плацентарного гормонопродуцирующего комплекса.

При изучении факторов На, Нк и Ни в разных группах во время гестации выяснилось, что все они в любом сроке были выше (особенно в Последнем триместре) в группах С1 и 01, т.е. - в группах с рождением здоровых детей. Группа С1 характеризовалась неуклонным подъемом Ни во влагалище и стабилизацией в цервнкальном канале и зеве; менее выраженный подъем в группе С2 с аналогичным поведением Ни в разных биотопах; выраженный подъем Ни во влагалище и зеве и снижение в цервиксе в группе 01; и наконец, заметное снижение Ни во влагалище и зеве на фоне некоторого повышения в цервиксе для группы Б2. В группах 03 и 04 характерным было снижение суммарных Ни во всех трех биотопах ниже единицы как минимум за месяц-полтора перед наступлением выкидыша.

В каждом биотопе изменения при беременности отмечены разной степенью выраженности колебаний Ни, что можно объяснить тем, что все три биотопа имеют разную степень подверженности гормональным и иммунным влияниям (гормоны - максимум в матке (и в цервикальном канале шейки матки), меньше во влагалище, минимум в зеве; иммунные влияния - максимум в зеве, меньше в цервиксе и влагалище) [Савельева Г.М., 1992], но тем не менее, параллелизм изменений сохраняется.

В "благополучных" по течению и исходу контрольных группах (С1 и С2) отмечена следующая зависимость Нк и уровней специфических к возбудителям Инфекций - чем больше уровни специфических ^С, тем выше Нк (больше вариантов микроорганизмов). Для максимально неблагополучных групп фЗ и 04) зависимость диаметрально противоположная - чем меньше уровни специфических ТеО, тем больше вариантов микроорганизмов.

Проанализировав значения Ни по всем группам, получаем: Ни в С1-С2 наибольшая; Ни в 01-02 промежуточная; Ни в 03-04 минимальная,

кроме того:

Ни в А наибольшая;

Ни в В минимальная,

что может в клиническом смысле отражать исходную "фоновую" стабильность микрофлоры (в смысле недостаточной вариабельности биохимических ферментативных систем) в пределах конкретного биотопа и макроорганизма в целом в результате каких-либо ограничений имеющихся в этих биотопах субстратов, вследствие некоторых достаточно стойких особенностей этих макроорганизмов, а следовательно, ограничение приспособительной способности микрофлоры, приводящее к возможному развитию микробиологического фактора угрозы невынашивания беременности.

Достоверность различий Ни в разных группах подтверждается результатами статистического сравнения их с использованием тестов "Two-Sample Analysis" и "Kolmogorov-Smirnov Two-Sample Test" из пакета Statgraphics 3.

Фактически, использование Hk, На и Ни - это нечто вроде способа диагностики угрозы невынашивания - если проверить все колонии из одного биотопа и Hk для них будет большим при одновременном низком значении На и, особенно, Ни, видимо можно говорить о Наличии неполного приспособления микрофлоры к внутренним условиям (в сроках 3 и более месяцев) и о возможности угрозы невынашивания микробиологического генеза. Бели Hk низкий (близок к нулю), а На и Ни высокие, то с точки зрения микробиологии есть основания Говорить о достаточном приспособлении исследуемых микроорганизмов, Т.е. - о достижении ими необходимого гомеостатического оптимума к конкретным условиям биотопа, о по величине факторов - с некой вероятностью предсказать возможность рождения детей с или без патологических изменений. Появляется реальная возможность, во-первых, прогнозирования развития планируемой беременности до ее наступления но установлению фоновой стабильности микрофлоры; во-вторых, определения в пределах беременйости Возможности рождения детей с патологическими отклонениями, являющихся следствием особенностей микробного фона матери; в-третьих, применимость использования выявленных параллелей в динамике развития микрофлоры в пределах менструального цикла и гестационного периода для исследования материала только из такого биотопа как зев, что в-четвертых, позволит подойти к массовому профилактическому определению групп риска на возникновение патологических отклонений, могущих быть

обусловленными особенностями микробного фона (в т.ч. ..и у еще небеременных пациенток).

Предлагаемый метод оценки результатов исследования микрофлоры о определением разработанных нами параметров открывает еще один путь для достижения более полного описания динамики жизнедеятельности микроассоциации с учетом возможностей конкретного субстрата ее обитания и, в перспективе дальнейшего исследования, позволяет сделать еще один шаг по пути создания математических моделей микробных процессов. Результаты проведенных исследований и разработанные критерии могут способствовать совершенствованию микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых ассоциациями Enterobacteriaceae и Candida.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена связь ассоциантов энтеробактерий и Candida представителей резидентной микрофлоры родовых путей женщин с характером течения беременности и с динамикой иммуно-инфекционного и эндокринного статуса.

2. Впервые обнаружена взаимосвязь биохимических свойств (биокодов) микробных ассоциантов с периодами беременности, выразившаяся в преимущественном формировании в отдельные сроки беременности микрофлоры со строго определенными биокодами, отражающих тем самым особенности не только собственно микрофлоры, но и некоторые особенности ее функционирования и взаимодействия с органами и тканями макрооргаиизма.

3. Впервые разработан метод расчета и обнаружена взаимосвязь . утилизационной активности (Ua) энтеробактерий и Candida с

особенностями иммуно-инфекционного и гормонального статуса беременных женщин, выразившаяся в наличии параллелизма между Ua и пределами разнообразия факторов гормонального и инфекционного (IgG) статуса.

4. Впервые разработан метод определения и обнаружена взаимосвязь метаболической гетерогенности (коэффициент разиообр_азия, Кр) энтеробактерий и Candida с динамикой- иммуно-инфекционного и эндокринного статуса женщин с нормальным течением беременности и с угрозой невынашивания,проявившаяся в наличии достаточно четко выраженных различий в динамике поведения Кр в группах женщин с разной степенью выраженности патологических проявлений во время и вне текущей беременности.

6. Предложены формализованные показатели На, Нк, Ни как бинарные логарифмы утилизационной активности (Ua), коэффициента разнообразия (Кр) и отношения Kp/Ua энтеробактерий и Candida, наиболее полно характеризующие степень их приспособления к изменяющимся иммуно-инфекционному и эндокринному состоянию организма женщины в процессе беременности.

в. Дано теоретико-практическое обоснование использования формализованных показателей На, Нк, Ни для принципиальной возможности определения групп риска возникновения угрозы невынашивания у беременной женщины.

7. Разработаны и внедрены в практику модификация метода определения теста GermTube для грибов рода кандида, транспортно-культивационная кассета, комплекс программных средств для лаборатории иммуноферментного анализа.

Публикации по теме диссертации:

1. Голубев А.В. Распространенность хламидийной инфекции и роль в нарушении гомеостаза при осложненной и пеосложненной угрозой невынашивания беременности. / В сбора. Молекулярно-клоточные механизмы иммунной регуляции гомеостаза и проблемы математического моделирования. Красноярск, 1990, с. 68-69.

2. Голубев Л.В. Ранняя диагностика цитомегаловирусной инфекции. / В сб. Тезисы докладов IV Областной конференции молодых ученых и специалистов по актуальным общественно-политическим и научно-техническим проблемам. Том 1. Иваново, 1890, с. 66

3. Сотникова Н.Ю., Голубев Л.В. И др. Иммунологический профиль женщин с привычным невынашиванием.//Челябинск,109О.С.135-136.

4. Сотникова Н.Ю., Голубев А.В. Преимущества ИФА-выявления антигена Chlamydia trachomatis// Киев, 1990. С.27.

6. Голубев А.В., Смирнов С.Г. Носительство Streptococcus "А" и содержание сывороточного IgE и ферритнна у беременных женщин с угрозой невынашивания. / В сб. научи, трудов Московского НИИ педиатрии и детской хирургии и Ивановского НИИ материнства и детства МЗ РФ "Здоровье семьи и репродуктивная функция", М.- 1993.-С.65

0. Автоиомова Е.В., Богатова И.К., Голубев А.В., Кулида Л.В. Воспалительные заболевания гениталий и особенности бактериальной обсемененности слизистых оболочек женщин, работающих в текстильной промышленности / В сб. няучн. трудов Московского ПИИ педиатрии и детской хирургии и Ивановского НИИ материнства н детства МЗ РФ "Здоровье семьи и репродуктивная функция", М.- 1893.--С.56

7. Мукатдисова З.Г., Голубев А.В., Зотов А.А., Смирнов С.Г. и др. Лабораторная диагностика краснушной инфекции у беременных // в сб. "Актуальные проблемы инфекционной патологии", с.148, СПб, НИИЭМ, 1993 г.

8. Голубев А.В., Смирнов С.Г., Городков В.Н. Выявление цитомегаловирусной инфекции у детей // в сб. "Актуальные проблемы инфекционной патологии", с. 116, СПб, НИИЭМ, 1993 г.