Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы

Горбунова, Валентина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы"

1 3 СЕН

На правах рукописи

ГОРБУНОВА Валентина Юрьевна

АНДРОГЕНЕЗ Ш МТКО у ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ

03.00.15. - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петс эбург К 2000

;_] ¡..„Л.,

Работа выполнена в Башкирском государственном педагогическом институте и Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

С.А. Гостимский

доктор биологических наук, П.Н. Харченко

доктор биологических наук, профессор И.П.Гаврилюк

Ведущая организация: Ботанический институт РАН.

Защита диссертации состоится 21 апреля 2000 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 020.18.02 при Государственном научном центре РФ - Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова по адресу:

190000, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И. Вавилова.

Автореферат разослан " 20 марта" 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Э.А.Гончарова

Общая характеристика работы

Актуальность темы диссертации. В современных генетических, молекулярно-биологических, биотехнологических и селекционных исследованиях важнейших сельскохозяйственных культур существуют проблемы, решение которых возможно только с помощью высокоэффективных методов, позволяющих выявить генетический потенциал растений.

Внедрение новых клеточных технологий в сочетании с методами классической генетики и селекции открывает большие перспективы и для практического использования, и для решения фундаментальных проблем генетики, биотехнологии и физиологии растений.

Сказанное в большей степени относится к методу культивирования изолированных пыльников, основанного на использовании явления андрогенеза in vitro - процесса образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна - гаметофита высших растений (Guha, Maheshvari, 1964). Этот уникальный феномен связан с переключением генетической программы развития спорогенных клеток с обычного для них гаметофитного пути на принципиально иной - спорофитный путь развития. Смены поколений (спорофитного на гаметофитное), характерной для растений in vivo, не происходит, а производные спорогенных клеток - микроспоры и пыльцевые зерна ведут себя подобно зиготам ( Батыгина, 1978-1992; Горбунова и др.1993). Поэтому андрогенез in vitro рассматривается как особая система размножения растений (Суханов, 1983), позволяющая ускоренно получать полностью гомозиготные растения-регенераты при гомозиготизации гаплоидных растений, выращенных из микроспор гибридных форм в культуре изолировнных пыльников.

Использование в качестве объекта для данных исследований яровой мягкой пшеницы, имеющей огромное народнохозяйственное значение объясняется тем, что не разработаны высокоэффективные технологии массового получения гаплоидных растений. Основная причина этого - методические и методологические трудности, связанные с исследованием и использованием андрогенеза in vitro у представителей именно этого семейства.

Одной из принципиальных проблем считается низкая продуктивность андрогенеза in vitro. Перетасовка условий культивирования, состава питательных сред, особенно их гормональных компонентов, для яровой мягкой пшеницы не стала такой же продуктивной, как для культуры тканей двудольных.

До настоящего времени открыт вопрос об индукторах андрогенеза in vitro. Остается далекой от окончательного решения и ключевая проблема андрогенеза in vitro - механизм переключения генетической программы развития микроспор/ клеток пыльцевого зерна с гаметофитного пути на спорофитный. Не исследованы вопросы: каковы предпосылки этого явления в условиях in -vivo, каковы

начальные этапы дифференциации микроспор наэмбриоидогенез и каллусогенез и каковы эндогенные факторы, предопределяющие выбор различных путей морфогенеза. Поэтому можно предположить, что исследование молекулярно-генегических особенностей ответной реакции экспланта на условия культивирования и баланса эндо- и экзогенных фитогормонов как в момент инокуляции экспланта в питательные среды, так и в процессе культивирования, являются решающими и для понимания дифферециальных путей морфогенеза. Изучение этих вопросов может иметь принципиальное значение, так как, знание механизмов "переключения" генетических систем развития микроспор, могло бы приблизить к возможности управления процессом морфогенеза в культуре изолированных пыльников и решению фундаментальной проблемы современной биологии - проблемы морфогенеза.

Цель исследования заключалась в выявлении возможности дифференциальной экспрессии генов, ответственных за реализацию спорофитной генетической программы развития микроспор а также в изучении роли эндогенных фитогормонов пыльника в регуляции спорофитного пути в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы.

В процессе реализации поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучение закономерностей нетрадиционной системы бесполого размножения

в культуре изолированных пыльников.

2. Исследование генетической изменчивости морфогенных образований и андроклинных удвоенных гаплоидных (АДГ) растений на молекулярном, хромосомном и геномном уровнях.

3. Изучение характера связи между генетической и фенотипической изменчивостью АДГ форм.

4. Выявление эндогенных факторов, влияющих на андрогенез in vitro и изучение

их роль.

5. Проведение цитологического мониторинга всего процесса культивирования

изолированных пыльников, используя возможности светового (СМ) и электронного микроскопов разных типов: сканирущего (СЭМ) и трансмиссионного (ТЭМ). Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Возможность реализации генетической системы гомофазного (спорофит -

спорофит) пути развития микроспор в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы, прямым доказательством которого является получение чистых линий исходных сортов в культуре изолированных пыльников.

2. Осуществление процесса переключения генетической программы развития

микроспор с гаметофитного на спорофитный путь при экспрессии генов, участвующих в регуляции и функционировании этапов клеточного цикла.

3. Возможность создания в культуре изолированных пылышков различных клеточных систем с высоким мофогенным потенциалом: эмбриоидов и морфогенных каллусов. Формирование таких структур зависит от: фазы развития микроспор, эндогенного уровня фитогормонов в экспланте и концентрации 2,4-Д в питательной среде.

4. Возможность управления геномной изменчивостью с целью сохранения исходной плоидности ядер микроспор и формирование андроклинных удвоенных гаплоидных растений-регенерантов с нормальным набором хромосом. Это важный фактор культивирования изолированных пыльников такого сложного аллоплоида, какой является яровая мягкая пшеница.

5. Использование RAPD- ПЦР анализа амплифицированных фрагментов ДНК

исходных и АДГ линий для молекулярно-генетического анализа изменчивости при андрогенезе in vitro.

Научная новизна и практическая ценность работы состоит в проведенном впервые широком системном исследовании роли эндогенных и экзогенных факторов, детерминирующих спорофитный путь развития in vitro у яровой мягкой пшеницы.

Впервые изучены и являются приоритетными: синтез в ревертазной реакции кДНК, на основе мРНК экспланта, дифференциально экспрессирующейся в ответ на предобработку изолированных пыльников низкими положительными температурами.

Впервые экспериментально продемонстрирована зависимость дифференциальных путей морфогенеза (эмбриоидогенез и /или каллусогенез) у яровой мягкой тпеницы от концентрации эндогенных фитогормонов, и зависимость индукции эмбриоидогенез а от концентрации 2,4-Д в питательной среде, адекватной эндогенному уровню фитогормонов в экспланте.

Выявлены и описаны закономерности формирования клеточных структур с различной морфогенной способностью и проведен комплексный мониторинг всех ключевых моментов культивирования изолированных пылышков. Использование методов световой и электронной микроскопии в сочетании с твердофазным иммуноферментным анализом фитогормонов позволило описать особенности морфогенеза в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы и показать, что синхронность многих изученных факторов: фаза развития микроспоры, ее эндогенные характеристики (развитие ядра, наличие вакуолей), состояние стенок гнезда пыльников (наличие фиброзных утолщений в эндотеции) и концентрация эндогенных фитогормонов в пыльнике в момент инокуляции их на питательные среды, являются ключевыми для успешного осуществления прямого андрогенеза in vitro.

С помощью RAPD - ПЦР метода исследован характер наследования фрагментов ДНК у АДГ форм.

Исследована динамика изменения градиентов концентраций фитогормонов в замкнутой системе пыльник - питательная среда в течение 21 дня и изучен характер наследования признака "содержание АЬ'К" у АДГ форм.

Проведен сравнительный анализ альтернативных путей морфогенеза в культуре изолированных пыльников. Определены, конкретизированы и визуализированы фенотипические и цитологические маркеры, соответствующие оптимальной для андрогенеза in vitro фазе микроспорогенеза.

Унифицирована терминология, используемая для описания процессов, происходящих при культивировании изолированных пыльников.

Разработана технология прямого андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы, которая защищена тремя авторскими свидетельствами.

Получены андроклинкые удвоенные гаплоидные растения и линии, характеризующиеся высокой продуктивностью, засухоустойчивостью и скороспелостью.

Реализация результатов исследования заключается в том, что технология культивирования изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы внедрена в Башкирском НИИ земледелия и селекции полевых культур.

Андроклинные удвоенные гаплоидные гибридные линии, полученные в ходе проведения экспериментов в культуре изолированных пыльников испытываются в селекционных учреждениях Башкортостана.

Полученные теоретические и практические результаты активно используются при чтении курсов общей генетики с основами селекции, биотехнологии и сцецкурсов в Башкирском государственном педагогическом институте.

Личный вклад соискателя. Инициация программы исследования осуществлена автором. Результаты исследований, представленных в диссертации, получены при непосредственном личном участии диссертанта или под его руководством. Интерпретация результатов исследования и оформление выводов выполнены самостоятельно. Вклад автора был опреляющим и при написании научных статей.

Апробация работы. Основные положения настоящего исследования обсуждались и были представлены на 3,4, 5 съездах ВОГиС им. Н.И. Вавилова (Ленинград, 1977; Кишинев, 1982;Москва, 1987J; Учредительном, 1 и 2 съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Минск, 1992; Саратов, 19У4; СПб, 2000); Всесоюзных конференций: по генетике развития (Ташкент, 1980), по биохимии НК и метаболизму белка (Минск 1981), экологической генетике растений и животных (Кишинев, 1982, 1984, 1987, 1989, 1991); на 1 и 2 Всесоюзной школе-семинаре по иммуноферментному анализу фитогормонов (Уфа, 1989, 1991); 2 и 3 Всесоюзных съездах физиологов растений (Минск, 1990, СПб, 1993); Международных рабочих совещаниях по программе 5.1.1.1.

КПНТП СЭВ (Алма-Ата, 1988, 1990; Москва, 1990); Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988; Москва, 1989, 1990-1992; Алматы, 1993, 1999); на 11 Международном симпозиуме по эмбриологии и семенному размножению (Ленинград, 1990); на 12, 13 и 14 Международных конгрессах по половому размножению растений ( Ohio, 1992; Vienna, 1994; Lome, 1996); на международных конференциях: "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда (Москва, 1997); "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998), "Клеточная и молекулярная биология растений" (Varna, 1998).

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, включающих: обзор литературных источников по проблеме, материалы и методы исследования и четырех глав с результатами и их обсуждением. Имеется также заключение, выводы и список цитированной литературы. Обьем основного текста работы составляет 290 страниц, включая 61 рисунок и 46 таблиц. Список использованной литературы включает 465 наименований, в том числе 322 на иностранных языках.

Связь работы с крупными научными программами.

За время выполнения работы получены гранты следующих фондов: ГНТП "Новейшие методы биоинженерии" (1987-1993), "Приоритетные направления генетики" (1989), "Российского фонда фундаментальных исследований" (19941995, 1999-2001), Фонда "Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки" (1997-2000 гг.).

Автор выражает сердечную благодарность чл-корр. РАН Бутенко Р.Г., проф., д.б.н. Шаминой З.Б. и проф., д.б.н. Батыгиной Т.Б за инициацию данных исследований.

Глубокую признательность диссертант выражает проф., д.б.н. Крупнову В.А., проф., д.б.н. .Вахитову В.А., к.б.н. Внучковой В.А. - к сожалению, скоропостижно ушедшей от нас, за постоянное внимание к работе. Также благодарит коллег, которые принимали участие в проведении экспериментов и обсуждении результатов: д.б.н. Кудоярову Г.Р., к.б.н. Круглову H.H., к.б.н. Геращенкова Г.А., к.б.н. Абрамова С.Н., Надольскую С.Н., Зарянову Л.Д., за неоценимую помощь при оформлении работы - к.б.н. Богданова М.Р., за методическую помощь при сканирующем электронном микроскопировашш -к.б.н. Г.Е.Титову.

Объекты и методы исследований

Исходным материалом служили районированные и перспективные для зоны Южного Урала сорта и линии яровой мягкой пшеницы; гибридные формы, полученные автором; а также селекционно-генетический материал, любезно предоставленный Е.Б.Будапшшой (Гибрид 21, Линии 37,38), В.А.Крупновым

(почти изогенные линии), Ю.М.Козловым (Линия 35).

В работе использовали: общепринятые приемы культивироания изолированных органов растений (Бутенко, 1964), культуры изолированных пыльников пшеницы (Sunderland, 1971; Heberle-Bors, 1982; Суханов, 1983; Дьячукидр., 1988; Горбунова и др., 1986-1998).

Применяли общепринятые цито-гистологические методы (Бродский, 1966; Батыгина и др., 1974; Паушева, 1978) с незначительными модификациями (Горбунова, 1993).

Исследование веретена деления ядер микроспор выполнено по прописи Н.В.Шаминой (устное сообщение).

Иммуноферментный анализ фитогормонов в пыльниках проведен по методикам, разработанным Г.Р. Кудояровой и др.(1986-1992).

Молекулярно-генетические исследования проводились по методикам, модифицированным Г.А.ГеращенковьШ (1998).

Тотальную ДНК 4-х дневных этиолированных проростков пшеницы для RAPD-анализа выделяли по модифицированному методу Graham (1987). Полученную ДНК анализировали в 1 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Количество ДНК в образце определяли с помощью DNA mini-fluorom-eter фирмы Hoefer Scientific Instruments.

В работе использовали 15 праймеров длиной от 10 до 18 нуклеотидов. Полимеразную цепную реакцию ДНК проводили в амплификагоре Терцик МС2 (Россия), используя 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 0.2 мМ каждого dNTP, 10 pmol праймера, 10 нг ДНК, 2 ед Taq-полимеразы в 1х PCR-буфере Бион, Россия). Температурный профиль подимеразной цепной реакции был следующим: инициирующая денатурация ДНК - 94°С 3 мин, затем 3 цикла амплификации с мягким отжигом (94°С 0.5 мин, 38°С 1 мин, 72°С 1 мин), далее 30 циклов амплификации (93"С 0.5 мин, 48иС 1 мин, 72"С 1 мин), заключительная элонгация 72°С 5 мин. Необходимость проведения трех циклов амплификации с мягким отжигом была продшсювана необходимостью увеличения синтеза гетеродимерных молекул. Оказалось, что некоторые праймеры проявляют неполную комплементарность ДНК-матрице. Поэтому в предварительных экспериментах было установлено, что мягкий отжиг не менял молекулярных спектров в сравнении с реакцией амплификации, при которой использовался толы® строгий отжиг. Для коротких праймеров: Ds, Grig-3, Grig-13, Р37 и Р42 отжиг вели при температуре 40°С в течение 0.5 мин. Полиморфность тестируемых локусов и генетические расстояния рассчитывали по формулам, приведенным в работах Ю.М.Сиволапа и др.(1998).

Статистическую обработку полученных данных проводили по общепринятым методикам (Рокицкий, 1974) с использованием пакета программ для IBM.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Зависимость андрогенеза in vitro от стадии развития микроспоры и состояния стенок гнезда пыльника

Исследователи, занимающиеся проблемами эмбриоидогенеза не пришли к единому мнению о фазе развития микроспор, наиболее адекватной для начала культивирования пыльников с целью получения гаплоидных эмбриоидных структур. Имеющиеся исследования свидетельствуют о том, что благоприятная фаза развития микроспор и пыльцевых зерен (и, естественно, благоприятный период в развитии пыльника в целом) в момент инокуляции - один из основных факторов, определяющих успешное культивирование изолированных пыльников как злаков, так и представителей других семейств. Микроспоры и пыльцевые зерна реагируют на условия культивирования только в пределах ограниченного промежутка времени. Согласно литературным данным (Wilson, et al., 1978; Sunderland et al., 1979; Wheatley et al, 1986; Hu, 1986; Schumann, 1987) и результатам наших исследований (Горбунова и совт., 1988,1997), у злаков фазой, оптимальной для индукции андрогенеза in vitro является фаза сильновакуолизированной микроспоры, соответствующая постмейотическому периоду в развитии пылышка или завершению этапа созревания пыльника.

Культивировали пыльники, микроспоры которых находились на разных фазах микроспорогенеза. Как показывают результаты, культивирование пыльников, большинство микроспор которых находится на поздней фазе микроспорогенеза, приводит к повышению продуктивности эмбриоидогенеза. В то же время, чем больше микроспор, находящихся на средней фазе микроспорогенеза в пыльнике, тем меньше морфогенных структур (табл. 1).

Многолинейная корреляция выявила и то, что микроспоры больших размеров не обязательно расположены в крупных пыльниках, и наоборот; мелкие микроспоры не всегда принадлежат только мелким пыльникам. Показано также, что размеры ядер микроспор не зависят как от размеров пыльника, так и микроспор. В то же время, оба показателя не влияют на эибриоидогенез in vitro. Не обнаружено прямой корреляции и между величиной ядер и продуктивностью эмбриоидогенеза.

Из результатов, приведенных в таблице 1, также следует, что фазы микроспорогенеза зависят и/или соответствуют размерам пыльника.

Примечателен тот факт, что чем больше мелких микроспор в пыльнике, тем ниже интенсивность эмбриоидогенеза. Наличие плохо окрашиваемых ацетокармином микроспор не способствует повышению продуктивности андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы.

11римечагелен тот факт; что чем больше мелких микроспор в пыльнике, тем ниже интенсивность эмбриоидогенеза. Наличие плохо окрашиваемых ацетокармином микроспор не способствует повышению продуктивности андрогенеза in vito у яровой мягкой пшеницы.

Таблица I

Корреляционная решетка взаимосвязи цитологических параметров сорта Скала с продуктивностью эмбриоидогенеза

Признаки Размер пыльника Эмбриоидогенез

Размер микроспор 0,5143 0,0286

Размер ядер 0,1167 0,06124

Ранняя микроспора 0,3050 0,0650

Средняя микроспора 0,2777 -0,5401

Поздняя микроспора 0,5002 0,7000

Размер делящихся микроспор 0,4082 0,2500

Мелкие микроспоры 0,381 -0,182

Плохо окрашиваемые микроспоры • 0,239 -0,387

г > 0,4. значимо на 0,05% уровне

Согласно полученным данным, состояние стенки гнезда пыльника в момент инокуляции у всех исследованных генотипов яровой мягкой пшеницы, проявляющих отзывчивость иа условия культивирования, сходна: начинается дегенерация клеток тапетума и среднего слоя, кутинизация оболочек экзотеция, формирование фиброзных утолщений в оболочках клеток эндотеция (Горбунова, 1993)

Факту начала формирования фиброзных утолщений в оболочках клеток эндотеция мы придаем особое значение. Установлено, что такие утолщения появляются синхронно с изменением популяции микроспор в пыльнике в сторону увеличения (более 50%) доли микроспор, находящихся в сильновакуолизированной фазе микроспорогенеза (рис. 1, ф). В целом, появление фиброзных утолщений характеризует начало качественного сдвига в развитии пыльников не только яровой мягкой пшеницы, но и тритикале и озимой ржи (Горбунова, 1992).

Таким образом, анализ литературных и собственных экспериментальных данных (Горбунова, 1992, 1993) позволил выявить следующие важнейшие особенности развития пыльника и микроспор, знание которых способствует унификации начальных этапов андрогенеза in vitro. К ним относятся:

1. Значительная морфологическая и функциональная гетерогенность популяции микроспор in vivo, характеризующая полиморфизм микроспор, находящихся в пыльнике в фазу поздней стадии развития микроспор. Определение четких цитологических и фенотипических критериев морфогенных микроспор позволяет повысить продуктивность эмбриоидогенеза в культуре изолированных пыльников. При этом, размер микроспор не является определяющей характеристикой морфогенности микроспор.

в*,» ОМ»

€ ^

Рис. 1. Фаза сильновакуализированной (поздней) микроспоры: I - микроспора на средней стадии развития, II - микроспора на поздней стадии развития. Я -ядро, В - вакуоль, П - пора, Ф - фиброзные утолщения эвдотеция; х 120.

л.» ■

М I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Праймер Р-2 Праймер Р-3

Рис.2. Дифференциальный дисплей кДНК сорта Жница. М- молекулярный маркер, 1-10 -варианты амплификации кДНК, четные -при обработке холодом.

2. При культивировании изолированных пыльников необходимо учесть, что наибольшая продуктивность эмбриоидогенеза достигается в тех пыльниках, большинство микроспор которых находится на поздней стадии развития, маркером которой является наличие большой вакуоли, развитого ядра в микроспоре и зрелого эндотеция в стенке гнезда пыльника.

3. Феногапическим критерием для срезания колосьев перед предобработкой и инокуляцией является расположение кончика колоса на 1/5 расстояния между лигулой предпоследнего листа и флаговым.

Влияние низких положительных температур на андрогенез in vitro

Начальным этапом технологии культивирования изолированных пыльников является воздействие на изолированные колосья низкими положительными температурами (+3 - +7°С) в течение 4-7 дней.

Вопрос состоит в том, как реагируют микроспоры на воздействие температурного шока. Результаты проведенных нами экспериментов свидетельствуют, что деление ядер микроспор происходит только в тех из них, которые отрываются от орбикул и «выпадают» в полость гнезда пыльника. Те микроспоры, которые остаются прикрепленными к орбикулам и через них - к стенке гнезда пыльника, не приступают к делению.

Микроспоры, находящиеся на средней фазе микроспорогенеза, чаще всего, остаются прикрепленными к тапетуму и поэтому редко приступают к делению.

У пыльников, микроспоры которых находятся на ранних фазах микроспорогенеза, не развит эндотеций, то есть отсутствуют фиброзные утолщения, даже холодовая предобработка не приводит их к делениям. Они как бы "замирают" в своем развитии. Фенотипически эту фазу развития можно определить по соотношению расстояния между лигулой предпоследнего и флаговым листьями. Если кончик колоса, находящегося в трубке, располагается в середине вышеназванного расстояния, то это соответствует ранней, невакуолизированной фазе микроспорогенеза.

В литературе сосуществуют разноречивые мнения о влиянии этого приема на микроспоры культивируемых пыльников. Для внесения ясности в исследуемую проблему, мы изучили динамику изменения эндогенного содержание ИУК и АБК в пыльниках, начиная с момента срезания колосьев в полевых условиях и после 4,6,7.8 дней температурных воздействий на колосья донорных растений. Результаты эксперимента приведены в таблице 2, Сорта различались и по исходному уровню эндогенных фитогормонов, и по динамике накопления АБК и ИУК в ответ на воздействие холодового шока.

'Гак, у сорта Скала за 8 дней предобработки пониженной температурой концентрация ИУК в пыльниках увеличивалась в 14 раз, а концентрация АЬК в 6 раз. Сходные изменения в сторону увеличения концентрации эндогенных фитогормонов наблюдалась у всех изученных сортов. Это свидетельствует о

Таблица 2

Содержание фитогормонов в пыльниках при воздействии низкими положительными температурами

Сорт Число дней Фитогормоны, нг/г

воздействия ПУК АБК

0 2,25 ±0,15 38,36+ 1,7

4 10,4+0,25 112,4 ± 1,2

Скала 6 25,4+0,30 158,6 ± 1,2

7 30,2 + 0,30 192,2 ± 1,3

8 28,4 ±0,35 187,2 ±1,5

С-29 0 2,25 ±0,13 55,96 ±0,9

7 4,47 + 0,20 70,9+1,0

Sonalika 0 8,02 + 0,12 88,7 ± 1,1

7 45,4 + 0,16 120,8 ±1,2

0 3,55 + 0,10 85,5 ± 0,9

Tr. Timoph 4 9,61 + 0,19 428,9 ± 1,8

6 7,63 ±0,15 538,5 ±2,1

8 13,6± 0,14 761,4 ±2,2

Московская 35 0 1,36 ±0,10 27,04 ± 0,6

7 2,24 ±0,14 95,9 ± 0,6

0 0,80 ±0,10 125,2 ± 1,1

Тг. Dirk Vrn 33 7 1,74 + 0,12 166,9 ± 1,2

8 2,24 + 0,14 170,6 ± 1,4

том, что холодовое воздействие является большим стрессом для микроспор и они "выпадают" в полость гнезда пыльника. В связи с этим, микроспоры "голодают". В то же время, возможности транскрипции в ядре в этот период также ограничены. Однако, происходит нечто удивительное: как видно из результатов наших исследований, в ответ на воздействие низкими положительными температурами, в пыльниках накапливается небольшое количество м-РНК. Пока происхождение ее не понятно: то ли она транскрибируется заново, то ли в цитоплазму поступает готовая м-РНК спорофита, как предполагает I. В1ктБ0п (1987). Вполне вероятно, что предположение это неверно, так как, по последним данным молекулярно-генетических исследований, время полужизни мРНК составляет всего 15-30 мин.

И появление спорофитной генетической информации в микроспорах, которые еще находятся, по всей видимости, в фазе в, клеточного цикла является решающей для дифференциации путей морфогенеза в культуре изолированных пыльников. Только те микроспоры, которые не прошли некую точку в фазе

клеточного цикла в момент срезания колосьев, могут развиться в многоклеточные образования эмбриоидоподобного типа, тогда как микроспоры, уже прошедшие эту точку, хотя и находятся в фазе Ор выполняют таметофитную программу развития.

В связи с этим, было интересно исследовать наличие транскриптов, дифференциально экспрессирующихся в пыльниках под влиянием пониженных температур. Поэтому, при изучении функциональной активности мРНК использовали метод дифференциального дисплея, состоящий из двух этапов: ревертазной реакции на основе полиА* мРНК и последующей полимеразной цепной реакции.

Различные варианты кДНК получали в ревертазной реакции на основе следующих Т-богатых якорных праймеров (табл.3). Использование Т-богатых якорных праймеров с динуклеотидным мотивом на 3'-конце необходимо для упрощения и сегрегации субпопуляций кДНК при синтезе цепей кДНК.

На сравниваемых матрицах кДНК была проведена полимеразная цепная реакции без Т-праймеров и с использованием комбинации четырех Т-богатых якорных праймеров с динуклеотидным мотивом на 3 - конце (в качестве 3 -праймеров) и 30 праймеров различной структуры с размером от 15 до 30 нуклеотидов (в качестве 5'- праймеров). Большая часть 5'- праймеров выбраны нами не случайно: некоторые из них составлены на основе нуклеотидных последовательностей, кодирующих ключевые белки клеточного цикла.

Амплнфицированные кДНК-варианты анализировали при помощи электрофореза в агарозном геле. Как показывают результаты эксперимента, основные компоненты амплификации накапливаются в диапазоне от 1700 п.н. и ниже. На рисунке 2 представлены электрофореграммы, полученные с использованием праймера Р-2 (на основе с<3с 25 протеиикиназы). В некоторых вариантах (треки 1,2- без Т25-праймера, треки 7,8 - с ТМС-праймером и треки 9, 10 - с ТМТ-праймером) хорошо видны отличия фрагментов амплификации кДНК. С праймером Р-3 (сс1с2 протеинкиназа) также было выявлено небольшое отличие в спектрах амплифицированных фрагментов кДНК (треки 1,2 - без Т-праймеров и треки 3, 4 - с ТМА-праймером).

Таблица 3

Т-богатые праимеры

N Якорные праймеры 5'—3' последовательность

1 Т25 Вю1т-125

2 ГМА ВЫш-йдс-срс-^-М-а

3 тмв Вюип^с-сеЫп-М-д

4 ГМС Вю^п-е^с-сзсЧр-М-с

5 ТМТ ВюПп^с-с.есЧр-М-!

Учитывая то обстоятельство, что четкие различия между контрольными и исследованными вариантами обнаружены с помощью праймеров, ответственных за синтез протеинкиназ клеточного цикла, выделенная нами мРНК является гранскриптом генов, специфически переключающих генетическую программу развития микроспор с гаметофитного на спорофитную.

Таким образом, из представленных результатов следует, что низкие положительные температуры индуцируют изменение функциональной активности м-РНК, результатом чего являются изменения как ориентации, так и конфигурации веретена деления, которые приводят к равному делению ядра микроспоры (рис. 3 а, б). В таких микроспорах подавляется экспрессия гаметофитной программы развития.

Цитологический мониторинг предобработки пыльников перед инокуляцией выявил появление клеток с двумя равными ядрами при разных положениях веретена деления по отношению к оси микроспоры: имелись равные ядра при перпендикулярном расположении оси деления ядра микроспоры относительно общей оси микроспоры (рис.3, б) и при другом, неперпендикулярном расположении взаимных осей (рис.3,а). При этом веретено деления микроспор равного митоза имеет конфигурацию зонта с совершенно одинаковыми сторонами. Направление осей веретена деления произвольное. Этот феномен может свидетельствовать о первичности появления спорофитной информации и независимости образования двух идентичных ядер от расположения осей деления и местонахождения ядра микроспоры: в центре или на периферии клетки. Как видно из приведенных микрофотографий, делящиеся ядра могут располагаться около поры микроспоры, в то же время, к равному делению приводит и деление ядра, расположенного в центре и на проксимальном конце клетки.

Те микроспоры, в цитоплазме которых появилась мРНК гаметофита или ядро которых миновало S фазу клеточного цикла до воздействия низкими температурами, продолжают реализацию гаметофитной программы развития, что приводит к неравным делениям ядра микроспоры (рис.3 в,г). Реализация программы гаметофитной генетической информации завершается вторым митотическим делением в пыльцевом зерне, при котором делится ядро генеративной клетки. Дальнейшее развитие таких микроспор зависит от состава питательных сред, но чаще всего, они развиваются по непрямому пути андрогенеза in vitro, результатом чего является каллусогенез.

Таким образом, равный гаплоидный митоз в микроспорах, зависит только от генетической информации о спорофитном пути развития, эксперессирующейся вследствие воздействия холода на постмейотическую микроспору, еще не приступившую к синтезу гаметофитной м-РНК.

Рис.3. Митотическое деление ядра микроспоры: а - конфигурация веретена деления раного митоза; б - спорофитное, равное деление ядра; в - конфигурация веретена неравного митоза; г - неравные ядра и клетки, х 500. 1 - генеративная клетка, 2 - вегетативная клетка.

Эндо-'и экзогенная регуляция андрогеиеза in vitro у яровой мягкой пшеницы

Чувствительность генотипов к 2,4-Д. Показано, что исследуемые генотипы по-разному реагируют на действие 2,4-Д. Самым чувствительным является сорт Sonalika, у которой стимулирующая рост доза 2,4-Д (СД равна 0,1 мг/л. Концентрация 2,4-Д способная ингибировать ростовые процессы (ИДда) для этого сорта равны 0,4 мг/л. На рисунке 4 приводятся также кривые доза-эффект для генотипа Московская 35, у которой соответствующие дозы равны 1,0 и 1,6 мг/л.

к я я

У-

X я

с. г 13

100

О 0,5

концентрация 2,4-Д мг/л

Рис.4. Кривые доза — эффект сортов: • - ЗопаНса, я - Московская-35.

Влияние концентрации 2,4-Д. При культивировании изолированных пыльников подбор оптимальных концентраций гормональных компонентов культуральной среды является ключевым этапом. Однако он носит случайный характер, т.е. исследователи проводят перебор широкого диапазона концентраций фитогормонов и их сочетаний друг с другом с целью найти наиболее удачную комбинацию фитогормонов для культивирования каждого генотипа.

Установлено, что 2,4-Д индуцирует образование различных морфогенетических структур в культуре изолированных пыльников: эмбриоидов и каллусов. Так, у сорта БопаНка на питательной среде, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,1 мг/л продуктивность эмбриоидогенеза достигала 151,8% по отношению к количеству инокулированных пыльников (табл.4). У сорта Скала на той же среде продуктивны 59,1% пыльников, а на среде с концентрацией ауксина 0,25 мг/л выход составил 41,67%, в то время, как на среде с содержанием 1,0 мг/л 2,4-Д - всего 11,1%. Для Линии 35 (Тша 66 х Кавказ) выход эмбриоидов был значительно выше на среде с содержанием 1,0 мг/л 2,4-Д (71,67%), чем на среде с концентрацией 0,25 мг/л (14%).

Таким образом, у всех исследованных сортов, кроме Линии 35, при концентрации 2,4-Д, в питательной среде, равной 1,5 и 2,0 мг/л интенсивность каллусогенеза выше интенсивности эмбриоидогенеза.

Культивировали также изолированные пыльники гибридных форм второго поколения. Оказалось, что почти все они проявляют отзывчивость к культуральным средам, соответственно той концентрации 2,4-Д, при которой наиболее отзывчива материнская форма. Такая тенденция сохраняется в этой

Таблица 4

Влияние концентрации 2,4-Д на морфогенез в культуре изолированных пыльников

Генотип Андрогенез (%) при концентрации 2,4-Д (мг/л)

0 1 0,25 0,5 1,0 1,5 2, 0

э К Э К Э К Э К Э К Э к

Sonalika 151, 8 0 82, 8 5, 8 39, 2 11,4 6,2 43,0 0 32,3 0 20,5

Скала 59,1 0 41,6 0 28,1 14, 0 11,1 16,1 0,8 19,3 0 11,1

Саратовская 29 0 0 0,5 0 14,3 0 2,12 1 2,2 16,8 0 12, 1

Линия 35 0 0 14,2 0 24,5 0 76,1 0 19, 1 13,8 0, 4 28,3

Башкирская 4 0 0 12,7 0 5, 8 4,2 8, 6 3,2 4,2 8,7 0, 5 2,8

Московска я 35 0 0 0 0 2, 4 1,2 12,5 1,7 3,1 8, 6 0 12, 6

Naiach 24,2 16,2 1,4 7,4 15,3 2,1 14,7 0 15, 7

Э - эмбриоид, К - каллус

серии эксперименту всех гибридных форм (рнс.5). Например, если материнской формой является сорт Sonalika, продуктивность эмбриоидогенеза которой выше на питательной среде с низкой (0,25 мг/л) концентрацией 2,4-Д, то и гибридные формы более отзывчивы на этой же питательной среде.

У реципрокных гибридных комбинаций между сортами Sonalika и Жница в обоих направлениях скрещивания микроспоры оказались отзывчивыми и на питательной среде с более высокой концентрацией 2,4-Д. Такое же явление на&подается и у гибридной комбинации Sonalika х Московская 35.

Что касается комбинации скрещивания между сортами Najach и Sonalika, то это единственная гибридная форма, превысившая по продуктивности эмбриоидогенеза лучшую родительскую форму Najach.

Концентрация эндогенных фнтогормонов в пыльниках. Исследователи давно пришли к мысли о необходимости учета уровня эндогенных фитогормонов в экспланте при культивировании (Wheeler, 1972). Но с тех пор эта мысль оставалась на уровне констатации по ряду причин:

- во-первых, существуют методические трудности количественного определения фитогормонов. Имеющиеся методы определения фитогормонов очень трудоемки и требуют больших навесок используемого материала.

- во-вторых, сложность изучения гормональной регуляции морфогенеза связана также с интегральным характером морфогенетических процессов, их зависимостью от многих внешних и внутренних процессов (Бутенко, 1984).

Перспективы преодоления перечисленных методических ограничений

Рис. 5. Влияние 2.4-Д на продуктивность эмбриоидогенеза у яровой мягкой пшеницы: 1 - БопаШса, 2 - Жница, 3 - БопаИка х Жница, 4 - Жница х БопаИка, 5 - Московская -35,6 - Московская 35 х БопаИка, 7 - ЯопаНка х Московская 35, 8 - Najach, 9 - ^асЬ х Московская 35, 10 - ^'асЬ х ЭопаПка

открывает использование метода твердофазного иммуноанализа, который повышает точность экспериментов за счет высокой специфичности отношений антител к фитогормонам (Кудоярова и др., 1986).

С помощью твердофазного иммуноферментного анализа фитогормонов изучаемый набор генотипов пшеницы исследован на содержание АБК и ИУК в пыльниках на разных фазах микроспорогенеза. Установлено, что объекты значительно различаются по концентрации эндогенных фитогормонов, особенно, в фазе поздней микроспоры. Сорта и линии яровой мягкой пшеницы расположены в таблице 5 в порядке убывания количества эндогенных фитогормонов. В том же порядке происходит смена соотношения интенсивности эмбриоидогенеза в пользу среды, содержащей 2,4-Д в количестве 1,0 мг/л. Следовательно, чем выше содержание эндогенных фитогормонов, тем меньшая концентрация экзогенного ауксина необходима для того, чтобы направить микроспоры по спорофитному пути развития. Так, у сортов 8отаНса, Скала, Башкирская 4 и Симбирка частота образования эмбриоидных структур выше на среде, содержащей 0,25 мг/л 2,4-Д чем на среде с содержанием ауксина 1,0 мг/л.

Сорта, расположенные до Тг. йторЬее-и, отличаются высоким содержанием эндогенных фитогормонов. Тг. йтор11ееУ1 включена в анализ как родительская форма Гибрида 21 и Линии 3 8. Эндогенное содержание фитогормонов у Гибрида 21 промежуточное между родительскими формами (Скала и Тг.йтор1гееуГ).

Сравнительное сопоставление экспериментальных данных, приведенных в таблицах 4,5 и рисунке 4 показало, что сорта яровой мягкой пшеницы (Sonalika, Скала), характеризующиеся высоким содержанием эндогенной ИУК и АБК, оказались более чувствительными к 2,4-Д и нуждались в небольшой концентрации 2,4-Д в среде, тогда как сорта с низким уровнем АБК и ИУК (Линия 35, Саратовская 29), напротив, требовали большие количества этого экзогенного гормона. Этот вывод подтвержден цитологическим мониторингом процесса андрогенеза in vitro у различных генотипов пшеницы при воздействии различных концентраций 2,4-Д (рис.6-9). Так, воздействие на пыльники, содержащие много ИУК и АБК, высокой концентрацией 2,4-Д (1,5-2 мг/л) вызывает усиленную пролиферацию микроспор, а затем - каллусогенез. В микроспорах этих же сортов, инокулированных на среды с низким (0,1-0,25 мг/л) содержанием 2,4-Д наблюдается множество митотических делений, ведущих к формированию сначала многоклеточных структур, а затем - эмбриоидов.

Таблица 5

Зависимость продуктивности эмбриоидогенеза от уровня эндогенной ИУК в пыльниках

Эмбриоидогенез (%),

Сорт Количество, нг/г концентрация 2,4-Д (мг/л)

ИУК АБК 0,25 1,0

Sonalika 502,4 + 6,4** 483,2+3,8** 82,8 6,2

Скала 401,2 + 2,2** 187,3+2,6** 41,6 21,1

Башкирская 4 282,9+3,9** 134,2+4,1** 12,7 8,6

Симбирка 248,6 + 3,9** 128,4+3,1** 10,8 0,4

Najach 174,1+2,4 117,5+2,7 31,4 12, 5

Tr. Timopheevi 202,2+1,4* 107,5+3,4** 14, 8 4,1

Линия 35 104,4 + 1,2* 90,5+3,4* 14, 0 71, 7

Гибрид 21 93,6 + 2,8* 157,6+2,8** 9,5 11,9

Московская 35 71,1 + 1,3 30,1+3,2 9,8 12,4

std

Tr. Dirk., VRN 63,5 + 1,2 54,8+1,9 18,5 56,8

Жница 62,9 + 1,5 78,2+1,8* 1,6 3, 8

Ершовская 32 61,7 + 1,1 71,7+2,8 0,49 1,6

Саратовская 29 43,8 + 1,4 111,4+2,8** 0, 5 2, 12

Пиния 38 31,2 + 2,3** 97,4+3,5* 0 0

Башкирская 9 21,9 + 3,1** 58,4+1,8 4,5 13, 0

* - значимо на 5% уровне; ** - значимо на 1% уровне.

Таким образом, нами впервые разработан метод оптимизации сред при помощи иммуноферментного анализа. Он является прямым методом, а метод выявления стимулирующих доз - косвенным. Оба эти метода хорошо дополняют друг друга и для большей достоверности лучше использовать оба метода в совокупности. Но в то же время, информации, полученной отдельно в каждом случае, вполне достаточно для индивидуального подбора оптимальных условий для эмбриоидогенеза в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы у различных генотипов.

Корреляция, рассчитанная по результатам, приведенным в таблице 5 показала, что у сортов, характеризующихся высоким уровнем эндогенных АБК и ИУК, оптимальной для индукции андрогенеза in vitro оказалась среда с меньшим содержанием 2,4-Д. И наоборот, сортам с низким уровнем эндогенных гормонов необходима питательная среда с высоким содержанием 2,4-Д. Так, если в экспланте высокое содержание ИУК, то в питательную среду необходимо добавлять меньше 2,4-Д (ИУК/экдогенная - 2,4-Д/экзогенная, г = - 0,83). Такая же тенденция взаимоотношений наблюдается между концентрацией эндогенной АБК и величиной экзогенной инъекции 2,4-Д в питательную среду (АБК/ эндогенная - 2,4-Д/экзогенная, г = - 0,77).

Влияние форм азота на морфогенез. Известно, что присутствие всех форм азота в питательной среде при выращивании растений в водной культуре стимулирует синтез и накопление в корнях цитокининов. В литературе имеются данные о том, что гормональная система растений может оказывать влияние на обмен азота в растениях. Так, показано (Кузнецов и др., 1986), что экзогенная обработка растений синтетическим цитокинином б-бензиламинопурином индуцирует синтез в них нитратредуктазы. С другой стороны, известно, что присутствие всех форм азота в питательной среде, стимулирует синтез" и накопление цитокининов (Любарская и др., 1982). Нами проведено исследование чувствительности сортов яровой мягкой пшеницы к различным формам азота как в условиях водной культуры, так и in vitro. При выращивании растений различных генотипов показано, что они значительно' различаются по способности реагировать на аммонийный и нитратный формы азота, что выражается в различной способности накапливать или синтезировать цитокинины и АБК в корнях и надземной части.

Пыльники растений этих сортов, выращенных в полевых условиях, культивировались по следующей методике:1) контороль - на обычной питательной среде Potato П; 2) на среде Potato II с заменой всех нитратных солей на аммонийные; 3) на среде Potato П с заменой всех аммонийных солей на нитратные. Все другие компоненты сохранены одинаковыми во всех вариантах эксперимента. Так, рН оставалась на уровне 5,7, а концентрация 2,4-Д - 0,25 мг в литре питательного раствора.

Как видно из данных таблицы 6, у большинства сортов яровой мягкой пшеницы эмбриоидогенез более продуктивен на среде, в которой аммонийные соли заменены на нитратные формы. У этих сортов продуктивность эмбриоидогенеза на стандартной среде Potato П ниже, чем на среде с нитратной формой, но выше, чем на аммонийной форме. Культивирование пыльников сорта Скала успешнее на стандартной среде. Особая реакция у пыльников сорта Najach, которые проявили большую отзывчивость при инокуляции пыльников на питательную среду Potato II с аммонийными солями.

Таблица 6

Эмбриоидогенез (%) в культуре изолированных пыльниковна питательных средах с разной формой азота

Эмбриоидогенез при 0,25 мг/л 2,4-Д

Сорт Potato II Potato II Potato II

(NH/) (N0.0

Sonalika 3,01 0,8 4,55*

Жница 2,7 1,7 12.5

Московская 35- std 1,2 1,5 11,1

М-35 х Sonalika 5,26* 3,2* 8,6

Sonalika х М-35 7,41* 2,8 9,4

Саратовская 29 3,19 1,54 9,02

Скала 8,7* 2,82 3,45*

Najach 5,1 23,08** 5,19

* - значимо на 5% уровне; ** - значимо на 1% уровне.

Реципрокные гибридные комбинации между сортами М-35 и Sonalika на стандартной и аммонийной среде превышали показатели обеих родительских форм.

Разработчики искусственной питательной среды Potato П (Chuang, Quang, 1978) значительно уменьшили концентрацию аммонийного азота, что не всегда способствует инициации эмбриоидогенеза увеличению морфогенеза. Поэтому, нами модифицирована эта среда, включением нитрата аммония в концентрации 1000 мг/л. Культивирование изолировнных пыльников на ней среде повысило продуктивность морфогенного каллусогенеза.

На самом деле, регуляция морфогенных процессов в культуре изолированных пылышков за счет компонентов питательной среды значительно сложнее, чем сказано выше. При исследовании изменчивости градиентов концентрации эндогенных фитогормонов в длительно, в течение 21 дня, культивируемых пыльниках и динамики изменения концентрации гормонов в питательной среде, происходящей синхронно, локазывано наличие перемежающихся "вода" увеличения и уменьшения концентрации гормонов как

в пыльниках, так и в питательной среде (Гобунова, 1993). В диссертации приводятся результаты этого исследования и обращается внимание на следующее обстоятельство: эксгшанты с высоким уровнем эндогенных ИУК и АБК способны саморегулировать морфогенные процессы даже при отсутствии экзогенных стимуляторов.

В табл1ще7 приводятся данные, конкретизирующие вышеприведенные результаты, в которой все характеристики подвергались стандартному многофакторному дисперсионному анализу. Результаты показали, что во всех случаях главным фактором, влияющим на продуктивность прямого андрогенеза in vitro, является генотип исследуемых растений и предобработка пыльников перед инокулировашгем. Содержательным смыслом понятия "генотип" в данном случае является концентрация эндогенных фитогормонов.

Значительный вклад вносят такие сочетания факторов, как "генотшт-фаза развития мтсроспор" и "фаза-предобработка". Наиболее существенное влияние оказывает также консистенция питательной среды. В этом эксперименте по каждому источнику варьирования выбирались не менее трех градаций признака, кроме "предобработки", по которой были только две градации: с предварительной холодовой обработкой перед инокуляцией пыльников и без нее.

Морфогенез в культуре изолированных пыльников

При культивирования изолтгрованньгх пыльников пшеницы отмечены два пути морфогенеза: эмбриоидо- и каллусогенез, которые связаны с формированием двух типов морфогенных структур - эмбриондов и каллусов. Первый путь определен как прямой, а второй - непрямой, поскольку связан с трудоемким процессом множественных пересадок образовавшихся структур на различные питательные среды с целью получения растений-регенерантов.

Светооптнчеекие н ультраструктурные особенности строения клеток эмбрнонда. Пыльники различных генотипов инокулировали на питательные среды с учетом индивидуальных, особенностей эксплантов. Например, при культивировании пыльников сорта Sonalika использовали искусственную питательную среду с концентрацией 2,4-Д, равной 0,1 мг/л. Оказалось, что в первые же часы культивирования появляются двуядерные и двуклеточные образования (рис.ба), затем - четырехклеточные структуры (рис.66). На 7 сутки культивирования в гнездах пыльников наблюдается появление многоклеточных структур (МКС), располагающихся в пределах неповрежденной оболочки морфогенной микроспорц (рис.бв, 76). Этот этап образования МКС является одним из основных этапов морфогенеза в культуре изолированных пыльников по пути эмбриоидогенеза. Клетки этих структур характеризуются нами как меристематические, поскольку имеют крупные ядра и тонкие клеточные стенки.

МКС, разрывая оболочку микроспоры через 25-30 дней культивирования

Таблица 7

Дисперсионный анализ влияния генотипа и внешних факторов на продуктивность эмбриоидогенеза (в %) при различной температуре культивирования

Источник варьирования Число степеней свободы ((11) Средние квадраты (тБ)

28 °С 32 °С

Генотип (Г) 9 29,65* 7,90*

Среда (С) 14 0,9 9,5*

Фаза развития микроспоры (Ф) 2 112* 114*

Консистенция среды (К) 2 14,25* 11,9*

Предобработка (П) 1 179* 4,4*

Г х С 125 1,79* 0,76

Г х Ф 17 10,2* 9,8*

ГхК 17 0,62 1,2

Г х П 9 1,60 0,7

С х Ф 27 1,4 1,8

С х К 27 9,48 3,01

СхП 13 0,91 3,7

ФхК 3 0,9 2,3

ФхП 1 118* 121*

КхП 1 3,51 2,8

Случайная изменчивость 267 15,5 0,6

* - значимо на 5% уровне.

появляется на поверхности пыльника (рис.бг). По морфологическим показателям эмбриоид, полученный в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы - это белая матовая структура шаровидной или булавовидной формы, нередко с «ножкой» (рис. 6д). Светооптический гистологический анализ эмбриоида (27 дней культивирования) пшеницы свидетельствует о наличии в составе этой структуры массы однородных меристематических клеток с крупными ядрами, расположенными в центре клетки и небольшим количеством цитоплазмы (рис.бв, 7а,б). Поверхность эмбриовда яровой мягкой пшеницы на поздней стадии развития по данным СЭМ, представляет собой комплекс плотно упакованных клеток с четкими границами (рис. 6д). Клетки полусферической формы, они значительно мельче, достаточно однородны по своей морфологии и не сморщены, в отлнчие от клеток каллуса (рис. 8,9).

Проведенные нами электронно-микроскопические исследования клеток эмбриоида пшеницы (рис. 7в) подтверждают, что это клетки слегка вытянутой

Г"

Рнс. 6. Прямой андрогенез in vitro: а -двуктеточная структура, х250; б четырехклеточиое образование, хЮО ; в - многоклеточная структура, х120; г - эмбриоид на пыльнике, хЗО; д - эмбриоид, СЭМ, х 130; е - эмбриоиды в пробирке, П - пыльцевые зерна.

или округлой формы, прилегающие друг к другу. Цитоплазма электроноплотная, включает большое количество полирибосом, что свидетельствует о повышенной синтетической активности клетки. С другой стороны, клетки функционально независимы друг от друга. Многочисленные рибосомы связаны также с наружной мембраной ядерной оболочки. Ядра крупные, занимают центральное положение, объем их по отношению к объему клетки составляет примерно третью часть. Глыбки конденсированного хроматина равномерно распределены по всему ядру, ядерная оболочка нередко имеет инвагинации, что увеличивает площадь контактов ядра и цитоплазмы. Это состояние ядра говорит о синтетической активности клеток. Как признак готовности клеток к делению можно рассматривать наличие многочисленных пор в ядерной оболочке, возрастание ее контактов с конденсированным хроматином, поскольку с функционированием примембраннош хроматина связывают инициацию репликации, а в некоторых случаях и транскрипцию ДНК (Ченцов, 1984). В некоторых клетках этого эмбриоида можно наблюдать ядрышко, находящееся в центре ядра. Вблизи ядрышка выявляются свободные ог хроматина светлые зоны. Такое сочетание хорошо оформленного ядрышка при сильно инвагинизированной оболочке ядра говорит о том, что клетка способна активно делиться (Ченцов, 1984).

По периферии клетки и возле ядра можно наблюдать большое количество глобул липидной природы, расположенных в основном вдоль клеточной мембраны. Между осмиофильными глобулами находится агранулярный эндоплазматический ретикулум, появление которого можно связать с активным синтезом липидов в растущей и делящейся клетке.

Клетки эмбриоида содержат небольшое количество митохондрий, которые практически принадлежат новой генерации митохондрий, и обычной гетерогенности между ними не наблюдается. Форма их округлая, кристы неразвиты. Необходимо также отметить наличие амилопластов, располагающихся группами. Они имеют булавовидную или округлую форму и содержат крупные светлые зерна крахмала, что также свидетельствует о синтетической активности клеток эмбриоида. Тилакоиды отсутствуют.

Эмбриоды прорастают в дальнейшем в растения, пройдя через множество ступеней органогенеза (рис.7е).

Светооптические и ультраструктурные особенности строения клеток каллуса, Каллусы, образующиеся в культуре изолированных пыльников морфологически разнообразны. Отчетливо различаются два типа этих структур: компактные, узловатые, белого цвета (рис. 8а) и мягкие, рыхлые, водянистые каллусы (рис. 9), причем только каллусы первого типа способны к регенерации растений.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что каллусы появляются позднее эмбриоидов (на 30-45 сутки от начала культивирования

Рис. 7. Цитологический анализ поперечных срезов эмбриондов: а - эмбриоид в полоста гнезда, х250, б - сердцевидная форма эмбриоида в полости гнезда, х250, в, г - фрагменты клеток эмбриовда, ТЭМ х10500, д - дифференциация тканей, х350, е - продольный срез через почку, х250. Я - ядро, ЯЯ - ядрьпнко, ЯО - ядерная оболочка, А - амилопласт, Л - липидные включения, КО - клеточная оболочка, К - крахмальные зерна, МК - межклетник, М - митохондрия, ПС -полисома.

пыльников). Однако у сортов с высоким уровнем эндогенных фитогормонов в пыльнике, каллусогенез инициируется уже при концентрации 2,4-Д, равной 0,5 мг/л в первые дни культивирования.

Нужно отметить, что у сортов с высоким эндогенным уровнем фитогормонов каллусы, образовавшиеся на питательной среде с концентрацией 2,4-Д от 0,25 до 0,5 мг/л, были морфогенными и обладали регенерационной способностью. Каллусы же, индуцированные при концентрации 1,5 - 2,0 мг/л, имели рыхлую и водянистую консистенцию и были не способны к регенерации растений (рис.9,а). Визуальная оценка формы морфогенного каллуса показывает, что она сплюснута и вытянута по длинной оси (рис.8а). Светооптический анализ этих образований выявил коренные различия в структурах эмбриоидов и каллусов. Клетки каллуса, в отличие от клеток эмбриоида, имеют неправильную форму. В строении этой структуры можно выделить две клеточные зоны -центральную и периферическую. Клетки каждой из этих зон различаются по морфологическим показателям - размеру, форме и степени окрашиваемости. Часть этих клеток мы рассматриваем как меристематические(рис.8б,в - М).

Рис. 8. Цитологическая характеристика морфогенного каллуса: а - каллус, СЭМ, х200, б,в - поперечный срез, х250, г - вторичные эмбриоиды на морфогенном каллусе, СЭМ, х86. ЦЗ - центральная зона, ПЗ - периферическая зона, Т - трубки.

Морфологическая вариабельность клеток морфогенного каллуса связана с генетической и морфологической неоднородностью клеток, потенциальные возможности которых реализуются различными путями: гистогенез (рис.8б,в), органогенез и эмбриоидогенез (рис.8г). В данном случае, речь идет о так называемых "вторичных" эмбриовдах (Шамров и др., 1988), которые, чаще всего, образуются на первичных каллусах при небольших концентрациях экзогенного гормона 2,4-Д.

Исследование поверхности неморфогенного каллуса яровой мягкой пшеницы сорта БопаНка с помощью СЭМ показало, что на поздней стадии развития (30 сут культивирования) он представляет собой структуру средней плотности, достаточно гомогенного состава. Характерна сморщенность поверхности этого новообразования, что особенно наглядно видно при большем увеличении объекта (рис. 96,в).

Отличительной чертой неморфогенной каллусной ткани является ее рыхлость, обусловленная наличием гипертрофированных межклетников (рис.9д). Тем не менее, при анализе каллусной ткани мы выделили две зоны клеток. Если рассматривать морфологию составляющих клеток, то видно, что по периферии каллуса расположены крупные, слабоокрашенные клетки, ядерный материал в них почти не представлен. Клетки расположены очень рыхло, создавая тем самым водянистую текстуру поверхности каллуса (рис. 9а,г).

Ультраструктурные исследования клеток неморфогенного каллуса пшеницы свидетельствуют о следующем: цитоплазма насыщена органеллами, электронопрозрачна, включает в себя отдельные свободные рибосомы, которые редко агрегируются в полирибосомные комплексы. Множество митохондрий распределено по всей клетке. Строение их сложное, кристы везикулярного типа заполняют весь матрикс (рис. 9д).

Отличительной чертой клеток немофогенного каллуса является также и наблюдаемый в них автолиз. Начало процесса автолиза в лизосомоподобной структуре можно распознать митохондрии с сохранившейся разбухшей мембраной. Рядом с ней видна полуразрушенная митохондрия (рис. 9е).

На всех этапах культивирования мы регистрировали наличие множества погибших микроспор, находящихся и в пыльнике (рис.6 б), и на морфогенных структурах (рис.9б): видны оболочки дегенерировавших микроспор.

Кроне вышеописанных особенностей морфогенеза в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы мы наблюдали нехарактерные события, возникающие в процессе культивирования. Так, при исследовании андрогениых каллусов методом сканирующей электронной микроскопии нами был обнаружен интересный случай образования пыльцевых трубок (рис.8г,9б), о чем ссылок в литературе мы не встретили.

Интересен вопрос о том, каков способ формирования пыльцевых трубок

Рис. 9. Цитологическая характеристика неморфогенного каллуса: а -внешний вид, хЗО, б- внешний вид, СЭМ, х86, в - поверхность неморфогенного каллуса, СЭМ, хЗОО, г-поперечный срез, х150, д - фрагмент клетки, ТЭМ, хЮООО, е - автолиз в клетках, ТЭМ, х15000. ЦЗ - центральная зона, ПЗ - периферическая зона, Т - трубки, МК - межклетник, М - митохондрии Л - лизосомоподобное образование.

среди клеток андрогенного каллуса пшеницы. На наш взгляд, каллус, берущий начало от морфогенной микроспоры, в ходе своего раннего развития внутри гнезда пыльника среди множества других микроспор, «захватывает» часть микроспор в свою структуру и выносит с собой на поверхность пыльника. Внутри каллуса создаются физиологические условия для развития этих микроспор до зрелых пыльцевых зерен и прорастания их в пыльцевые трубки, так как появляются предпосылки для активации ядер пыльцевых зерен. Часть «захваченных» микроспор останавливается на стадии двукпеточного пыльцевого зерна, часть - дегенерирует.

Таким образом, при андрогенезе in vitro у яровой мягкой пшеницы, на путь морфогенеза вступает лишь малая часть популяции микроспор, подавляющая масса микроспор при культивировании либо дегенерирует; либо продолжает свое развитие по гаметофитному пути до зрелого пыльцевого зерна с последующим прорастанием в пыльцевые трубки.

Генетическая изменчивость при андрогенезе in vitro у яровой мягкой пшеницы. Показано, что на характер генетической изменчивости в культуре тканей влияет как концентрация гормонов в питательной среде, так и длительность экспозиции (Шашша, 1981). Зачастую считается, что вследствие этого происходят необратимые измененпя генома культивируемой клетки (Щамина,1981; Кунах и др.1985). Они выражаются в изменении плоидности (Ни,1986), мутациях генов (Ананьев и др., 1986; Гостимский, 1987-2000).

Геномные мутации, наряду с другими формами генетической изменчивости, играют большую роль в расширении генетической изменчивости вида. Использование таких мутантов не только в генетическом анализе и изучении наследования признаков, но и в лрактичесокй работе значительно расширяет арсенал методов исследователя. Имеется возможность регулирования частоты геномных мутаций и в культуре изолированных пыльников и она зависит от целей экспериментальных работ. Преимущество гаплоидных культур в том, что при днплоидизации гаплоидных растений образуются автоплоидные регенеранты, позволяющие гомозиготизировать любые, даже рецессивные мутации. В случае появления анеугагоидной гаплоидной особи, при удвоении генома мы имеем, в результате, нуллисомик по определенной хромосоме.

Анализ плоидности морфогенных структур в культуре изолированных пыльников затрудняется тем, что необходимо подбирать специфические условия для отбора проб, чтобы не нарушать целостности структуры. Используя методы суспензнроваши и мацерации клеток исследовали шгандность эмбриоидов, морфогенных и неморфогенны каллусов. Оказалось, что все новообразования гаплоидной природы, го есть, ни клетки стенки гнезда пыльника, ни связника, ни тычиночной нити не участвовали в морфогенетических процессах.

Результаты исследования показывают, что при культивировании

изолированных пыльников сорта БопаИка на среде, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,1 мг/л большинство образовавшихся структур - гаплоидные эмбриоиды, имеющие 21 хромосому в исследованных клетках. Наличие одного гаплоидного анеуплоида при колхицинировашш не проявилось. Все удвоенные растения имели нормальный набор хромосом (табл.8).

Таблица 8

Геномная изменчивость при различных концентрациях 2,4-Д у сорта ЗопаНка

Количество

2,4-Д, Морфогенных структур Регенерантов

мг/л N п-1 п-2 другие 2п (42) 2п-2 (40)

0,1 49 1 0 0 50 0

0,25 43 4 0 3 43 1

0,5 37* 4 2 6 37 1

1 15** 15** 8* 12 15 7

1,5 0 24** 7* 19 0 0

2 0 0 0 50** 0 0

* - значимо на 5% уровне; ** - значимо на 1% уровне.

При повышении концентрации 2,4-Д в индукционной среде достоверно увеличивается число морфогенных структур с нерегулярным набором хромосом, чаще всего - с анеуплоидным. В этих структурах возрастает и часота "других" нарушений, что выражается в слипании хромосом, безъядерности клетки и т.д. Такие новообразования неморфогенны и не способны к регенерации растений.

Особый интерес представляет изучение генетической изменчивости у "вторичных" эмбриоидов и полиэмбриоидов. При тщательном анализе регенерантов оказалось, что полиэмбриоиды и "вторичные" эмбриоиды раличаются по происхождению, хотя внешне их трудно различить. Полиэмбриоиды могут образоваться слипанием нескольких эмбриоидов и дальнейшим их разрастанием. "Вторичные" же эмбриоиды чаще всего, появляются на участках морфогенного каллуса. И в том, и в другом случае, они производят при регенерации растений потомство, не стабильное и по морфологическим признакам, и по числу хромосом в клетках. В первом случае это выражается в фенотипических различиях растений, так как произошли от микроспор с разным набором генов, а во втором - могут появиться и нуллисомики, и альбиносы. Поэтому, при генетическом анализе потомства растения-регенеранта основным правилом является индивидуальное исследование популяции зерен с каждого колоса. В противном случае, создается впечатление о расщеплении потомства андрокшшного удвоенного гаплоидного растения.

Регенерационная способность генотипов яровой мягкой пшеницы в культуре изолированных пыльников

Как известно, лимитирующим фактором развития технологии культивирования изолированных пыльников является низкая регенерационная способность генотипов яровой мягкой пшеницы.

На рисунке 10 представлены данные о регенерационной способности различных генотипов. Из всех исследованных генотипов наибольшей отзывчивостью обладали гибридные формы с участием сортов БопаИка и Жница.

Линия Фотос - это андроклинная дигаплоидная форма, выделенная из гибридной комбинации между сортами Жница и Московская 35. Она обладает уникальной продуктивностью эмбриоидогенеза. По всем другим показателям (урожайность, скороспелость и содержание бежа) она превосходит не только родительские формы, но и стандартный сорт по нашей зоне. Эта линия проходит

Генотипы

Рис. 10. Продуктивность морфогенеза у различных генотипов: | [- эмбриоиды, регенераты. 1-Соналика, 2-Соналиках Симбирка, З-Симбирка, 4- Сонора 64, 5-Сонора 64 х Симбирка, 6-Соналика х Фотос, 7-Соналика х Шафран, 8-Шафран, 9- Шафран х Соналика, 10-Фотос х Соналика, 11-Фотос, 12-Сонора 64 х Фотос.

в настоящее время Государственные сортоиспытания. Данные, приведенные на рисунке 10 показывают также, что гибридные формы с участием Фотоса имеют и высокую продуктивность эмбриоидогенеза.

В начале наших работ по культивированию изолированных пыльников не было никакого ориентира относительно состава питательных сред, адекватных для регенерации растений, кроме указания на определенные концентрации микро - и макросолей, и поэтому поиск причин низкой регенерационной способности генотипов привели нас к изучению концентрации эндогенных фитогормонов в эмбриоидах у различных сортов. Полученные результаты показали, что у наиболее продуктивных генотипов то признаку "регенерационная способность" регистрируется и высокий уровень всех эндогенных фитогормонов в эмбриоидах (табл.9). В то же время, наблюдается тенденция к уменьшению продуктивности регенерации растений у сортов, имеющих высокий суммарный пул эндогенных фитогормонов при высокой (1 мг/л) концентрации кинетина в питательной среде, и наоборот, сорта, которые характеризуются низким пулом эндогенных фитогормонов, тяготеют больше к среде с высоким содержанием кинетина. С другой стороны, суммарный выход растений регенератов у сортов с высоким эндогенным уровнем АБК больше, чем у тех сортов, которые накапливают мало эндогенной АБК.

Таблица 9

Концентрация эндогенных фитогормонов в эмбриоидах.

Генотип Уровень эндогенных фитогормонов, нг/г Регенерационная способность (%), при концентрации кинетина в среде (мг/л)

цитокинины ИУК АБК 0,5 1,0

Sonalika 389 + 5 584 + 6 1338 + 3 52,4 25,4

Скала 378 + 4 424 + 5 1528 + 4 53,2 16,8

Жница 284 + 2 440 + 4 764 + 3 31,4 36,8

Московская35 198 + 4 84 + 6 580 + 4 12,3 14,2

Najach 292 + 3 286+2 720 + 3 25,6 11,4

Селекционно-генетическая оценка андроклинных дигаплоидных линий яровой мягкой пшеницы

При использовании описанной выше технологии андрогенеза in vitro, при участи пяти человек, мы ежегодно получали более 1100 андроклинных удвоенных гаплоидных растений. В это число не включены регенеранты-альбиносы, моносомные растения и стерильные гаплоидные растения, устойчивые к удвоению через колхицинирование. Такие растения неизбежно появляются при любых экспериментах.

Ежегодно проводятся испытания полученных АДГ-линий в различных экологических условиях. Наиболее продуктивные дигаплоидкые гибридные линии, отличающиеся скороспелостью, засухоустойчивостью и с хорошим каччеством белка используются в качестве исходного материала в НПО «Башкирское» (ОПХ Чишминское). Часть линий проходят конкурсное и Государственное сортоиспытание.

При изучении удвоенных гаплоидных линий, полученных методом андрогенеза in vitro го районированных сортов, установлено следующее:

а) между чистыми линиями исходных и удвоенных гаплоидных форм не наблкадается фенотипических различий;

б) 11спользова1 п ie метода повтор; ют клльп т ироваш w линий, полученных из чистых линий сортов: Саратовская 29-АДГ-1, Саратовская 29-АДГ-2, Sonalika-АДГ-1, Somlika-АДГ-2 не приводит к увеличению частоты андрокгаппш по сравнению с исходными формами. При скрещивании их с другими генотипами мы не нашподали повышения ни продуктивности морфогенеза in vitro, ни регенерационной способности генотипов гибридных форм. Исследована доля влияния генотипа на некоторые хозяйственно-важные признаки у яровой мягкой пшеницы. Показано, что характеристики изученных признаков "продуктивная кустистость", "содержание белка" и " масса зерна с штоса" в большей степени зависят от изменяющихся условий года воспроизводства, чем от особенностей генотипов, холя влияние последних достоверны и значимы. В то же время, показатели кшичества и качества производимого белка изученными сортами в большей степени зависят от особенностей геногипо.

АДГ линии и популяция F5, отобранные по методу ОСП (одно семя с растения на потомство, Крупное и соавг., 1983), в некоторых случаях различаются существенно. Например, АДГ линия, полученная из кобшшащш скрещивания между сортами Жница х Московская 35 превышает показатели другой линии, оторашой по методу ОСП по всем изученным признакам. Однако если большинство гибридных форм идошпвфуют над показателями обоих родительских компонентов скрещивания, то только некоторые линии (Жницах М-35, М-35 х АС-29, М-35 х С-52) могут конкурировать со стандартом по основным показателям структуры урожая (Горбунова, 1997).

Андроклинные дигаплоидные гибридные формы (табл.10) имели значзгтельные преимущества перед сортом Московская 35 по д лине колоса (Жница х Sonalika, Московская 35 х Sonalika), по числу зерен в колосе (Жницах Московская 35 и Жница х Sonalika). По массе зерен с колоса незначотеельное превышение показателен стандарта имели те же сорта. Масса 10ОО зерен у трех гибридных комбинаций (Жница х Московская 35, Московская 35 х Sonalika, Московская 35 х Саратовская 52, Московская 35 х Саратовская 29). В то же время, имело место и проявление значительного отрицательного гетерозисного эффекта у АДГ (Симбирка х Московская 35, Саратовская 29 х Sonora 64).

Таблица 10

Степень фенотипического доминирования (Ир) по элементам продуктивности у андроклинных дигаплоидных гибридных линий над родительскими формами (Р) и стандартом (Б!)

Линия Число зерен в колосе Масса

зерен в колосе 1000 зерен

кР к 81 кР кБ1 КР

ЖницахМ-35 +3,9 +0,3 +0,7 +0,2 +24,8 +19,4

М-35 х АС-29 +1,2 +1,3 +0,25 +0,2 +4,4 +2,2

М-35 х 8опа1 -0,5 -12,8 +0,29 -0,3 +16,6 +11,5

Жница х 8опа1 +14,1 -5,4 +0,9 -0,2 +10,8 +0,9

С-29 х 8оп-64 -5,5 -5,4 -0,05 -0,6 -1,6 -9,4

Симб х М-35 +1,7 -1,2 +0,1 -0,06 0 -0,4

М-35 х С-52 -1,5 -1,3 +0,15 +0,1 +7,4 +4,0

Очевидно, что при культивировании пыльников растений Р, мы сталкиваемся с разнокачественностью гамет, обусловленной расщеплением, произошедшим в мейозе, фактически уже в Рг Поэтому неизбежно вьпцепление гамет, в которых не всегда наличествует благоприятное сочетание генов количественных признаков, ответственных за продуктивность и другие качества. Безусловно, изменчивость по числу и массе зерен в колосе и содержанию белка детерменирована модификационной изменчивостью генотипов. Поэтому при отборе линий серьезное внимание уделяли признаку «число седиментации», характеризующему качество белка у гибридных форм (табл.11).

Ниже приводятся характеристики АДГ линий, полученных из пыльников одного гибридного растения Б, (данные второго года испытания).

Таблица 11

Характеристика АДГ линий по продуктивности и качеству белка

Линия АДГ Число зерен в колосе Масса 1000 зерен Содержание белка, % Число седиментации

Жница х Московская 35 34,8+1,4 40,2+0,8 22,4+0,9 44,8+1,8

Жница х Московская 35 28,5+0,7 34,8+0,9 18,3+1,0 64,5+2,1

Жница х Московская 35 39,8+2,7 37,5+1,1 18,6+0,7 73,4+1,9

Жница х Московская 35 30,6+1,7 56,0+1,8 18,4+1,2 87,3+2,4

Жница х Московская 35 35,6+3,1 46,8+2,1 15,3+0,8 82,2+1,9

Жница х Московская 35 31,8+2,5 41,1+1,9 19,4+1,3 74,2+3,2

Жница х Московская 35 41,2+4,0 51,1+1,8 19,8+1,5 77,1+2,1

Ма]ас11 х Жница 36,1+3,1 43,1+2,1 24,3+1,8 ' 52,2+1,4

^асЬ х Московская 35 41,2+2,6 38,1+1,8 26,2+1,5 58,4+1,7

Ма^асЬ х 8опаНка 38,2+3,4 38,2+1,5 28,2+2,3 61,2+2,3

Данные, приведенные в таблице 11, показывают значительное превышение по содержанию белка АДГ-линий, полученных с участием сорта №]асЬ.

Таким образом, проведенное селекционно-генетическое исследование АДГформ указывает на однородность потомства, полученного с одного растения-регенеранта. В то же время, эти линии различаются между собой по многим признакам. Во все годы изучения гомозиготные лишш, полученные методом культивирования изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы, не показывают расщепления при повторных пересевах. Нами проводился генетический анализ наследования концентрации эндогенной АБК в пыльниках у сортов, гибридных форм первого и второго поколений, а также их андроклинных дигашюидных форм (табл. 12). Анализ показал, что исследуемые сорта значительно отличаются по содержанию АБК в пыльниках поздней фазы микроспорогенеза. У сорта Московская 35 эндогенное содержание АБК 78,6 нг/г пыльников, в то время как у сорта БопаИка - 483,2 нг/г пыльников. Реципрокные гибридные комбинации почти не различаются по этому показателю, хотя у гибридной формы БопаНка х Московская 35 в пыльниках накапливается большее количество АБК, чем у обратной комбинации скрещивания. Во втором поколении происходит выравнивание показателей в обоих направлениях скрещивания. Размах изменчивости признака широкий: от минимальных значений концентрации АБК (30 нг/г пылытков) до значительных - 345 нг/г пыльников. Популяция гибридных растений второго поколения включает самое большее число классов расщепления. Что же касается характеристики андроклинных дигашюидных форм по уровню синтеза и накопления АБК, то прямая гибридная комбинация значительно превосходит показатели обратной комбинации скрещивания и его значения приближаются к характеристикам лучшей родительской формы. В этой комбинации скрещивания произведены отборы засухоустойчивых форм, поскольку сорт БопаНка характеризуется высокой засухоустойчивостью и скороспелостью в условиях Южного Урала. У отобранных форм обнаружен высокий уровень накопления эндогенного АБК.

Молекуляроно-генетические аспекты генетической стабильности

андроклинных днгаилоидиых линий Использование молекулярных ДНК-маркеров отличается высокой технологичностью и возможностью одновременного анализа вариабельности большого количества локусов. Последнее качество особенно ценно для генетического типироваиия лиши! и сортов растений. Метод ЯАР1>ПЦР является быстрым и надежным способом контроля г енет ических изменений при создании новых форм растений не только методами биотехнологии, но и традиционными методами селекции.

Метод ЫАРО с использованием произвольных праймеров позволяет

Таблица 12

Распределение частот (%) содержания АБК в пыльниках (нг/г) in vivo у сортов Sonalika, Московская 35

и их реципрокных гибридных форм

UJ 00

Генотип Покол ение Цент] ралыюе значение классов

30 75 120 165 210 255 300 345 390 435 480 525 п X C.v.,%

М-35 45,0 42,5 2,5 50,0 78,6 16,8

Sonalika 4,7 7,1 23,0 54,2 11,0 50,0 483,2 15,4

Sonalika х М-35 F, 2,0 24,0 42,0 28,0 4,0 71,0 198,2 16,2

М-35 х Sonalika F, 7,4 19,4 32,0 29,1 12,1 65,0 145,4 16,6

Sonalika х М-35 АДГ 6,4 23,4 64,2 4,0 2,0 25,0 384,6 13,2

М-35 х Sonalika АДГ 6,3 18,3 71,4 4,0 25,0 150,8 13.8

Sonalika х М-35 F?. 3,17 17,5 33,3 22,8 9,8 5,7 7,2 0,45 100,0 118,4 24.5

М-35 х Sonalika F2 2,97 22,4 28.4 23,9 10.2 5,4 4,9 1,3 100,0 111,8 23,1

получать молекулярные спектры амплифицированных ДНК-фрагментов, называемых фингерпринтами, или молекулярными паспортами (Welsh et al., 1990).

Целью этого этапа работы являлось исследование молекулярно-генетической изменчивости сортов и линий яровой мягкой пшеницы, выращенных в культуре изолированных пылышков с помощью метода RAPD-ПЦР.

Как следует из представленных данных (рис.11,12), для каждой из генотипических пар (исходной и АДГлишш) был присущ сходный молекулярный спектр амплификации, характеризующийся одинаковым числом компонентов, так и их представленностью (мажорностью или минорностью ампликонов ДНК) по всем использованным праймерам.

Из 15 использованных праймеров только И показали полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК у различных форм, также сходные у каждой сравниваемой пары. При этом средний уровень полиморфизма составляет всего 20%, причем, максимальный уровень полиморфизма был отмечен для Р10 праймера - 50% (пыльцеспецнфическин ген кукурузы).

Из литературных данных известно, что болышпгство изученных RAPD-ампликонов проявляют себя как неаллельные доминантные маркеры (Rogowsky et al., 1992; linker et al., 1993; Doves et al., 1992), хотя и отмечены случаи кодоминирования (Tinker et al., 1993). В связи с этим, исследовали наследование молекулярных спектров при внутривидовой гибридизации. Изучали характер наследования RAPD-ПЦР локусов у гибрида Фотос, полученного при скрещивании сортов Жница и Московская 35. В молекулярных спектрах гибрида Фотос и его АДГ-линии при использовании праймера Р1 был обнаружен дополнительный компонент 250 пн, праймера Р8 - два дополнительных компонента: 750 и 900 пн, и праймера Р10 - три фрагмента: 550, 570 и 690 пн, отсутствующие у родительских форм. Вероятно, внутривидовая гибридизация при скрещивании сортов Жница и Московская 35 сопровождалась неменделевскнм наследованием повторов ДНК в геноме гибрида Фотос. Вполне вероятно, что появление дополнительных компонентов в молекулярном спектре АДГ формы данного гибрида явилось результатом кроссинговера.

С другой стороны, молекулярные RAPD-спектры гибридной формы Фотос, полученные с помощью праймеров Р2, РЗ, 1*4, Р5. Р6, Р7, Р9, характеризовались кидоминан 1 ным наследованием ки.миинснiuk родшельских ДКК. Огмешм, чю наличие кодоминантных RAPD-маркеров представляет значительный интерес для генетических исследований.

Вместе с тем, специфические фрагменты амплификации встречались не только у гибрида Фотос. Так, в молекулярных спектрах Жницы и ее АДГ-линии детектировались ампликоны 630 пн с помощью Р1 праймера, отсутствующие у

Рисунок 11

Рисунок 12

Рис.11 RAPD-ПЦР-спектры линий и сортов яровой мягкой пшеницы, выявленные с помощью Р10 праймера.

L-Молекулярный маркер 1 Sonalika, 2 Sonalika -АДГ, 3 Саратовская 29, 4 Саратовская 29-АДГ, 5 Жница, 6 Жница-АДГ, 7 Фотос, 8 Фотос-АДГ, 9 Московская 35.

Рис.12 RAPD-ПЦР-спектры линий и сортов яровой мягкой пшеницы, выявленные с помощью Р6 праймера.

—Sonalika — Фотос —Саратовская 29 —Московская 35

0,11

0,092

ЩЙУ

0,12 0,10 ' 0,08 0,06 0,(И 0,02

Генетическое расстояние (Б)

Рис.13 Дендрограмма, отражающая генетическое сходство между исследованными формами яровой пшеницы.

остальных генотипов. Только для фингерпринтов Sonalika и ее АДГ-линии были характерны фрагменты 520 пн (Р4 праймер), 380 и 400 пи (Рб праймер), а также полосы 630 и 900 пи (Р10 праймер).

Совпадение молекулярных спектров исходных форм и их АДГ-линий упростило задачу построения схем, отражающих сходство между анализируемыми образцами. На основании результатов RAPD-ПЦР, полученных с участием праймеров Р1, РЗ, Р4, Р6, Р8 и PIO, Grig-3, Grig-13, Ds, P42, P37, обеспечивающих полиморфизм молекулярных спектров ДНК, была рассчитана матрица значений генетического сходства (F) и построена дендрограмма генетического сходства между 5 генотипами яровой мягкой пшеницы. Как следует из представленной дендрограммы (рис. 13) Sonaíika наиболее обособлена от остальных форм пшениц (генетическая дистанция D=0.ll). Интересным представляется факт генетической близости сортов Жница и Московская 35, имеющих показатель сходства D=0.04. При этом гибридная форма Фотос оказалась равноудаленной от обеих родительских форм, D=0.046.

В настоящей работе, используя RAPD-ПЦР-анализ, была оценена степень генетического сходства 5 генотипов яровой мягкой пшеницы и их АДГ-линий, полученных в культуре изолированных пыльников.. Нами был обнаружен незначительный внутривидовой полиморфизм, составивший 20% и показано, что разработанная технология прямого андрогенеза in vitro позволяет получать чистые линии любого сорта, подтверждением чего является отсутствие генетической изменчивости у андроклинных удвоенных гаплоидных форм, регенерированных из микроспор исходных сортов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые методом ревертазной реакции получена кДНК, анализ которой с использованием специфических праймеров методом полимеразной цепной реакции укалывает на возможное участие в регуляции экспрессии спорофитной генетической информации в культуре изолированных пыльников ферментных систем клеточного цикла, в частности, протещцсиназ: cdc 25 и cdc 2.

2. Впервые показана дифференциальная экспрессия транскриптов, накапливающихся в микроспорах в ответ на воздействие пониженных положительных температур на пыльники яровой мягкой пшеницы поздней стадии микроспорогенеза. Эта спорофитная генетическая информация реализуется в перестройке веретена деления первого митоза и появлении микроспор с двумя равными ядрами, что характеризует начало прямого андрогенеза in vitro.

между эндогеннымн (в пыльниках) и экзогенными (в питательной среде) гормонами. Так, генотипам, имеющим высокий эндогенный уровень фитогормонов адекватны низкие концентрации 2,4-Д в питательной среде и наоборот. Такой подход к культивированию пыльников разных генотипов позволил повысить частоту прямого андрогенеза in vitro в среднем с 2,5% (до эксперимента) до 50-60% (после эксперимента) в расчете на общее число культивируемых пыльников.

4. Показано, что высокая чувствительность к 2,4-Д у сортов яровой мягкой пшеницы определяется генетически обусловленным высоким уровнем эндогенных фитогормонов в пыльниках, имеющих микроспоры поздней стадии мнкроспорогенеза и выражается в том, что у чувствительных сортов (Скала и Sonalika) наивысший уровень эмбриоидогенеза проявляется при культивировании их пыльников на питательной среде, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,1 мг/л. Эмбриоидогенез у этих сортов происходит и на безгормональной питательной среде. При увеличении концентрации 2,4-Д в питательной среде до 0,5 мг/л у этих сортов происходит каллусогенез.

У нечувствительных к 2,4-Д сортов уровень эндогенных ИУК и АБК сравнительно ниже. К ним относятся сорта Московская 35 и Линия 35.

5. Признак "концентрация эндогенных фитогормонов" наследуется как количественный. На основе учета характера наследования этого признака отобраны линии с высоким содержанием как ИУК, так и АБК и проведена селекционная оценка андроклинных удвоенных гаплоидов. Среди регенератов выделены линии, имеющие высокий уровень АБК и характеризующиеся высокой засухоустойчивостью.

6. Определен и описан цитологический маркер поздней стадии микроспорогенеза: наличие фиброзных утолщений в стенке гнезда пыльника. Фенотипически это соответствует расположению кончика колоса на 1/5 расстояния между лигулой предпоследнего листа до флагового. Нами показано, что культивирование пыльников с такими параметрами приводит к увеличению продуктивности эмбриовдогенеза у яровой мягкой пшеницы

а) при эмбриоидогенезе первое деление ядра микроспоры приводит к образованию равных ядер и клеток, которые развиваются в многоклеточные структуры с упорядоченным расположением клеток, затем такие структуры прорастают в эмбриоиды;

б) на путь каллусогенеза вступают микроспоры, первое деление ядра которых неравное, что и обуславливает образование структур с нерегулярным,

неупорядоченным расположением клеток;

в) образование морфогенного и или/ немофогеннош каллуса зависит от концентрации 2,4-Д в питательной среде. У всех исследованных генотипов неморфогенные каллусы формировались при высоких концентрациях 2,4-Д, равной 1,0 - 2,0 мг/л. У генотипов с высоким эндогенным уровнем фитогормонов появление неморфогенных каллусов зафиксировано и при 0,5 мг/л 2,4-Д.

8. Показано, что регенерационная способность генотипов индивидуальна и зависит также от взаимовлияния эндогенных (з экспланте) и экзогенных (в питательной среде) гормонов. При высокой концентрации гормонов в эмбриоидах регенерационная среда содержит низкие концентрации цитокишша и, наоборот, при низком уровне эндогенных фитогормонов в экспланте регенерационная среда более насыщена цигокинином.

9. Показано, что молекулярные спектры ДНК у гибридной формы Фотос, характеризующейся уникальной продуктивностью морфогенеза в культуре изолированных пыльников, помимо амшппсонов, свойственных родительским сортам Жница и Московская 35, содержат дополнительные полиморфные локусы.

10. Достижением разработанной авторами технологии прямого андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы является подбор таких условий кулът5твйроьания изолированных пьшьн»шОв, которые не вызывают генетических изменений в ДНК, доказательством чего является отсутствие у исследованных генотипов и их андроклинных удвоенных гаплоидных линий молекулярного полиморфизма ДНК, изученного методом RAPD-ПЦР анализа ДНК с использованием 15 праймеров. Данный факт свидетельствует, с одной стороны, о возможности сохранения стабильности генома при культивировании изолированных пыльников, с другой - о соответствии факторов, воздействующих на эксплашы при эмбриоидогенезе и регенерации растений его эндогенным характеристикам.

11. Выявлены особенности регуляции генетической изменчивости изолированных пыльников и получены андоклшшые удвоенные гаплоидные линии яровой мягкой пшеницы, характеризующиеся высокой засухоустойчивостью, продуктивностью, хорошим качеством и высоким количеством белка и скороспелостью.

Список основных работ по теме диссертации

1. Горбунова В.Ю. Андроклиния у яровой мягкой мягкой пшеницы // Новые направления в биотехнологии. Москва, 1986. Пущино. С. 34.

2. Горбунова В.Ю. Андроклиния у изогенных линий яровой мягкой пшеницы // Ш съезд ВО! иС. Москва, 1987. С. 110.

3. Горбунова В.Ю., Докичева P.A., Кужлева Н.Г., Башаркина Н.В. Андроклиния у сортов яровой мягкой пшеницы саратовского экотипа //

Сб.применение достижений биотехнологии в народном хозяйстве. Уфа: БФ АН СССР, 1987. С. 56-57.

4. I орбунова В.Ю., Кужлева Н.1'., Докичева P.A. Регенерация растений в культуре изолированных пыльников яровой пшеницы // Экологическая i енетика растений и животных. Тез. 111 Всесоюз. конф. Кишинев, 1987.

5. Садыков Б.Ф., Пропадущая Л.А., Ильина Л.Б., Горбунова В.Ю. Возможные пути активации ассоциативной азотофиксации в ризосфере у андрогенных линий пшеницы. Сельхоз. биология. 1987, № 6. С. 56-60.

6. Горбунова В.Ю., Круглова H.H. Методические аспекты культивирования изолированных пыльников пшеницы. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1988. 20 с.

7. Горбунова В.Ю., Докичева P.A., Надольская С.Н. Математическое обеспечение экспериментальных работ по культуре пыльников // Межд. конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология" Новосибирск, 1988. С. 227.

8. Горбунова В.Ю., Надольская С.Н., Башаркина Н.В., Кудоярова Г.Р. Способ получения растений-регенерантов яровой пшеницы из пыльцы в культуре пыльников // A.C. №1628248. 1988, ДСП.

9. Горбунова В.Ю., Надольская С.Н., Башаркина Н.В., Кужлева Н.Г. Экзогенные ауксины и интенсивность эмбриогенеза у сортов яровой пшеницы / / Тр. межд. конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология" Новосибирск, 1988. С. 212-213.

10. Горбунова В.Ю., Кудоярова Г.Р., Надольская С.Н., Башаркина Н.В. Зависимость ростовой реакции растений на действие 2,4-Д от эндогенного гормонального статуса растений пшеницы разных генотипов // Всес.науч. конф. "Онтогенетика высших растений": Тез.докл., Кишинев. 1989. С.311.

11. Горбунова В.Ю., Башаркина Н.В., Надольская С.Н., Кудоярова Г.Р. Гормональная регуляция процессов эмбриоидогенеза при культивировании пыльников яровой пшеницы // Сб.: Иммуноферментный анализ регуляторов роста растений. Уфа БНЦ УрО АН СССР, 1990. С. 85-89.

12. Кудоярова 1 '.Р., Докичева P.A., БашаркинаH.B. 1 орбунова В.Ю. Влияние низкой концентрации аммонийной и нитратной форм азота на содержание гормонов в дигаплоидных растениях пшеницы //Сб.: Иммуноферментный анализ регуляторов роста растений: Применение в физиологии растений и экологии. Уфа: БНЦ УрО АН СССР 1990. С. 60-65.

13. Кудоярова ПР., Мустафина А.Р., Горбунова В.Ю. Взаимосвязь между выживаемостью и распределением гормонов в растениях пшеницы при обезвоживании: на примере дигаплоидов. И Сб.: Иммуноферментный анализ регуляторов роста растений: Применение в физиологии растений и экологии. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1990. С. 41-46.

14. Gorbunova V.Ju., Nadolskaja S.N.,.Basharkina N.V., Kudojarova G.R. Abscisic acid and embryoidogenesis in spring wheat anther culture // XI

Int.Symp.Embryology and seed reproduction. Leningrad, 1990. P.82.

15. Kruglova N.N., Gorbunova V.Yu., Potapova N.N. Cyto and embryological aspects o! wheat anther culture//Abstr. XI Int. Sympos. «Embryology and seed reproduction». Leningrad, 1990. P. 84.

16. Горбунова В.Ю., Иадольская C.H., Башаркина H.B., Кудоярова Г.Р., Кужлева Н.Г. Способ получения растений-регенератов пшеницы из пыльцы в культуре пыльников // А.С. № 1650051. 1991, бюл. № 19.

17. Круглова Н.Н, Горбунова В.Ю., Багыгина Т.Е. Периодизация развития пыльника злаков. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1991. 8 с.

18. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Потапова Н.Н. Цитологическая характеристика культивируемых пыльников яровой мягкой пшеницы при различных концентрациях 2,4-Д в составе питательной среды // Всес.конф. "Экологическая генетика растений, животных, человека": Тез. докл. Кишинев,

1991. С.418

19. Горбунова В.Ю. Способ культивирования изолированных пылышшв растений / А.С. № 1724688. 1992, бюл. № 13.

20. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н., Потапова Н.Н. Эмбриоидогенез в культуре пыльников пшеницы: цитолого-гистологические аспекты. Ч. 1. Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. 64 с.

21. Батыгина Т.К., Круглова Н.Н, 1 орбунова В.Ю. Культура изолированных пыльников злаков с позиции экспериментальной эмбриологии растений (методологические аспекты). Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992.32 с.

22. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Потапова Н.Н. Цитолого-гисталогическая характеристика эмбриоидов и каллусов яровой мягкой пшеницы сорта Соналика // VI съезд ВОГиС: Тез. докл. Минск, 1992.

23. Надольская С.Н., Горбунова В.Ю., Башаркина Н.В. Роль абсцизовой кислоты в регуляции спорофитного пути развития у яровой мягкой пшеницы в культуре изолированных пыльников // II съезд ВОФР: Тез.докл. Москва, 1992. С. 145.

24. Kruglova N.N., Gorbunova V.Yu., Potapova N.N. Cytological and embryological aspects of wheat anther culture//Procced. XI Int. Sympos. «Embryology and seed reproduction». St.Petersburg, 1992. P. 292-293.

25. Kruglova N.N., Gorbunova V.ju. Pollen embyoid and sexual embryo; simila Kiey and difference II XII Int. Congress on Sexual Plant reproduction. Kolumbus,

1992.

26. Galieva E.R., Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Ultrastucture of spring wheat embryoid and callus cells/VProceed. XI Int. Sympos. «Embryology and seed reproduction». St.Petersburg, 1992. P. 164-166.

27. Gorbunova V.Ju., Nadolskaja S.N., Basharkina N.V. Abscisic acid and embryoidogenesis in spring wheat anther culture // XI Int.Symp.Embryology an seed

Reproduct (Proceedings). S.-Peterburg, 1992. P. 186-188.

28. Kruglova N.N., Gorbunova V.Ju., Potapova N.N. Cytological and embyological aspects ot why at anther culture // XI Int.Symp.fcmbryology and seed Reptoduct (Proceedings). S.-Peterburg, 1992. P. 292-293.

29. Kruglova N.N., Gorbunova V. Yu. Pollen embryoid and sexual embryo: similarity and difference// XII Int. Congress «Plant reproductive biology. Pollen, ovules and seeds». Abstr. The Ohio State University, 1992. P. 36.

30. Горбунова В.Ю. Генетические предпосылки спорофитного пути развития микроспор злаков в условиях in vitro. Моногр. Уфа: УНЦ РАН, 1993 г. 104 с.

31. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н, Батыгина Т.Б. Андрогенез в культуре изолированных пыльников злаков: цитолого-эмбриологические аспекты//Успехи соврем, биологии. 1993. Т. 113. Вып. 1. С. 19-35.

32. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические основы андрогенеза in vitro у злаков//Тез. докл. III съезда ВОФР. Ч. 1. СПб., 1993. С. 86.

33. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Сравнительный цитологический анализ эмбриоида и зародыша яровой мягкой пшеницы на ранних этапах их развития/ /Тез. докл. II междунар. (VI Национ.) конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология». Ч. 1. Алмагы, 1993. С. 16.

34. Круглова Н.Н., 1 орбунова В.Ю., Потапова Н.Н. Влияние концентрации 2,4-Д на начальные этапы эмбриоидогенеза в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы/ЛГез. докл. Ш съезда ВОФР. Ч. 2. СПб., 1993. С. 139.

35. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Влияние генетической детерминации уровня эндогенных фитогормонов на выход андрогенных новообразований у пшеницы/Яенетшса. 1994. Т. 30. Приложение. С. 34.

36. Батыгина Т.Е., Круглова Н.Н, Горбунова В.Ю. Андрогенез in vitro у злаков: анализ с эмбриологических позицийУ/Цитология. 1994. Т. 36. N 9-10. С. 993-1005.

37. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Андрогенез in vitro и амфимиксис: сравнительный ультраструктурный анализ развивающихся эмбриоида и зиготического зародыша яровой мягкой пшеницы//Сб. трудов междунар. симп. «Апомикснс у растений: состояние, проблемы и перспективы исследований». Саратов, 1994. С. 86-88.

38. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Androgenesis in vitro: physiological aspects of the phenomenon in cereales//Abstr, XIII Internat. Congress on Sexual Plant Reproduction. Vienna, 1994. P. 70.

39. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические аспекты андрогенеза in vitro у злаков/Л ез. докл. Ш Росснйск. симп. «Новые методы биотехнологии растений». Пущино, 1995. С. 18.

40. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенез как путь

морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков//Успехи современ, биологии. 1995. Т. 115. Вып. 6. С. 692-705.

41. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Genetical determination of the cereals androgenesis in vitro: hormonal aspects/ZProcced. XIV Internat. Congress on Sexual Plant Reproduction. Lome. 1996. P. 146.

42. Kruglova N.N., Gorbunova V.Yu. Androgenesis in vitro and amphimixis: comparative analysis of the early stages in wheat//Procced. XIV Intemat. Congress on Sexual Plant Reproduction. Lome, 1996. P. 146.

43. Горбунова В.Ю., Круглова H.H. Индукция андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы. Оптимальная фаза микроспорогенеза/УИзвестия РАН. Серия биол. 1997. N 6. С. 668-676.

44. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические аспекты андрогенеза in vitro у злаков//Тез. докл. VII междунар. конф. «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». М., 1997. С. 81.

45. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Цитологический анализ начальных этапов морфогенеза в культуре изолированных пылышков шпетщы//Сб. трудов междунар. конф. по анатомии и морфологии растений. СПб., 1997. С. 348.

46. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Каллусогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков//Успехи современ. биологии. 1997. Т. 117. Вып. 1.С. 83-94.

47. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Микроспора как инициальная клетка морфогенеза в культуре in vitro пыльников пшеницы// Тез. докл. VII междунар. конф. «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». М., 1997. С. 117.

48. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Цитолого-гистологический анализ эмбриоидов и каллусов пшеницы на ранних этапах развития//Сб. трудов междунар. конф. по анатомии и морфологии растений. СПб., 1997. С. 355-356.

49. Абрамов С.Н., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Анализ андрогенных эмбриоидов и каллусов методом сканирующей электронной микроскопии//Тез. докл. междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология». Минск, 1998. С. 135.

50. Куксо П.А., Веселое С.Ю., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Фитогормональный статус пыльников яровой мягкой пшеницы на разных стадиях развитая//Гр. межд. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология». Минск, 1998. С. 135.

51. Abramov S.N., Kruglova N.N., Gorbunova V.Yu. Wheat androgenic embry-oid and callus: data of scanning electron microscopy/ZBulg. Journ. Plant Physiol.. Special issue. Varna. 1998. P. 15.

52. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Androgenesis in vitro in cereals: physiological aspects//Bulg. Journ. Plant Physiol. Special issue. Varna. 1998P. 68.

53. KruglovaN.N., Gorbunova V.Yu. Morphogenic microspore as the initial cell of morphogenesis in wheat anther culture in vitro//Bulg. Journ. Plant Physiol.. Special issue. Varna. 1998 P. 164.

54. Круглова H.H., Горбунова В.Ю., Куксо П.А. Морфогенез в культуре изолированных пыльников: роль фитогормонов//Успехи современ. биол. 1999.Т.119.Вып. 6. С.567-577.

55. Горбунова В.Ю., КругловаН.Н., Абрамов С.Н. Индукция андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы. Баланс эндогенных и экзогенных фитогормонов//Известия РАН. Серия биол., 2000,№2.

56. КругловаН.Н., ГорбуноваВ.Ю., Абрамов С.Н. Андрогенные эмбриоиды и каллусы пшеницы: данные сканирующей электронной микроскопии/УИзвестия РАН. Серия биол., 2000, №3.

57. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Абрамов С.Н. Андрогенный каллус пшеницы: данные цитолого-гистологического анализа методами световой и электронной микроскопии//Сб. тр. XI междунар. конф. «Изучение онтогенеза растений природных и культурных флор в ботанических учреждениях и дендропарках Евразии». Киев, 1999, с. 34-36.

58. G. Gerashchenkov, N. Rozhnova, V. Gorbunova.// Subtractive self-hybridization for the isolation of differentially expressed genes in cob of AT-1 line of maize with the autonomous development of embryo// Apomixis Newsletter.- 1999. No. 11-P. 21-25.

59. Горбунова В.Ю., Зарянова Л.Д. RAPD —ПЦР анализ особенностей организации генома яровой мягкой пшеницы при эмбриоидогенезе//Гез.докл II съезда ВОГиС, СПб.2000. С. 144.

60. Геращенков Г.А., Горбунова В.Ю., Зарянова Л.Д., Рожнова Н.А., , Вахитов В.А. Молекулярно-генетические особенности организации генома при эмбриоидогенезе in vitro у яровой мягкой пшеницы// Генетика. 2000. Т. 36..№ 3.

Горбунова Валентина Юрьевна

А11ДРОГЕНЕЗ Ш VITRO У ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Лиц. на издат. деят. МП РБ №0187 от 08.10.96 Подписано в печать 17.03.2000. Формат 60x84/16. Компьютерный набор. Усл. печ. л. 2,0 Тираж 100. Заказ 33.

Изд-во БашГПИ 450000, г. Уфа, ул. Октябрьской революции, За Отпечатано в типографии БГПИ Лиц. на полигр. деят. Б 848280 от 17.11.99

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Горбунова, Валентина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

1. Предпосылки андрогенеза in vitro у яровой мягкой пше- 14 ницы (Обзор литературы)

1.1 .Генетические предпосылки спорофитного пути развития микроспор in vitro у яровой мягкой пшеницы

1.2. Влияние условий культивирования на эмбриоидогенез в культуре 25 изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы

1.3. Цитологические особенности андрогенеза in vitro у яровой мягкой 31 пшеницы

1.4. Гормональная регуляция андрогегнеза in vitro у яровой мягкой 54 пшеницы

1.5. Эффективность морфогенеза и регенерации растений в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы

2. Материал и методы исследований

2.1. Растительный материал

2.2. Методы исследований

2.2.1. Методы культивирования изолированных пыльников

2.2.2. Цитологические методы исследования

2.2.3. Морфометрические методы изучения микроспор

2.2.4. Биохимические методы исследования

2.2.4.1. Комплексный метод выделения фитогормонов из растительных тканей

2.2.4.2. Твердофазный иммуноферментный анализ

2.2.4.3. Выделение тотальной ДНК

2.2.4.4. Проведение ревертазной реакции

2.2.4.5. Полимеразная цепная реакция ДНК

2.2.5. Статистические методы исследования

3. Влияние эндогенных и экзогенных факторов на андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы

3.1. Зависимость андрогенеза in vitro от стадии развития микроспор и 114 состояния стенок гнезда пыльника

3.1.1 Влияние цитоплазматической мужской стерильности

3.2. Влияние температурных воздействий

3.3. Влияние состава питательных сред

3.4. Влияние концентрации 2,4-Д на андрогенез in vitro

3.5. Исследование чувствительности сортов яровой мягкой пшеницы к 2-4Д

3.6. Генетическая детерминация уровня эндогенных фитогормонов в пыльнике у яровой мягкой пшеницы

3.7. Взаимовлияние эндо- и экзогенных факторов на андрогенез in vitro

4. Цитологические характеристики андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы

4.1. Цитологические характеристики начальных этапов спорофитного пути развития микроспор

4.2. Светооптические и ультраструктурные особенности строения клеток эмбриоида

4.3. Светооптические и ультраструктурные особенности строения клеток мофогенного и неморфогенного каллуса

5. Регенерация растений при у андрогенезе in vitro яровой мягкой пшеницы

5.1. Регенерационная способность генотипов яровой мягкой пшеницы в культуре изолированных пыльников

5.2. Селекционно-генетическая оценка андроклинных удвоенных гаплоидных линий яровой мягкой пшеницы

6. Генетическая изменчивость при андрогенезе in vitro у яровой мягкой пшеницы

6.1. Геномная изменчивость

6.2. Молекулярно-генетическая оценка АДГ линий 225 Обсуждение результатов 235 Выводы 254 Список цитированной литературы

Список сокращений

АБК - абсцизовая кислота;

АГ- антиген;

АДГ- андроклинные удвоенные гаплоиды

АТ- антитело;

АК- аминокислота;

ГК- гибберелловая кислота;

ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота; кДНК - копийная ДНК;

ИУК- индолил-3-уксусная кислота;

ИД- ингибирующая доза;

2,4-Д- 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота;

НУК - нафтилуксусная кислота; пэм- просвечивающая электронная микроскопия;

ПЦР- полимеразная цепная реакция;

РНК- рибонуклеиновая кислота;

МРНК- матричная (мессенджер) РНК;

СД- стимулирующая доза; см- световая микроскопия; сэм- сканирующая электронная микроскопия; тэм- трансмиссионная электронная микроскопия;

Введение Диссертация по биологии, на тему "Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы"

Актуальность темы диссертации. В современных генетических, моле-кулярно-биологических, биотехнологических и селекционных исследованиях важнейших сельскохозяйственных культур существуют проблемы, решение которых возможно только с помощью новых, нетрадиционных методов, позволяющих выявить генетический потенциал растений.

Сказанное в большей степени относится к методу культивирования изолированных пыльников, основанного на использовании явления андрогенеза in vitro - процесса образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна - гаметофита высших растений (Guha, Maheshvari, 1964). Этот уникальный феномен связан с переключением генетической программы развития спорогенных клеток с обычного для них гаме-тофитного пути на принципиально иной - спорофитный путь развития. Смены поколений (спорофитного на гаметофитное), характерной для растений in vivo, не происходит, а производные спорогенных клеток - микроспоры и пыльцевые зерна ведут себя подобно зиготам ( Батыгина, 1978-1992; Горбунова и др.1993). Поэтому андрогенез in vitro рассматривается как особая система размножения растений (Суханов, 1983), позволяющая ускоренно получать полностью гомозиготные растения-регенеранты при гомозиготизации гаплоидных растений, выращенных из микроспор гибридных форм в культуре изолировнных пыльников.

Культивирование изолированных пыльников основано на использовании явления прямого или непрямого андрогенеза in vitro (Vasil, Nitsch, 1975; Sangwan, Sangwan-Norrel, 1987). При прямом андрогенезе in vitro образование гаплоидного растения происходит за счет микроспор или клеток пыльцевого зерна, развивающихся в эмбриоиды. Прямой андрогенез in vitro связан с явлением эмбриоидогенеза как типа бесполого размножения растений (Batygina, 1990). В свою очередь, эмбриоидогенез рассматривается как путь морфогенеза в культуре пыльников (Batygina, 1984, 1986; Kudarov et al., 1990). При непрямом андрогенезе in vitro микроспоры или клетки пыльцевого зерна образуют недифференцированный каллус, который после переноса на среду, индуцирующую органогенез, дает начало растениям-регенерантам различной степени плоидности. Непрямой андрогенез in vitro связан с явлением гемморизогенеза как типа бесполого размножения растений (Batygina, 1990), в то же время, гемморизогенез (органогенез) рассматривается как путь морфогенеза в культуре пыльников (Kudarov et al., 1990). Следует подчеркнуть, что прямой эмбриоидогенез несомненно является более выгодным способом получения гаплоидов in vitro (Суханов, 1983; Шамров и др., 1988; Горбунова и др., 1988; Батыгина и др., 1992;), поскольку он не связан со сложным многоступенчатым процессом морфогенеза через каллус, требующим трудоемкой процедуры пассирования.

Использование в качестве объекта для данных исследований яровой мягкой пшеницы, имеющей огромное народнохозяйственное значение объясняется тем, что не разработаны высокоэффективные технологии массового получения гаплоидных растений злаков. Основная причина этого - методические и методологические трудности, связанные с исследованием и использованием андрогенеза in vitro у представителей именно этого семейства.

Так, одна из принципиальных проблем, стоящая перед исследователями - низкая продуктивность андрогенеза in vitro. Перетасовка условий культивирования, состава питательных сред, особенно их гормональных компонентов для яровой мягкой пшеницы не стала такой же продуктивной, как для культуры тканей двудольных (Sunderland, 1977; Heberle-Bors, 1983). Традиционные методы изучения фитогормонов и не позволяют решать эти проблемы, поэтому исследователям не доступны для изучения процессы фитогормональной регуляции андрогенеза in vitro. Существенным недочетом многих исследований, поэтому, является то, что изучается влияние того или иного воздействия на эксплант без учета эндогенных изменений в изолированном пыльнике. Так, одна из принципиальных проблем, стоящая перед исследователями - низкая продуктивность андрогенеза in vitro. Перетасовка условий культивирования, состава питательных сред, особенно их гормональных компонентов для яровой мягкой пшеницы не стала такой же продуктивной, как для культуры тканей двудольных (Sunderland, 1977; Heberle-Bors, 1983). Традиционные методы изучения фитогормонов и не позволяют решать эти проблемы, поэтому исследователям не доступны для изучения процессы фитогормональной регуляции андрогенеза in vitro. Существенным недочетом многих исследований, поэтому, является то, что изучается влияние того или иного воздействия на эксплант без учета эндогенных изменений в изолированном пыльнике.

Перспективы к преодолению перечисленных методических ограничений открывает использование метода твердофазного иммуноанализа, который повышает точность экспериментов за счет высокой специфичности отношений антител к фитогормонам.

Критическое отношение к гипотезе прямого андрогенеза in vitro из одиночной клетки высказывалось почти 30 лет назад (Homes et al.,1967; Tor-rey, 1967), что вполне естественно, так как из-за отсутствия детальных цито-эмбриологических данных о начальных этапах эмбриоидогенеза из одиночной изолированной клетки трудно говорить о прямом и организованном пути образования эмбриоида и сейчас. В настоящее время имеются разрозненные публикации о цитологических особенностях разных этапов андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы (Размологов и соавт., 1979; Shumann et al., 1986; Kruger et al., 1988; Barnabas et al., 1988; Higuchi, 1991).

Совершенно не разработаны подходы к унификации процесса культивирования изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы, что приводит к разночтению результатов культивирования. Поэтому невозможно сравнивать экспериментальные данные, полученные разными авторами, успешно работающими в данной области (Дьячук и соавт., 1986; Приходько, 1988; Barnabas et al., 1989; Foroughi-Wehr, et al., 1990; Loschenberger et al., 1992; Shimada et al., 1993; Henry et al., 1993; Горбунова 1993; Першина и соавт., 1993).

До настоящего времени открыт вопрос и об индукторах андрогенеза in vitro. Остается далекой от окончательного решения и ключевая проблема андрогенеза in vitro - механизм переключения генетической программы развития микроспор/клеток пыльцевого зерна с гаметофитного пути на спорофит-ный. Не исследованы вопросы: каковы предпосылки этого явления в условиях in vivo, каковы начальные этапы дифференциации микроспор на эмбрио-идогенез и каллусогенез и каковы эндогенные факторы, предопределяющие выбор различных путей морфогенеза. Поэтому можно предположить, что исследование молекулярно-генетических особенностей ответной реакции экс-планта на условия культивирования и баланса эндо- и экзогенных фитогор-монов как в момент инокуляции экспланта в питательные среды, так и в процессе культивирования, являются решающими и для понимания диффереци-альных путей морфогенеза. Изучение этих вопросов может иметь принципиальное значение, так как, знание механизмов «переключения» генетических систем развития микроспор, могло бы приблизить к возможности управления процессом морфогенеза в культуре изолированных пыльников и решению фундаментальной проблемы современной биологии - проблемы морфогенеза.

В процессе реализации поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучение закономерностей нетрадиционной системы бесполого размножения в культуре изолированных пыльников.

3. Изучение характера связи между генетической и фенотипической изменчивостью АДГ форм.

4. Выявление эндогенных факторов, влияющих на андрогенез in vitro и изучение их роль.

5. Проведение цитологического мониторинга всего процесса культивирования изолированных пыльников, используя возможности светового (СМ) и электронного микроскопов разных типов: сканирущего (СЭМ) и трансмиссионного (ТЭМ).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Возможность реализации генетической системы гомофазного (спорофит -спорофит) пути развития микроспор в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы, прямым доказательством которого является получение чистых линий исходных сортов в культуре изолированных пыльников.

2. Осуществление процесса переключения генетической программы развития микроспор с гаметофитного на спорофитный путь при экспрессии генов, участвующих в регуляции и функционировании этапов клеточного цикла.

3. Возможность создания в культуре изолированных пыльников различных клеточных систем с высоким мофогенным потенциалом: эмбриоидов и морфогенных каллусов. Формирование таких структур зависит от: фазы развития микроспор, эндогенного уровня фитогормонов в экспланте и концентрации 2,4-Д в питательной среде.

5. Использование RAPD - ПЦР анализа амплифицированных фрагментов ДНК исходных и АДГ линий для молекулярно-генетического анализа генетической изменчивости при андрогенезе in vitro.

Впервые изучены и являются приоритетными: синтез в ревертазной реакции кДНК, на основе мРНК экспланта, дифференциально экспрессирующей-ся в ответ на предобработку изолированных пыльников низкими положительными температурами.

Впервые экспериментально продемонстрирована зависимость дифференциальных путей морфогенеза (эмбриоидогенез и /или каллусогенез) у яровой мягкой пшеницы от концентрации эндогенных фитогормонов, и зависимости индукции эмбриоидогенеза от концентрации 2,4-Д в питательной среде, адекватной эндогенному уровню фитогормонов в экспланте.

Выявлены и описаны закономерности формирования клеточных структур с различной морфогенной способностью и проведен комплексный мониторинг всех ключевых моментов культивирования изолированных пыльников. Использование методов световой и электронной микроскопии в сочетании с твердофазным иммуноферментным анализом фитогормонов позволило описать особенности морфогенеза в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы и показать, что синхронность многих изученных факторов: фаза развития микроспоры, ее эндогенные характеристики (развитие ядра, наличие вакуолей), состояние стенок гнезда пыльников (наличие фиброзных утолщений в эндотеции) и концентрация эндогенных фитогормонов в пыльнике в момент инокуляции их на питательные среды, являются ключевыми для успешного осуществления прямого андрогенеза in vitro.

С помощью RAPD - ПЦР метода исследован характер наследования фрагментов ДНК у АДГ форм.

Получены андроклинные удвоенные гаплоидные растения и линии, характеризующиеся высокой продуктивностью, засухоустойчивостью и скороспелостью.

Андроклинные удвоенные гаплоидные гибридные линии, полученные в ходе проведения экспериментов в культуре изолированных пыльников испы-тываются в селекционных учреждениях Башкортостана.

Работа выполнена на кафедре общей биологии Башкирского государственного педагогического института и в лаборатории генетики растений Института биохимии и генетики Уфимского Научного Центра РАН. Связь работы с крупными научными программами. За время выполнения работы получены гранты следующих фондов: ГНТП «Новейшие методы биоинженерии (1987-1993), «Приоритетные направления генетики (1989)», «Российского фонда фундаментальных исследований (1994-1995, 1999-2001)», Фонда «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки» (1997-2000 гг.).

Глубокую признательность диссертант выражает проф., д.б.н. Круп-нову В.А., проф., д.б.н. .Вахитову В.А., к.б.н. Внучковой В.А. - к сожалению, скоропостижно ушедшей от нас, за постоянное внимание к работе. Также благодарит коллег, которые принимали участие в проведении экспериментов и обсуждении результатов: д.б.н. Кудоярову Г.Р., к.б.н. Круг-лову Н.Н., к.б.н. Геращенкова Г.А., к.б.н. Абрамова С.Н., Надольскую С.Н., за неоценимую помощь при оформлении работы - к.б.н. Богданова М.Р., за методическую помощь при сканирующем электронном микроско-пировании - к.б.н. Г.Е. Титову.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Горбунова, Валентина Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Впервые методом ревертазной реакции получена кДНК, анализ которой с использованием специфических праймеров методом полимеразной цепной реакции указывает на возможное участие в регуляции экспрессии спорофитной генетической информации в культуре изолированных пыльников ферментных систем клеточного цикла, в частности, протеинкиназ: cdc 25 и cdc 2.

3. Впервые показано, что частота прямого андрогенеза in vitro (эмбриоидогенез) и пределы ее изменчивости обусловлены генотипическими факторами, важнейшим среди которых является эндогенный уровень фитогормонов в экспланте в момент инокуляции. Показана обратная зависимость между эндогенными (в пыльниках) и экзогенными (в питательной среде) гормонами. Так, генотипам, имеющим высокий эндогенный уровень фитогормонов адекватны низкие концентрации 2,4-Д в питательной среде и наоборот. Такой подход к культивированию пыльников разных генотипов позволил повысить частоту прямого андрогенеза in vitro в среднем с 2,5% (до эксперимента) до 50-60% (после эксперимента) в расчете на общее число культивируемых пыльников.

Скала и Sonalika) наивысший уровень эмбриоидогенеза проявляется при культивировании их пыльников на питательной среде, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,1 мг/л. Эмбриоидогенез у этих сортов происходит и на безгормональной питательной среде. При увеличении концентрации 2,4-Д в питательной среде до 0,5 мг/л у этих сортов происходит каллусогенез.

5. Признак «концентрация эндогенных фитогормонов» наследуется как количественный. На основе учета характера наследования этого признака отобраны линии с высоким содержанием как ИУК, так и АБК и проведена селекционная оценка андроклинных удвоенных гаплоидов. Среди регенеран-тов выделены линии, имеющие высокий уровень АБК и характеризующиеся высокой засухоустойчивостью.

6. Определен и описан цитологический маркер поздней стадии микроспорогенеза: наличие фиброзных утолщений в стенке гнезда пыльника. Фе-нотипически это соответствует расположению кончика колоса на 1/5 расстояния между лигулой предпоследнего листа до флагового. Нами показано, что культивирование пыльников с такими параметрами приводит к увеличению продуктивности эмбриоидогенеза у яровой мягкой пшеницы

7. Впервые проведен полный цито-гистологический мониторинг дифференциальных путей морфогенеза в культуре изолированных пыльников и показано наличие принципиальных различий в начальных путях эмбриоидогенеза и каллусогенеза: а) при эмбриоидогенезе первое деление ядра микроспоры приводит к образованию равных ядер и клеток, которые развиваются в многоклеточные структуры с упорядоченным расположением клеток, затем такие структуры прорастают в эмбриоиды; б) на путь каллусогенеза вступают микроспоры, первое деление ядра которых неравное, что и обуславливает образование структур с нерегулярным, неупорядоченным расположением клеток; в) образование морфогенного и или/ немофогенного каллуса зависит от концентрации 2,4-Д в питательной среде. У всех исследованных генотипов неморфогенные каллусы формировались при высоких концентрациях 2,4-Д, равной 1,0 — 2,0 мг/л. У генотипов с высоким эндогенным уровнем фитогормонов появление неморфогенных каллусов зафиксировано и при 0,5 мг/л 2,4

Д.

8. Показано, что регенерационная способность генотипов индивидуальна и зависит также от взаимовлияния эндогенных (в экспланте) и экзогенных (в питательной среде) гормонов. При высокой концентрации гормонов в эмбриоидах регенерационная среда содержит низкие концентрации цитоки-нина и, наоборот, при низком уровне эндогенных фитогормонов в экспланте регенерационная среда более насыщена цитокинином.

9. Показано, что молекулярные спектры ДНК у гибридной формы Фо-тос, характеризующейся уникальной продуктивностью морфогенеза в культуре изолированных пыльников, помимо ампликонов, свойственных родительским сортам Жница и Московская 35, содержат дополнительные полиморфные локусы.

10. Достижением разработанной авторами технологии прямого андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы является подбор таких условий культивирования изолированных пыльников, которые не вызывают генетических изменений в ДНК, доказательством чего является отсутствие у исследованных генотипов и их андроклинных удвоенных гаплоидных линий молекулярного полиморфизма ДНК, изученного методом RAPD-ПЦР анализа ДНК с использованием 15 праймеров. Данный факт свидетельствует, с одной стороны, о возможности сохранения стабильности генома при культивировании изолированных пыльников, с другой - о соответствии факторов, воздействующих на экспланты при эмбриоидогенезе и регенерации растений его эндогенным характеристикам.

11. Выявлены особенности регуляции генетической изменчивости изолированных пыльников и получены андоклинные удвоенные гаплоидные линии яровой мягкой пшеницы, характеризующиеся высокой засухоустойчивостью, продуктивностью, хорошим качеством и высоким количеством белка и скороспелостью

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Горбунова, Валентина Юрьевна, Уфа

1. Абрамова З.В. Практикум по генетике. М.: Наука, 1987. С.216

2. Анапияев Б.Б., Аникеева А.А., Фурсов О.В., Богуспаев К.К. //Тез. докл. II междунар. (VI национ.) конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Ч. 2. Алматы, 1993. С.41.

3. Ананьев Е.В., Бочканов С.С., Сонина Н.В., Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Изменение структуры хлоропластного генома у регенерантов тритикале, полученных из микроспор при культивировании пыльников // Доклады ВАСХНИЛ. 1986. №6. С.1-3.

4. Банникова В.П., Хведынич О.А., Кравец Е.А., Тарасенко А.В., Шулаев

5. B.К., Ильченко К.В., Майстров П.Д., Барабанова Е.А. Основы эмбриогенеза злаков. Киев: Наукова думка, 1991. 176 с.

6. Батыгина Т.Б. Пыльник как модель изучения морфогенетических потенций и путей морфогенеза//Тез. докл. Всесоюз. симп. "Развитие мужской генеративной сферы растений (морфо-физиологические аспекты)". Симферополь, 1983. С. 9-10.

7. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно: Атлас. Л.: Наука. Ленингр. отд-ние, 1987. 103 с.

8. Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения новая категория способов размножения цветковых растений//Тр. Ботан. ин-та им. В.Л.Комарова. Вып. 8. СПб., 1993. С. 15-25.

9. Батыгина Т.Б. Эмбриология пшеницы. Л.: Колос, 1974. 206 с.

10. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметьева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro. Эмбриоидогенез у покрытосеменных растений // Бот. журн. 1978. Т. 63. N 1.С. 87-111.

11. Батыгина Т.Б., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Андрогенез in vitro у злаков: анализ с эмбриологических позиций//Цитология. 1994. Т. 36. N 9-10.1. C. 993-1005.

12. Батыгина Т.Б., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Культура изолированных пыльников злаков с позиции экспериментальной эмбриологии растений (методологические аспекты). Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. 32 с.

13. Батыгина Т.Б., Терехин Э.С., Алимова Г.К., Яковлев М.С. Генезис мужских спорангиев Gramineae и Ericaceae // Бот. журн. 1963. Т. 48. N 8. С. 11081120.

14. Батыгина Т.Б., Шамров И.И. Эмбриология нимфейных и лотосовых. 1. Развитие пыльника//Бот. журн. 1981. Т. 66. N 12. С. 1696-1709.

15. БатыгинаТ.Б.Эмбриоидогенез как способ образования индивидуума в естественных условиях и в культуре in vitro // Тез. докл. на П съезде Всесо-юз.об-ва физиологов растений. М., 1990. С.14.

16. Биотехнология зерновых культур. Алма-Ата: Гылым, 1992. 240 с.

17. Богуспаев К.К., Ережепов А.Е., Батыргожин Б.А., Тулегенова Б.Т., Ра-химбаев И.Р., Султанбаев Б.Ж., Кильдибеков Н.А.//Тез. докл. V конф. биохимиков респ. Сред. Азии и Казахстана. Ташкент, 1991. С. 158.

18. Богуспаев К.К., Тулегенова Б.Т., Анапияев Б.Б., Аникулов З.А., Кильдибеков Н.А.//Тез. докл. II съезда о-ва физиологов растений. 4.2. М., 1992. С.28.

19. Бродский В.Я. Трофика клетки. М.: Наука, 1966. 354 с.

20. Бугара A.M., Русина JI.B., Резникова С.А. Эмбриоидогенез в культуре пыльников шалфея мускатного // Физиол. и биохимия культ, раст. 1986. Т. 18. N4. С. 381-386.

21. Бутенко Р.Г. Культуро изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.:Наука,1964. 272с.

22. Бутенко Р.Г. Дифференциация и морфогенез в культуре тканей, клеток и протопластов//Биология развития растений. М.: Наука, 1975. С. 48-65.

23. Бутенко Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений // Гормональная регуляция онтогенеза растений. М.:Наука, 1984. С. 42-54.

24. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике // Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М.: Агропромиз-дат, 1990. С. 154-235.

25. Васильева (Горбунова) В.Ю., Ильина Л.Б. К изучению наследования продуктивности, содержания белка и признаков, определяющих технологические свойства у гибридов мягкой пшеницы // Проблемы генетики и селекции на Урале. Свердловск, 1976. С. 24.

26. Внучкова В.А. Чеботарева Т.М., Глущенко Г.И. Получение гаплоидов и фертильных андрогенетических линий пшеницы при посадке пыльников in vitro//Cocтoяниe и развитие сельскохозяйственной биотехнологии. М.: Колос, 1986. С. 74.

27. Внучкова В.А., Чеботарева Т.М. Оптимизация условий получения гаплоидов пшеницы при посадке пыльников in vitro// Докл. ВАСХНИЛ, 1990.№ 5.С. 6-9.

28. Внучкова В.А., Анащенко А.В. Создание перспективных линий яровой пшеницы при использовании метода гаплоидии in vitro // Докл. Рос. акад. с.-х. наук. 1993. №1. С.12-15.

29. Володарский А.Д. Системный иммунохимический подход в изучении клеточных антигенов основа фитоиммунобиотехнологии//Тез. науч.-метод. совещ. "Методы комплексной оценки продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений". М., 1994. С. 4.

30. Гамбург К.З., Высоцкая Е.С., Леонова JI.A., Оапрова JI.M., Юзенасов В.И. Влияние разных ауксинов на рост тканей табака и сои в суспензионной культуре//Докл АН СССР. 1971. 202, № 3. С.714-717.

31. Гаплоидия и селекция. М.: Наука, 1976. 221 с.

32. Голубинский И.Н. К познанию физиологии прорастания пыльцы //ДАН СССР. 1945. Т. 18. N 1. С. 45-49.

33. Голубинский И.Н. Биология прорастания пыльцы. Киев: Наукова думка, 1974. 368 с.

34. Горбунова В.Ю., Бебякин В.М., Ишина Г.Ф. Изменчивость белковости зерна и седиментационного значения в пределах сорта, растения и колоса пшеницы // Селекционно-генетические исследования пшениц. Уфа, деп. № 261, 1977. С. 95-102.

35. Горбунова В.Ю. Экспрессия генов яровизации у скороспелых сортов яровой мягкой пшеницы //1 Всесоюзная конференция по генетике развития. Ташкент: 1980. С.259.

36. Горбунова В.Ю. Андроклиния у яровой мягкой мягкой пшеницы // Новые направления в биотехнологии. Москва. 1986. Пущино. С. 34.

37. Горбунова В.Ю. Способ культивирования изолированных пыльников злаковых растений//А.С. 1724688. 1992. Бюлл. N 13.

38. Горбунова В.Ю. Генетические предпосылки спорофитного пути развития микроспор злаков в условиях in vitro. Уфа: УНЦ РАН, 1993. 104 с.

39. Горбунова В. Ю., Докичева Р. А., Кужлева Н. Г. Изменчивость сортов яровой пшеницы по признаку «андроклиния» в изолированной культуре пыльников//Исследования по генетике и селекции растений на Урале: Ин-форм. материалы. Свердловск. 1987. С.29-30.

40. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Влияние генетической детерминации уровня эндогенных фитогормонов на выход андрогенных новообразований у пшеницы//Генетика. 1994. Т. 30. Прилож. С. 34.

41. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Индукция андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы. Оптимальная фаза микроспорогенеза//Известия РАН. Серия биол. 1997. N 6. С. 668-676.

42. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Методические аспекты культивирования изолированных пыльников пшеницы. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1988. 20 с.

43. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические аспекты андрогенеза in vitro у злаков//Тез. докл. Ш Российск. симп. "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1995. С. 18.

44. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические основы андрогенеза in vitro у злаков//Тез. Докл. Ш съезда ВОФР. Ч. 1. Санкт-Петербург, 1993. С. 86.

45. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н., Батыгина Т.Б. Андрогенез в культуре изолированных пыльников злаков: цитолого-эмбриологические аспек-ты//Успехи соврем.биологии. 1993. Т. 113. N 1. С. 19-35.

46. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н., Потапова Н.Н. Эмбриоидогенез в культуре пыльников пшеницы: цитолого-гистологические аспекты. Часть 1. Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. 64 с.

47. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Цитологический анализ начальных этапов морфогенеза в культуре изолированных пыльников пшеницы. Тр. Межд. Конф. По анатомии и морфологии растений. СПб, 1997, С. 15.

48. Горбунова В.Ю., Печура А.А Содержание белка у скороспелых сортов яровой мягкой пшеницы // Конференция по биохимии нуклеиновых кислот и метаболизму белка. Минск, 1981. С. 17.

49. Горбунова В.Ю., Печура А.А. Генетическая система засухоустойчивости как адаптивный признак в условиях Башкирии // Адаптация и рекомби-ногенез у культурных растений. Кишинев, 1982. С. 146-147.

50. Горбунова В.Ю., Ямалеев A.M. Анализ генетических компонентов вари-ансы продуктивности растений, устойчивых к бурой ржавчине сортов яровой мягкой пшеницы // Доклады ВАСХНИЛ, № 4, 1981. С. 9-12.

51. Гостимский С.А., Багрова A.M., Ежова Т.А. Обнаружение и цитогенети-ческий анализ изменчивости, возникающей при регенерации растений из культуры тканей посевного гороха // Докл. АН СССР.1985. Т.283. №4. С. 1007-1011.

52. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений // Генетика 1999. Т. 35. № 11. С. 1538-1549.

53. Гуньков Ю.П. Влияние условий опыления на прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок в тканях рылец диплоидной ржи//Цитологоэмбриологические и генетико-биохимические основы опыления и оплодотворения растений. Киев: Наукова думка, 1982. С. 156-159.

54. Турецкая B.C. //Тез. докл. междунар. конф. « Молекулярная генетика ибиотехнология» Минск, 1998. С. 170.

55. Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир, 1985.304с.

56. Дмитриева Н.Н. Индукция клеточных делений в сердцевинной паренхиме стебля табака. Автореф. Дис. канд . биол. Наук. М., 1972. 27 с.

57. Дмитриева Н.Н., Липский А.Х. О роли ауксина и кинетина при индукции делений в сердцевинной паренхиме стебля табака // Физиология растений.- 1973. -Т.20, вып.2.- С.339-347.

58. Дмитриева Н.Н. Проблема регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток и тканей растений. // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. - с.113-124.

59. Дмитриева Н.Н., Винникова Н.В., Ермаков И.П., Матвеева Н.П. Ранняя реакция хроматина на ауксин у протопластов табака//Физиол. растений. 1988. Т.35, № 5. С.879-887.

60. Дьячук П.А., Дьячук Т.И., Кудашкина С.В., Сафронова Н.Ф., Давыдов С.Д. Получение гаплоидных растений мягкой пшеницы саратовских сортов в культуре пыльников//Доклады ВАСХНИЛ. 1986. N 10. С. 3-10.

61. Дьячук Т.И., Дьячук П.А. Культура пыльников злаков: современное состояние, проблемы, перспективы // С.-х. биол. 1989. N 5. С. 3-10.

62. Егорова Н.А., Резникова С.А. Исследование культуры изолированных пыльников кориндра в связи с индукцией андрогенеза //Физиология растений. 1982. Т. 29. N 1. С. 142 -149.

63. Ермаков И.П., Матвеева Н.П. Диморфизм пыльцы и андрогенез в культуре пыльников и микроспор // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. 1986. N 3. С.28-40.

64. Ильина Л.Б., Васильева (Горбунова) В.Ю., Сафаргалиева К.М. Изучение белка зерна некоторых сортов пшениц и их гибридов методом электрофореза в полиакриламидном геле // Цитология и генетика №3. Киев, 1973. С.274-276.

65. Иммуноферментный анализ регуляторов роста: применение в физиологии растений и экологии. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1990. 132 с.

66. Искакова К.М. Морфогенез в длительно поддерживаемой культуре анд-рогенных каллусов ячменя: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Алма-Ата: Ка-захск. гос. ун-т, 1991. 21 с.

67. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры ткани вфизиологии и биохимии растений. Киев: Наукова думка. 1980. С.3-277.

68. Калинин А.В. Индукция андрогенеза и факторы, лимитирующие морфо-генетические потенции микроспор изолированных пыльников картофеля //Тез. докл. конф. "Гаметная и зиготическая селекция растений". Кишинев: Штиинца, 1987. С. 158-159.

69. Кацы Е.И. Участие ауксинов в регуляции экспрессии генов бактерий и растений//Генетика. 1997. Т. 33. N 5. С. 565-576.

70. Коваленко О.В. Генетические аспекты морфогенеза расте-ний//Успехи соврем, биологии. 1993. Т. 113. Вып. 3. С. 269-285.

71. Конарев В.Г. Белки пшеницы. М., 1980. 351 с.

72. Коробова С.Н. Движение спермиев покрытосемянных растений в пыльцевой трубке и в зародышевом мешке//Актуальные вопросы эмбриологии покрытосемянных растений. Д.: Наука, 1979. С. 5-19.

73. Кривченко В.И., Ямалеев A.M., Горбунова В.Ю., Исаев Р.Ф. Влияние фактора пленчатости семян на устойчивость видов пшеницы к возбудителю твердой головни // Микология и фитопатология. 1979. № 3. С. 330-333.

74. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Периодизация развития пыльника злаков. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1991.18 с.

75. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков//Успехи соврем. биол. 1995. Т. 115. Вып. 6. С. 692-705.

76. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Каллусогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков//Успехи соврем, биол. 1997. Т. 117. Вып. 1.С. 83-94.

77. Крупнов В.А. Генная и цитоплазматическая мужская стерильность растений. М:.Колос. 1973. 277 с.

78. Крупнов В.А., Мартынов С.П., Седловский А.И., Добротовская Т.В. Методические указания по использованию метода ОСП (односемя с растения на потомство) в селекции самоопыляющихся культур. М.: ВАСХНИЛ. 1983. 36 с.

79. Крупнов В.А. Сравнительная оценка биотехнологических методов в селекции злаков // Вестн. с.-х. науки. 1989. №3. С.24-29.

80. Кударов Б.Р., Есмагулов К.Е., Тулегенова Б.Т., Анапияев Б.Б.//Тез. докл. II съезда о-ва физиологов растений. Ч. 2. М., 1992. С. 111.

81. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых антител//Физиол. Раст. 1986. Т. 33. N 6. С. 1221-1227.

82. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю.ДСаравайко Н.Н., Мошков И.Е. и др. Им-муноферментная тест-система для определения цитокининов // Физиол. Раст.1989. Т.37. №1. С.80-89.

83. Кузьменко А.И., Дьячук Т.Н., Галкин А.Н., Данилова В.А., Зотова Г.К. Об итогах изучения андрогенных линий яровой пшеницы // Сел. и семен. 1990. №4. С.10-12.

84. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. М.: Наука, 1982.- С.3-10.

85. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. М.: Наука, 1973. -С.11-23.

86. Кунах В.А., Адонин В.И., Алпатова Л.К., Ткачук З.Ю., Потапальский А.И. Цитогенетические действия нативных и модифицированных тиофосфа-мидом РНК на культутру тканей Haplopappus gracilis // Цитология. 1985.Т.27.С.476-487.

87. Куперман Ф.М. Теория индивидуального развития и пути управления природой организма // М.: Изд-во МГУ, 1962. 78 с.

88. Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Влияние различных факторов на гапло-продукцию при культивировании пыльников тритикале // Науч.-техн. бюлл. Всес. селекц.-генет. ин-та. 1986. N 2. С. 41.

89. Любарская Н.Г., Лихолат Т.В., Павлова А.Н. Влияние уровня азотного питания на аттрагирующую способность колосьев и активность в них эндогенных цитокининов//Докл. АН СССР. 1982. Т. 265. № 1. С.253-258.

90. Маковейчук А.Ю. Эмбриоидогенез как модель коррелятивного взаимодействия фитогормонов // Второй съезд Всесоюзного о-ва физиологов растений: Тез. Докл., Минск. 24-29 сент. 1990. С.58.

91. Маруненко И.М., Кучко А.А. Каллусогенез и эмбриоидогенез в культуре пыльников картофеля // Цитология и генетика. 1989. Т. 24. N 3. С. 48-51.

92. Маруненко И.М., Кучко А.А., Бутенко Р.Г. Физиологические аспекты получения гаплоидов картофеля методом культуры изолированных пыльни-ков//Физиология растений. 1988. Т. 35. N 1. С. 136-143.

93. Медведев С.С. Физиологические основы полярности растений // СПб.: Кольна, 1996. 159 с.

94. Мертвецов Н.П. Гормональная регуляция экспрессии генов // М.:Наука, 1986. 207 с.

95. Муромцев Г.С. Фузикокцин новый фитогормон?//Физиол. раст. 1996. Т. 43. N3. С. 478-492.

96. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяственной биологии // М.: Агропромиздат, 1990. 384 с.

97. Мустафина А.Р., Жирмунская Н.М., Горбунова В.Ю., Кудоярова Г.Р. Распределение АБК и ИУК при водном стрессе между органами растений пшеницы двух сортов, различающихся по засухоустойчивости // Вторая респ. конф. Кишенев: Штиинца, 1989. С. 3-4.

98. Нгуен Тхи Дао, Шамина З.Б. Культура изолированных пыльниковтома-тов // Физиол. раст., 1978. Т.25. №1. С.155-160.

99. Нгуен Хонг Минь, Смирнов В.А., Балашова Н.Н. Генетические различия по потребности к фитогормонам//Изв. АН Республики Молдова. Биол. и хим. науки. 1991. N5. С. 13-20.

100. Носова О.Н. Использование раствора 2,4-Д для повышения эффективности получения гаплоидов в культуре пыльников тритикале//Тез. докл. II Рос-сийск. Симп. "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1993. С. 160.

101. Орел Л.И. Цитология мужской цитоплазматической стерильности кукурузы и других культур.М:. Колос .1974. 283с.

102. Палилова А.Н. Цитоплазматическая мужская стерильность у растений. Минск: Наука и техника. 1969. 277с.

103. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений // М.:Колос,1974. С.66102.

104. Першина Л.А., Нумерова О.М., Белова Л.И., Девяткина Э.П., Шумный В.К. Особенности андрогенеза у мягкой пшеницы, межвидовых и меж родовых гибридов//Сиб. биол. журн. 1993. Вып. 3. С. 3-9.

105. Полевой В.В. Роль ауксина в системах регуляции растений. Л.:Наука, 1986.-С.4-12.

106. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та. 1982. 248 с.

107. Приходько Н.Иполучение гаплоидных растений из пыльцевых зерен мягкой пшеницы Triticale aestivum L. // Тр. По прикл. бот., ген. и сел. 1980. Т.67. №3. С. 75-79.

108. Приходько Н.И. Получение гаплоидов в культуре пыльников мягкой яровой пшеницы//Науч.-техн. Б.лл. ВНИИ растениеводства. 1988. N 174. С. 51-59.

109. Прозина М.Н. Ботаническая микротехника. М.: Высшая школа, 1960. 206 с.

110. Пухальский В.А. К разработке системного подхода в определении генов, детерминирующих количественные и качественные признаки // С.-х. биол. 1992. № 1.С. 17-21.

111. Радионенко М.А., Хведынич О.А., Гудзь В.Н, Кучук Н.В. // Тез. докл. II междунар. (VI нац.) конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Вып. 1. Алматы. 1993. С.68.

112. Размологов В.П., Пухальский В.А. Культура пыльцевых зерен Triticum aestivum L. in vitro // Докл. Акад. наук СССР. 1979. Т.244. №5. С.1278-1280.

113. Ратнер В.А., Чураев Р.Н. Существуют ли двухоперонные системы управления (триггер)? Некоторые факты и эвристическое значение тригге-раУ/Генетика. 1971. Т. 7. № 9. С.175.

114. Рахимбаев И.Р., Тивари HL, Кударов Б.Р. Экспериментальная гаплоидия в культуре пыльников и микроспор зерновых злаков (обзор) // С.-х. биол. 1990. N3. С. 44-49.

115. Рахимбаев И., Тивари Ш. Андрогенез в культуре пыльников и микроспор ячменя // Тез. докл. 2 Съезда ВОФР. 4.2. М.: Пущинский науч. центр РАН. 1992. С.175.

116. Резникова С.А. Пыльник как интегрированная система//Тез. докл. Все-со.зн. симп. "Развитие мужской генеративной сферы растений (морфофизио-логические аспекты)". Симферополь, 1983. С. 69-70.

117. Резникова С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника. М.: Наука,1984. 272с.

118. Романов Г.А., Суховеров С.С. Использование кинетики роста и динамики гормональных градиентов на модельных структурах растительного типа -компь.терных растениях//Докл. РАН. 1997. Т. 352. N 6. С. 845-848.

119. Ромейс Б. Микроскопическая техника. М.: Иностр. лит-ра, 1953. 718 с.

120. Сайб JI.P., Карабаев М.К. Фитогормональная регуляция регенерации растений: качественная модель // Изв. АН Каз. ССР, сер. биол. 1991. № 3,с.15-22.

121. Сатарова Т.Н. Особенности культуры пыльников кукурузы на примере генотипа В 14XWf9//H3B. РАН. Сер. биол. 1994. N 5. С. 771.

122. Семова Н., Анохин Н. Индуцированный эмбриоидогенез в культуре пыльников белокочанной капусты//Докл. ВАСХНИЛ. 1990. N 8. С. 27-31.

123. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н. Генетический полиморфизм ячменя, выявленный ПЦР с произвольными праймерами// Генетика.- 1995.- Т.31,№10.-С.1358- 1364.

124. Сиволап Ю.М., Солоденко А.Е., Бурлов В.В. RAPD анализ молекулярно-генетического полиморфизма подсолнечника (Helianthus annus)// Генетика. 1998. Т34. №2. 266- 271.

125. Синнот Э.М. Морфогенез растений. М.: Иностр. лит-ра. 1963. 415 с.

126. Сравнительная эмбриология цветковых. JL: Наука, 1981. 264 с.

127. Суханов В.М. Андроклиния и ее особенности у пшеницы: Автореф. Дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1983. 24 с.

128. Суханов В.М., Тырнов B.C., Салтыкова Н.Н. Способ получения растений из пыльцы в культуре пыльников//А.с. 1036906. СССР. Заявл. 01.04.81, №3268360/30-15, опубл. В Б.И., 1983. №31.МКИ А 01Н 3/00.

129. Тивари Ш. Пути развития микроспор в культуре пыльников ячменя. Алма-Ата, 1988. 20 с. Деп. в КазНИИ науч.-технич. Информации 24.02.88. N 2317- Ка88.

130. Тивари Ш. Морфогенез в культуре пыльников и изолированных микроспор ячменя: Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: ТСХА, 1989. 25 с.

131. Тивари Ш., Рахимбаев И.Р. Действие 2,4-Д на морфогенез в культуре пыльников и микроспор ячменя//Тез. Докл. II Всесо.з. конф. "Регуляторы роста и развития растений". Киев, 1989. С. 295.

132. Тивари Ш., Рахибаев И.Р., Колумбаева С.В., Искакова К.М. //Изв. АН СССР, серия биол. 1990 б. N 6. С. 939.

133. Токин Б.П. Бесполое размножение, соматический эмбриогенез и регене-рация//Журн. общ. биологии. 1969. Т. 30. N 1. С. 15-21.

134. Токин Б.П. Общая эмбриология. М.: Высшая школа, 1987. 480 с.

135. Тураев A.M., Шамина З.Б. Оптимизация состава среды для культивирования пыльников хлопчатника//Физиол. раст., 1986, т . 33, N 3, с. 565-571

136. Тураев A.M. Молекулярная генетика и биотехнология пыльцы покрытосеменных :Автореф. Дис. . на соиск. уч. ст. д.б.н. Ташкент. 1998. 42с.

137. Тырнов B.C. Андрогенез in vivo у растений // Биология развития и управление наследственностью. М.: Наука, 1986. С. 138-164.

138. Тюкавин Г.Б. Получение константной линии перца через культуру пыльников//Тез. докл. II междунар. конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Алматы, 1993. С. 160.

139. Тютерев СЛ., Чмелева З.В. Методы белкового и аминокислотного анализа растений. JL: 1973. С.4-7.

140. Уоддингтон К. Морфогенез и генетика. М.: Мир. 1964. 259 с.

141. Фурст Г.Г. Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей. М.: Наука, 1979. 155 с.

142. Хеберле-Борс Э. Гаплоидные спорофиты и функциональные мужские гаметофиты из культивируемой in vitro незрелой пыльцы табака// Биология культивируемых клеток и биотехнология. М.: Наука, 1991. С. 146.

143. Чайлахян М.Х. Гормональная регуляция роста и развития высших рас-тений//Успехи соврем, биологии. 1982. Т. 95. Вып. 1. С. 23-34.

144. Чернышева В.Г., Долгих .И., Шамина З.Б., Бутенко Р.Г. Влияние генетических характеристик исходных растений на морфогенный потенциал кал-лусных клеток кукурузы. Докл. АН СССР. 1988, 300, N 1, с.227-229.

145. Чкаников Д.И., Микитюк О.Д., Макеев A.M., Петелина Г.Г.,Климова О.В. Возможная роль абсцизовой кислоты в реализации гербицидной активности 2,4-Д и пиклорама //Физиология и биохимия культурных растений., 1980, 12, №5, 199-503.

146. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. С. 124-126.

147. Эмбриология растений: использование в генетике, селекции, биотехнологии. Т. 1. М.: Агропромиздат, 1990. 509 с.

148. Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 1. Генеративные органы цветка/Ред. Батыгина Т.Б. СПб.: Мир и семья, 1994. 508 с.

149. Юркова Г.Н., Левенко Б.А. Изолированная культура пыльников злаков // Экспериментальная генетика растений. Киев. Наукова думка, 1982, с. 46-65.

150. Ямалеев A.M., Горбунова В.Ю., Генетический состав популяций возбудителей бурой ржавчины в Башкирской АССР и выявление генов устойчивости у сортов яровой мягкой пшеницы // Генетический анализ количественных признаков растений. Уфа. 1979а. С.123-129.

151. Ямалеев A.M., Горбунова В.Ю., Исаев Р.Ф. Генетическая дифференциация рас твердой головни пшеницы на Южном Урале // Вопросы генетики и селекции на Урале и в Зауралье. 19796. С. 88-90.

152. Andersen S.B., Due I.K.,01esen A. The response of anther culture in a genetically wide material of winter wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Breed. 1987. V.99. №3. P.181-186.

153. Anonim: A sharp increase of of the of the freqency of pollen plant inductionin wheat with potato medium. Acta Genet.Sin. 1976. N. 3. P. 30-31.

154. Armstrong T.A., Metz S.G., Mascia P.N. Two regeneration systems for the production of haploid plants from wheat anther culture //Plant Sci. 1987. V. 51. N 2-3. P. 231-237.

155. Aruga K., Nakajima Т., Yamamoto K. Embryogenic Induction in pollen Grains of Nicotiana tabacum L//Japan. J. Breed., 1985a, V.35, N 1, P. 50-58.

156. Aruga K., Nakajima T. Role of Anther on Pollen Embryogenesis in Anther Culture of Nicotiana Tabacum // Japan. J. Breed. 1985b. V.35. №4. P.390-397.

157. Atzorn R., Weiler E.W. The immunoassay of gibberellins // Planta. 1983. V.159. №1. P.7.

158. Baenziger P.S. The effects of interaction of culture environment with genotype on wheat anther culture response//Plant Cell Repts. 1990. V.9. # 9. P.525-529.

159. Baenziger P.S.,Wesenberg D.M., Schaffer G.W., Galun E., Feldman M. Variation among anther culture derive doubled haploids of "Kitt" wheat // Proc. Intern. Sympl. Wheat Genetics. Kyoto. 1983. P.575-581.

160. Baenziger P.S., Peterson C.J., Morris M.R., Mattern PJ. Quantifying gametoclonal variation in wheat doubl haploids // Current options for cereal improvement. Advances in agricultural biotechnology. 1989. P.

161. Barloy D., Denis L., and Beckert M. Comparison of the aptitude for anther culture in some androgenetic doubled haploid maize lines // Maydica. 1989. V.39. P.303-308.

162. Barnabas В., Fransz P., Schell J. Ultrastructural studies on pollenembryoginesis in maize (Zea mays L.) // Plant Cell Repts. 1987. Vol.6. N 3. P. 212-215.

163. Barnabas В., Szakacs E., Liszt K. Cytological aspects of in vitro androgenesis in cereals//Sexual reproduction in higher plants. Berlin, 1988. P. 113-118.

164. Barnabas В., Szakasz E., Kovacs G. Induction of haploid plants from wheat {Triticum aestivum L.) anther culture//Sver. Utsadesforen. Tidskr. 1989. V. 99. N 2. P. 115-123.

165. Batygina T.B. The place of embryoidogeny in system of flowering planth reproduction // Abstr. XI internat. sympos. "Embryology and seed reproduction". Leningrad: Nauka, 1990. P. 17.

166. Batygina T.B. Position of the phenomenon of embryoidogeny in the system of flowering plant reproduction//Abstr. XI internat. sympos. "Embryology andseed reproduction". St.Petersburg: Nauka, 1992. P. 6-8.

167. Batygina T.B. Problems of morphogenesis in situ, in vivo and in vitro//Proc. intern, sympos. "Plant tissue and cell culture: application to crop improvement". Prague: Czechosl. acad. sci. press, 1984. P. 43-49.

168. Beaumont V.H., Rocheford T.R., and Widholm J.M. Mapping the anther culture response genes in maize (Zea mays L.)// Genome 1995.- V.38.- P.968-975.

169. Becraft P.W., Taylor J.A. Effects of nucleus, cytoplasm and male sterile nucleus cytoplasm combination on callus initiation in anther culture of wheat//Suphytica. 1989. V.44. P. 235-240.

170. Bernard S. In vitro androgenesis in hexaploid Triticale: determination of physical condition increasing embryoid and green plant production// Z/Pflanzenzucht.l980.V.85.P.308-321.

171. Bhojwani S.S., Dunwell J.M., Sunderland N. Nucleic acid and protein contents of embryogenic tobacco pollen//J. Exp. Bot. 1973. V.24. №13. P.863-871.

172. Blaydes D.F. Interaction of kinetin and various inhibitors in the growth of soybean tissues//Physiol. Plant. 1966. V.19. № 3. P.748-753.

173. Bojadjiev P., Cuong Ph. V. Cytological and physiological studies of some varieties and F1 hubrids of rice, Oruza sativa, uging the method of anther culture //Bionature. 1988. V. 8. N 1. P. 41-46.

174. Borkird C., Choi H., Sung Z.R., Effect of 2,4-dichlorophenozyacetic acid on the expression of embryogenic programm in carrot// Plant Phisiol. 1986, 81, №4, 1143-1146.

175. Bullock W., Baenziger P., Schaeffer G. Anther culture in wheat (Triticum aestivum L.) Fi's and their reciprocal crosses//Teor. And Appl. Genet. 1982. V.62. №2. P. 155-159.

176. Buyser J., Henry Y., Taleb G. Wheat androgenesis: cytogenetical analysis and agronomie perfomance of doubled haploids // Z. Pflanzenzucht. 1985 V.95. P. 23-34.

177. Buyser J., Henry Y. Wheat: productoin of haploids, performans of doubled haploids and yield trials // Biotechnology in agriculture and forestry. Berlin. 1986.V.2.P.73-88.

178. Buyser J., Henry Y., Lonnet P., Hertzog R., and Hespel A. "Florin": a doubled haploid wheat variety developed by the anther culture method // Plant Breed. 1987. V98. №1. P.53-56.

179. Buyser J., Bachelier В., Henry Y. Gametic selection during wheat anther culture // Genome. 1989 V.32. P. 54-56.

180. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplificationfingerprinting using very shot arbitrary oligonucleotide primers// Bio/Technology.- 1991.- V.9.- P.553- 557.

181. Chang Yin-Fu, Warfield Collen Y., Itano Andrea A., Wong James R. An anther culture-derived system for transformation studies in wheat (Triticum aestivum L.) // Cell. Biochem. 1992. Suppl. 16F. P.205.

182. Charmet Gilles, Bernard Sylvie, Bernard Michel. Origin of aneuploid plants obtained by anther culture in tritikale // Can. J. Genet, and Cytol., 1986, 28, N 3, p. 444-452.

183. Charsynska M., Pfhenko. Inhibition of cytokinesis in the microspores of Tradescantia bracteata Small, by caffeine // Acta Soc. Bot. Pol. 1976. V.45. P. 469-476.

184. Chen C., Chen C. Changes in chromosome number in microspore callus of rice during successive subcultures // Can.J.Genet.and Cytol. 1980. V.22. №4. P607-614.

185. Chen C.C., Howarth M.J., Peterson R.L., Kasha K.J. Ultrastructure of androgenetic microspores of barley during the early stages of anther culture //Canad. J. Genet.Cytol. 1984. Vol. 26. N 4. P.484-491.

186. Chen Ch., Tsay H., Huuang Ch. Rice (Oryza sativa L.): factors af fecting androgenesis // Biotechnology in agriculture and forest ry. Berlin, 1986. P. 123.

187. Chi V.H., Ziauddin A., Simon E., Kasha K. Ethylene production and its effect on androgenesis in barley pollen cultures//VII Intern. Congr/Plant Tissue and Cell Culture: abstracts. Amsterdam. 1990. PI85.

188. Cho M.S., Zapata F.J. Plant regeneration from isolated microspore of indica rice//Plant and Cell Physiol., 1990. V. 31. N 6, P. 881-885.

189. Chu Ch.-Ch. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparativ experiments on the nitrogen soureces // Sci. Sinica. 1975. V.18. №5. P.659-668.

190. Chu Ch.-Ch. The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops // Proc. sympos. on Plant Tissue Culture. Peking: Sci. Press. 1978. P. 43-50.

191. Chua B.-Kh., Chen Y.-H., Omar O. Anther culture of rice hybrids 1854 and 1856 //MARDI Res. Bull. 1984. V.12. N 3. P. 275-280.

192. Chuang Ch.-Ch., Quang T.W. A set of potato media for wheat anther culture //Proc. sympos. on Plant Tissue Culture. Peking: Sci. Press. 1978. P. 51-56.

193. Clapham D. In vitro development of callus from the pollen of Lolium and Hordeum // Z. Pflanzenzucht. 1971.V.65. №2. P.285-292.

194. Clapham D. Haploid Hordeum plants from anthers in vitro // Ibid. 1973. V. 69. P. 142-155.

195. Cordewener J.H.G., Busink R., Traas J.A., Custers J.B.M., Dons H.J.M., Compagne M.M.L. Induction of microspore embryogenesis in Brassica napus L. Isaccompained by specific changes in protein synthesis// Planta.- 1994.- V.195.-P.50- 56.

196. Corduan G. Regeneration of anther-derived plants of Hyoscyamus niger L. // Planta. 1975. V. 127. N 1. P. 27-36.

197. Dale P.J. Pollen dimorphism and anther culture in barley // Planta. 1975. V. 127. N3. P. 213.

198. Day A., Ellis T.H.N. Deleted forms of plasmid DNA in albino plants from cereal anther culture // Curr. Genet. 1985. V.9. P.671-678.

199. De Buyser J. Gametic selection during wheat anther culture//Genome. 1985. V32. №1. P.54-56.

200. De Fossard R.A.Summation: method for producting of haploids/ZHaploids in higher plants: advances and potential. Proc. 1-st Intern. Symp. Guelph: University of Guelph. 1974. P.145-150.

201. De la Pena."In vitro" culture of isolated meiocytes of rye, Secale cereale L.// Environ, and Exp. Bot. 1986. V.26. №1. P.17-23.

202. Devaux P. Variation in the Proportion of Fertile Colchicine Treated Haploid Plants Derived from Whinter Barley Hybrids // Plant Breed. 1989. V.103. №3. P.247-250.

203. Dickinson H.G. The physiology and biochemistry of meiosis in the anther // Intern. Rev. Cytol. 1987. V. 107. P. 79.

204. Dodds J.H., Roberts L.W. Anther and pollen cultures // Experiments in plant tissue culture. Cambridge: Cambridge Univ. press, 1985. P. 157-171.

205. Dodds J.M., Reynolds T.L. A scanning electron microscope study of pollen embryogenesis in Hyosciamus niger / Z. Pflanzenphysiol.Bd. 97. S 271-276. 1980.

206. Doves K., Gale M. The use of random amplified polymorphic DNA markers in wheat// Theor. Appl. Genet.- 1992.- V.84.- P.567- 572.

207. Dunwell J.M. Antherand ovary culture // Cereal tissue and cell culture. Norwich: Nijhoff Publ., 1985. P. 1-44.

208. Dunwell J.M. Embryogenesis from pollen in vitro//Biotechnology in plant science. New York et al.: Acad, press Inc., 1985. P. 49.

209. Dunwell J.M., Sunderland N. Pollen ultrastructure in anther culture of Nicotiana tabacum. 1. Early stages of culture//J. Exp. Bot. 1974a. V.25. №85. P.852-861.

210. Eberle J., Arnsheidt A., Klix D., Weiler E.W. Monoclonal antibodies to plant growth regulators // Plant. Physiol. 1986. V.81. №2. P.516.

211. Ekiz H., and Konzak C.F. Nuclear and cytoplasmic control of anther culture response in wheat: I. Analyses of alloplasmic lines // Crop. Sci. 1991.V.31. P.1421-1427.

212. Evans D.A., Sharp W.R., Medina-Filho H.P. Somaclonal and gametoclinal variation/Miner.J.Bot. 1984. V.71. P.759-764.

213. Evans M.L. Function of hormones at hte cellular level of organization // Hormonal Regulation of Development. II. Berlin ect: Springer-Verlag, 1984. P. 47.

214. Fang G.-W., Liang H.-M. Influence of cold pretreatment on the efficiency anther culture of rice//Acta phytophysiol. Sin. 1985. V.l 1. №4.P.366-380.

215. Foroughi-Wehr В., Mix G., Gaul H., Wilson H.M. Plant prodaction from cultured anther of Hordeum vulgare L.//Z.Pflanzenzucht. 1976. V.77. P.l98-204.

216. Foroughi-Wehr В., Fridt W., Wenzel G. On the genetoic improvement of androgenetic haploid formation in Hordeum vulgare L. // Theor. Appl. Genet. 1982. V. 62. P. 233-239.

217. Foroughi-Wehr В., Zeller F. In vitro microspore reaction of different German wheat cultivars//Theor. and Appl. Genet. 1990. V. 79. N 1. P. 77-81.

218. Fried W. and Foroughi-Wehr B. Field perfomanse of androgenetic doubled haploids spring barley from F1 hybrids // Z. Pflanzenzuchtg. V90. P. 177-184.

219. Futchs S., Futchs G. Immunological assay for plant hormone using specific antibodies to indoleacetic acid and gibberelic acid //Biochem. Biophys. Acta. 1969. V.192. №3. P.528.

220. Galieva E.R.,Gorbunova V.Ju.,Kruglova N.N. Ultrastructre of spring wheat embryoid and callus cells // Proc. lllnt. Symp "Embriol. and Seed Reprod.", Leningrad, Juli 3-7,1990. St. Petersburg. 1992. P.164-165.

221. Gallais A. Quantitativ Genetics of Doubled Haploid Population and Applicatoin to the Theory of Line Development // Genet. 1990. V.124. №1. P.199-206.

222. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and defection of glucanases in cultures of wheat and barley //Canad. J. Biochem. 1968. V. 46. № 5. P. 417-421.

223. Geler Т., Kohlenbach H.W. Entwicklung von Embryonen und embyogenem kallus ans pollen kornern von. Datura meteloides and D. innoxie //Protoplasma. 1973. V.78. N2. P.381-396.

224. Gentzbittel L., Perrault A., Nicolas P. Molecular phylogeny of the Helianthus genus, based on nuclear restriction fragment length polymorphism (RFLP)// Mol. Biol. Evol.- 1992.- V.9.- P.872- 892.

225. G. Gerashchenkev and N. Rozhnova Subtractive self-hybridization for the isolation of differentially expressed genes in cob of AT-1 line of maize with the autonomous development of embryo// Apomixis Newsletter.- 1999.- No.l 1.- P.21-25.

226. Gibbs R.A., Chemberlain J.S. The polimerase chein reaction: a meeting report.// Genes and Development. 1989.V.3. P. 1095-1098.

227. Gillings M, Holley M. Amplification of anonymous DNA fragments using pairs of long primers generates reproducible DNA fingerprints that are sensitive to genetic variation// Electrophoresis. 1997. V.18, № 9. P.1512-1518.

228. Goldberg R.B., Barker S.J., Perez-Grau L. Regulation of gene expression during plant embriogenesis // Cell. 1989. V.56. #2. P.149-160.

229. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Androgenesis in vitro: physiological aspects of the phenomenon in cereals //Proc. XIII intern. Congress on Sexual Plant Reproduction. Vienna, 1994. P. 70.

230. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Genetical determination of the cerel androgenesis in vitro: hormonal aspects //Proc. XIV internat. Congr. on Sexual Plant Reproduction. Melbourne, 1996. P. 146.

231. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Physiological aspects of the androgenesis in vitro in cereals //Тез. докл. VIII междунар. конф. "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда". М., 1997. С. 31-.

232. Gorbunova V.Yu., Nadolskaya S.N., Basharkina N.V., Kudoyarova G.R. Abscisic and embryogenesis in sprig wheat anther culture //Abstr. XI internat. sympos. "Embryology and seed reproduction". Leningrad: Nauka, 1990. P. 53.

233. Cordewener J.H.G., Busink R., Traas J.A., Custers J.B.M., Dons H.J.M., Compagne M.M.L. Induction of microspore embryogenesis in Brassica napus L. Is accompained by specific changes in protein synthesis // Planta. 1994. V.195. P.50-56.

234. Gorska Brylass A. Transitory callose envelope surrounding the generative cell in pollen grains//Acta Soc. Bot. Pol. V. 36. # 3. Suppl. P.38.

235. Govil S., Babbar S.B., Gupta S.C. Plant regeneration from in vitro cultured anthers of black mustard (Brassica nigera Koch) //Plant Breed. 1986. V. 97. N 1. P. 64-71.

236. Graham D.S. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or large tissue masses// Analyt. Biochem. 1987. V.85. N2.P.609-613.

237. Gregoire S., Brown S., Picard E. Can one identify and sort viable P-type pollen of Triticum ae^/vww//Biol.Cell.l989.V.67.№3 Suppl.P.38.

238. Guo Zh., Sun A., Wang Yu. Studies on induction of pollen plants and androgenesis in maize//Acta bot. sin. 1987. V. 20. N 3. P. 204-208.

239. Guha S., Maheshwari S. Haploids of higher plants in vitro. Berlin et al.: Springer-Verlag, 1986. 203 p.

240. Guha S., Maheshwari S. In vitro production of embryos from anther of Datura//Nature. 1964. V. 204. N 4957. P. 497.

241. Guha-Mukherjee S. Genotypic differences in the in vitro formation of embryoids from rice pollen //J. Expt. Bot. 1973. Vol. 24. N 78. P. 139-144.

242. Guiderdoni E. Cametic selection in anther culture of rice (Oryza sativa L.).

243. Theor. and Appl. Genet. .-1991 .-81 N 3.-p.406- 412.

244. Hadwiger M.A., Heberlr-Bors E. Pollen plant production in Triticum turgidum ssp. Durum//Proc. Intern, sympos. "Genetic manipulation of plant breedings". Berlin; New York: Waler de Gruyter, 1986. P. 303.

245. Halperin W. Alternative morphogenetic events in cell suspensions //Amer. J. Bot. 1966. V. 53. N 5. P. 443-453.

246. Halperin W. Embryos from somatic plant cells//Proceed. Symp. of Intern. Soc. Cell Biol. "Control Mechanism in the Expression of Cellular Phenotypes". New York; London: Acad. Press, 1970. P. 169-191.

247. Haploids of higher plants in vitro. Berlin et al.: Springer-Verlag, 1986. 203 p.

248. Hassawi D.S., Liang G.H. Effect of cultivar, incubation tempera ture and stage of microspore development on anther culture in wheat and triticale//Plant Breed. 1990. V. 105. N 4. P. 335.

249. Hassawi D.S., Sears R.G., Liang G.H. Micrispore development in the anther culture of wheat {Triticum aestivum L.) // Cytologia. 1990. V. 55. N 3. P. 475.

250. He D.-G., Ouyang J.Callus and plantlet formation from cultured wheat anthers at different developmental stages// Plant Sci. Lettera. 1984.V.33. P71-79.

251. He D.-G., Ouyang J.-W He D.-G., Ouyang J. Observation of androgenesis in cultured wheat anthers //Acta bot. sin. 1985. V. 27. N 5. P. 469-475.

252. Heberle-Bors E. Induction of embryogenic pollen grains in situ and subsequent in vitro pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum by treatments of the pollen donor plants with feminizing agents // Physiol, plant. 1983. V.59. N 1. P. 67-72.

253. Heberle-Bors E. Genotypic control of pollen plant formation in Nicotiana tabacum L. //Theor. Appl. Genet. 1984. Vol. 68. N 1. P. 475-479.

254. Heberle-Bors E. In vitro haploid formation from pollen: a critical review//Theor. and. Appl. Genet. 1985. V. 71. N 3. P. 361-375.

255. Heberle-Bors E. In vitro pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum L. and its relation to pollen, sex balance, and floral induction of pollen donor plants/ZPlanta. 1982a. Vol. 156. N 5. P. 396-401.

256. Heberle-Bors E. On the time of embryogenetic pollen grain induction during sexual development of Nicotiana tabacum L. plants //Planta. 1982b. Vol. 156. N 5. P. 402-406.

257. Heberle-Bors E., Odenbach W. In vitro pollen embryogenesis and cytoplasmic male sterility in Triticum aestivum II Z. Pflanzenzucht. 1985. V.95. №1. P. 14-22.

258. Heberle-Bors E., Reinert J Isolated pollen cultures and pollen dimorfism //Naturwissenschaften. 1980. V.67. P.311.

259. Heberle-Bors E., Reinert J. Environmental control and evidence forpredetermination of pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum pollen// Protrplasma. 1981. V.109. P.249-255.

260. Henry Y., de Bayser J. Float culture of wheat anthers // Theor. And Appl. Genet. 1981. V.60. #2. P77-79.

261. Henry Y., de Bayser J., Guenegou Т., Ory C. Wheat microspore embryogenesis during in vitro anther culture//Theoret. and Appl. Genet. 1984. V. 67. N5. P. 439-442.

262. Henry Y., Marcotte J.-L., de Buyser J. Nuclear gametophytic genes from chromosome arm IRS improve regeneration of microspore-derived embryos//Genome. 1993. V. 36. N 5. P. 808-811.

263. Heslop-Harrison J. Compartmentation in anther development and pollen wall morphogenesis//Proc. intern, sympos. "Cell compart mental and metabolic channeling. Jena, 1980. P. 471.

264. Higuchi N., Maeda E. Reobservation with light microscope of scanning electron microscopic speciments in rice callus cultures//Jap. Journ. Crop Sci. 1991. V. 60. N2. P. 278-282

265. Hlasnikova A.Androgenesis in vitro evalusted from aspects of genetics//Z. Pflanzenzacht. 1977. V.88. №1. P.44-56.

266. Hoffmann В., Schumann G., Kruger H.-U. In vitro androgenesis in wheat (!Triticum aestivum L.). I. Effects of donor plant genotype on the development of pollen derived macrostructures and plantlets // Arch. Zucht. 1991. V. 21. N. 3. P. 153-159.

267. Hoffmann В., Schumann G., Kruger H.-U.In vitro androgenesis in wheat. 2. The influence of donor peant growth environment // Arch. Zucht 1990. Bd. 20. H. 3.P. 179.

268. Homes J.L., Guillaume M. // Bull. Soc. Roy.Bot.Beigigue.1967. T.100. #2.1. P.79.

269. Horner M., Mott R.L.The frequency of embryogenic pollen grains is not increased by in vitro anther culture in Nicotiana tabacum L.//Planta. 1979. V.147. P.156-158.

270. Horner M., Street H.E. Pollen dimorphism origin and significance in pollen plant formation by anther culture//Ann. Bot. 1978. V. 42. N 180. P. 763.

271. Ни H. Use of haploids in crop improvement. In: Biotechnology in international agricultural research/ Int.Res.Rise Inst.l985.P.75-84.

272. Ни H. Wheat: improvement through anther culture/ZBiotechnology in agriculture and forestry. Berlin. 1986.V. 2, С. 1, P. 55-72.

273. Ни H., Jing J., Xi Z., Wang X. Production of aneuploids and heteroploids of pollen derived plants // Proc. 5-th Intern. Cong. Plant Tissue and Cell Culture. Peking. 1982. P.421-424.

274. Ни Н., Huang В. Application of pollen-derived plants in crop improvement//Intern. Rev. Cytol. 1987. V. 107. P. 293-299.

275. Ни H., Liu C., Tan X., Zhou Q. Anther-Pollen Culture in Cereals // Proc. of international symposium "Wheat breeding prospects and future approaches", Albena, 1990. P. 129-132.

276. Huang B. Haploids in higher plants in vitro //Eds Ни H., Yang H.Y. New York; Heidelberg; Berlin: Springer-Verlag, 1986. P.91

277. Jacobson E., Sopory S.K The influence and possible recombination of genotypes on the production of microspore embryoids in anther cultures of Solanum tuberosum and dihaploid hybrids // Theor. Appl. Genet. 1978. V.52. P.119-123.

278. Johri M.M. Развитие и дифференцировка у растений . Development and diffelopment and differentiation in plants. Biosci, Repts.- 1988.-8,N6.-C.553-564.

279. Keller J. Some results and problems of cultyre // 3-rd Symp/Young Sci. " Physiol. And Biochem. Plants": Abstracts.- Lublice, 1986.- p.52.

280. Khan S.K., Sen O., Ghosh P.D. Scanning electron microscopic analysis during embryogenesis of Cicer arietium L. anthers in vitro//DAE Symp. Adv. Mol. Biol. Bombay, 1990. P. 411-412.

281. Kao K.N. Plant formation from barley anther cultures with ficol media//Z. Pflanzenzucht. 1981. V. 103. N 5. P. 437-443.

282. Karsia I., Bedo Z., Balla L. The effekt of repeated anter cultural on in vitro androgenesis of wheat (Triticum aestivum L.) // Cereal Res. Commun. 1991. V 19. № 4. P. 425-430.

283. Kleijer G., Schmid J., Winzeler H., Fried P.M. La culture d antheres: possibilites et limites dans la selection du ble et de 1 epeautre//Rev. suisse Agr. 1986. V. 18. N6. P. 305.

284. Koinuma K., Mochizuki N., Inoue Y. Embryoid and callus induction andplant regeneration by anther culture of Japanese local varientles of maize (Zea mays L.)//Bull. Nat. Grassland Res. Inst. 1990. N 43. P. 13-22.

285. Kott L., Polsoni L., Beversdorf W.D. Cytological aspects of isolated microspore culture of Brassica napus//Can. J. Bot. 1988. V. 66. N 8. P. 1658-1664.

286. Kudarov B.R., Anapiaev B.B., Bogouspaev K.K., Shamrov I.I., Batygina T.B. Pathways of morphogenesis in culture of wheat anther//Abstr. XI internat. sympos. " Embryology and seed reproduction". Leningrad: Nauka, 1990. P. 212.

287. Kruger H.-U. Untersuchungen zur Antherenkultur von Spargel(Asparagus offieinalis L.) Arch.Zuchtungsch., 1985,15,N l,p.53-60.

288. Kruger H.-U. Zytologische Characterisierumg androgetischer Entwicklungsphasen bei Weisen (Triticum aestivum L.) // Arch. Zucht. 1987. Bd. 17. H. 5. S. 297-307.

289. Kruger H.-U. Ein Beitrag zum Verlauf der Androgenese bei Weizen // Arch. Zucht. 1988. B. 18. N 3. P. 133-138.

290. Kruglova N.N., Gorbunova V.Ju., Potapova N.N. Cyto- and embryological aspects of wheat anther culture // Abstr. XI intern, symp."Embryology and Seed Reproduction". Leningrad: Nauka, 1990. P. 84.

291. Kruglova N.N., Gorbunova V.Ju., Potapova N.N. Cytological and embryological aspects of wheat anther culture //Proc. XI intern, symp. "Embryology and Seed Reproduction".St. Petersburg: Nauka, 1992. P. 292-293.

292. Kruglova N.N., Gorbunova V.Yu. Pollen embryoid and sexual embryo: similarity and difference// ХП Int. Congress "Plant reproductive biology. Pollen, ovules and seeds". Abstr. The Ohio State University, 1992. P. 36.

293. Kudirka D., Schaeffer G., Baenziger P.Cytogenetic characteristics of wheat plants regenerated from anther calli of "Centuck" // Can. J. Genet. Cytol. 1983. V.25. P.513-517.

294. Kyo M., Ohkawa T. Investigation of subcellular localization of several phosphoproteins in embryogenic pollen grains of tobacco //J. Plant Physiol. 1991. V. 137. N5. P. 525-529.

295. Kudarov B.R., Anapiaev B.B., Bogouspaev K.K., Shamrov I.I., Batygina T.B. Pathwey of morphogenesis in culture of wheat // XI Intern. Symp. Embryology and Seeds Reproduction: Abstracts. Leningrad. 1990. P.212.

296. Kudirka D., Schaeffer G., Baenziger P. Wheat: genetics variability through anther cultmire//Biotexhnology in agriculture and forestry. V. 2. Grops I. Berlin. 1986. P.39-54.

297. Maeda E., Chen M.-H., Inoue M. Rice: Regeneration of plant from callus cultures. // "Crops I." Berlin. 1986. P.105-122.

298. Maeda E., Nakano H. Scanning electron microscope study on pollen development in Oryza sativa L. / Japan. Jour.Crop.Sci. 1979. 48. № 4. 490-494.

299. Maheshwari S.C., Tyagi A.K., Maltorta K., Sopory S.K. Induction of haploidy from pollen grains in angiosperms the current status //Theor. Appl. Genet. 1980. V.58. N5. P.193-206.

300. Maheshwari S.C., Rashid A., Tyagi A.K. Haploids from pollen grains -retrospect //Amer. J. Bot. 1982. V. 69. N5. P.865-879.

301. Marburger J.E., Jauhar P.P. Agronomic, Isozime, and Cytogenetic Characteristics of "Chris" Wheat Doubled Haploids // Plant Breed. 1989. V.103. №1. P.73-80.

302. Marcotte W.R., Bayley C.C, and Quatrano R.S.Regulation of wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts //Nature. 1988. V.335. P.454-457.

303. Mascarenhas J.P. The biochemistry of angiosperm pollen development // Bot. Rev. 1975. V.41. N 1. P.260-314.

304. McCormick Sh. Male gametophyte development // Plant Cell. 1993. V.5. N10. P.1265.

305. McGregor L.J. and McHugher A. The influence of varios cultural factor on anther culture of four cultivars of spring wheat (Triticum aestivum L.) // Can. J. Plant. Sci., 1990, V. 70. P. 183-191.

306. Meins F. Determination and morphogenetic competence in plant tissue culture // In: Plant Cell Culture Technology. Oxford et al. 1986. P.7-25.

307. Mercy S.T., Zapata F.J. //Proc. Indian Nat. Sci. Acad. 1987. V. 53. N 3. P.253.

308. Miah M.A.A., Earle E.D., Khush G.S. Inheritance of callus formation ability n anther cultures of rice, Orysa sativa L. // Theor Appl. Genet. 1985. V. 70. N.2. P. 113-116.

309. Miao Sh., Kuo Ch., Kwei Y. Induction of pollen plants of maize and observations on their progeny //Proc. Sino-Austral. symp. "Plant tissue culture". Boston: Pitman Publ. Ltd., 1981. P. 23-34.

310. Milevska-Pawliczuk E. Induction of androgenesis in vitro in various genetic forms of Secale cereale // Biol. Peant. 1987. V.29. #4. P.295-298.

311. Millonig G. In Fifth International Congress on Electron Microscopy (Edited by S.S. Breese). New York. Academic Press. 1962. Vol.2. P.8.

312. Mitchell A.Z., Hanson M.P., Skvinsky R.C., Ausubel F.M. Anther culture of Petunia: genotipes with high frequency of callus, root or plantlet formation // Z. Pflanzenphysiol. 1980. V 100. P. 131-146.

313. Moieni A., Sarrafi A. The effects of gibberllic acid, phenylethyla mine, 2,4-D and genotype on androgenesis in hexaploid wheat {Triticum aestivum)//Cereal Res.Commun. 1996. V.24. N 2. P. 139-145.

314. Murashige T. Plant propagation through tissue culture // Ann.Rev. Plant Physiol.- 1974. Vol.25. - P.135-166.

315. Murasige Т., Skoog F. A revised medium for Growth and Bioassays with Tobaco Tissue Cultures // Physiol, plant. 1962. V.15. №13. P.473-497.

316. Nakano H., Maeda E. Cyto-histological studies on callus formation and its regeneration in anther culture of Oryza sativa L. // Japan. J. Crop Sci. 1988. Vol.58. N3. P. 409-418.

317. Narayanaswamy S., Chandy L.P. In vitro induction of haploid, diploid and triploid androgenic embrioids and plantlets in Datura metel L.//Ann. Bot. 1971. V.35. N7. P. 535-542.

318. Nitsch J.P., Nitsch C. Auxin-dependent growth of excised Helianthus tuberosus tissues // Amer.J.Bot. 1956. - Vol.43, 10. - P. 839-851.

319. Nitch J.P. Haploid plants from pollen // Z. Pflanzenzucht. 1972.V.67. P.3-18.

320. Nitch C. La culture de pollen isole sur milien syntetique //C. R. Acad. Sci. D. 1974. V. 278.№8. P. 1031-1034.

321. Nuti V., Giorgetti L., Martini G. // Proc. XI internat. sympos. "Embryology and seed reproduction". St. Peterburg.: Nauka. 1992. P.409.

322. Orias-Akins P., Vasil I.K. In vitro regeneration and genetic manipulation of grasses // Physiol, plant. 1982. V.73. N4. P.565-569.

323. Ouyang T.W., Ни H., Chuang C.C., Tseng C.C. Induction of pollen plants from anthers of Triticum aestivum L. Cultured in vitro//Sci. Sin. 1973. V. 16. N 1. P. 79.

324. Ouyang J.W., Zhou S.M., Jia S.E. The response of anther culture to culture temperature in Triticum aestivum II Theor. Appl. Genet. 1983. V.66. P.101-109.

325. Ouyang J.W. Induction of pollen plants in Triticum aestivum //Haploids in higher plants in vitro. Beijing: China acad. Publ., 1986. P. 26-41.

326. Ottaviano E., Mulcahy D. Gametophytic selection as a factor of crop plant evolution//Origin and domestical cultivated plants. Amster dam, 1986. P. 101-134.

327. Ouyang J.-W. Induction of pollen plants in Triticum aestivum //Haploids in higher plants in vitro. Beijing: China acad. Publ., 1986. P. 26-41.

328. Ouyang T.W.//Haploids in higher plants in vitro/Eds Ни H., Yang H.Y. New York; Heidelberg; Berlin: Springer Verlag, 1986. P. 26.

329. Pace G.M., Reed J.N., Ho L.C., Fahey J.W. Anther culture of the visualization of embryogenic microspores by fluorescent microscopy//Theoret. and Appl. Genet. 1987. V. 73. N 6. P. 863-869.

330. Pan Ch., Kao K. The production of wheat pollen embryo and the influence of some factors on its frequency of induction // Proc. Sino-Austral. Symp.'Tlant tissue culture". Boston: Pitman Publ. Ltd., 1981. P. 133-142.

331. Pang Hanhua, Shu Lihui, Wu Miaoxin, Sun Huihong. Studies on the anther culture of Oryza rufipogen Griffil. Studies on the induction rate of callus and the differentiation rate of green plantiet. Acta Agron. Sin. 1991. 17, N 6. p. 436-443.

332. Park S.J., Walsh E.J., Reinbergs E., Song L.S.P., Kasha K.J. Field perfomance of doubled haploid barley lines in comparison with lines developed by the pedigree and single descent methods // Can. J. Plant Sci. 1976. V.56. P.467

333. Pease D.C. In Histological Tehniques for Electron Microscopy. New York and London, Academic Press, 1964.

334. Pechan P.M., Keller W.A., Mandy F., Bergerson M. Selection of Brassica napus L. embryogenic microspores by flow sorting // Plant Cell Rep. 1988. V.7. N 6. P. 396-398.

335. Pengelly W., Meins F. A specific radioimmunoassay for nanogram quantities of the auxin, indole-5-acetic acid // Planta. 1977. V.136. №1. P.173.

336. Philip VJ., Schraudolf H. // Beitr. Biol. Pflanzen. 1987. B.62. H.l. S.9.

337. Philpott D.E., A rapid method for staining plastic-embedded tissue for light microscopy, Scientific Instruments, 1966, 11, P. 11-12.

338. Phippen C., Ockendon D.J. Genotype, plant, bud size and media factors affecting anther culture of cauliflowers (Brassica oleracea var. botrytis) //Theoret. and Appl. Genet. 1990. V. 79. N 1. P. 33-38.

339. Pierik R.L.M. In vitro culture of higher plants. Dordrecht: M. Nijhoff Publ., 1987. 344 p.

340. Picard E., de Buyser J. Obtention de plantules haploides de Triticum aestivum L. a partiv de culture d'antheres in vitro // C.R.Acad Sc. Paris. 1973.V.277. P.1463-1466.

341. Picard E., de Buyser J Nouveaux resaltuts concernoung la culture de antheres in vitro de bio tendro (Triticum aestivum) effects d un choe termigue et de la position de 1 anthere dans 1 epi //C.R.Acad. Sci. 1975. Ser. D. 281. №2-3. P.127-130.

342. Picard E., de Buyser J., Henry V. Technique de Production d'haploides de ble par culture d'antheres in vitro // Selec. Franc. 1978. № 26. P. 25-37.

343. Picard E., Hours C., Gregoire S., Phan Т.Н., Meunier J.P. Significant improvement of aqndrogenetic haploids and doubled haploid induction from wheat plants treated with a chemical hybrization agent // Theor. Appl. Genet. 1987. V.74.P. 289-297.

344. Pohler W., Schumann G., Sulze M., Kummer I. M. Cytological invesfigafion of callus fissue and regenerated plants from trificale anther culture. Biol.Zbl. 1988.107.N 6. P.643-652.

345. Powell W., Hayter A.M., Dunwell J.M., Huang B. Variation in he agronomic characters of microspore derived plants of Hordeum vulgare cv.Sabarlis // Heredity. 1984. V.52. P.19-23.

346. Qu R.-D., Chen Y. A preliminary research on the function of callus induction frequency by cold pretreatment in rice anther culture // Acta phytophysiol. sin. 1983. V. 9. N4. P. 375-381.

347. Quatrano R.S. Regulation of gene expression by abscisik acid during angio-sperm embryo development // Oxford Surv. Plant. Mol. Cell Biol. V.3. P.467-476.

348. Radojevic L., Djordjevic N., Tucic B. In vitro induction of pollen embryos and plantlets in Aesculus carnea Hayne through anther culture //Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1989. V. 17. N 1. P. 21-26.

349. Raghavan V. Induction of haploid plants from anther cultures of henbane //Z.Pflanzenphysiol. 1975. V. 76. N. 1. S. 89-92.

350. Raghavan V. Embriogenic determination and ribonucleic acid sinthesis in pollen grains of Hyascyamus niger (henbane) // Amer. J. Bot. 1979. V. 66. №1. P. 36-39.

351. Raghavan V. Origin and development of pollen embryoids and calluses in cultured anther segments of Hyoscyamus niger (Henbane) //Amer. J. Bot. 1978. V. 65 (9). P. 984-1002.

352. Raghavan V. Developmental strategyies of the angiosperm pollen: a biochemical perspective // Cell Differ. 1987. V.21. #4. P.213-226.

353. Raghavan V., Nahmani R. Cytokinin effects on pollen embryogenesis in cultured anthers of Hyoskyamus niger //Canad. J. Bot. 1989. V. 67. N 1. P. 247257.

354. Rajasekaran K., Hein M.B., Davis G.S. Endogenous Plant Growth Regulators in Leaves and Tissue Cultures of Pennisetum purpureum Schum // J.Plant Physiol. 1987. V. 129. #4. P.310-318.

355. Rashid A. Induction of embryos in ab initio pollen culture of Nicotiana/ZPlant cell culture in crop improvement. New York; London: Plenum press, 1983. P. 141144.

356. Rashid A., Street H.E. The development of haploid embryoids from anther cultures of Atropa beladonna L.//Planta. 1973. V. 113. N 3. P. 263-270.

357. Rashid A., Reinert J. Differentiation of embryogenic pollen in cold-treated buds of Nicotiana tabacum var. Badischer Burley and nutritional requirements of the isolated pollen to form embryos// Protoplasma. 1981. V. 106. N 1. P. 137-144.

358. Rashid A., Reinert J. High frequency embryogenesis in ab initio pollen cultures of Nicotiana tabacum var. Badischer Burley//Naturwissenschaften. 1981a. №68. P. 378-379.

359. Rashid A., Reinert J. In vitro differentiation of embryogenic pollen control by cold treatment and emryo formation in ab initio pollen cultures of Nicotiana tabacum var. Badischer Burley/ZProtoplasma. 1981c. V. 106. N 2. P. 285-294.

360. Rashid A., Reinert J. Selection of embryogenic pollen from cold-treated buds of Nicotiana tabacum var. Badischer Burley and their development into embryos in cultures/ZProtoplasma. 1980. V. 105. N 1. P. 161-167.

361. Rashid A., Siddiqui A.W., Reinert J. Subcellular aspects of origin andstructure of pollen embryos of Nicotiana/ZProtoplasma, 1982. V. 113. N 1. P. 202208.

362. Reddy V.S., Leelavathi S., Sen S.K. Influense of genotype and culture medium on microspore callus induction and green plant regeneration in anthers of Oryza sativa //Physiol, plant. 1985. V. 63. N.3. P. 309-314.

363. Reinbergs E., Song L.S.P., Choo T.M., Kasha J. Yield stability of double haploid lines of barley // Can. J. Plant Sci. 1978. V.58. P.929-933.

364. Reinert J. Untersuchungen uber die Morphogenese an Gewebekulturen //Berl. Deutsch. bot. Ges. 1958. Bd. 71. H. 1. S. 218-226.

365. Reynolds T. Pollen embryogenesis in anther cultures of Solanum carolinense L. //Plant Cell Repts. 1986. Vol. 5. N 4. P. 273-275.

366. Reynolds Th.L. Ethelene effects of pollen callus formation and organogenesis in anther culture of Solanum carolinense L. //Plant Sci. 1989. V.61. N 1. P. 1 Sine.

367. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain electron microscopy, Journal of Cell Biology, 1963, 17, P. 208-214.

368. Rogowsky P., Shepherd K., Zangridze P. Polymerase chain reaction based mapping of rye involving repeated DNA sequences// Genome.- 1992.- V.35.-P.612- 626.

369. Rose Ju.B., Dunwell J.M., Sunderland N. Anther culture of Sorghum bicolor (L). Maench. I. Effect of panicle pretreatment, anther incubatoin temperature and 2,4-D concentration //Plant Cell Tissue Organ Culture. 1986. V. 6. N 1. P. 15-22.

370. Sagi L., Barnabas B. Evidence for cytoplasmic control of in vitro microspore embriogenesis in the anther culture of wheat (Triticum avestivum L.) // Theor. Appl. Genet. 1988. V. 78. № 6. P. 867-872.

371. Sangwan R.S., Camerfort H. The Tonoplast, a Specific Marker of Embriogenic Microspores pf Datura cultured in vitro //Histochemistry. 1983. V.78. P.473-480.

372. Sangwan R.S., Sangwan-Norreel B.S. Biochemical cytology of pollen embryogenesis //Intern. Rev. Cytol. Orlando 1987. V.107. P. 221-272.

373. Sangwan-Norreel B.S. Male gametophyte nuclear DNA content evolution dureng androgenic induction in Datura innoxia Mill // Z. Pflanzenphysiol. 1983. V. 11. P. 47-54.

374. Schaeffer G.W., Baenziger P.S., Worley J. Haploid plant development from anthers in vitro emrio culture of wheat // Crop Sci. 1979.-19.-P.687-702.

375. Schmid J., Keller E.R. Improved androgenetic response in wheat {Triticum aestivum L.) as a result of gametocide application to anther donor plants // Abstr. L-th Inter Congr. Plant Tissue Culture. Minnesota: Universiti of Minnesota, 1986a. P.146.

376. Schmid J., Keller E.R. Effect of gametocide on the induction of haploids in Triticum aestivum II Genet. Manipul. Plant Breeding Proceeding of Intern. Symp. Berlin, N.York: Walter de Giuyter. 1986b. P.347-350.

377. Schumann G. Beeinflussung morphogenetischer Prozesse dure Temperaturvorstimulation in Antherenkulturen von Triticale // Arch. Zucht. 1986. B. 16.N3.S. 153-159.

378. Schumann G. Zur Morphologie und Entwicklung androgenetischer Makrostrukturen inntherenkulturen von Triticale. Arch Zu chtungsforsch. 1987.Bb. 17,H.4. S.245-257.-Bibliogr.:S.256 257.

379. Schumann G. Zytologisch-hiologische Untersuchungen in Triticale -Antherenkulturen. Arch. Zuchtungsforsch.1987.Bb.17, H.l. S.17-25.

380. Schumann G., Hoffman В., Kruger H.-U. Histological observations on morphogenesis from androgenetic tissues of Triticum aestivum L. II. Embryoids and embryo cell complexes//Arch. Zuchtung. 1991. Bd. 21. H. 3. S. 161-168.

381. Schaeffer G.W., Baenziger P.S., Worley J. Haploids plant development from anther and in vitro embryo culture of wheat // Crop. Sci. 1979. P.697-702.

382. Sharma K.K., Bhojwani S.S. Histological and histochemical investigations of pollen embryos of Brassica juncea (L.) Czern. //Biol, plant. 1989. V. 31. N 4. P. 276-279.

383. Shimada Т., Otani M., Hatanaka H. Genetic factors of the anther culture response in Japanese winter wheat cultivars/ZBull. Res. Inst. Agr. Resour. 1993. N 3.P. 1-4.

384. Simola L. Ultrastricture of callus culture from Betula pendula and Picea abies //Proc. V intern. congr."Plant tissue and cell culture". Tokyo: Maruzen Co. Ltd., 1982. P. 173-174.

385. Skoog F., Miller C.O. Chemical regulation of grouwth and organ formation in plant tissue cultured in vitro // Symp. Soc. Exp. Biol. Cambridge: Univ. Press, 1957.-Vol. 11. P.l 18-131.

386. Smith D.L., Krikorian A.D. Production of somatic embryos from carrot tissues in hormone-free medium. Plant Sci., 1988, 58, N 1,p.103-110.

387. Sopory S.K., Maheshwari S.C./ Development of pollen embryoids in anther cultures of Datura innoxia II Effects of growth hormones//J. Exptl Bot. 1975. V. 27. N 96. P. 58-68.

388. Stanley R.G. Pollen chemistry and tube growth//Pollen: development and physiology. London: Butterworth, 1971. P. 131-155.

389. Stanley R.G., Linskens H.F. Pollen: biology, biochemistry, management. Berlin, Heidelberg, New York: Springer, 1974. 181 p.

390. Steward F.G. Growth and organized development of cultured cells. III. Interpretation of the growth from free cells to carrot plants //Amer. J. Bot. 1958. V. 45. N 10. P. 467-473.

391. Sun Ch.-Sh. Androgenesis of cereal crops//Proc. sino-austral. sympos. "Plant tissue culture". Boston: Pitman publ. Ltd., 1981. P. 117-124.

392. Sunderland N. Anther culture: a progress report // Science progress (Oxford). 1971. Vol. 59. N236. P. 527-549.

393. Sunderland N. Pollen and anther culture//Plant tissue and cell culture. Oxford: Oxford Univ. press, 1973. P. 205-239.

394. Sunderland N. Anther culture as a means of haploid induction// Haploides in higher plants: advances potential. Guelph: University of Guelph Press. 1974. P. 92-122.

395. Sunderland N. Anther and pollen culture // The plant genome. Norwich: Inn es Inst, press, 1980. P. 171-183.

396. Sunderland N. Induction of growthin the culture of pollen.// In: Differentiation in vitro (eds Zeoman M., Trumen D.).Cambrige. Cambrige Univ. press. 1982. P. 1-24.

397. Sunderland N. The concept of morphogenic competence with referen ce to anther and pollen culture//Plant cell culture in crop improvement. New York; London: Plenum (Pleum?) press, 1983. P. 125.

398. Sunderland N., Collins G.B., Dunwell J.M. The role of nuclear fusion in pollen embryogenesis of Datura innoxia Mill.//Planta. 1974. V. 117. N 3. P. 227.

399. Sunderland N., Dunwell J.M. Anther and pollen culture//Plant tissue and cell culture. Oxford: Blackwell, 1977. P. 223-265.

400. Sunderland N., Evans L.J. Multicellular pollen formation in cultured barley anthers. II. The A, B, C-pathways//J. Expt. Bot. 1980.V. 31. N 3. P. 501-504.

401. Sunderland N., Roberts M., Evans L.J. Wildon D.C. Multicellular pollen formation in cultured barley anthers. 1. Independent division of the generative and vegetative cells//J. Exp. Bot. 1975. V. 30. N 119. P. 1133-1144.

402. Sunderland N., Roberts M. New approach to pollen culture // Nature/ 1977. V.279. № 270. P.236-238.

403. Sunderland N., Wicks F.M. Embryoid formation in pollen grains of Nicotiana tabacum//J. Exp. Bot. 1971. V. 22. N 70. P. 213-226.

404. Sung P., Chiang Ch., Pen W. The induction effect of somatic tissue in the anther cultured in vitro on androgenesis // Proc. Sino-Ausrtal. symp."Plant tissue culture". Boston: Pitman Publ. Ltd., 1981. P. 143-149.

405. Tautz O. Hypervariability of simple sequences as source for polimorfic DNAmarkers//Nucl. Acids Res.-1988.- V.16 №16.-P.6463-6470.

406. Tautz O. Trick M., Dover D.A. Criptic simplicity DNA is a major sours of genetic variation// Nature.- 1986.-V.322.-P 652-656.

407. Teplitskaya L.M. Investigation of critical events in androgenesis process in Nicotiana tabacum L. plants/ZProceed. XI internat. sympos. "Embryology and seed reproduction". St. Petersburg: Nauka, 1992. P. 553.

408. Terzi M., Sung Z. Somatic cells genetics ol plants // CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1986. V.3. №4. P.303-330.

409. Tinker N., Fortin M., Mather D. Random amplified DNA and pedigree relationships in spring barley// Theor. Appl. Genet.- 1993.- V.85.- P.976- 984.

410. Torrey J.G. Morphogenesis in relation to chromosomal constitution in longterm plants tissue cultures // Physiol, plant. 1967. V.20. #2. P.265-275.

411. Tsay S., Tsay H., Chao C. Cytochemical studies of callus development from microspore in cultured anther of rice //Plant Cell Repts. 1986. Vol. 5. N 2. P. 119123.

412. Tsukahara M., Hirosawa T. Simple dehydration treatment promotes regeneration of rise (Oryza satyva L.) callus. Plant Cell Repts. 1992, 11, N11, P. 550-553.

413. Touraev A., Fink Ch., Stoeger E. and Heberle-Bors E. Pollen selection: a transgenic- reconstruction approach.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P.12165-12169.

414. Touraev A. Ilham A, Vicente O. and Heberle-Bors E. Stress induced microspore embryogenesisfrom tobacco microspores: an optimized system for molecular studies. // Plant Cell Rept. 1996a. V. 15. P.561-565.

415. Touraev A. Indrianto A., Wratscko I., Vicente O. and Heberle-Bors E. Efficient microspore embryogenesis in wheat (Triticum aestivum) induced by starvation at high temperatures. //Sex. Plant Repr. 1996b. V. 9. P.209-215.

416. Touraev A. Pfosser M., Vicente O. and Heberle-Bors E. Stress as the major signal controlling the developmental fate of tobacco microspores: towards a unified model of induction of pollen embryogenesis. //Planta. 1996c. V. 200. P. 144-152.

417. Touraev A. Stoeger E., Voronin V. and Heberle-Bors E.Plant male germ line transformation. //Plant. 1997. V. 12. P. 949-956.

418. Trewavas A.J. How do plant growth substances woek? // Plant Cell Envir. 1981. V. 4. № l.P. 203

419. Tulecke W. A tissue derived from the pollen of Gingko biloba L. // Science. 1953. V. 117. №3048. P.599-600.

420. Van Geyt J., D Hlluin K., Jakobs M. Induction of nuclear cell divisions in microspores of sugarbeet (Beta rulgaris L.)//Z. Pflanzenzucht. 1985.V. 95. №N 4.1. Р.325-335.

421. Vasil I.K., Hildebrandt A.C. Variations of morphogenetic behavior in plant tissue cultures. II. Petroselinum hortense //Amer. J. Bot. 1966. V. 53. N 9. P.869-874.

422. Vasil I.K. The New Biology of Pollen // Naturwissenschschaften. 1973. B. 60. H. 5. S. 247-253.

423. Vasil I.K. The histology and physiology of pollen germination and pollen tube growth on the stigma and in the style//Fertilization in higher plants. Amsterdam, 1974. P. 105-118.

424. Vasil I.K. Androgenetic haploids//International review of cytology. Suppl. 11 A. L. 1980. P. 195-223.

425. Vasil I.K., Nitsch C. Experimental production of pollen haploids and their uses // Z.Pflanzenphysiol. 1975. № 3. S.191-212.

426. Void В., Nelson J.I. Production and characterization of antibodies and esteblishment of a radioimmunoassay for ribosylzeatin//Plant Physiol. 1981. -V.67, №2. -P.401-403.

427. Walton D.C., Dashek W., Galson E. A radioimmunoassay for abscisic asid// Planta.-1979.-V.146, №1.-P. 139-145.

428. Wakhlu A.K. Bajwa P.S. Citological analisis in embryogenis callus cultures and regenerated plants of Papaver somniferum L. (Opium poppy). Cytologia.1987. 52. № 3. P.631-638.

429. Wei Z.M. Pollen callus culture in Triticum aestivum II Theor. Appl. Genet., 1982, V. 63, № 1, P. 71-73.

430. Weiler E.W. An enzyme-immunolassay of cis-(+)-abscisic acid // Physiol. Plant. 1982. V.54. №4. P. 510.

431. Weiler E.W., Joourdan P.S., Conrad W. Levels of indol-3-acetic acid in intact and decapitated coleoptiles as determined by a specific and highly sensitive solid-phase immunoassay // Planta. 1981. V.153. №4. P.561.

432. Welsh J., McCleland M. Fingerprinting genome using PCR with arbitrary primers//Nucl. Acids Res. 1990. V.18, N.24. P.7213- 7218.

433. Wenzel G., Hoffman F., Potrykus I., Thomas E. The separation of viable rye microspores from mixed population and their development in culture/ZMolec. Genet. 1975. V. 138. N 1. P. 293-297.

434. Wenzel G., Hoffman F., Thomas E. Increased induction and chromosome doubling of androgenetic haploid rye // Theor. Appl. Genet. 1977. V. 51. P81-86.

435. Wenzel G. Protoplast techniques incorporated into applied breeding programs // V Intern. Protoplast Symp.: proceedings. Budapest. 1980. P.327-340.

436. Wernicke W., Milkovits L. Development gradients in wheat leaves-Responceof leaf segments in different genotypes cultured in vitro. J.Plant Physiol. 1984, V. 115. № l.P. 49-58.

437. Wernicke W., Gorsy J., Milkovits L. The albiguous role of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in wheat tissue culture. Physiol. Plantarum. 1986, V. 68. № 4. P. 597-602.

438. Wheatley W.G., Marsolais A.A., Kasha KJ. Microspore growth and anther staging in barley anther culture/ZPlant Cell Repts. 1986. V. 5. N 1. P. 47.

439. Wheeler A.W. Chandes in Growth Substanses Contents during Growth of Wheat Grains // Ann.Appl.Biol. 1972. V.72. №3. P.327 334.

440. Williams B.A., Tsang A./ Analysis of multiple classes of abscisic acid-responsive genes during embryogenesis in Zea mays//Dev. Genet. 1994. V. 15. N 5. P. 415-424.

441. Wilson H., Mix G., Foroughi-Wehr B. Early microspore divisions and subse quent formation of microspore calluses at high frequency in anthers of Hordeum vulgare L. // J. Exp. Bot. 1978. Vol. 29. N 108. P. 227-238.

442. Xu Z., Huang B. Anther factor(s) in barley anther culture // Acta bot. sin. 1984. Vol. 26. N l.P. 1-10.

443. Xu Z.-H., Sunderland N. Glutamine, inositol and the conditioning factors in the production of barley pollen callus // Plant Sci. Lett. 1981. V. 23. N 1. P. 161168.

444. Yadav N.R., Varghese T.M., Sharma D.R. Morphogenetic studies in androgenic callus of Solanum melongena L.//Curr. Sci. 1989. V. 58. N 11. P. 637639.

445. Yeoman M.M. Early development in callus cultures//Intern. Review of Cytol. V. 29. New York; London: Acad, press, 1970. P. 383-409.

446. Yistra В., Touraev A., Benito-Moreno R.-M., Stoeger E., van Tunen A.J., Vicente O., Mol J.N.M.,and Heberle-Bors E. Flavonois stimulate development, germination and tube growth of tobacco pollen/ZPlant physiol. 1992. V.100. P.902-907.

447. Zagorska N.A.,Abadjieva M.D., Oanh H.K. Factors affecting callus and plant production in anther cultures of tomato. Gen. Manipulat. Plant. Breed. Proc. Int. Symp., Berlin. (West), Sept. 8-13,1985. Berlin, New York, 1986, p.361-363.

448. Zapata F.J., Torrizo L.B., Romero R.O., Alejar M.S. Androgenesis in Oryza sativa//Proc. V Intern, congr. "Plant tissue and cell culture". Tokyo: Maruzen Co. Ltd, 1982. P. 531.

449. Zhang L.J., Anceau C., Lepoivre P. An efficient method for the regeneration of wheat (Triticum aestivum L.) from anther cultures//Bull. Rech. Agron., Gembloux. 1987.V.22 №4. P.301-314.

450. Zheng J., Ouyang J. The early androgenesis in vitro wheat anthers underordinary and low temperature // Acta genet, sin. 1980. Vol. 7. N 2. P. 165-175.

451. Zhenghua C., Changfa Q., Xuen X., Zhongtao D. Anther culture techniques of rubber tree and sugarcane //Proceed. V Intern. Congr."Plant Tissue and Cell Culture". Tokyo, 1982. P. 533-534.

452. Zhou J. Pollen dimorphism and its relation to the formation of pollen embryos in anther culture of wheat {Triticum aestivum)!IActa bot. sin. 1980. V. 22. N2. P. 117.

453. Zhu Z.-Q., Sun J.-Sh., Wang J.-J. Cytological investigation on androgenesis of Triticum aestivum!!Acta bot. sin. 1978. V. 20. N 1. P. 6-12.

454. Zimmerman J.L. Somatic embryogenesis: a model for early development in higher plants // Plant Cell. 1993. V.5. N 10. P.1411-1423.rTjCVnAFCTSEHh'U*

Информация о работе

Горбунова, Валентина Юрьевна
доктора биологических наук
Уфа, 2000
ВАК 03.00.15

Диссертация

Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Горбунова, Валентина Юрьевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы"

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Горбунова, Валентина Юрьевна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Горбунова, Валентина Юрьевна, Уфа

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы
ВАК РФ 03.00.15, Генетика