Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ состояния биологических систем с помощью ИК-спектрометрии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ состояния биологических систем с помощью ИК-спектрометрии"

На правах рукописи

Зубарева Галина Мефодьевна

Анализ состояния биологических систем с помощью ИК-спектрометрии.

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Тверской государственной медицинской академии федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию на кафедре общей и биоорганической химии

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Каргаполов Александр Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ребров Леонид Борисович доктор биологических наук, Воейков Валерий Леонидович доктор химических наук, с.н.с. Бодоев Николай Васильевич

Ведущая организация: Российская медицинская академия последипломного образования МЗ РФ

Защита состоится « Ж » 2005г в // часов

на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121 Москва, ул. Погодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Автореферат разослан « ¿г» ¿ЗГ 2005г.

Ученый секретарь ¡/А///1/1

диссертационного совета /bf f/ к.б.н. B.C. Былинкина

A^Jлл

Актуальность темы. Проблема определения значимости изменений * отдельных биохимических процессов для сохранения параметров целостного состояния и обеспечения функционирования биологических систем остается мало изученной. Доказано, что существенное значение в формировании таких параметров играет степень и характер организованности молекул водного компонента. В частности установлено, что структурообразующая функция воды обеспечивает возникновение нативных форм макромолекул [Böhm S., Abaturov L.V. 1977; Rupley J.A., Careri G. 1991; Ernest Beutler 2004]. При этом обнаружено, что действия биологически активных ионов, ферментных систем, лекарственных веществ, экологических факторов в значительной мере связаны с изменениями физико-химических и струюурных свойств воды. [Аксенов С.И 1990; Choo-LP; Jackson-M. et al. 1993; Keutsch FN, Saykally RJ. 2001; Chatake T, Ostermann A. et al. 2003]. В настоящее время вода рассматривается как организованная динамическая жидкость, в которой постоянно образуются и распадаются разнообразные по характеру и количеству ассоциаты молекул [David J. 1976; Timothy S. 2004; D.Hem Paik, I-Reen Lee et al. 2004]. Доказано, что данное вещество является необходимым составным компонентом основных структурно-функциональных элементов живых систем [Гамалей И.А., Каулин А.Б., Трошин A.C. 1997, Chatake T et. al. 2003, Kurihara К, Parak FG, Niimura N. 2003]. Существует ряд работ, посвященных изучению роли воды в биологических системах и влиянию гидратации белков на их активность [Rupley J.A., Careri G. 1991; Григорьев Е.И, Хавинсон В.Х., Малинин В.В 2003; Suzuki M et al. 2004]. Часто эффект различных внешних факторов (ионов, лекарственных веществ, различных антропогенных загрязнений) связывают с изменением состояния водной среды, а также с действием ферментов аквапарииов, контролирующих водно-солевой обмен клеток и осуществляющих транспорт молекул воды через биологические мембраны. [Keutsch FN, Saykally RJ. 2001; Hill A.E. et al. 2004; Beitz E et al. 2004].

Внимание большинства исследователей в первую очередь привлекает

проблема участия воды в обеспечении активности и структуры ферментных систем

[Эйзенберг Д., Кауцман В 1975, Kalko S.G et al 1995; Svedruzic D et al, 2005;

Mildvan AS et al. 2005; Bahnson B.J. 2005]. Доказано,

1

41 и существует равновесие

PUC • • f ft ПАЙ I

6- !КА

с..' PK

е..'с Zf tjpr

между свободной и структурной водой входящей в состав различных тканей, которое определяется характером и степенью их взаимодействия. [Рязанов МА. 1996; Ребров Л.Б 1983; Chatake Т, Ostermann A, Kurihara К 2003; Suzuki М, Kabir SR, Siddique MS 2004]. Этот факт свидетельствует о том, что состояние гидратированных биологически значимых молекул (их конформация, ее изменения в процессе функционирования) в большей или меньшей степени зависят от физико-химических параметров воды.

В связи с этим актуальной задачей является разработка эффективных методических подходов к определению целостных показателей состояния биологических систем, которые будут характеризовать суммарный эффект взаимодействия отдельных гидратированных компонентов, включая свободную воду. Наличие таких критериев, играющих самостоятельную роль в оценке функциональной активности системы и определении ее отличий от контроля, дополнительно позволят установить степень значимости изменений комплекса показателей, характеризующих отдельные биохимические реакции. Особенный интерес представляет изучение в качестве биологических систем состояния сыворотки крови больных с различной патологией. Это даст возможность продемонстрировать каким образом оценивается система с различным или одинаковым биохимическим составом по целостным критериям состояния.

Крайне перспективным является проведение исследований тонких слоев водных систем (менее 20мк), т.к., по свидетельству ряда авторов (Фесенко Е.Е и соавт. 1999), в этих условиях возникает неустойчивое состояние жидкости, что предполагает возможность получения принципиально новой информации о степени и характере взаимодействия свободной, связанной воды и сложных белковых макромолекул биологических систем в условиях различной патологии.

Цель работы и задачи исследования. Цель работы состояла в том, чтобы на основе данных ИК-спектрометрии разработать методику позволяющую характеризовать особенности целостного состояния биологических систем и использовать ее для оценки степени значимости различий их биохимического состава.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

- создать методику исследования и обработки данных, разработав аппаратно-программный комплекс, позволяющий регистрировать степень и характер колебания показателей пропускания тонкими слоями жидкости в средней * области ИК-спекгра.

- на основе полученных данных с использованием значений дисперсий девяти диапазонов средней области ИК-спектра в см'1: 3500 - 3200, 3085 - 2832, 2120-1880, 1710- 1610, 1600-1535, 1543- 1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067 - 930 и критериев многомерного анализа (расстояния Махаланобиса и критерия Бартлетга), определить оптимальные параметры состояния различных биологических систем и модельных растворов.

- с помощью аппаратно-программного комплекса «ИКАР», целостных системных показателей, компьютерных объемных образов, диаграмм рассеяния и Вороного выявить и количественно охарактеризовать различные состояния цельной крови, слюны, а также сыворотки крови контрольной группы и больных при остеопорозе, диабете, алкоголизме, гепатитах, шизофрении, эпилепсии, гипертонической и шпемической болезнях, онкологических и неврологических заболеваниях - патологиях, характеризующихся выраженной спецификой биохимических процессов;

- определить в сыворотке крови исследуемых групп больных уровень содержания общего белка, мочевины, фосфолипидов, холестерина, кальция, калия, глюкозы, трансаминазной активности.

- провести сравнительный анализ параметров состояния разведенных образцов сыворотки крови больных остеопорозом, алкоголизмом с контрольной группой.

- у больных алкоголизмом, а также при алкогольной интоксикации крыс выявить возможные механизмы участия водного компонента сыворотки крови в реализации эффекта действия этанола;

- установить возможные механизмы участия водного компонента сыворотки крови в патогенезе остеопороза.

- выявить особенности влияния на состояние модельных водных растворов веществ различной химической природы и биологической активности (ионов калия, натрия, кальция, этанола, глюкозы, аскорбиновой кислоты, тироксина,

тирозина и пероксида водорода), дифильных веществ (липосом фосфолипидов)

- провести сравнительный анализ параметров целостного состояния модельных растворов веществ различной функциональной активности (метаболит, регулятор, необходимый компонент биологических мембран)

Новизна исследования

1. Впервые в девяти диапазонах (3500 - 3200см'1, 3085 - 2832см"1, 2120 - 1880 см"1, 1710 - 1610см"1,1600 - 1535см"1,1543 - 1425см 1430 - 1210см 1127 -1057см"1, 1067 - 930см"1) средней области ИК-спекгра обнаружено явление колебания показателей пропускания ИК-излучения, проходящего через тонкие слои водных модельных растворов и биологических систем, параметры которого позволяют оценивать суммарный эффект степени организованности отдельных компонентов и молекул воды.

2. Впервые на основе результатов ИК-спекгрометрии разработана методика, позволяющая определять целостное состояние биологических систем с помощью дисперсии показателей пропускания, критериев Махал анобиса, Бартлетта, диаграмм рассеяния, Вороного, компьютерных образов. Это дает возможность оценивать значимость изменений отдельных биохимических показателей для всей системы в целом.

3. Впервые на примере сывороток крови больных осгеопорозом, алкоголизмом, диабетом, гепатитами, шизофренией, эпилепсией, гипертонической и ишемической болезнями, онкологическими и неврологическими заболеваниями доказано существование различных типов их состояний, количественные характеристики которых при вирусных гепатитах, сердечно-сосудистых заболеваниях, алкоголизме согласуются с биохимическими показателями активности трансаминазы, фосфолипидов и холестерина

4. Впервые установлено, что критерии Махал анобиса и Бартлетта позволяют определять различие в состоянии водного компонента сыворотки крови при ряде заболеваний (остеопорозе, ушибе головного мозга, эпилепсии, шизофрении), которые традиционными биохимическими показателями не устанавливаются

5. Впервые на модельных растворах полярных, неполярных, дифильных веществ органической и неорганической природы, обладающих различной биологической активностью, показана способность химических соединений * определять параметры целостного состояния водных систем.

6. Разработан, запатентован и сертифицирован как новый тип измерителя ИК-спектрометр, позволяющий в девяти диапазонах средней области спектра (3500-960см*1) количественно регистрировать величины колебания показателей пропускания ИК-излучения различных водосодержащих систем.

Практическая и теоретическая значимость.

Удалось установить, что неоднозначные по составу биологические системы сыворотки крови больных с различной патологией характеризуются различными типами целостного состояния, которые могут быть количественно оценены критериями Махаланобиса и Бартлетта и идентифицированы с помощью диаграмм Вороного. Разработанные таким образом критерии состояния биологических систем позволяют оценить важность для всей системы в целом разнонаправленных изменений ряда параметров, происходящих в анализируемом водном объекте. Значение полученных результатов для практики заключается в том, что разработанная аппаратно-программная система в комплексе с другими методами дает возможность оперативно осуществлять диагностику заболеваний, а также оценивать суммарный эффект влияния экологических факторов на процессы жизнедеятельности, проводить скрининг биологически активных веществ а также фармацевтических препаратов

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный метод определения состояния водосодержащих систем основанный на использовании параметров обнаруженного явления колебания показателей ИК-излучения, проходящего через тонкие слои жидкости в девяти широких диапазонах средней области спектра.

2. Способ оценки состояния биологических систем и водных модельных растворов с помощью величин дисперсии показателей пропускания ИК-излучения исследуемых диапазонов, данных кластерного и многомерного анализа,

диаграмм рассеяния и Вороного, объемных компьютерных образов и их профилей.

3. Существование различных типов состояний сыворотки крови при остеопорозе, диабете, алкоголизме, шпемической и гипертонической болезнях, эпилепсии, шизофрении, вирусных гепатитах А, В, С, рассеянном склерозе, раке желудка и молочной железы, опухоли и ушибе головного мозга.

4. Наличие взаимосвязи между параметрами состояния водных модельных систем и характером химической природы, атакже функциональной активности ряда компонентов биологических систем (фосфатидилхолинов, сфингомиелинов, фосфатидилинозитов, тироксина, тирозина, глюкозы, этанола, аскорбиновой кислоты, ионов водорода, калия, натрия, кальция, магния, пероксида водорода).

5. Особенности параметров состояний образцов сыворотки крови больных остеопорозом, алкоголизмом, контрольной группы, а также модельных растворов веществ различной биохимической активности, характеризующихся изменяющимся объемом водного компонента

Апробация материалов диссертации.

Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на ХП съезде психиатров России (Москва 1995), IV Международной конференции челюсгно-лицевой хирургии и стоматологии (СЛетербург, 1999), научно-практической конференции «Эколого-медицинские аспекты состояния и среды обитания населения Тверской области и города Твери» (Тверь, 1999), межрегиональной научно-практической конференции «Качество питьевой воды, водоотделение и здоровье населения» (Рязань, 2000), Всероссийской конференции «Обеспечение качества и безопасности алкогольной продукции» (Москва, 2000), IV международном салоне промышленной собственности «Архимед-2001» (Москва, 2001), XIII Международном симпозиуме «Международный год воды» (Австрия, 2003), Ш Международном кошрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биолоши и медицине» (СЛетербург, 2003), Российском конгрессе по остеопорозу (Москва, 2003), международной научной конференции "Социально-медицинские аспекта состояния здоровья и среды обитания населения, проживающего в йод-

дефицитных регионах России и стран СНГ" (Тверь, 2003), V и VI международном конгрессе «Экватек» (Москва, 2002, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 46 печатных работы: 26 статей, из них 10 статей в центральной печати; 15 тезисов докладов на международных конгрессах и конференциях, а также авторское свидетельство №1802341 и патенты Р.Ф. №2148257, № 2164685, №2137126, №2164350.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 260 страницах машинописного текста, включая 8 таблиц, 89 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав результатов исследований, выводов, списка литературы, включающего 270 источников.

Материалы исследования.

В качестве анализируемых биологических систем использовали сыворотку крови 60 подопытных крыс, слюну, цельную кровь, а также сыворотку крови больных диабетом, алкоголизмом, остеопорозом, эпилепсией, шизофренией, вирусными гепатитами, гипертонической и ишемической болезнями, онкологическими заболеваниями с контрольной группой. Во всех исследуемых группах сыворотку крови брали натощак у лиц в возрасте от 35-59лет со средними и легкими формами заболеваний, т.к. при тяжелых возникают глубокие изменения метаболизма, связанные с осложнениями. Отбирались больные до лечения с четко выраженными клиническими симптомами. Диагностика вирусных гепатитов проводилась маркерными антигенами. Наличие онкологических заболеваний подтверждалось рентгенологически, а также соответствующими маркерами и гистологически. При диагностике сердечно-сосудистых заболеваний использовались данные электрокардиографии, артериального давления, велоэргометрии, определения активности трансаминаз, креатинкиназы, лакгатдегидрогеназы. Наличие остеопороза доказывалось рентгенологически, с помощью денситометрии костной ткани, а также определением коэффициента соотношения мышечной и костной массы. Диабетические больные характеризовались уровнем глюкозы, не

превышающим 14,0мМ/л до лечения. Диагностика психических и неврологических заболеваний осуществлялась на основе клинических и анамнестических данных, рентгенологических исследований. При этом в каждой исследуемой группе стандартными методами проводили биохимический анализ сыворотки крови, определяли общий белок, мочевина, фосфолипиды, холестерин, кальций, калий, глюкоза, трансаминазная активность.

Одновременно с биологическими системами анализировали состояние модельных растворов веществ различной химической природы и биологической активности в разведениях от 10* до 101браз. В качестве экспериментального материала использовали дважды перегнанную деионизованную воду и 1М растворы биологически активных веществ: KCl, NaCl, СаС12, MgCl2, пероксида водорода, аскорбиновой кислоты, глюкозы, этанола, тирозина, тироксина, а также липосомы из фосфатидилхолинов, сфингомиелинов, фосфатидилинозитов, выделенных из сыворотки крови с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Исследуемые водосодержащие системы в зависимости от поставленной задачи измеряли в течение 30с и анализировали сразу или после последовательного многократного разведения в 10|враз для получения серии растворов, каждый из которых подвергался анализу. Приготовление растворов сопровождалось их тщательным десятикратным перемешиванием с помощью дозатора, затем образцы оставляли на 20мин при комнатной температуре, после чего проводили спектрометрию.

Методы исследования. 1. ИК-спектрометрия с помощью аппаратно-программного комплекса «Икар».

В работе использовался разработанный совместно с сотрудниками НИИ-2 МО

РФ аппаратно-програмный комплекс, представляющий собой девятизональный спекхроанализатор. Положение и число исследуемых диапазонов выбрано, исходя из особенностей спектров поглощения воды и фундаментальных компонентов крови. Цикл девяти измерений не превышал 1 секунды. Спектральная область действия прибора составляла от 3500см"1 до 960см"1, объем исследуемого материала 0,02мл. С помощью интерференционных фильтров выделялись следующие диапазоны в см'1: 3500 - 3200, 3085 - 2832, 2120 - 1880 , 1710 - 1610, 1600 - 1535, 1543 - 1425, 1430 - 1210, 1127 - 1057, 1067 - 930. Спектрометр

сертифицирован как новый тип измерителя (сертификат № 5745 от 20.11 98г.), который позволяет регистрировать дисперсии показателей пропускания ИК-излучения после их многократного определения в девяти широких диапазонах в * слоях жидкости толщиной 15мк [Каргаполов A.B. в соавт. Патент Р.Ф. №2137126, 1999]. Кюветы, в которых проводили анализы, изготавливали из фтористого кальция, а также сплава хлористо-бромистого и йодисто-бромистого талия (KRS). Для сравнения состояний исследуемых водосодержащих систем в качестве эталона были взяты предварительно определенные значения дисперсий показателей пропускания ИК-излучения тонких слоев (15мк) бидистиллированной воды (рН=6,7±0,2; р=17Мом'См). В процессе создания эталона было изучено влияние на дисперсию показателей пропускания температурного фактора, а также особенности действия на состояние воды водонерастворимых материалов (германия, кремния, графита, фуллерена, алмаза, стекла, кварца). Полученные результаты были учтены при калибровке прибора и создании программного обеспечения.

Первичную обработку сигнала с аппаратно-программного комплекса «ИКАР» и аппаратных данных проводили специализированным программным обеспечением, разработанным для этих целей на базе операционной системы Windows ХР в вычислительной среде системы MATLAB 6.5 фирмы Math Works Ine (лицензия №146229).

2. Анализ состояний биологических систем.

Для анализа состояний различных биологических систем был использован комплекс подходов и методов, который включал в себя определение традиционных биохимических показателей основных компонентов систем (белков, липидов, углеводов, минеральных соединений), а также создание компьютерных объемных образцов состояний и их профилей - на основе данных ИК-спектрометрии. С помощью многомерного анализа рассчитывались целостные системные критерии Махаланобиса и Бартлетта, позволяющие оценивать соответственно статические и динамические свойства состояния; проведение кластерного анализа дало возможность по критерию «осыпи» определить наиболее оптимальное количество состояний. Использование диаграмм рассеяния и Вороного для аналитической и графической интерпретации полученных результатов позволило определить на

основе дистанционного анализа степень их близости друг к другу и сформировать группы [Сошникова Л.А., Тамашевич В.Н. 1999]..

3. Построение объемных образов.

Построение объемных образов состояний исследуемых систем проводилось в следующей последовательности. Для каждого из девяти диапазонов средней области ИК-спектра на основании 30 измерений, полученных за 30с, определяли среднее значение показателей пропускания. После чего для всех измерений подсчитывали абсолютные величины отклонений. Используя полученные значения, строили квадратичную матрицу размером 9x9, состоящую из 81 ячейки, которые содержали значения произведения величин отклонений показателей пропускания, полученных путем последовательного их перемножения друг на друга. В результате по диагонали матрицы оказывались произведения величин отклонений одинаковых диапазонов, т.е. их квадраты, представляющие собой дисперсию, которая определяла вариацию системы, остальные ячейки обозначались как ковариации. Величины ковариации ячеек в трехмерном пространстве изображали вертикальными линиями, перпендикулярными плоскости матрицы, и затем аппроксимировали поверхностью, конфигурация которой отражала особенности их взаимосвязи, формируя таким образом портрет целостного состояния. Для более наглядной демонстрации объемных образцов созданных моделей получали их 20 кратные плоскостные профили (табл. 1). Созданный образ и его профиль является усредненным и строился на основании каждой биологической системы, входящей в анализируемую группу. Данная характеристика не является количественной, однако может быть использована для оперативного экспресс-анализа систем.

4. Многомерный анализ результатов ИК-спектрометрии и определение критериев Махаланобиса и Бартлетта.

С помощью многомерного анализа с использованием ковариационных

матриц рассчитывался критерий Бартлетта, который позволил при наличии эталона (бидистиллированной воды) определять степень различия дисперсий анализируемых систем на основании математического выражения: IV = Ь*(-21т), где параметры Ъ и -21т определяются по формулам: Ь = 1 - -

l^ifarW * 3,13; -2lnv = (£j~,(nrl)) * ln\S\ - T2]-i((nrU*^\Sj\), где nj - число строк в таблице данных, Sj - ковариационные матрицы данных, S - объединенная ковариационная матрица. Величина многомерного критерия Бартлетга * сравнивается с/2^ (Хи-квадрат распределение) - значениями: а ~ 0,05; v = п]+пг2. Следовательно, данный показатель характеризует целостное состояние с позиций его динамичности.

Для учета характера изменений абсолютных показателей пропускания исследуемых систем применялся целостный критерий - расстояние Махаланобиса, который также рассчитывался при сравнении исследуемого объекта с эталоном. В данном случае анализировали средние значения показателей пропускания инфракрасного излучения двух многомерных выборок биологических жидкостей по формуле: DB3 = (M0-MJ *(M0-MJгде M0 и М, - векторы средних выборок «образца» и «эталона соответственно, S,'1 - обратная ковариационная матрица «эталона»,'- знак транспонирования.

5. Алкоголизация крыс в эксперименте.

В эксперименте опыты проводили на беспородных белых крысах-самцах массой 200-250г. Животным внутрибрюшинно вводили 25% раствор этанола в дозе 3,5г/кг согласно стандартной методике, моделирующей состояние ' острой алкогольной интоксикации [Ю.В.Буров, 1985]. Через 6 часов брали кровь из хвостовой вены. Препараты этанола вводили как в чистом виде, так и в присутствии примесей (изобутилового, изопропилового и метилового спирта, а также ацетальдегида, этилацетата, метилацетата). [В.П.Нужный, 1998; А.П.Еськов и соавт. 2000]. Для выполнения работы эталонный спирт был предоставлен д.б.н. В.П.Нужным (НИИ наркологии г. Москвы)

6. Стандартная ИК-спектроскопия.

Анализ образцов цельной крови, бидистиллированной воды, этилового спирта, стандартных препаратов фосфатидилхолинов (фирма «Coch-Light» Англия), сфингомиелинов(фирма «Sigma», Германия), фосфатитшшнозитов (фирма «Serva»CIIIA), а также их смесей проводили с помощью спектрофотометра модели 270-30 (фирма .Hitachi", Япония) при длине волны 4000-400 см"1. Для

съемки ИК-спекгров использовали жидкостные кюветы с окошками из KRS-5 (41,7% ТеВг +58,3% Tel) толщиной слоя 25 микрон.

7.Препаративное выделение фосфатидилхолинов (ФХ), сфингомиелинов (СФМ) и фосфат ид ил инозитов (ФИ) с помощью тонкослойной хроматографии.

Аналитическое и препаративное выделение ФХ, СФМ и ФИ из многокомпонентной смеси липидов осуществляли с помощью проточной тонкослойной хроматографии в камерах оригинальной конструкции [Каргаполов A.B., 1981]. В качестве адсорбента использовали силшсагель ("Chemapol"). Количественное определение отдельных фракций проводили денситометрическим способом по степени обугливания пятен после проявления хроматорамм хромовой смесью и построения калибровочной кривой зависимости пиков денситограмм от количества фосфора стандартного препарата фосфатидилхолинов (фирма «Coch-Light» Англия), сфингомиелинов(фирма «Sigma», Германия), фосфатитилинозитов (фирма «Serva»CIIIA). Экстракция липидов сыворотки осуществляли по методу Блайя и Дайера [Bligh E.G., Dyer W.J., 1959].

8. Методика получения липосом.

При йриготовлении липосом использовали фракции фосфатидилхолинов, сфингомиелинов, фосфатитилинозитов, выделенные из сыворотки крови. Для получения 1% раствора эфирный раствор фосфолипидов добавляли к бидистиллированной воде. Данный процесс проводили на водяной бане при t=40±2°C при постоянном перемешивании на роторной мешалке. Интенсивное механическое воздействие продолжали в течении 20 минут. В результате данного процесса в водной среде образовались мультиламеллярные липосомы сферической формы, диаметром от 30 до 100 мкм, хорошо видимые под световым микроскопом [Бабак В.Г. 1991].

Результаты исследований и их обсуждение.

1. Комплексный подход к анализу сыворотки крови при различных заболеваниях.

В данном разделе работы в качестве биологических систем характеризующихся определенным составом и активностью использовались

образцы сыворотки крови больных с наиболее распространенными заболеваниями, диагностика которых на основе клинико-биохимических исследований не вызывала сомнений. Представляло интерес с помощью разработанного метода ИК- " спектрометрии показать, какое значение имеет состояние водного компонента сыворотки крови в комплексной диагностике заболеваний, особенно в тех случаях, когда широко используемые биохимические показатели практически не изменяются при возникновении патологий. В таблице 1 и 2 представлены результаты анализа состояний сыворотки крови с помощью критериев Махаланобиса и Бартлетга, а также объемных образов и их профилей, одновременно приведены данные биохимических показателей: белков (общий белок, мочевина), липидов (холестерин, фосфолипиды), углеводов (глюкоза), минеральных веществ (кальций, калий), ферментов (скрининг-тест трансаминазная активность).

Таблица 1

Характеристика сыворотки крови при различных заболеваниях с помощью

целостных критериев, пространственных моделей и их горизонтальных профилей.

№ п/п Заболевание Количественные параметры Визуализация

Значение крите РЕЯ (М±ш) Объемные образы Горизонтальные профили

Махаланобиса Бартлетга

1 Остеопороз 11=56 29 13* 31416*

2 Алкоголизм п = 48 414117* 191128* Ж О ^^¿¿Ф

3 Диабет п = 52 234+ 12* 214116* 4-

4 Гипертоническая болезнь п = 50 7318* 91114*

5 Ишемическан болезнь сердца п = 47 39 + 6* 83 ±11* 1 л ' ^ о

6 Гепатит-А п = 42 99+18* 434 ±10* <9

7 Гепатнт-В п = 45 98 ±9* 348 ± 12* 1 то т - О о • (2) 'Ой <а? • * ®

8 Гепатит-С п = 40 62 + 6* 364 ±13* [Б

9 Шизофрения п = 56 259 ±4* 219 ±11* Л О

10 Эпилепсия п = 44 248 ±19* 153 ± 14*

11 Рак желудка п = 46 172 ± 5* 248 ±10* + ОШ

12 Рак молочной железы п = 40 161 ±4* 271 ±9* т | »<> |о]) » 0 •©¡о

13 Опухоль головного мозга п = 39 201 ± 6* 254 ±7*

14 Ушиб головного мозга п = 60 26 ±3* 183 + 8* ©>0# - ©о @

15 Рассеянный склероз п= 57 51 ±2* 192 ±12* • °! О о о О

16 Контроль (здоровые) п = 60 114 ±29* 683 ± 36* 1

17 Эталон (дистиллированная водМ = 2°С) 0 + 2 0 + 5 г

• - достовернось различий по отношению к контролю (р<0,05)

Сравнительный анализ новых критериев и биохимических показателей дает возможность отметить определенную их взаимосвязь. Так, например, для больных гепатитами установлено, что повышенная активность аланинаминотрансферазы соответствует высоким показателям Бартлетта. В то время как низкие значения Махаланобиса и Бартлетта при ишемической и гипертонической болезнях сопровождаются повышенным содержанием холестерина и фосфолшшдов. Установлено, что низкий уровень холестерина, обнаруженный у больных алкоголизмом, характеризуется высокими критериями Махаланобиса. Одновременно отмечается, что минимальные расстояния Махаланобиса при остеопорозе, а также достоверные отличия целостных показателей от контроля при психических, онкологических и неврологических заболеваниях не сопровождаются какими-либо изменениями приведенных биохимических показателей. Следовательно, как показывают полученные данные, новые критерии состояния биологических систем не только согласуются с традиционными биохимическими показателями, характеризующими представленные группы заболеваний, но и дают новую интегральную информацию, анализ которой позволит более точно определять состояние сыворотки крови и проводить диагностику заболевания. Приведенные в таблице 1 объемные образы являются усредненными и построены на основании анализа ковариационных матриц показателей ИБС- спектрометрии сыворотки крови всех больных в каждой исследуемой группе.

Таблица 2

Биохимические показатели состояния белков, липидов, углеводов, минеральных веществ сыворотки крови при различных заболеваниях

№ п/ п Заболевание л 1 1 Мочевина мМ/л Холесерин мМ/л Фосфолициды мМл Калий мМл Кальций мМл Глюкоза мМл Аминотране-фероза ед.

1 Остеопороз 78,1± 2,4 6,3± 1,3 2,8± 0,3 2,4± 0,2 4,1± 0,4 2,0± 0 Л 4,6± 0,4 25± 3,0

2 Алкоголизм 76,3± 2Д 7,9± 1,6 2,1± 0,2* 3,0± 0,3 4,0± 0,3 23± ОД 3,3± 0,4 85± 12

3 Диабет 78,4± 2Д 6,1± 0,6 3,3± 03 2,8± ОД 3,4± 0,4 2,5± 0,2 7,б* 0,9* 48± 4,0

4 Гипертоническая Болезнь 78,2± 2,4 5.8± и 4.9± 0,4* 3 Д± 0,3* з,з± 0 л 2,2± 0 Л 4,9± 0,5 42± 2,0

5 Ишемическая Болезнь 77,3± 2,7 6,8± 0,9 6,9± 0,5* 3,8± ОЛ* 3,4± 0,4 2,1± ол 4,8± 0,4 62± 11

6 Гепатит А 77,2± 2,1 5,2± 1,4 2,8± 0,3 2,8± 0,4 4 Д± 0,4 2,3± 0,2 5,0± 0,5 225± 35*

7 Гепатит В 79,1± 1.7 6,8± 1,1 2,6± од 2,7± 0,3 2.1± 0 Л 2.8± 0,3 4,6± 03 275± 28*

8 ГепатитС 77,4± 1.8 6,9± 1,6 2,8± 0,2 2,1± 0 л 4Д± 0,4 2.2± 0 Л 4.3± 0,4 318± 18*

9 Шизофрения 79,4± 1,9 5Д± 0,8 3,4± 03 2.8± 0 л 4,7± 0,4 2,5± 03 4,9± 0,4 32± 2

10 Эпилепсия 76,4± 2,5 4,2± 0,8 3,4± 0,4 2,1± ОД 4,3± 0,4 2,4± 0,3 3,1± 0,4 28± 3

11 Рак желудка 77.3± 2,1 6,9± 1,1 3,8± 0,4 2,3± 0,3 5,5± 0,6 2,4± 0,3 3,0± 0,4 35± 3

12 Рак молочной Железы 77,3± 2,2 6,1± 0,9 3,1± 0,3 2,4± 0 Л 4,5± 0,5 2,5± 0,2 3,2± 0,5 39± 4

13 Опухоль мозга 72,9± 1,8 6,1± 0,9 3,8± 0,3 2 Д± 0,3 5 Д± 0,5 2Д± од зд± 0,4 42± 5

14 Ушиб головного Мозга 76,5± 1,5 6,2± 1,1 3,2± 0,3 2.3± 0,28 4,1± 0,4 23± од 33± 0,5 22± 2

15 Рассеянный Склероз 76,1± 2,8 6Д± 0,9 3,8± 0,3 2,6± 0,3 4Д± 0,5 2,4± 0,3 зд± 0,5 27± 5

16 Контроль 78,1± 2,1 5,5± 0,8 3,1± 0,4 2,7± ол 4,6± 0,5 2,5± ОД 4,8± 0,6 24± 6,0

* - достовернось различий по отношению к контролю (р<0,05)

Обнаружено, что объемные образы могут изменяться в каждой отдельной группе, но в пределах средних отклонений целостных показателей Махаланобиса и Бартлетга. Данные таблицы характеризуют состояние сыворотки крови не только -визуально, но и количественно с помощью критериев Махаланобиса и Бартлетга. Анализ их дает возможность утверждать, что по этим показателям статистически достоверно контрольная труппа отличается от анализируемых патологий (р<0,05), Следует отметить, что в работе не ставилась задача осуществлять дифференциальную диагностику по целостным показателям. Проводя анализ, можно отметить, что по расстоянию Махаланобиса сыворотка крови больных эпилепсией, шизофренией, диабетом, опухолью мозга, мало отличается друг от друга, в то время как по критерию Бартлетга отмечается сходство сыворотки крови больных алкоголизмом, шизофренией, диабетом, ушибом головного мозга. Поэтому чтобы различить данные заболевания по результатам ИК-спекгрометрии, необходимо было применить дополнительные подходы. Одним из таких подходов является использование кластерного анализа, который позволил построить диаграмму возможных вариантов группировки исследуемых состояний (рис. 1). На основании критерия «осыпи» сделано заключение о том, что все исследуемые системы разделяются на восемь кластеров. При этом наиболее близкой к контрольной группе по показателям состояний являются труппы (VII, VI), включающие вирусные заболевания (гепатиты А.В.С.) и осгеопороз, затем формируются V и IV кластеры, представляющие соответственно сердечнососудистую и неврологическую патологию. Отдельно классифицируется Ш кластер больных алкоголизмом. Наиболее существенная разница в состоянии сыворотки крови по сравнению с контролем наблюдается в кластерах П и I, формирующихся соответственно на основании системных показателей, характеризующих онкологические заболевания, а также эпилепсию, шизофрению и диабет -патологий, которые отличаются стойкими необратимыми изменениями процессов функционирования сложных белковых комплексов различных ферментных систем. Таким образом, кластерный анализ дал возможность сделать вывод о том, что наиболее предпочтительное количество типов состояний сыворотки крови больных с исследуемыми патологиями соответствуют восьми. Для утверждения данного предположения используется диаграмма Вороного, которая в большей степени

является аналитическим средством, чем просто графическим (рис. 2).

17

мг&мИмп

450

Рис. 1. Дендрограмма

состояний сыворотки крови при различных заболеваниях

I

Примечание: 1- остеопороз, 2 -алкоголизм, 3 - диабет, 4 -гипертоническая болезнь, 5 -ишемическая болезнь сердца, 6, 7, 8 - гепатита А, В, С, 9,10 -шизофрения и эпилепсия, 11,12,

13

онкологические

100

I II Ш IV —-IV VI VII VIII

заболевания, 14,15 -неврологические заболевания, 16 - контрольная группа

о

п гн! П п

3 > И 11 12 13 2 4 5 14 19 1 а 7 а и

!|Щ«) ибопотш

В ней пространство между точками данных, представленными в координатах целостных показателей, делится границами на такие области, каждая точка которой находится ближе к заключенной внутри точке данных, чем к любой другой соседней. На диаграмме Вороного два значения критериев целостных показателей (Махаланобиса и Бартлегга) превращаются в одну точку, определяющую состояние "исследуемой системы. В каждой группе точек, сформированных с использованием результатов кластерного анализа, определяется среднее значение (обозначенное на рисунке +). Затем на основе анализа расстояний между точками формируются границы областей. В пределах границ каждой области любая дополнительно внесенная точка, характеризующая состояние сыворотки крови больного с неизвестным заболеванием, будет находиться ближе к этой группе, чем к соседним, что может быть успешно использовано для определения типа состояния сыворотки при диагностике заболеваний. На диаграмме Вороного убедительно демонстрируется тот факг, что определенные с помощью ИК-спектрометрии состояния сыворотки крови формируются в труппы, которые совпадают с соответствующими клиническими формами заболеваний (вирусные, сердечнососудистые, онкологические и т.д.). Это свидетельствует о том, что параметры сыворотки крови, определяемые с помощью ИК-спектрометрии, являются ее объективной характеристикой.

Рис 2. Диаграмма Вороного различных состояний сыворотки крови при различных заболеваниях

Примечание: 1- остеопороз, 2 - алкоголизм, 3 - диабет, 4 - гипертоническая болезнь, 5 - шпемическая болезнь сердца, 6, 7, 8 - гепатиты А, В, С, 9,10 -шизофрения и эпилепсия, 11, 12, 13 - онкологические заболевания, 14,15 -неврологические заболевания, 16 - контрольная группа, + - средний показатель данной области.

Таким образом, с помощью разработанного аппаратно-программного комплекса получена принципиально новая информация, позволяющая количественно и визуально определять типы состояний сыворотки крови, которые характерны для различных заболеваний, что может быть использовано при их диагностике.

2. Влияние величины водной составляющей биологических систем на дисперсию показателей ИК-излучения.

Для того чтобы подтвердить значимость участия водного компонента в

изменениях целостных показателей биологических систем, представленных сывороткой крови больных с различной патологией, проведено исследование образцов, полученных путем последовательного разведения исследуемого материала на несколько порядков. При этом все пробы имели одинаковый объем и уменьшающееся в 10 раз при каждом разведении количество сыворотки. Представляло интерес выяснить: зависит ли характер изменений дисперсий

исследуемых показателей растворов сыворотки крови от количества водного компонента.

Установлено, что в исследуемых областях ИК-спектра в тонких слоях сыворотки крови здоровых людей наблюдаются специфические для каждого разведения изменения дисперсий показателей пропускания. Анализ исследуемых величин позволил обнаружить, что в интервале ИК-спектра 3085-2832см-1 разведение сыворотки в 101 и 102 раз не вызывает изменения дисперсии исследуемой величины, затем при последующем разведении происходит увеличение показателя в 1,5 раза по сравнению с контролем (р<0,05) (рис.За). Этот факт находится в соответствии с литературными данными, свидетельствующими о том, что ряд ферментных систем при данных концентрациях проявляет свою максимальную активность [ВоясоЬоиик Б., вгегуегук А. 1991; Бурлакова Е.Б. 1994]. Максимальные значения обнаружены для разведения в 109, Ю10, 1013 раз, что выше значения контроля в 1,8 раза (р<0,05). В области 2120-1880см'\ 1710-1610СМ"1 и 1600-1535СМ"1 колебания дисперсии имеют сходный характер. Максимальное значение величины дисперсии определено при разведении в Ю10, что выше минимального установленного для разведения 10б и 10® и контроля соответственно в 3,0 и 1,7 раза (р<0,05) (рис. Зв). Следует отметил., что при разведениях 1013-1016раз в диапазонах ИК-спекгра ШО-ШОсм"1, 1600-1535 см"1, 1543-1425см"'1430-1210см"1, 1127-1057см"1, 1067-963СМ"1 не происходит изменения дисперсии показателей пропускания сыворотки крови, значения которой остаются стабильными и не имеют достоверных отличий от контроля. Полученные результаты и имеющиеся литературные данные о высокой активности различных биологически активных веществ (гормонов и факторов роста, опоидных пептидов, веществ непептидной природы) в сверхмалых количествах находятся в соответствии и предполагают, что действие веществ опосредуется через изменения структурных свойств воды [Бурлакова Е.Б 1989-2004; Лобышев В.И 200-2004; Бульенков Н.А 1998-2003]. В области 1543-1425 см"1 интервалы разведения от 101 до 107раз и от 10* до 1013раз характеризуются сходными изменениями дисперсий (рис. Зс), при которых происходит постепенное повышение исследуемого показателя с достижением его максимального значения при разведении в 107раз и 1013, что выше контроля в 2 раза (р<0,05).

3085-2832сн-1 -—

JJ 'ьИ1

в '

* V Ч^

* ж

раэкетяс

1543-1425Ш-1

елиш!

_

рюаедевве

а) в) с)

Рис. 3. Изменения дисперсии показателей пропускания ИК-излучения водной составляющей сыворотки крови здоровых людей при ее разведении от 101 до 101враз в диапазонах: а) 3085-2832 см", в) 2120-1880см"1, с) 1543-1425см*'

Отмечено, что колебания показателей пропускания в диапазонах 1430-1210см'1 и 1067-963 см"1 отличаются высокой амплитудой. Максимальный уровень его обнаружен при разведении сыворотки крови в 10браз, что в несколько раз выше контроля (р<0,001). В интервале 1127-1057см"' по сравнению с другими исследуемыми областями ИК спектра область разведения от 101 до 107 раз характеризуется стабильностью дисперсии, значения которой выше контроля в 1,5 раза (р<0,05) (рис. 4). Наиболее высокие величины дисперсии обнаружены при разбавлении сыворотки в 109раз, что превышает контрольный уровень в 2,5 раза (р<0,05), далее при разведении в 1013раз происходит уменьшение этой величины до минимального значения. В диапазоне 1067-963см"' установлено, что максимальная дисперсия наблюдается при разведении в 106раз, а минимальная характеризует разведение 1011.

Рис. 4. Изменения дисперсии показателей пропускания ИК-излучения водной составляющей сыворотки крови здоровых людей при ее разведении от 101 до 1016раз в в диапазоне 1127-1057СМ"1

« 1127-1057 ш-1

• —

дисперсия д,д»/ «л ГТК

1 " ■

разведение

Следовательно, при различных разведениях сыворотки крови наблюдаются неодинаковые дисперсии показателей пропускания ИК-излучения тонких слоев исследуемого раствора.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что между содержанием веществ в сыворотки крови и состоянием ее водного компонента на уровнях разведения от 101 до 1016раз существует тесная взаимосвязь, которая определяется суммарным эффектом их взаимодействия. При этом изменение величины водной составляющей по отношению к компонентам сыворотки крови является фактором, определяющим значения дисперсий в исследуемых диапазонах.

3. Анализ особенностей динамики состояния разведенных образцов сыворотки крови больных остеопорозом.

Известно, что остеопороз является системным заболеванием, при котором

существенно нарушается баланс кальция в организме. Однако количественное содержание этого элемента в тканях и биологических жидкостях не всегда соответствует тяжести заболевания [Беневоленская Л.И., Финогенова С.А. 1999].

Представляло интерес с помощью дисперсий показателей пропускания и целостных критериев Махаланобиса и Бартлетга, показать особенности изменений состояния многократно последовательно разведенных в 10 раз образцов сыворотки крови больных остеопорозом по сравнению с контрольной группой. Это позволило получить дополнительную информацию о характере состояния водного компонента сыворотки крови, что может быть использовано для оценки степени тяжести заболевания.

Сравнивая характер исследуемых изменений, можно отметить, что в диапазоне 3500-3200см'' (рис. 5а) максимальный показатель для больных остеопорозом определен при разведении в 109раз, для контрольной - 104, при этом происходит уменьшение амплитуды колебания дисперсии в 1,3 раза (р<0,05). Отличие наблюдается и для минимального уровня соответственно 1013 и Ю10(рис. 5а). В диапазоне 3085-2832см"' отмечается волнообразная зависимость дисперсии показателей пропускания ИК-излучения сыворотки крови от разведения. При этом разведение в 102 раз приводит к возрастанию данной величины у больных в 1,7 раза (р<0,05), в то время как у контрольной группы этот показатель остается без изменения. Последующее десятикратное разведение сыворотки приводит к

постепенному уменьшению анализируемой величины с достижением значения (при разведении в 104раз), равного контролю. Следует отметить, что при разведении от 107 до 10й изменения исследуемого показателя в данных группах" имеют сходный характер, в то время как разведение от 1013 до 1015 вызывает противоположные изменения анализируемой величины. В области 2120-1880см"1 отмечаются 2 пика увеличения дисперсии при разведении 106 и 1014 раз (рис. 5в). Такого рода зависимость обнаружена при действии разнообразных биологически активных веществ, проявляющих высокую активность при концентрациях, различающихся на несколько порядков.

Рис. 5. Динамика изменения дисперсии показателей пропускания ИК-излучения сыворотки крови здоровых (1) и больных остеопорозом (2) под влиянием разведения в диапазоне: а) 3500-320см*', в) 2120-1880СМ'1 с) 1127-1057см"'

В этом случае обнаруживаются максимумы и так называемые «мертвые зоны» - интервалы, где отсутствует эффект действия вещества [Davis J.V., Svendsgaard D.JJ. 1990; Бурлакова Е.Б. 1994, Веселовский В.А., Веселова Т.В. 1999]. В группе здоровых людей в этих интервалах наблюдается падение данного показателя (р<0,05). В диапазоне 1710-1610см'1 значения дисперсий показателя ИК-излучения сыворотки крови больных имеют сходный характер с изменениями, наблюдаемыми в предыдущем диапазоне (2120-1880см"1). В областях 1600-1535см" 'и 1543-1425см"! последовательное разведение сыворотки больных остеопорозом приводит к постепенному повышению величины дисперсии с достижением ее максимума при 1015. В то же время в сыворотке контрольной группы наблюдается падение данного показателя с достижением минимального значения при этом же

разведении. Такого рода эффекты установлены при изучении действия человеческого гормона роста на мембраны эритроцитов, опухолевые и лейкозные клетки [Katz L.S., Marquis J,K, 1989; Sonenberg M. 1971; Бурлакова Е.Б. 1996]. Диапазон ИК-спектра 1430-1210см"' характеризуется невысокими значениями дисперсии показателей пропускания. При этом для больных остеопорозом максимальное значение определено при разведении 1014, что выше минимального полученного при разведении в 101, 104, 109 и 1012 в 3 раза (р<0,05). Для контрольной труппы наименьший показатель определяется при 106. В области спектра 1127-1057СМ"1 отмечено два диапазона разведения сыворотки: от 101 до 10s и 1014 до 1016, где наблюдается сходный характер изменения исследуемого показателя дисперсии (рис. 5с). При этом максимальные дисперсии, обнаруженные при 106 и 10", в 3 раза больше минимальных (10') (р<0,05), в то время как эти величины для контрольной группы приходятся на разведение 10® и 1012 соответственно. В интервале 1067-963см*' характер колебания дисперсии у больных остеопорозом имеет сходный характер с изменениями, наблюдаемыми в диапазоне 1430-1210см"1.

Таким образом, обнаружены особенности изменений дисперсий показателей пропускания ИК-излучения тонких слоев сыворотки крови больных остеопорозом при многократном ее разведении по сравнению с контрольной труппой, что может быть использовано в диагностических целях.

Анализ критериев целостного состояния сыворотки крови контрольной группы и больных остеопорозом позволил выявить закономерности, свидетельствующие о том, что между величиной расстояния Махаланобиса и степенью разведения сыворотки здоровых лиц существуют прямая зависимость (рис. 6а). При этом у больных остеопорозом, в отличие от контроля, процесс разведения сыворотки вызывает постепенное уменьшение данного показателя с достижением минимального значения при разведении в Ю10 раз, после чего происходит постепенное его повышение.

Аппроксимированные линии критерия Бартлетга, характеризующего динамические свойства состояния сыворотки крови, свидетельствуют о том, что этот показатель практически не изменяется для здоровых людей, при этом у больных остеопорозом последовательное разведение сыворотки крови приводит к

постепенному понижению данного критерия (рис. 66).

24

ч

«■( 1 (И

-4_I_I_I_1-

6 I

Рис. б. Аппроксимированные кривые зависимости критерия Махаланобиса (а) и Бартлетта (в) от разведения сыворотки крови от 101 до 101 раз здоровых людей (1) и больных остеопорозом (2).

Таким образом, показано, что изменение объема водного компонента сыворотки крови контрольной группы и больных остеопорозом вызывает неодинаковые изменения системных показателей в анализируемых образцах биологической жидкости.

Представляло интерес выяснить, будет ли существовать разница в параметрах состояний разведенных образцов сыворотки крови у больных остеопорозом различной степени тяжести. Для реализации этой задачи анализировалась кровь больных с легкой и средней формой заболевания. Диагностика их осуществлялась на основании клинико-биохимических и рентгенологических исследований, а также денситометрии косгаой ткани.

Данные ИК-спектрометрии разведенных образцов сыворотки крови представлены на диаграмме рассеяния (рис 7), где отчетливо видно, что параметры

Рис. 7. Диаграмма рассеяния динамики состояния сыворотки крови больных с легкой (2) и средней (1) формой остеопороза.

целостных показателей формируют не перекрывающиеся области, характеризующие состояния исследуемых биологических систем. Это свидетельствует о том, что анализ сыворотки крови содержащей различные количества экзогенно добавляемой воды позволяет получить принципиально новую информацию об особенностях ее состояния, что может быть использовано в диагностике заболеваний.

4. Особенности действия этанола на состояния сыворотки крови больных алкоголизмом и в эксперименте при алкоголизации крыс.

Несмотря на большое количество исследований, посвященных изучению

влияния этанола на биологические процессы, некоторые детали механизма его действия окончательно не установлены. Известно, что этанол значительно изменяет физико-химические свойства воды [Кеслер ЮМ., Зайцев АЛ. 1989., Антонченков В Я. и соавт. 1991., Broad NW. et al. 2000]. Следовательно, можно предположить, что в действии данного соединения на многочисленные звенья биохимических процессов существенную роль может играть его влияние на состояние водного компонента биологических систем. В эксперименте на крысах представляло интерес выяснить, каким образом изменяется состояние сыворотки крови как водосодержащей системы под влиянием данного вещества. В опытах in vivo были изучены изменения особенности дисперсии показателей пропускания ИК-излучения тонкими слоями сыворотки крови крыс под влиянием чистого этанола, а также в присутствии различного количества примесей, характерных для данного препарата, что было сделано для того, чтобы исключить преобладание их эффекта над действием этанола. В качестве добавок использовались смеси веществ, содержащиеся в низкокипящей и высококипящей фракциях, полученных при перегонке технического этанола. В результате проведенной работы установлено, что увеличение количества примесей в этаноле способствует незначительному возрастанию показателей дисперсии в исследуемых областях ИК-спектра. Полученные данные свидетельствуют о том, что в сыворотке крови под действием чистого этанола наблюдаются специфические изменения дисперсии показателей ИК-излучения (рис. 8), при этом наличие примесей существенным образом не изменяет действие препарата, причем

максимальный их эффект наблюдается при концентрации, равной 1%, что находится в соответствии с данными литературы (Нужный В.П. 1998).

ДкМиож 31ИПП гж-1 ^шм М1-КЯ с*-1 Д**п«1о* 11(743»

Рис.8. Значения дисперсий показателей пропускания инфракрасного излучения сыворотки крыс: 1 - контрольная группа, 2 - алкоголизация с минимальными добавками примесей, 3 - алкоголизация с максимальными добавками примесей, 4 - алкоголизация чистым этанолом.

Параллельно в опытах на модельных растворах обнаружена способность этанола влиять на состояние водосодержащих систем. Из рисунка 9а, где представлена аппроксимированная линия зависимости критерия Бартлетта от разведения этанола, видно, что имеет место волнообразный характер зависимости, причем максимальные значения показателя регистрируются при разведениях в 106, 107,109 раз. Аппроксимация другого целостного критерия (рис. 9в), полученного путем обработки экспериментальных данных полиномом десятой степени в координатах: критерий Махаланобиса - степень разведения этанола, обнаружено, что максимальные значения этой величины наблюдаются при разведении раствора в 1012-1013. При этом достаточно высокий показатель критерия Махаланобиса зарегистрирован при разведении в 106 раз. Представляло интерес выяснить, сохранится ли характер влияния этанола в разведенной сыворотке крови больных алкоголизмом, когда увеличивается объем водного компонента. В данной серии опытов проводили анализ системных показателей сыворотки крови больных при ее разведении в 1016раз. Как свидетельствуют данные, в этом случае, изменения критериев Махаланобиса характеризовались постепенным понижением до разведения 10чраз и появлением максимумов

при 106 и 109 (рис.10а). В отличие от этого, критерий Бартлетга имеет минимальное значение при разведении 108раз (рис. 10в).

Рис. 9. Зависимость критерия Бартлетга и Махаланобиса от степени разведения этанола

Можно предположить, что в соответствии с клатратной теорией модели структуры воды, механизм действия этанола заключается в связывании молекул спирта с гидратироваиным комплексом, что нарушает структуру его водного каркаса из-за возникающей деформации Н-связей и способствует проявлению эффекта ближнего действия [Маленков Г.Г, Дьяконова Л.П. 1979].

5 10

Степень рязвддсиия

а)

■У

Стм»№ рпмд*ния

Рис.10. Изменения критерия Махаланобиса (а) и Бартлетга (в) в зависимости от степени разведения сыворотки больных алкоголизмом.

Регуляторный эффект этанола может быть также связан с тем, что водная структура в его присутствии приобретает более высокую способность

к дальнодействию. В результате активное перемещение протона по структуре с жесткими Н-связями эффективно увеличивает энергию взаимодействия молекул воды, что приводит к стабилизации ассоциатов в присутствии * этанола и изменению конформаций сложных белковых ферментных комплексов.

5. Особенности влияния веществ различной химической природы на <• состояние их модельных растворов.

Предыдущие исследования показали, что оценка состояния

биологических систем, в частности сыворотки крови, с помощью целостных критериев дает возможность получить новую информацию, которая может быть использована при диагностике заболеваний. Представляло интерес выявить, как влияют отдельные вещества, являющиеся небходимым составным компонентом биологических систем, на состояние их модельных растворов.

На первом этапе исследования изучалось влияние одно- и двухвалентных катионов на целостные показатели состояния их водных систем. В качестве анализируемых жидкостей использовали серии растворов HCl, NaCl, KCl, СаСЬ, MgCl2, полученные разведением в 1016раз исходных. Анализ результатов позволяет отметить особенность влияния каждой отдельной концентрации ионов на состояние водосодержащих систем, что демонстрируется с помощью аппроксимированных значений критериев Махаланобиса, из которых видно, что сверхмалые количества исследуемых катионов (10"п - 10"15 моль/л) вызывают максимальные изменения данного критерия (рис. 11).

Рис.11.

Аппроксимированные зависимости критерия Махаланобиса от

разведения 1М растворов содержащих катионы водорода (1), калия (2), натрия (3), кальция (4), магния (5).

2 4 в в (0 <2 14 1Б

п мояьЛЛО""

500

450

400

1 350

S

i

s

i

Е ал

£ 150

100

50

■

Li

I ' 1 !

I ; 1 ;

I ; 1 ;

/

.... ¿¿я

На следующем этапе исследования изучалось изменение состояния ОДЫ раствора пероксида водорода в чистой воде и в присутствии 0,05М сульфата железа (II) с 0,Ш серной кислотой. Модельные системы готовили последовательным десятикратным разбавлением исходных растворов.

Как показывают полученные данные (рис. 12), в исследуемых

водосодержащих системах низкие количества пероксида водорода по сравнению с

их высокими концентрациями вызывают более существенные изменения критерия

Махаланобйса. Однако одновременно отмечается, что сходные значения

исследуемого критерия могут возникать в присутствии существенно

отличающихся друг от друга количеств пероксида водорода.

Рис.12. Изменения расстояния Махаланобйса водных систем при разведении Ш Н2О2 в присутствии 0,ШРе304 и 0,005М Н280ч (1- раствор Ш Н2О2; 2- раствор Ш Н2О2 в присутствии 0,Ш Ре804 и 0,005И Н2804)

Поэтому ставилась задача провести сравнительный анализ дисперсий показателей пропускания отдельных исследуемых областей инфракрасного спектра в образцах, имеющих сходные высокие или низкие критерии Махаланобйса. Эти данные позволяют провести более детальную идентификацию состояний модельных систем. Установлено, что водосодержащие системы, имеющие сходные минимальные критерии Махаланобйса (рис. 13а), характеризуются достоверной разницей дисперсий показателей пропускания в диапазонах 3085-2832, 2120-1880, 1600-1535см"1. В отличие от этого, максимальные показатели Махаланобйса не обнаруживают отличий значений дисперсий в исследуемых областях ПК-спектра (рис. 13в).

Рис. 13. Сравнительный анализ дисперсий показателей пропускания (по критерию Фишера) растворов пероксида водорода а) разведения в 10* и в 1014 раз, имеющих минимальные критерии Махаланобиса. в) разведения в Ю10 и в 1015 раз, имеющих максимальные критерии Махаланобиса.

Следовательно, состояние модельных систем возникающее в присутствии малых концентраций пероксида водорода, характеризуется сходными величинами дисперсий. При определении эффекта влияния пероксида водорода на водный компонент в присутствии ионов железа и водорода, которые, согласно литературным данным, существенным образом изменяют процессы образования перекисей, высокие значения критерия Махаланобиса отмечены только при разведении в 1015 раз (рис. 12).

Таким образом, полученные данные показывают, что различные малые количества пероксида водорода, а также факторы, стимулирующие его образование (ионы железа и водорода), в узком интервале концентраций влияют на целостное состояние водосодержащих систем. При этом максимальные критерии Махаланобиса исследуемых систем сопровождаются сходными значениями дисперсий пропускания средней области ПК-излучения, в то время как целостные показатели, близкие к эталону, основываются на существенно отличающихся друг от друга величинах дисперсий в областях спектра, характеризующих состояние водных ассоциаггов.

Действие органических веществ на состояние модельных систем изучалось на примере аскорбиновой кислоты, глюкозы, тирозина и тироксина.

При изучении состояния водных растворов в присутствии различных количеств аскорбиновой кислоты установлено, что разведение ее растворов в 10® и 1015 раз вызывает резкие изменения дисперсий показателей пропускания ИК-излучения по сравнению с эталоном (бидистиллированной водой), что, по-видимому, обусловлено активизацией процессов образования ассоциатов в тонких слоях жидкостей.

Оценивая эффект воздействия малых количеств аскорбиновой кислоты на исследуемые показатели с помощью критерия Махаланобиса, обнаружено, что максимальные значения этой величины наблюдаются при разведениях исходного 1М раствора в 109 и 1013 раз, в то время как уровень содержания вещества при разведении в 107 и Ю10 раз сопровождается в несколько раз меньшими значениями этого показателя, которые существенно не отличались от эталона (рис. 14). Полученные результаты находятся в соответствии с данными литературы, свидетельствующими о том, что целый ряд разнообразных соединений действует на биологические процессы в сверхмалых концентрациях (Бурлакова Е.Б. 1994-20<|).

? На следующем этапе исследований выяснялось, имеют ли место различия в значениях отдельных дисперсий показателей пропускания на различных частотах, характеризующих состояния биологически активных систем одинаковыми критериями Махаланобиса.

10 11 12 13 14 15 16

рювчдвниа в 1СГ р«э

Рис.14. Влияние

присутствия

аскорбиновой кислоты (разведения 1М раствора в 101 - 1016 раз) на дисперсию показателей пропускания ИК-

излучения водных систем Количественная оценка дана по величине критерия Махаланобиса.

Анализ данных величин дисперсий в исследуемых областях ИК-спектра с использованием критерия Фишера позволил установить, что существуют различия

данных показателей в диапазонах 3500-3200см'', 1710-1610СМ"1, 1127-1057СМ"1 (рис. 15).

Следовательно, одинаково неустойчивое состояние воды может быть дополнительно идентифицировано с помощью значений дисперсий определенных широких диапазонов ИК-спектра. Анализ величин колебаний показателей пропускания растворов аскорбиновой кислоты, имеющих сходные минимальные значения критериев Махал анобиса, в отличие от максимальных, показал, что достоверной разницы дисперсий в девяти исследуемых областях спектра не обнаруживается. Это, по-видимому, обусловлено тем, что они характеризуют устойчивое состояние водной основы растворов, приближающееся к эталону (рис. 14).

Из полученных результатов можно заключить, что в условиях опыта различные количества аскорбиновой кислоты в широком интервале разведений изменяют состояние всей водосодержащей системы, вероятно, по-разному индуцируя процесс образования разнообразных ассоциатов молекул, которые в значительной степени определяют наблюдаемые колебания показателей пропускания и устойчивое состояние модельных растворов.

Диатэоя{с*г1]

^ЧЙМОИ (см"

и

Отноцяиия дисперсий

12 14 16

Опкшни» ДИСЛфЯЙ-

Рис. 15. Результаты сравнения дисперсий показателей пропускания растворов аскорбиновой кислоты в разведении 109 и 1015раз (а) и 107 и Ю10 раз (в) по одномерному критерию Фишера.

Следовательно, эффективность действия различных количеств аскорбиновой

кислоты на дисперсии показателей пропускания птттртт>.нт.та д^^пячпнпн Ш"-ггп<арф|

1>0' >

и критерий Махал анобиса, характеризующий целости

33

>е состояние модергьньп

растворов, свидетельствуют о том, что механизм влияния данного вещества на биологические процессы может быть обусловлен изменением состояния водного компонента. При этом специфичность проведенного воздействия определяется как с помощью критерия Махаланобиса, так и величинами отдельных дисперсий показателей пропускания в конкретной области ИК-спекгра.

Таким образом, на примере модельных растворов веществ различной химической природы показана способность данных соединений определять параметры состояния водосодержащих систем (дисперсий показателей пропускания, критерии Махаланобиса, Бартлетта,). Представляло интерес с помощью диаграмм рассеяния продемонстрировать различия целостного состояния модельных растворов на примере ионов кальция, водорода, глюкозы, тирозина , тироксина, а также липосом.

В координатах целостных показателей (расстояния Махаланобиса и критерия Бартлетта) на диаграмме рассеяния в широком диапазоне концентраций (от 10"'М до 10"16М) глюкозы, катионов водорода и кальция отражается весь комплекс возможных состояний исследуемых растворов, которые могут возникать в биохимических процессах в присутствии исследуемых веществ. При этом полученные на диаграмме области характеризуются по осям целостных показателей относительными величинами максимальных диапазонов, которые показывают по какой координате преимущественно реализуется эффект влияния исследуемых веществ на состояние систем. По величине диапазонов проводился сравнительный анализ эффективности влияния изучаемых веществ на водный компонент растворов.

Обнаружено, что в координатах критериев Махаланобиса и Бартлетта на

диаграмме рассеяния образуются областей точек регистрирующих различные

концентрации характеризующиеся особенностями расположения по отношению к

осям целостных показателей. Оказалось, что область с наибольшей площадью

соответствует катиону водорода (рис. 16). Эта площадь равняется 8377,5 у.е., при

этом максимальный диапазон колебания составляет по оси Махаланобиса -118 у.е,

Бартлетта - 129 у.е. Следовательно, данная область в равной степени распределена

вдоль осей целостных показателей, отражающих динамику и статику состояния

индивидуальных систем. В отличие от ионов водорода различные концентрации

катионов кальция в исследуемых растворах формируют на диаграмме рассеивания

34

область с меньшей площадью, составляющей 5557,0 у.е., диапазон колебания которой по осям Махаланобиса и Бартлетта равняется соответственно 47 и 214 у.е (рис. 16). Таким образом, расположение данной области преимущественно происходит вдоль оси Бартлетта, что может характеризовать способность вещества влиять на динамические свойства целостного состояния.

1

Полученные результаты свидетельствуют о сильном влиянии ионов водорода на состояние модельных растворов находятся в соответствии с данными литературы, согласно которым данные катионы определяют фундаментальные, кислотно-основные свойства многих биологических систем и природных химических комплексов, проявляя при этом регуляторную роль [Мирошниченков А.И.1998., АоЫ в 2002]. В отличие от этого, катионы кальция осуществляют в клетке на уровне биохимических процессов передачу информации о действии различных первичных агентов [НпЬаг В (А а1. 2002], что в условиях эксперимента подтверждается преимущественным расположением области совокупности точек вдоль оси Бартлетта. Следовательно, можно предположить, что функциональная активность ионов водорода и кальция в значительной мере определяется их способностью определенным образом изменять характер целостного состояния водосодержащих систем.

Наименьшая площадь из исследуемых компонентов (2770,5 у.е.), которая характеризует водную основу различных концентраций растворенного вещества в системе целостных координат, соответствует глюкозе. Максимальные диапазоны колебания её составляют по Махаланобису - 44,0 у.е., по Бартлепу - 97.0 у.е (рис.16). Обнаруженные результаты находятся в соответствии с тем, что глюкоза

1

Рис. 16. Диаграмма рассеяния растворов глюкозы (1), ионов водорода (2) и кальция (3).

является энергетическим материалом клетки и уровень её подвержен постоянным колебаниям в определенных пределах.

Следовательно, глюкоза, ионы водорода и кальция, являющиеся факторами различной природы и биологической активности, оказывают характерное для каждого компонента воздействие на состояние водосодержащих систем, которое определялось с помощью целостных показателей - критериев Махаланобиса и Бартлетта. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при реализации биохимических эффектов необходимо учитывать состояние водного компонента биологических систем.

Для подтверждения обоснованности данного вывода на следующем этапе

работы изучены параметры состояния модельных растворов, содержащих в своем

составе вещества, выполняющие в процессах функционирования биологических

систем различную роль (метаболитов, регуляторов, компонентов биологических

мембран). В качестве примера таких соединений были использованы тирозин,

тироксин и фосфолипиды в виде их липосом. Оказалось, что наиболее высокие

критерии Махаланобиса характеризовали системы, содержащие липосомы

фосфолипидов, и составляли 985±111у.е., большие значения этого показателя

отмечаются для тироксина - 405±38у.е., значительно меньшие для тирозина -

85±.7у.е.. Это дает возможность предположить, что роль воды в обеспечении

функции различных компонентов биологических систем неодинакова. Анализ

состояний растворов липосом различного разведения свидетельствует о том, что

параметры состояния системы зависят от полярности вещества. Обнаружено, что

наибольшие значения критерия Махаланобиса характеризуют ФИ, более низкие

показатели отмечаются в растворах липосом СФМ и ФХ. Этот факт дает

возможность определять количество фосфолипида по параметрам состояния их

водных систем. На примере ФХ, СФМ и ФИ, выделенных из сыворотки 1фови с

использованием ТСХ, выявлен характер зависимости между величиной критерия

Махаланобиса и концентрацией фосфолипида. Эта зависимость выражается

следующим образом для ФХ - Сфх = 0,00037Мах2 -0,17Мах +21 (мг%), для СФМ -

Ссфм = 0,00021 Мах2 - 0,1 Шах +16 (мг%), для ФИ - Сфи = 0,0000046Мах2 - 0,064

Мах + 18(мт%) Для смеси фосфолипидов, состоящей из 73% фосфатидилхолинов,

25% сфингомиелинов, 2% фосфатидилинозитов, состав которой соответствует

соотношению фосфолипидов в сыворотке крови, уравнение принимает вид: Сфл =

36

0,00018МЭХ2 -0,11 Max +19 (мг%), где Max - величина критерия Махаланобиса, определенная с помощью ИК-спектрометрии. Полученные результаты дают возможность использовать метод ИК-спектрометрии для определения количества " различных фосфолипидных фракций в водных системах.

Следовательно, можно сделать вывод о том, что необходимые структурные компоненты биологических мембран - фосфолипиды - из всех анализируемых веществ органической и неорганической природы оказывают наиболее сильное влияние на состояние водных систем. Химические агенты обладающие выраженной регуляторной функцией (тироксин), в большей степени чем метаболиты (тирозин, глюкоза, этанол) изменяют критерии Махаланобиса, что может быть использовано для скрининга биологически активных веществ.

Таким образом, результаты проведенной работы показали, что разработанный аппаратно-программный комплекс «ИКАР» и созданная методика анализа позволяют определять параметры состояния биологических систем и модельных растворов, что может быть использовано в комплексной диагностике заболеваний, скрининге биологически активных веществ, прямом определении в водных системах фосфолипидов. Практическая значимость разработанного аппаратно-программного комплекса подтверждается возможностью использования для определения чистоты воды, состояние слюны, для диагностики кариеса и определения количества фосфатидилхолинов, сфингомиелинов и фосфатидилинозитов при алкоголизме и инфаркте миокарда.

Выводы.

1. С помощью разработанного аппаратно-программного комплекса «ИКАР», сертифицированного как новый тип измерителя, обнаружено явление колебания показателей пропускания ИК-излучения, проходящего через тонкие слои биологических систем и водных модельных растворов в девяти широких диапазонах средней области спекгра в см"1: 3500 - 3200, 3085 - 2832, 2120 - 1880, 1710 - 1610, 1600 - 1535, 1543 - 1425, 1430 - 1210, 1127 - 1057, 1067 - 930. Создана методика количественной характеристики этого явления с использованием

дисперсии показателей пропускания, целостных критериев многомерного анализа (расстояния Махаланобиса и критерия Бартлетга), диаграмм рассеяния и Вороного, компьютерных образов.

2. В биологических системах различного биохимического состава (цельная кровь и сыворотка крови, слюна) с помощью модифицированного способа ИК-спектрометрии определены наиболее оптимальные параметры различных целостных состояний, которые характеризуют суммарный эффект взаимодействия гидратированных веществ и водной составляющей, компонентов образующих единую динамическую систему.

3. С помощью ИК-с пектро метрии на основании значений дисперсий показателей пропускания, целостных критериев Махаланобиса и Бартлетта, кластерного анализа, диаграмм рассеяния и Вороного, компьютерных объемных образов удалось выделить различные состояния сыворотки крови больных с различной патологией (гипертоническая и ишемическая болезни, ушиб мозга, рассеянный склероз, опухоль головного мозга, гепатиты А, В, С, рак желудка, рак молочной железы, диабет, шизофрения, эпилепсия, алкоголизм, остеопороз). Обнаружено, что каждый тип состояния соответствует группе заболеваний, имеющих сходную клинику и этиологию. Применение диаграмм Вороного позволило аналитически доказать существование разницы состояний сыворотки крови у больных с различной патологией в тех случаях, когда один из целостных критериев, характеризующий заболевание, достоверно не отличается от контроля.

4. Сравнительный анализ критериев Махаланобиса и Бартлетта, характеризующий

состояние водного компонента сыворотки крови со стандартными биохимическими

показателями белков, липидов, углеводов, минеральных веществ исследуемых

групп больных, позволил установить, что низкие значения целостных критериев

сопровождаются высоким содержанием фосфолипидов и холестерина у больных

гипертонической и ишемической болезнями, в то время как максимальный

показатель Махаланобиса обнаружен при гипохолестеринемии у больных

алкоголизмом. Установлено также, что повышение активности

аланинаминотрансферазы у больных гепатитами А, В, С сопровождается

значительными критериями Бартлетга. Одновременно обнаружена достоверная

разница в целостных показателях по сравнению с контролем при остеопорозе,

неврологических, психических и онкологических заболеваниях, которая не

38

сопровождается какими-либо изменениями приведенных стандартных биохимических показателей.

5. Анализ последовательно разведенных образцов сыворотки крови больных • алкоголизмом и остеопорозом по сравнению с контрольной группой показывает, что существуют выраженные особенности изменения показателей Махаланобиса и Бартлетга. При этом максимальные и минимальные критерии обнаруживаются при различных разведениях. Построение диаграмм рассеяния разведенных образцов сыворотки крови больных с легкой и средней формой остеопороза демонстрирует существенную разницу в их состоянии, что подтверждает факт непосредственного участия воды в формировании различных целостных состояний.

6. Показано, что присутствие в водных системах различных количеств биологически значимых веществ неорганической и органической природы (пероксида водорода, катионов водорода, калия, натрия, кальция, магния, этанола, аскорбиновой кислоты, глюкозы, тирозина, тироксина, липосом фосфолипидов) создает различные целостные состояния, которые характеризуются специфической дисперсией показателей пропускания на различных частотах, а также критериями Бартлетга, Махаланобиса и диаграммами рассеяния.

7. Анализ состояний водных модельных систем содержащих вещества с различной химической структурой и биологической активностью свидетельствует о том, что наиболее высокими значениями критерия Махаланобиса, составляющими 985±11у.е., характеризуются системы, содержащие липосомы из фосфолипидов. Одновременно установлено, что в растворах гидрофильных веществ, эти значения существенно ниже и максимальные величины этого критерия выявлены в присутствии гормона тироксина - 405±38у.е..

8. В тонких слоях модельных систем дифильных веществ, представленных липосомами фосфатидилхолинов, сфингомиелинов, фосфатидилинозитов и их смесями, обнаружены различные значения критерия Махаланобиса, величины которых определяются как концентрацией фосфолипида так и его химической природой. Установлена математическая зависимости между количеством каждой отдельной фракции фосфолипида и значением целостного показателя состояния водной системы.

Список работ, опубликованных но теме диссертации

1. А.с. 1802341 СССР. Способ диагностики инфаркта миокарда [Текст] / А.В. Каргаполов [и др ] СССР. -N4851949 ; заявл. 18.7.1990 ; опубл 9.10.1992

2. Особенности динамики быстрых изменений фосфотидшшнозитов крови у больных с ишемической и алкогольной кардиомиопатией [Текст] / А.В. Каргаполов [и др.]; Депон. в ВИНИТИ АН России № 35657,-1995

3. Разработка и применение ИК-спектроскопии для диагностики алкоголизма [Текст] / А.В.Зиньковский [и др.] // XII съезд психиатров России: материалы съезда: - М., 1995. - С. 723-724.

4. Пат. № 2137126 Российская Федерация С1 6 G 01 N33/487 Способ исследования биологических жидкостей и устройство для его осуществления [Текст] / А.В. Каргаполов [и да.]; заявитель и патентообладатель Твер. гос. мед. акад. №98108578/14 ; заявл. 13.05.98 ; опубл. 10.09.99, Бюл. N 25. - Зс.: ил.

5. Использование ИК спектроскопии крови и смешанной слюны для ранней диагностики стоматологических заболеваний у детей [Текст] / Б.Н Давыдов [и др.] // Материалы IV-ro Международ, конф. челюстгто-лицевых хирургов и стоматологов. С-Пб. 1999. - С.46-47

6. Зубарева Г.М. Применение ИК спектроскопии для изучения особенностей динамики быстрых изменений сфингомиелинов крови [Текст] / Г.М.Зубарева, Г.Е. Бордина, А.В.Каргаполов // Физико-химия полимеров. Синтез, свойства и применение: сб. науч. тр. - Тверь, 1999. - Вып.5. - С. 118-122.

7. Бордина Г.Е. Использование ИК спектроскопии для идентификации водного и спиртового растворов биополимеров [Текст] / Г.Е.Бордина, Г.М.Зубарева, А.В.Каргаполов // Физико-химия полимеров. Синтез, свойства и применение : сб. науч. тр. - Тверь, 1999. - Вып.5. - С. 126-136.

8. Зубарева Г.М. Возможности использования инфракрасной спектроскопии для изучения процессов регенерации [Текст] / Г.М.Зубарева, А.В.Каргаполов // Проблемы регенерации в эксперименте и клиники. - Тверь, 1999. - С. 54-56

9. Бордина Г.Е. Использование ИК спектроскопии для определения экологически чистой и безопасной алкогольной продукции [Текст] / Г.Е.Бордина, Г.М.Зубарева, А.В.Каргаполов // Эколого-медицинские аспекта состояния здоровья и среды обитания населения Тверской области и города Твери: сб. докл. науч.-пракг. конф. -Тверь, 1999.-С. 48-51.

10. Пат. 2148257 Российская Федерация, С1 7 G 01 N 33/49 Способ исследования крови [Текст] / А.В.Каргаполов, Г.М.Зубарева, Г.Е.Бордина; заявитель и

патентообладатель Твер. гос. мед. акад. №99111555/14 ; заяв. 01.06.1999 ; опубл.

27.04.2000, Бюл. №12. - 3 с.: ил.

11. Использование инфракрасной спектроскопии для идентификации спиртов и алкогольных напитков [Текст] / Г.Е.Бордина [и др.] // Новости науки и техники : сб. - М., 2000.- С. 7-10.- (Серия «Медицина»; вып. 2: Алкогольная болезнь).

12.Пат. 2164350. Российская Федерация С1 7 в 01 N 33/483, 33/52 Способ прогнозирования кариеса зубов [Текст] / Т.В.Захарова [и др.]; заявитель и патентообладатель Твер. гос. мед. акад - 2000111431/14; завл. 12.05. 2000; опубл.

20.03.2001, Бюл. N 8. - Зс.: ил.

13.Новый метод контроля степени очистки воды основанной на инфракрасной спектроскопии [Текст] / Г.М Зубарева [и др.] // Качество питьевой воды, водоотделения и здоровье населения: сб. материалов межрегион, науч.-практ. конф,- Рязань,2000.-С. 111-113.

Н.Зубарева Г.М. О полимерных свойствах воды [Текст] / Г.М. Зубарева, Г.Е.Бордина, А.В.Каргаполов // Фгаико-химия полимеров. Синтез, свойства и применение : сб. науч. тр. - Тверь, 2000. - Вып.6. - С. 134-137.

15.Пат. 2164685 Российская Федерация С1 7 в 01 N 33/18, 21/00 Способ исследования чистоты воды [Текст] / А.В.Каргаполов, Г.М.Зубарева // заявитель и патентообладатель Твер. гос. мед. акад. -N99127108/04; заявл. 28.12.1999; опуьл. 27.03.2001, Бюл. N 9. - Зс.:ил.

16. Зубарева Г.М.. Использование дисперсии показателей ИКС водных растворов биологически активных препаратов для оценки их эффективности [Текст] / Г.М.Зубарева, В.М.Микин, А.В.Каргаполов // Биологически активные добавки и здоровое питание; сб. Всерос. науч. молодеж. конф. с международ, участием. -Улан-Удэ, 2001. - С. 28-29.

17.Бордина Г.Е. Влияние микроколичесгв этанола на показатели инфракрасного спектра воды, характеризующие ее полимерные свойства [Текст] / Г.Е.Бордина, Г.М.Зубарева, А.В.Каргаполов // Физико-химия полимеров полимеров. Синтез, свойства и применение: сб. науч. тр. - Тверь, 2001. - Вып.7. - С. 118-122.

18. Зубарева Г.М. Влияние микроколичеств плазмы крови на дисперсию ИК спектра воды [Текст] / Г.М.Зубарева, Г.Е.Бордина, А.В.Каргаполов // Физико-химия полимеров. Синтез, свойства и применение : сб. науч. тр. - Тверь, 2001. - Вып.7. -С. 162-166.

19. Зубарева Г.М. Новая технология экологических исследований [Текст] / Г.М. Зубарева, ГЛ.Шматов, А.В.Каргаполов // Экватэк-2002 : сб. материалов У-го международ, конгр. - М., 2002. - С. 628.

20. Изменение ИК-характеристик Н20 в результате аквакомуникации под воздействием различных аллотропных форм углерода [Текст] / ВЛСлесарев [и др.] // Вестн. С-Петербург. мед. акад. им. И.И.Мечникова. - 2002. - № 1-2.- С. 191197.

21. Зубарева Г.М. Исследования влияния ультрамикроколичеств ионов водорода на дисперсию коэффициентов пропускания ИК-спектров полимерных растворов воды [Текст] / Г.М.Зубарева // Физико-химия полимеров. Синтез, свойства и применение : сб. науч. тр. - Тверь, 2002. Вып. 8. - С.156-163

22. Зубарева Г.М. Влияние сверхмалых количеств некоторых катионов на энергоинформационные свойства воды [Текст] / Г.М Зубарева, А.В. Каргаполов // Международный год воды : тез. докл. ХШ международ, симп. - Австрия, 2003. - С. 87-91.

23.Изучение влияния сверхмалых количеств этанола на водные системы методом ИК-спектроскопии [Текст] / Г.Е.Бордина [и др.] // Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине : тез. Ш межцународ. конгр. Т. 1. - СПб., 2003. -С. 13.

24. Зубарева Г.М. Особенности влияния сверхмалых ионов натрия и калия на показатели целостного состояния водных систем [Текст] / Г.М.Зубарева, Г.Е.Бордина, А.В.Каргаполов // Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине: тез. Ш международ, конгр. Т. 1. - СПб., - 2003, - С. 19.

25. Зубарева Г.М. Флюктуации коэффициентов пропускания воды и водных растворов солей в ИК-области спектра [Текст] / Г.М.Зубарева, А.В.Каргаполов, Л.С-Ягужинский // Биофизика 2003.- т. 48, Вып. 2, № 2. - С. 197-200.

26. Зубарева Г.М. Влияние сверхмалых количеств пероксида водорода на водную основу растворов [Текст] / Г.М.Зубарева, А.В.Каргаполов, Л.СЛгужинский // Биофизика 2003. - Т. 48, Вып. 4, № 4. - С. 581-584.

27. Зубарева Г.М. Особенности влияния сверхмалых количеств ионов натрия и калия на показатели целостного состояния водных систем [Текст] / Г.М.Зубарева, А.В.Каргаполов // Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине : изб. труды Ш международ, конгр. Т. 2. - СПб., 2003. - С. 28-30.

28. Зубарева Г.М. Механизмы влияния сверхмалых количеств веществ на биологические системы [Текст] / Г.М.Зубарева // Использование ИК-

спектроскопии в медицине, экологии и фармации : сб. науч. раб. - Тверь, 2003. -С.67-73.

29. Зубарева Г.М., Исследования влияния ионов натрия и калия на показатели целостного состояния водных систем [Текст] / Г.М.Зубарева // Использование ИК-спектроскопии в медицине, экологии и фармации : сб. науч. раб. - Тверь, 2003. - С. 85-91.

30. Использование показателей ИК-спектра водной основы сыворотки крови для оценки эффективности лечения осгеопороза [Текст] / Г.М. Зубарева [и др.] Н Российский конгресс по остеопорозу. - М., 2003. - С. 151-152.

31. Зубарева Г.М. Особенности влияния сверхмалых количеств аскорбиновой кислоты на флюктуацию коэффициента пропускания воды в инфракрасной области спектра [Текст] / Г.М.Зубарева, Л.СЛгужинский, А.В.Каргаполов // Докл. акад. наук.- 2003. - Т. 388, № 4. - С. 549-551.

32.Зубарева Г.М. Влияние сверхмалых количеств биологически активных веществ на целостные показатели состояния водных систем [Текст] / Зубарева Г.М., Шматов Г.П., Каргаполов АЛ. // Химия и хим. технология. 2003. - т 46, Вып. 7. - С. 74-77.

33.Получение пробиотиков с повышенным содержанием йода. [Текст] / ГМ. Зубарева [и др.] // Социально-медицинские аспект состояния здоровья и среды обшания населения, проживающего в йод-дефицитных регионах России и стран СНГ: материалы международ, науч. коиф. - Тверь, 2003. - С. 214.

34. Зубарева Г.М. Особенности влияния йодида калия на показатели целостного состояния водных систем [Текст] / Г.М.Зубарева, Н.В.Бурачук, А.В.Каргаполов // Социально-медицинские аспекты состояния здоровья и среды обитания населения, проживающего в йод-дефицитных регионах России и стран СНГ: материалы международ, науч. конф. - Тверь, 2003. - С. 150.

35.Влияние экзогенных препаратов этанола на показатели ИК-спеира крови [Текст] / Г.Е.Бордина [и др.] // Сб. Вопросы фармакологии и фармакотерапии: - Тверь, 2003. - С.28-30.

36. Зубарева Г.М. Особенности влияния хлорида натрия на водные системы [Текст] / Г.М.Зубарева, ОЛ.Свистунов, А.В.Каргаполов // Верхневолж. медицин, журн. 2003. т. 1,Вып. 1,-С. 47-50.

37. Особенности показателей инфракрасного спектра сыворотки крови гипертонических больных с различной чувствительностью к поваренной соли

[Текст] / Г.М. Зубарева [и др.] II Верхневолж. медицин- журн. 2003. т. 1, Вып. 2. - С. 50-53.

38-Каргаполов А.В. Состояние воды в биологических системах [Текст] / А.В.Каргаполов, Г.М.Зубарева // Использование ИК-спеетроскопии в медицине, экологии и фармации: сб. науч. раб. - Тверь, 2003. - С. 63-67.

39. Бордина Г.Е. Инфракрасная спектроскопия водных систем [Текст] / Г.Е.Бордина, Г.М.Зубарева // Использование ИК-спектроскопии в медицине, экологии и фармации: сб. науч. раб. - Тверь, 2003. - С. 73-79.

40. Зубарева Г.М. Дисперсия коэффициентов пропускания растворов, содержащих сверхмалые количества биологически активных катионов [Текст] / Г.М.Зубарева, А.В.Каргаполов // Использование ИК-спектроскопии в медицине, экологии и фармации: сб. науч. раб. - Тверь, 2003. - С. 123-128.

41.Каргаполов А.В. Некоторые особенности влияния малых концентраций катионов в их смесях на состояния водной основы их растворов [Текст] / А В.Каргаполов, Г.М.Зубарева // Использование ИК-спекгроскопии в медицине, экологии и фармации: сб. науч. раб. - Тверь, 2003. - С. 128-132.

42. Зубарева Г.М. Особенности динамики значений дисперсии коэффициентов

г

пропускания инфракрасного спектра крови под влиянием растворов этанола различной концентрации [Текст] / Г.М.Зубарева, Г.Е.Бордина, А.В.Каргаполов // Использование ИК-спектроскопии в медицине, экологии и фармации: сб. науч. раб. -Тверь, 2003.-С. 146-153.

43. Зубарева Г.М. Влияние температуры на целостные показатели состояния водных систем. [Текст] / Г.М.Зубарева, А.В.Каргаполов // Химия и хим. технология. 2004. т

47, Вып. 9.-С. 26-29.

44. Зубарева Г.М. Использование ИК-спеетроскопии низкого разрешения для исследования сенсорных свойств тонких слоев воды [Текст] / Г.М.Зубарева, А.В.Каргаполов // Вода. Экология и технология. Экватек • тез. VI международ, конгр. Т.1 М., 2004 - С. 548.

45. Зубарева Г.М. Изменения параметров состояния водных систем в присутствии ионов калия и натрия [Текст] / Г.М.Зубарева // Химия и хим. технология. 2005. Т

48, Вып. 1.-С. 13-16.

46. Зубарева Г.М. Особенности влияния малых концентраций этанола на состояния водной основы растворов. // Химия и хим. технология. 2005. Т.48, Вып. 4. - С. 2023.

РНБ Русский фонд

2007-4 5733

Í

0 9 ЯМ 2005 \

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Зубарева, Галина Мефодьевна

ВВЕДЕНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Состояние воды в биологических объектах. 13:

1.1. Особенности организации молекул воды в модельных и биологических системах.

1.2. Влияние веществ различной полярности на организацию? молекул воды;в модельных и биологических системах.

1.3. Физико-химические аспекты состояния воды в биологических системах.

1.41 Использование инфракрасной спектроскопии для исследования водосодержащих систем и биологических жидкостей;.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Материалы и методы.53;

2.1. Материалы исследования:.

2.21 Методы исследования

2.2.1. ИК-спектрометрия с помощью аппаратно-программного комплекса «Икар».

2.2.2.Анализ состояний биологических систем.

2.2.3е. Построение объемных образов.

2.2.4! Многомерный анализ результатов ИЬС-спектрометрии и определение критериев Маханолобиса и Бартлетта.

2.2.5. Алкоголизация крыс в эксперименте.

2.2.6. Стандартная ИК-спектрометрия.

2.2.7. Проточная тонкослойная хроматография фосфолипидов.

2.2.8. Идентификация фосфолипидов.

2.2.9. Препаративное выделение фосфатидилхолинов, сфингомиелинов и фосфатидилинозитов из сыворотки крови.

2.2.10. Методика получения липосом.

2.2.11. Статистическая обработка результатов исследования:

2.2.12. Способ исследования крови.

2.2.13; Способ исследования воды.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 3. Анализ показателей целостного состояния биологических систем. 68'

3.1. Разработка способа ИК-спектрометрии для исследования; тонких слоев биологических систем и модельных растворов. 68 3;2. Комплексная характеристика сыворотки крови при различных заболеваниях. 80 й

3;3; Влияние величины водной составляющей биологических систем на дисперсию показателей ИК-излучения.

3.4. Анализ особенностей динамики состояния разведенных образцов сыворотки крови больных остеопорозом.

3.5. Особенности действия этанола на биологические системы.

Глава 4. Особенности влияния веществ неорганической ирироды на состояние их модельных растворов.

4.1. Изменение дисперсии коэффициентов пропускания ИК-излучения, проходящего через тонкие слои модельных систем; содержащих одновалентные ионы.

4.2! Сравнительный анализ влияния ионов натрия и калия на показатели целостного состояния модельных систем;.

4.3. Особенности изменения дисперсии коэффициентов! пропускания ИК-спектра водной основы растворов под влиянием двухвалентных катионов различной концентрации.

4.4. Анализ параметров целостного состояния систем при действии сверхмалых концентраций ионов кальция и калия.

4.5. Особенности состояния воды в присутствии смеси катионов. 142 416. Влияние сверхмалых количеств пероксида водорода на= водную основу растворов.

Глава 5. Влияние биологически активных веществ органической природы на состояние их растворов.

5:1. Анализ изменения дисперсии показателей пропускания ИК-излучения тонких слоев растворов с различным содержанием глюкозы^ аскорбиновой кислоты, новокаина, тирозина и тироксина.

5.2. Изменения целостных показателей состояния воды в присутствии сверхмалых количеств аскорбиновой кислоты. 178:

5.3. Изменение параметров целостного состояния водных систем под влиянием веществ различной природы.

Глава 6. Изменение параметров состояния водосодержащих систем под влиянием различных экзогенных факторов.

6.1. Влияние температуры на показатели состояния водных систем.

6.2. Особенности влияния ионов водорода различных концентраций на состояние водного компонента их растворов.

6.3. Анализ влияния рН на температурную зависимость коэффициентов пропускания ИК-спектра воды.

6.4. Влияние водонерастворимых материалов на состояние водных систем.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ состояния биологических систем с помощью ИК-спектрометрии"

Актуальность темы. Проблема определения значимости изменений отдельных биохимических процессов для сохранения параметров? целостного состояния и обеспечения функционирования^ биологических систем остается -мало изученной. Доказано; что существенное значение в. формировании/ таких параметров! играет степень и характер' организованности молекул водного компонента. В1частности установлено, что структурообразующая функция« воды обеспечивает возникновение: нативных:форм макромолекул [1, 25, 45, 103, 143, 146, 167, 213, 251]. При этом обнаружено, что действия биологически активных ионов; ферментных систем, лекарственных веществ, экологических: факторов! в значительной* мере? связаны; с изменениями5 физико-химических и структурных свойств^воды. [2, 27, 35, 57, 81, 109, 153, 211]. В настоящее время вода рассматривается как организованная динамическая жидкость, в которой постоянно образуются ^ распадаются разнообразные по характеру и количеству ассоциаты молекул [60; 148, 183, 205; 210, 217, 218, 236, 253; 292, 293]. Доказано; что данное вещество является« необходимым составным компонентом^ основных структурно-функциональных элементов живых систем [2 - 4, 70, 167,. 177,, 184;. 209; 262; 267, 290]: Существует ряд работ, посвященных изучению роли воды в биологических системах и влиянию гидратации белков на их активность [ 1, 4, 12, 69;. 122; 146, 165, 187, 290]; Часто эффект различных внешних факторов? (ионов; лекарственных веществ, различных: антропогенных загрязнений) связывают с изменением: состояния водной среды,, а также с действием ферментов;аквапаринов, контролирующих; водно-солевой. обмен: клеток иг осуществляющих транспорт воды через; мембраны [ 117, 170, 201, 221, 246, 247].

Внимание большинства исследователей в. первую? очередь привлекает проблема участия воды в обеспечении активности и структуры ферментных систем [178; 199; 226 - 229; 231, 254]; Доказано, что существует равновесие между свободной и структурной водой, входящей в состав различных тканей, которое определяется характером и степенью их взаимодействия; [157, 159, 175; 197, 228, 232, 256]. Этот факт свидетельствует о том,* что состояние гидратированных. биологически значимых молекул: (их; конформация, ее: изменения! в. процессе функционирования) в большей или меньшей степени зависят от физико-химических параметров воды.

В связи с этим актуальной задачей является разработка эффективных методических подходов к определению целостных показателей;состояния» биологических систем,.которые будут характеризовать суммарный эффект взаимодействиям отдельных гидратированных: компонентов, включая! свободную воду. Наличие: таких критериев,, играющих самостоятельную? роль в оценке: функциональной активности? системы и определении! ее отличий от контроля; дополнительно позволит установить степень значимости изменений комплекса показателей, характеризующих отдельные биохимические реакции. Особенный интерес представляет изучение в? качестве: биологических систем; состояния? сыворотки; крови« больных: с различной* патологией. Это? даст возможность продемонстрировать, каким образом оценивается система с различным или: одинаковым биохимическим составом по целостным критериям состояния.

Крайне перспективным» является? проведение исследований» тонких слоев: водных систем; (менее: 20мк), т.к., по: свидетельству ряда' авторов? [119; 120;, 137, 141],в1этих условиях возникает неустойчивое* состояние: жидкости, что предполагает возможность получения принципиально новой: информации?о степени:и«характере взаимодействия: свободной, связанной: воды: и сложных: макромолекул биологических: систем' в условиях: различной патологии.

Цель работы иIзадачи исследования. Цель работы состояла:в том, чтобы на; основе данных ИК-спектрометрии разработать методику, позволяющую характеризовать особенности целостного состояния биологических систем и использовать ее для оценки степени значимости различий их биохимического состава.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

- создать методику исследования и обработки данных, разработав, аппаратно-программный комплекс, позволяющий: регистрировать степень и характер колебания показателей пропускания^ тонкими^ слоями жидкости в средней области ИК-спектра;

- на основе полученных данных с использованием значений дисперсий; девяти диапазонов средней области ИК-спектра (3500 - 3200см'1, 3085 - 2832см"1, 2120 - 1880 см"1, 1710 - 1610см"1, 1600 - 1535см'1, 1543 - 1425см"1, 1430- 1210см"1, 1127 - 1057см"1, 1067 - 930см"1) и критериев^ многомерного анализа (расстояния; Махаланобиса; и критерия Бартлетта) определить оптимальные параметры состояния различных биологических систем и модельных растворов;

- с помощью аппаратно-программного комплекса «ИКАР», целостных системных показателей, компьютерных объемных образов; диаграмм; рассеяния и Вороного выявить, и количественно* охарактеризовать различные состояния цельной крови, слюны; а также сыворотки крови контрольной: группы и 5 больных при остеопорозе, диабете, алкоголизме, гепатитах, шизофрении, эпилепсии, гипертонической и ишемической болезнях, онкологических и? неврологических заболеваниях - патологиях, характеризующихся; выраженной спецификой биохимических процессов;

- определить в сыворотке крови исследуемых групп больных уровень, содержания, общего белка, мочевины, фосфолипидов, холестерина, кальция, калия, глюкозы, трансаминазной активности;

- провести сравнительный анализ параметров состояния разведенных образцов сыворотки крови больных остеопорозом, алкоголизмом с контрольной группой;

- у больных алкоголизмом, а также при алкогольной интоксикации крыс выявить возможные механизмы участия водного компонента сыворотки крови в реализации эффекта действия этанола;:

- установить, возможные механизмы, участия^ водного компонента сыворотки крови в патогенезе остеопороза;:

- выявить особенности влияния; на состояние модельных водных растворов * веществ различной« химической? природы и биологической активности? (ионов; калия; натрия; кальция,. этанола,, глюкозы, аскорбиновой кислоты, тироксина, тирозина и пероксида водорода), дифильных веществ (липосом фосфолипидов);

- провести: сравнительный; анализ» параметров? целостного« состояния; модельных растворов веществ: различной: функциональной активности (метаболит, регулятор,, необходимый, компонент биологических мембран).

Новизна исследования

1. Впервые в девяти диапазонах см"1 (3500 * - 3200; 3085 - 2832; 2120 -1880, 1710 - 1610,.1600 - 1535,.1543 - 1425, 1430 - 1210, 1127 - 1057, 1067 - 930) средней области ИК-спектра обнаружено явление колебания показателей: пропускания: ИК-излучения,, проходящего: через; тонкие слои водных модельных растворов и биологических систем; параметры * которого позволяют оценивать, суммарный эффект степени: организованности отдельных компонентов и молекул воды.

2. Впервые: на основе: результатов ИК-спектрометрии разработана: методика, позволяющая определять целостное состояние биологических систем: с помощью дисперсии показателей пропускания; критериев Махаланобиса, Бартлетта, диаграмм рассеяния, Вороного, компьютерных: образов^ Это дает возможность оценивать значимость изменений г отдельных биохимических показателей г для всей системы в целом.

3. Впервые на примере сывороток крови больных остеопорозом, алкоголизмом, диабетом,, гепатитами, шизофренией, эпилепсией, гипертонической и ишемической< болезнями, онкологическими и неврологическими заболеваниями * доказано существование различных типов г их состояний; количественные характеристики« которых; при вирусных гепатитах, сердечно-сосудистых, заболеваниях, алкоголизме согласуются! с биохимическими? показателями активности, трансаминазы, фосфолипидов и холестерина:

4. Впервые установлено,- что критерии Махаланобиса. и Бартлетта позволяют определять различие в состоянии водного компонента сыворотки? крови «при: ряде заболеваний (остеопорозе, ушибе головного? мозга,. эпилепсии, шизофрении), которые традиционными биохимическими показателями не устанавливаются.

5: Впервые на модельных растворах полярных, неполярных, дифильных веществ органической и неорганической природы, обладающих различной биологической? активностью,- показана способность химических соединений: определять параметры; целостного: водных систем.

6. Разработан, запатентован и сертифицирован как новый тип измерителя ИК-спектрометр, позволяющий; в девяти диапазонах средней области спектра (3500-960см*1) количественно регистрировать, величины колебания показателей; пропускания? ИК-излучения различных водосодержащих систем.

Практическая и теоретическая значимость

Удалось установить, что неоднозначные по составу биологические системы сыворотки крови? больных характеризуются различными? целостными состояниями, которые могут бытьч количественно " оценены; критериями; Махаланобиса? и; Бартлетта и идентифицированы с помощью диаграмм Вороного. Разработанные таким образом? параметры состояния' позволяют оценить важность разнонаправленных изменений; ряда биологических показателей; происходящих в анализируемом: водном объекте, для всей системы в целом. Значение полученных результатов для; практики заключается в том, что разработанная: аппаратно-программная; система в: комплексе с другими £ методами: дает возможность, оперативно» осуществлять диагностику заболеваний, оценивать суммарный! эффект влияния: экологических факторов на процессы жизнедеятельности, проводить скрининг биологически активных веществ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный; метод определения: состояния: водосодержащих: систем основан на использовании параметров; обнаруженного явления * колебания показателей ИК-излучения, проходящего через тонкие слои жидкости в девяти широких диапазонах средней области спектра:

2. Способ оценки состояния? биологических систем: и водных модельных растворов с помощью величин; дисперсии: показателей пропускания! ИК-излучения исследуемых: диапазонов; данных кластерного и многомерного анализа, диаграмм рассеяния и Вороного, объемных компьютерных образов и их профилей:

3. Существование; различных состояний сыворотки: крови при остеопорозе; диабете, алкоголизме, ишемическош и гипертонической^ болезнях, эпилепсии, шизофрении; вирусных гепатитах А, В, С, рассеянном склерозе, ушибе головного мозга, раке желудка и молочной железы, опухоли и ушибе головного мозга.

4. Наличие; взаимосвязи; между параметрами; состояния водных модельных: систем и: характером1 химической? природы; и функциональной; активности; ряда? компонентов; биологических; систем (фосфатидилхолинов, сфингомиелинов,, фосфатидилинозитов, тироксина, тирозина, глюкозы, этанола; аскорбиновой: кислоты, ионов водорода, калия, натрия, кальция, магния, пероксида водорода).

5. Данные, свидетельствующие об особенности параметров состояний последовательно, многократно разведенных образцов сыворотки крови больных остеопорозом, алкоголизмом, контрольной группы, а. также модельных растворов веществ; различной биохимической; активности, характеризующихся изменяющимся объемом водного компонента

Апробация материалов диссертации ?

Основные результаты и положения? диссертации доложены, и обсуждены на; XII съезде психиатров России: (Москва, 1995),. IV Международной * конференции челюстно-лицевош хирургии и стоматологии; (С.-Петербург, 1999);. Научно-практической; конференции^ «Эколого-медицинские аспекты состояния! И; среды обитания; населения; Тверской области и города Твери» (Тверь, 1999); Межрегиональной научно-практической^ конференции «Качество питьевой воды,-водоотделение и здоровье: населения» (Рязань, 2000), Всероссийской конференции «Обеспечение качества, и безопасности алкогольной; продукции» (Москва, 2000); IV Международном салоне? промышленной? собственности; «Архимед-2001» (Москва, 2001), XIII Международном» симпозиуме «Международный! год воды»: (Австрия, 2003); III Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (С.Петербург, 2003), Российском конгрессе по остеопорозу (Москва, 2003), Международной научной» конференции: "Социально-медицинские: аспекты, состояния: здоровья и среды, обитания населения,, проживающего в; йод-дефицитных регионах России? и стран; СНГ" (Тверь, 2003), V и VI Международном конгрессе «Экватек» (Москва, 2002, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 47 печатных работы: 27 статей, из них 10 в центральной печати, 15 тезисов докладов на международных конгрессах: и конференциях; получены: Авторское свидетельство №1802341, Патенты Р.Ф. №2148257, № 2164685, №2137126, №2164350.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зубарева, Галина Мефодьевна

222 ВЫВОДЫ^

1. С помощью разработанного аппаратно-программного комплекса «ИКАР», сертифицированного как новый тип измерителя, обнаружено явление колебания? показателей? пропускания ИК-излучения, проходящего через тонкие? слои? биологических? систем« и? водных модельных растворов? в девяти широких? диапазонах средней? области« спектра в см'1: 3500- 3200, 3085 -2832,2120- 1880, 1710- 1610, 16001535; 1543 - 1425;. 1430 - 1210, 1127 - 1057, 1067 - 930. Создана методика количественной характеристики? этого? явления? с? использованием: дисперсии? показателей« пропускания, целостных критериев многомерного анализа; (расстояния Махаланобиса- и* критерия? Бартлетта), диаграмм рассеяния и Вороного, компьютерных образов.

2. В биологических системах различного биохимического состава (цельная« кровь и сыворотка крови,, слюна) с помощью модифицированного способа? ИК-спектрометрии определены? наиболее оптимальные параметры различных целостных состояний; которые характеризуют суммарный эффект взаимодействия гидратированных веществ и водной составляющей, компонентов образующих единую динамическую систему.

3. С помощью ИК-спектрометрии на основании значений дисперсий-показателей пропускания, целостных критериев Махаланобиса и Бартлетта, кластерного анализа, диаграмм рассеяния и Вороного, компьютерных объемных образов удалось выделить различные состояния сыворотки крови больных с различной патологией (гипертоническая и ишемическая болезни, ушиб мозга, рассеянный склероз, опухоль головного мозга, гепатиты А, В, С, рак желудка и молочной железы, диабет, шизофрения, эпилепсия, алкоголизм, остеопороз). Обнаружено, что каждый тип состояния соответствует группе заболеваний; имеющих: сходную клинику и: этиологию.

Применение диаграмм Вороного позволило аналитически доказать существование: разницы состояний» сыворотки; кровиI у больных с различной патологией; в тех случаях, когда; один из целостных критериев, характеризующий; заболевание, достоверно не отличаетсяI от контроля.

4. Сравнительный: анализ: критериев; Махаланобиса: и Бартлетта, характеризующий состояние водного компонента сыворотки крови; со стандартными; биохимическими; показателями» белков; лигшдов, углеводов; минеральных: веществ исследуемых групп больных, позволил установить,. что; низкие значения г целостных критериев г сопровождаются; высоким; содержанием фосфолигшдов и холестерина; у больных: гипертонической^ и: ишемической болезнями; в; то; время; как: максимальный; показатель Махаланобиса обнаружен: при гипохолестеринемии у больных алкоголизмом; Установлено также; что повышение активности аланинаминотрансферазы.у больных гепатитами А, В, С сопровождается значительными критериями Бартлетта. Одновременно обнаружена достоверная разница в целостных показателях но сравнению с контролем при остеопорозе, неврологических, психических и:онкологических заболеваниях, которая не сопровождается какими-либо изменениями приведенных стандартных биохимических показателей;

5. Анализ последовательно разведенных образцов сыворотки крови больных алкоголизмом и остеопорозом по сравнению с контрольной группой показывает, что существуют выраженные особенности изменения показателей Махаланобиса и Бартлетта. При этом; максимальные и минимальные критерии обнаруживаются при различных разведениях. Построение диаграмм рассеяния разведенных образцов сыворотки крови больных с легкой и средней формой остеопороза демонстрирует существенную; разницу в их состоянии,, что; подтверждает факт непосредственного участия воды в формировании различных целостных состояний.

6. Показано, что присутствие в водных системах различных количеств биологически; значимых веществ неорганической * и органической природы (пероксида водорода; катионов; водорода; калия,, натрия;, кальция; магния, этанола, аскорбиновой; кислоты, глюкозы, тирозина; тироксина,, липосом фосфолипидов) создает различные целостные; состояния, которые характеризуются; специфической дисперсией; показателей: пропускания; на различных: частотах, а также критериями Бартлетта, Махаланобиса и диаграммами рассеяния;.

7. Анализ; состояний; водных модельных систем; содержащих вещества; с различной; химической! структурой: и биологической; активностью> свидетельствует о том, что наиболее; высокими? значениями критерия; Махаланобиса, составляющими 985±11у.е., характеризуются; системы,, содержащие липосомы: из фосфолипидов. Одновременно» установлено; что в растворах гидрофильных веществ; эти значения существенно ниже и максимальные величины; этого; критерия? выявлены; в присутствии; гормона тироксина - 405±38у.е:.

8; В тонких слоях модельных систем дифильных веществ, представленных липосомами фосфатидилхолинов; сфингомиелинов, фосфатидилинозитов и- их смесями, обнаружены различные значения критерия Махаланобиса, величины которых определяются как концентрацией фосфолипида, так и его химической природой. Установлена- математическая; зависимости? между количеством каждой отдельной фракции фосфолипида и значением целостного показателя состояния водной системы.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Зубарева, Галина Мефодьевна, Тверь

1. Абатуров; Л.В. Вода; как стабилизатор и; пластификатор' глобулярной структуры; лизоцима / Л.В.Абатуров, Д.А.Файзуллин, Н.Г.Носова // Доклады; Академии наук. 1997. -Т. 355, №1.-С. 114-116.

2. Аксенов С.И. Вода; и; ее роль« в регуляции биологических процессов / С.И.Аксенов М.: 1990. 117с.

3. Аксенов С.И. О состоянии; воды в биологических объектах по» данным; различных физических методов / С.И:Аксенов // Биофизика 1977 - Т.22: - С. 923-924.

4. Аксенов С.И; Роль, воды в процессах функционирования; биологических структур и; в. их регулировании; / С.И.Аксенов * // Биофизика 1985 - т.ЗО - С. 220-223.

5. Аксенов С.И. Роль воды в регуляции биологических процессов и в их чувствительности к слабым1 воздействиям / С.И;Аксенов // Космическая биология; и авиакосмическая медицина: тез. докл. Х1-ой конф. М., 1998: - С. 21-22.

6. Аллик Т. А. Действие; алкоголя на функциональные, характеристики; внутренних органов; / Т.А.Аллик, С.П.Аникеева, Л.И:Маркелова // Вопросы мед. химии 1985. - № 3. - С. 116-120.,

7. Аношин А.Н. Колебательные спектры многоатомных: молекул /

8. A.Н.Аношин, В.Г.Гастилович. М. 1986; - 283с.

9. Антоненков В.Д. Патогенез; алкогольной кардиомиопатии /

10. B.Д.Антоненков // Вопросы наркологии. 1992. - № 1 - С.79-85.

11. Антонченко В .Я. Основы физики воды / В.Я.Антонченко, А.С.Давыдов, В.В.Ильин. Киев, 1991. - 667с.

12. Антонченко В.Я. Физика воды / В.Я.Антонченко. Киев, 1986. -125с.

13. Аристархов В.М. Влияние глюкозы на инфракрасный спектр воды (К вопросу о бескровном определении глюкозы в крови; методом фотометрии тканей) / В.М; Аристархов, И.С. Балаховский. // Клиническая лаб. диаг. 1998. - №4. - С. 18-22.

14. Ашмарин И.П. К вопросу о развитии проблемы эффективности сверхмалых доз? биологически активных соединений; / И.П.Ашмарин., Е.П; Каразеева., Т.В.Лелекова. // Российский?хим. Журнал. 1999.-Т. XLIII, №5: - С.21-28.

15. БабакВ.Г. Коллоидная химия в технологии микрокапсулирования / В.Г.Бабак. Свердловск, 1991. - 34с.

16. Байерман? К. Определение* следовых количеств; органических веществ / К.Байерман. М. : Мир, 1987. - 462с.

17. Балаховский И.С. Инфракрасная спектроскопия в клинической: лабораторной; диагностике / И.С.Балаховский // Клиническая; лабораторная диагностика. 1995. - №4. - С. 24-29.

18. Балаховский И.С. Одновременное определение содержания; холестерина и триглицеридов в плазме крови методом? инфракрасной спектроскопии?/ И.С.Балаховский И Лаб. дело. -1982 -№5. -С.25-29

19. Бахшиев Н.Г. Введение в молекулярную спектроскопию / Н.Г.Бахшиев Л., 1974 - 181с.

20. Беллами Л. Новые данные по ИК спектрам сложных молекул / Л.Беллами. - М., 1971. - 590 с.

21. Бирштейн М; Гидрофобные взаимодействия неполярных молекул / М.Бирштейн // В еб.: "Состояние и роль воды в биологических объектах". Л., 1967. - С. 16-30.

22. Блюменфельд Л.А. Понятие? конструкции? в? биологической; физике; К вопросу о механизме? действия? сверхмалых доз; / Л.А.Блюменфельд// Российский; хим. Журнал; — 1999. Т.ХЫП, №5.-С. 15-20.

23. Бонавида Б. Иммунологические эффекты веществ в сверхмалых дозах: новые механизмы и синергетические; взаимодействия / Б.Бонавида // Российский хим. Журнал. 1999. - Т.ХЫИ; №5. -СЛ00-107.

24. Борина А.Ф. О структурных особенностях воды. вблизи 30°С / Борина А.Ф. II Инс. Общей и неорг. Химии АН СССР. М. 1982. -15с.

25. Брандтс Дж.Ф: Конформационные переходы белков в воде и смешанных водных растворителях / Дж.Ф.Брандтс // Структура и стабильность биологических; макромолекул. М;, 1973. - С 174254:

26. Будников Г.К. Определение следовых количеств; веществ как? проблема современной аналитической химии / Г.К.Будников // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т.6, №3. - С.45-51.

27. Бурлакова Е.Б. Сверхслабые воздействия химических соединений? и физических факторов на биологические системы / Е.Б.Бурлакова, А.А.Конрадов, Е.Л.Мальцева II Биофизика. -2004.- Т.49, выи 3. С.551-564.

28. Бурлкова Е.Б. Особенности действия сверхмалых доз биологически; активных веществ и ? физических факторов * низкойинтенсивности / Е.Б.Бурлкова// Российский хим. Журнал. 1999. -Т. Х1ЛН;№5.-С. 3-11.

29. Буров Ю.В. Нейрохимия и фармакология, алкоголизма / Ю.В.Буров, Н.Н:Ведерникова. М=, 1985. - 240 с.

30. Буров Ю.В;, Ведерникова? Н.Н., Борисова И.П., Игнатков В.Я. Особенности эндокринной; системы крыс: с различной; склонностью; к добровольному потреблению алкоголизма. // Бюлл. экспер. биол. 1983. - № 6. - С. 80-82.

31. Валяшко В.М. Крутильные явления: в системах вода; — неэлектролит / В.М.Валяшко, М.А.Урусова // Ж. Физ. Химии. -2001. Т.75, №6. - С.996-1007.

32. Влияние аминокислот и низкомолекулярных пептидов на динамику воды / И.Н.Кочнев и др. //Биофизика. 2002. - Т.47, вып 1. - С 12-19;

33. Влияние компонентов; сивушного масла и эфироальдегидной фракции: на острую токсичность и наркотическое действиеэтилового спирта / В.П.Нужный и др. // Тезисы докладов 1-го» съезда токсикологов России. М; 1998; - С. 193.

34. Влияние: этанола: и ингибитора; катал азы 3-амино-1,2,4-триазола на перекисное; окисление; липидов в г гомогенате и * субклеточных фракциях печени крысы / В.Д.Антоненков и др. // Вопросы мед. химии. 1990. - Т.36, вып. 5.-0.15-18.

35. Вода — космическое явление / под ред Ю.А.Рахманина, В.К. Кондратова. М;, 2002. - 427с.

36. Вода в% дисперсных системах / под ред. Б.В.Дерягина. М!:; Химия, 1989. - 285с.

37. Вода, парадоксы и величие малых величин / Петросян В.И. и др. // Биомедицинская радиоэлектроника. 2000; - №2. - С.4-9.42! Гамалей И.А. Свойства клеточной воды. / И.А. Гамалей, А.Б. Каулин, А.С.Трошин // Цитология. 1977. - Т.Х1Х, №12. - С. 13091326.

38. Грибанов Г.А. Изменение белков и липопротеидов крови и миокарда при остром отравлении этанолом / Г.А.Грибанов, В.С.Челноков, Л.В.Лукьянова // Вопросы мед. химии. 1983. - Т. 29, Вып. 5. - С. 10-13.

39. Грибов Л.А. Введение в молекулярную спектроскопию / Л.А.Грибов. -М.,1976. 260с.

40. Григорьев Е.И. О роли водной среды в- механизмах действия иммуноактивных пептидов в сверхмалых дозах / Е.И.Григорьев // Бюллетень эксперимент, биологии; и медицины. — 2003. Т.136, №8. - С. 173-177.

41. Гуриков Ю.В. Проявления структуры воды в; спектре; валентных колебаний молекул ЩО / Ю.В.Гуриков //В сб. "Структура и роль воды в живом организме". Л., 1966.- С.103 -- 107.

42. Дин. Р. Процессы распада в клетке / Р.Дин // М., 1981. С. 107116;

43. Диэлектиреские релаксационные характеристики воды в смешанных растворителях вода-поливиниловый спирт и; вода-поливинил пиррол иди н / А.К.Лященко и др. // Ж. Физ. Химии; -20011 т.75; №2: - С.250-257.

44. Дубров A.M. Многомерные статистические методы / А.М.Дубров,

45. B.С.Мхитарян, Л.И.Трошин М., 1998. - 96с

46. Елецкий A.B. Свойства? кластерных ионов? / А.В.Елецкий, Б.М.Смирнов.//УФН 1989.-Т. 159, вып.1.- С.68-72.

47. Еськов А П; Оценка токсичности спиртов, спиртовых растворов и водок методом in vitro с использованием спермы быка в качестве клеточного тест-объекта / А.П.Еськов, Р.И.Каюмов, В.П.Нужный II Токсикологический вестник. 2000. - № 5; - С.16-21

48. Жуховицкий Д.Н. Численное моделирование эволюции? кластера в пересыщенном паре / Д.Н.Жуховицкий // изв. АН СССР. 1996; - Т.60, №9. - С.34-38.

49. Завьялов Ю.С. Методы сплайн-функции / Ю.С.Завьялов, Б.И.Квасов, В.Л.Мирошниченко М., 1980. - 352 с.

50. Зайцев С.В. Общие закономерности и возможные механизмы действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах /

51. C.В.Зайцев, А.М.Ефанов, Л.А.Сазанов И Российский хим. Журнал. 1999.-Т. XLIII, №5.- С. 28-34.

52. Зацепина Г.Н. Свойства и структура воды / Р.Н.Зацепина М., 1974. - 166с.

53. Зацепина Г.Н. Физические свойства и структура воды / Г.Н.Зацепина М, 1987. - 170с.

54. Иванова; Л.В., Золотарев;В.М. Исследования водных растворов; электролитов с помощью метода нарушения полного внутреннего отражения (НПВО) / Л.В.Иванова, В.М.Золотарев Структура и роль воды в живом организме : кн., Л;, 1968 . - С. 30-38.

55. Изучение возможного участия водной среды в дистантной передаче сигнала иммуноактивных дипептидов / Е.И.Григорьев и др. // Бюллютень эксперим. биологии и медицины. 2002. -Т. 133, №5. - С.525-529.

56. Изучение гидратации ионов в водных растворах по спектрам поглощения в; инфракрасной! области / А.К.Карякин и др. // Теорет. и эксперим. химия. 1966. —Т.2; №4. С.494-503.

57. Иогансен А.В. Инфракрасная спектроскоопия и спектральное определение энергии водородной связи / А.В^Иогансен М., 1981. - 111с.

58. Исследования; микроструктуры белков методом «парамагнитная метка пармагнитный зонд» / Г.И.Лихтенштейн и др. // Молекуляр. Биология. - 1970.-Т.4, №5. - С. 682-691.

59. Каплан Н.Г. Введение в теорию межмолекулярных взаимодействий / Н.Г.Каплан. М.: Наука, 1982. - 311с.

60. Карякин А.В- Состояние воды в органических и неорганических соединениях / А.В.Карякин, Г.А.Кривенцова М., 1973. - 175 с.

61. Кашпур В.А. Исследование гидратации? глобулярных белков; методами; диэлектрической; спектроскопии; в миллиметровом: диапазоне / В.А.Кашпур, В.Я.Малеев, Т.Ю.Щеголева // Молекулярная биология. 1976. - Т. 10. - С. 239-345.

62. Кейтс: М. Техника; липитодологии. Выделение, анализ и идентификация липидов / М:Кейтс Л., 1982. - 322с.

63. Кесслер И. Методы, инфракрасной спектроскопии в химическом анализе / И.Кесслер М., 1964: - 328 с.

64. Кесслер; Ю.М., Зайцев А.Л. Сольвофобные эффекты / Ю.М.Кесслер, А.Л.Зайцев Л., 1989. - 310с.

65. Кисловский Л.Д. О стабилизации активных комплексов в додекаэдриеских структурах воды; Физико-химический; и биологический аспекты проблемы / Л.Д.Кисловский II В сб. "Структура и;роль воды;в живом;организме". Л., 1966. - С.171-178.

66. Клинико-лабораторная диагностика инфекционных болезней СПб 2001 384с.

67. Козинец Г.И. Исследования системы крови в клинической практике / Г.И.Козинец, В.А Макаров. М., 1997. - 480с.

68. Количественный подход: к определению понятия? «сверхмапые? дозы лекарственных? веществ: и ядов» / Ф.С.Духович и? др. // Российский хим: Журнал; 1999; - Т.ХЫЩ №5; - €.12-15. .

69. Косяков В.И. Поля стабильности структур клатратных гидратов в модельных бинарных? системах: вода? — гость» / В.И.Косяков,

70. B.А.Шестаков // Журнал физической химии. 1998. - Т. 72, №111. C.1951-1954.

71. Косяков; В.И. Термодинамическая; модель бинарных систем? с клатратными гидратами? и? топология? их фазовых диаграмм? /

72. B.И.Косяков, В:А.Шестаков // Журнал физ. химии. 1998. - Т. 72, №11 - С. 1945-1950.

73. Кочнев И.Н. Изменения? ближнего инфракрасного спектра? воды под действием растворенных? неэлектролитов / Кочнев И.Н: // В сб. "Структура и роль воды в живом организме" Л., 1970. - С.8-16.

74. Кочнев г И.Н. Состояние ? воды; в ?. различных физико-химических: условиях / И.Н.Кочнев, М.Б.Винниченко, Л.Б.Смирнова // В'кн.:; Молекул. Физика и биофизика водных систем. Л. 1986. вып 6.1. C.53-62.

75. Кочнев; И.Н. Температурные? аномалии? спектра? поглощения; и показателя: преломления воды / И.Н.Кочнев, М.Б.Винниченко, Л.Б.Смирнова // В кн.: Молекул: Физика: и биофизика; водных систем. Л. 1986. вып 6. - С.42-52.

76. Крестов Г.А. Термодинамика ионных процессов в растворах / Г.А.Крестов. М. : Химия, 1984. - 272с.

77. Кросс А. Введение в практическую инфракрасную спектроскопию / А.Кросс М., 1961. - 326 с;

78. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф.Лакин М., 1990.- 352 с.

79. Лифшиц В.М. Медицинские лабораторные анализы? / В.МШифшиц, В.И.Сидельников. М., 2000.-312с.

80. Лобышев В.И. Вода как сенсор и; преобразователь слабых воздействий; физической! природы на биологические объекты; / Лобышев В.И. // Слабые и сверхслабые поля- и излучения; в; биологии и медицине :. тез. III международ, конгр. Т. 1. СПб., 2003; - С. 13;

81. Лобышев В.И. Компьютерный модульный. дизайн параметрических структур; воды / В.И.Лобышев, Соловей; А.Б, Н.А.Бульенков // Биофизика. 2003. - Т.48, вып 6. - С.1011-1021.

82. Маленков Г.Г. Машинное моделирование гидратной воды / Г.Г.Маленков, Л.П.Дьяконова // Молекулярная физика и; биофизика водных систем. Л., 1979. - С. 95-110.

83. Мартинек К. Гидрофобное взаимодействие алифатических спиртов с активным центром а- химотрипсина / К.Мартинек,

84. A.В.Левашов, И.В.Березин // Молекулярная биология. 1970. - Т. 4, вып. 4. -С.517-528.

85. Мартынов Ю.С. Нервные болезни / Ю.С.Мартынов. М., 1988: -496с.

86. Методические; указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования / под ред.

87. B.В.Меньшикова М;, 1977. 125с.

88. Механизмы функционирования водных биосенсоров электромагнитного излучения / Л.Д.Гапочка и; др. // Биомедицинская электроника. 2000. -№3.- С.49-55.

89. Мирошников А.И. Содержание перекиси водорода в электрохимически активных растворах и исследование ее влияния на рост клеток Escherichia coli / А.И.Мирошников,

90. Ж.К.Масалимов, В;И.Брусков // Биофизика. 2004. - Т.49, выи 1. -С. 32-38.95; Митчелл Дж. Акваметрия / Дж.Митчелл, Д.Смит: Пер. с англ. -М., 1980.-600 с.

91. Моделирование: структуры? воды? в широком диапазоне температур методом молекулярной динамики / Егоров А.В.и др. //Журнал физ. химии. 2000. - Т. 74, № 10; - С. 1817-1822.

92. Молочкина Е.М. Действие фенозана и экзогенного ацетилхолина на ацетилхолинэстеразу и систему липидной пероксидации в мембранах клеток: головного; мозга / Е.М.Молочкина, И.Б.Озерова, Е.Б.Бурлакова // Российский хим. Журнал. 1999. -Т. ХЕШ« №5.-С. 63-71.

93. Москва: В.В: Водородная; связь* в» органической? химии; / В.В.Москва // Соросовский образовательный журнал. 1999. -№2. - С.58-64.

94. Мревлишвили Г.М., Привалов: П.Л. Исследования: гидратации: макромолекул калориметрическими методами; В кн.: Состояние* и роль воды в биологических объектах: Л. 1967, с. 87-91.

95. Наберухин Ю.И. Строение водных растворов? неэлектролитов. Сравнительный! анализ; термодинамических свойств? водных и неводных двойных систем / Ю.И.Наберухин, В;А.Рогов // Успехи химии. 1971.-Т. П.-С. 369-384!

96. Назаренко? Г.И. Клиническая; оценка результатов лабораторных исследований? / Г.И.Назаренко, А.А.Кишкун. М: :: Медицина; 2000: - 544с.

97. Наканиси К. Инфракрасные спектры и; строение органических соединений / К.Наканиси М., 1965. - 265с.

98. Недев К.Н. Исследование поверхностного/ слоя; белковой? глобулы. Гидратация; молекулы? а-химотрипсина / К.Н.Недев,

99. Ю.И;Хургин // Молекуляр. Биология. 1975; - Т. 9, №5; - С. 761767.

100. Немухин A.B. Ван-дер* ваальсовы кластеры; / A.B.Немухин // Соросовский образовательный журнал. 2001. - Т.7, №1. - С.39-44.

101. Немухин А.В: Молекулы в матрицах и кластерах / А.В.Немухин // Соросовский образовательный журнал. — 2000. Т.6, №6. - С.27-31.

102. Новицкая Г.В. Методическое руководство по тонкослойной хроматографии фосфолипидов / Г.В.Новицкая // М., 1972. 64с.

103. Новскова Т.А. Связь спектров поглощения с вращательным движением молекул жидкой и связанной воды / Т.АШовскова, В.И.Гайдук // Биофизика. 1996.- Т. 41', вып. 3 - С. 565.

104. Перекисное окисление липидов и повреждение печени при острой алкогольной интоксикации / Брейдо В.В. и др. // Вопросы наркологии. 1991. - № 2. - С. 2-4.

105. Петрушанко НЛО. Физико-химические свойства водных растворов, полученных в мембранном электролизе / И.Ю.Петрушанко, В.И. Лобышев. // Биофизика. 2004. - Т. 49, выи 1.-С 22-32.

106. Пиментел Д: Водородная связь / Д.Пиментел, О.Мак-Клеллан. М. : Мир, 19641 107с.

107. Пиментел Дж. Водородная связь / Дж.Пиментел, О.Мак-Клеллан Под ред. В.М.Чулановского. М., 1964. - 462 с.

108. Поглощение ИК-излучения тонким слоем воды / О.А.Пономарев и др. // Биофизика. 2001. - Т.46, вып 3. - С.402-407.

109. Пономарев» О.А. Свойства5 жидкой? воды в электрических и магнитных полях / О.А.Пономарев, Е.Е.Фесенко // Биофизика. -2000; -Т.45, вып.З. С.389-398.

110. Препаративная=биохимия липидов / Бергельсон;Л; Д. и др. М., 1981.-256с.

111. Привалов П.Л. Вода; и ее роль в биологических системах / П.Л.Привалов//Биофизика. 1968.-Т. 13, № 1 - С. 163-177.

112. Применение спектроскопии в химии / Под ред. В.Вест. М., 1959;- 660 с.

113. Прозоровский' В;Б. Неантихолиэстеразные механизмы действия антихолинэстеразных средств / В.Б.Прозоровский, И.В.Саватеева.- Л. : Медицина, 1976. 32 с.

114. Прохорова М.И. Методы биохимических? исследований? (липидный и энергетический обмен) / М.И. Прохорова Л., 1982. -75с.

115. Равновесные флуктуации в миоглобине и лизоциме / Ю.Ф.Крупянский и др. // Биофизика. 2004. - Т.49, вып.З, -С.401-412.

116. В.А.Неверов, В.К.Пригожина. М., 2001. - 576с. 129. Рудаков A.M. Моделирование объемных характеристик водных растворов гидрофильных неэлектролитов / А.М; Рудаков, В.В.Сергеевский // Ж. Физ. Химии. - 2001. - Т.75; №9. - С.1610-1615.

117. Рязанов; М.Л. Влияние растворенного вещества; на состояние; свободной воды в водных растворах / М.А.Рязанов // Журнал физ. химии. 1996. - Т. 70, №11.- С.1980-1981.

118. Самойлов О.Я. Носова Т.А. Структурные особенности; воды / О.Я.Самойлов, Т.А.Носова // Журн. Структур. Химии. 1956. -вып.6, №5: - С.798-808;

119. Самойлов? О.Я. Структура: водных растворов электролитов; и гидратация ионов / О.Я.Самойлов М., 1957. - 192 с.

120. Сишоков В.В. Структура; одноатомных: жидкостей, воды и водных растворов? электролитов: / В.В.Синюков. М. :: Наука, 1976. - 255с.

121. Соркисов Г.Н. Дальний; порядок в: жидкостях: короткодействующие и дальнодействующие; потенциалы / Г.Н.Соркисов // Док. Акад. Наук. 1998. - Т.359, №3. - С.326-329.

122. Сорокина З.А. Состояние калия; натрия и воды; в цитоплазме клеток / З.А.Сорокина -Киев, 1978. 214 с.

123. Сошникова Л. А. Многомерный статистический анализ / Л.А.Сошникова, В.Н.Тамашевич. М.::Юнита-Дана, 1999; - 350 с.

124. Трех- и четырехточечные эмпирические жесткие модели * воды / В.Е.Петренко и др. // Ж.физ.химии. 2002. - Т.76, №2.\- С. 271277.

125. Урнышева В.В. Влияние химических токсикантов; в широком; диапазоне концентраций на характеристики липидов эр итроцитов; крови мышей / В.В.Урнышева, Л.Н.Шишкина // Биофизика. — 2004. Т.49, вып. 3.-С.5565-571.

126. Халоимов А.И. Структура* воды; и гомеостаз биологических систем / А.И.Халоимов, Л.В.Шурупова, М.Б.Винниченко II Вестник СПб РАМН. 1997.-Т.1, вып 4. -С.403-407.

127. Хиппель П., Шлейх Т. Влияние нейтральных солей на структуру и конформационную стабильность макромолекул в растворе / П.Хиппель, Т.Шлейх // Структура и стабильность биологических макромолекул в растворе. М., 1973. - С. 320-380.

128. Хмелевский Ю.В. Основные биохимические константы человека в норме и при патологии I Ю.В.Хмелевский, О.К.Усатенко -Киев, 1984. 148с.

129. Хургин Ю.И. Гидратация глобулярных белков / Ю.И.Хургин II Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева. 1976.-Т. 21.-С. 684-690.

130. Цундель Г. Гидратация и межмолекулярное взаимодействие. Исследование полиэлектролитов методом инфракрасной, спектроскопии / Г.Цундель М.: Мир, 1972. - 162с.

131. Ш. Ло. Наноструктуры в очень разбавленных: водных растворах / Ш. Ло., В. Л и // Российский хим. Журнал. 1999. - т XLIII, №5. -С.40-48.

132. Шамб У. Перекись водорода; / У.Шамб, Ч.Сеттерфилд, Р Вентворс. М. : Ил., 1958. - 578с.

133. Шляпочников В.А. Колебательные спектры алифатических нитросоединений / В.А.Шляпочников М., 1989. - 124 с.

134. Шумилина Е.В. Структура лицетиновых органогелей по данным метода ИК-спектрометрии с Фурье-преобразованием / Е.В.Шумилина, Ю.Л.Хромова, Ю.А.Щипунов // Журнал: физ. Химии. 2000.-т. 74, №7. - С. 1210-1219.

135. Эндогенный этанол и его возможное участие в деятельности центральной нервной системы в норме и при алкоголизме/ Р.В.Кудрявцев и др. // Журнал невропатологии и психиатрии им. С.С.Корсакова; 1987. - Т. 87, вып. 1. - С. 275-179.

136. Юхневич Г.В. Инфракрасная спектроскопия воды / Юхневич Г.В. -М., 1973.-207 с.

137. Юхневич Г.В. Полоса валентных колебаний и структура жидкой воды / Г.В.Юхневич, В.В.Волков // Докл. Акад. наук. 1997. - 'Г. 353, № 4. - С 465-468.

138. Al-Sarraf Н Effect of hypertension on the integrity of blood brain and blood CSF barriers, cerebral blood flow and CSF secretion in the rat /

139. H Al-Sarraf, L.Philip // Brain Res. 2003. - Vol.3, №975(1-2). -P. 179-88.

140. An ionised/non-ionised dual porosity model of intervertebral disc tissue / JM.Huyghe et al. // Biomech Model Mechanobiol. 2003. -Vol.2, № l.-P. 3-19.

141. Andreescu S: Correlation of analyte: structures with biosensor responses using the detection of phenolic estrogens as a model / S.Andreescu, O.A Sadik II Anal.Chem. 2004: - vol; 76, №3. -P.552-60.

142. Anomalies in the% temperature dependence of the 1.2mkm absorbtion of liquid water / G.Andoloro, M.B.Palma-Vittorelli, M.U.Palma // J; Solution Chem. 1975. - vol.4, №3. - P.215-224.

143. Avram L. The role of water molecules in a resorcinarene capsule as probed by NMR diffusion measurements / L Avram, Y.Cohen // Org Lett. 2002. - Vol.4, №24. - P.4365-8.

144. Bahnson BJ. Structure, function and interfacial allosterism in phospholipase A2: insight from the anion-assisted dimmer / BJ.Bahnson II Arch Biochem Biophys. 2005. - Vol.433, №1. - P.96-106.

145. Bernal J.D. The structure of water and biological implications. In: The state and movement of water in living organism. Cambridge. 1965: -P. 17-32.

146. Beutler E. "Pumping" Iron: the proteins / E. Beutler // Science. -vol.306, №5704. P. 2051-2053

147. Bjerrum N. Structure and Properties of Ice; Dan. Mat. Fys. Med;, 27, 1, 1951

148. Burykin A. On the origin of the electrostatic barrier for proton transport in aquaporin / A.Burykin, A.Warshel // FEBS Lett/ 2004. -vol.570, №1-3.- P.41-6.

149. Chakrabarti N. Structural determinants of proton blockage in aquaporins / N Chakrabarti, B Roux, R. Pomes // J Mol Biol. 2004. -Vol.343, №2. - P.493-510.

150. Chowdhry B.Z. Thermodynamics of phospholipids-sucrose interactions / B.Z.Chowdhry, G.Lipka, J.M.Sturtevant // Biophys. J. -1984. Vol.46, №3. - P.419-421.

151. Computational; and- NMR: analyses; for the identification of bound water molecules in ribonuclease T1 / S Shimotakahara et al. // Anal Sei. 2004. - vol.20, №10. - P. 1471-4.

152. Corne Tschelnokoo. U Secondary structure andl temperature behaviour of acetylcholisterase. Studies by Fourier-transform infrared spectroscopy / U. Come- Tschelnokoo et al:. // J. Biochim. - 1993. -vol. 213, №3. - P. 1235-42.

153. Dephosphorylation of the calcium pump coupled to counterion occlusion / C. Olesen et al. // Science. 2004: - vol. 306, №5705. -P. 2251-2255.

154. Electrons in finite-sized water cavities: hydration dynamics observed in real time / D. H. Paik et al. // Science. 2004. - - vol.306, №5696. -P. 672-675.

155. Finney Jlli Therole of water perturbations in biological processes / J.I.Finney // Water and aqueous solutions. Bristol-Boston. 1986. -P.227-232.

156. Frank H.S. Strukture of Ordinary Water / H.S.Frank II Science. 1970. — N196. — P.635.

157. Frank H.S. The structure of ordinary water / H.S.Frank // Science/ -1970.-vol. 169.-P. 635-641.

158. FTIR spectroscopy of the PC photointermediate of Neurospora rhodopsin: structural changes of the retinal, protein, and water molecules, after photoisomerization / Furutani Y. et al;.// Biochemistry. 2004. - Vol.43, №30.- P.9636-46.

159. Gorfe AA. The role of flexibility and hydration on the sequence-specific DNA recognition by the Tn916 integrase protein: a moleculardynamics analysis / AA Gorfe, A Caflisch, I.Jelesarov // J Mol Recognit. 2004; - vol: 17, №2. - P. 120-3 ll.

160. Grant E.H. Dielectric behavior of biological macromolecules in solutions / E.H.Grant, R.J.Sheppard, G.R.South. Oxford; 1978: - 234 P

161. Green M. T. Oxoiron (IV) in chloroperoxidase compound II is basic: implications r for P450 chemistry / M. T. Green; J: Hi Dawson, H. B. Gray// Science. 2004. - vol. 304, №5677. - P. 1653-1656.

162. Hagler A.T. Current status of the water structure problem; application to proteins / A.T.Hagler, H.F.Scherada, G. Nemethy // Ann. Neew York Acad. Sci: 1973: - vol. 204-P.51-75.

163. Hayakawa T. Hydration and thermal reversibility of glycolipids depending on sugar chains / T Hayakawa, M.Hirai // Eur Biophys J. -2002.-Vol.31, №1.-P.62-72.

164. Heat capacity effects of water molecules and ions at a protein-DNA interface / S.Bergqvist et al . // J.Mol.Biol. 2004. - vol.336, №4. -P.829-42

165. Hernick M. Zinc hydrolases: the mechanisms of zinc-dependent deacetylases / M Hernick, CA.Fierke // Arch Biochem Biophys. -2004. V.433, №1: - P.71-84.

166. Herzberg G., Infrared and Raman spectre of polyatomic molecules, N. Y., 1945

167. Hill AE What are aquaporins for? / AE Hill, B Shachar-Hill, Y.Shachar-Hill // J Membr Biol. 2004. -Vol.197, №1. - P. 1-32.

168. Holland D.M. A model for the formation and stabilization of charged water clathrates / D:M.Holland, A.M.Gastleman. // J. Chem. Phys. — 1980 —Vol.72, N.61. — P. 5984—5990.

169. Horeecker B.L. The absorption» spectra, of hemoglobin; and its derireation in visible and near infrared regions / B.L.Horeecker // J. Biol; Chem. 1993. - Vol. 148; N11 - P: 173-177:

170. Hoshi T., Lahiri S. Oxygen sensing: It's a gas / T. Hoshi, S. Lahiri // Science; 2004. - vol.306, №5704. - P. 2050-2051.

171. How do small Water clusters bind an excess electron? / N. I. Hammer et al. // Science. 2004. - vol.306, №5696. - P. 675-679.

172. How environment supports a state: molecular dynamics simulations of two states in bacteriorhodopsin suggest lipid and water compensations / H.Jang et al. II Biophys J. 2004. - vol.87, № 1, P. 129-45.

173. How ions affect the structure of water / B Hribar et al. //J Am Chem Soc. 2002.-vol.124, №41. - p. 12302-11.

174. Huang P Effects of dimethyl sulfoxide, glycerol and ethylene; glycol on secondary structures of cytochrome O and lysozyme as observed by infrared spectroscopy I P. Huang, A. Dong, WS. Coughey // J: Pharm. Sci. 1995. - vol.84, №4. - P.387-92.

175. Hubher C. Die rolle des wassers • m biologische system< / C.Hubher, K.Jung, F.V.Winkler II Akad. Verl. Berlin. 1970. - p.292.

176. Hydrated electron dynamics: from clusters to bulk / A.E.Bragg et al. // Science. 2004. - vol. 306, №5696. - P. 669-671.

177. Hydrophobic collapse in multidomain protein folding / R Zhou et al;. // Science. 2004. - Vol.305, №5690. -P. 1605-9.

178. Importance of increased irinary calcium excretion in the development of secondary hyperparathyroidism of patients under glucocorticoidtherapy / Y.Suzuki et al. // Metabolism. 1983; - Vol.32. - P. 151156.

179. Improved assessment of lumbar vertebral body strength using supine lateral!dual-energy x-ray absorptiometry / Myers B.S. et ah. II J. Bone Miner Res. 1994. - vol.9. - P. 687-693.

180. In vivo assessment:of forearm bone:mass andiulnar bending stillness; in healthy men / K.H.Myburgh et al.'// J. Bone Miner Res.—1992. -Vol 7.-P. 1345-1350;

181. Infrared signature of structures associated with the H+(H20)n (n=6 to 27) clusters / J.-W.Shin et al. // Science. 2004. - vol. 304, №5674. -P. 1137-1140.

182. Infrared spectroscopic evidence for protonated water clusters forming nanoscale cages / M. Miyazaki et al. // Science. 2004. - vol. 304, №5674.-PJ.1134-1137.

183. Inhibition of tumor angiogenesis in vivo by a monoclonal antibody targeted to domain 5 of high molecular weight kininogen / JS Song et al. II Blood. 2004. - Vol.104, №7. - P.2065-72.

184. Jensen MO Electrostatic tuning of permeation and selectivity in aquaporin water channels / MO Jensen, E Tajkhorshid, K.Schulten // Biophys J. 2003. - Vol.85, №5. - P.2884-99.

185. Kauzman W. Some factors in the interpretation of protein denaturation ; / W.Kauzman // Adv. Protein. Chem.—1959:—Vol. 14. — Pi — 63:225: Kavanaui J.L. Water and Solute-Water Interactions?/ J:L.Kavanau -San Francisko. 1964.-208 p.

186. Keutsch FN» Water clusters: untangling the mysteries of the liquid, one-molecule? at; a time / FN Keutsch, RJ.Saykally // Proc Natl Acad Sci USA.- 2001.- vol. 98, №19. P. 10533-40.

187. Keutsch F.N. Water clusters: untangling the: mysteries; of the liquid, one molecule at a time / FN Keutsch, RJ.Saykally // Proc Natl Acad; SciiUSA.- 2001.- vol: 98; №19i P; 10533-40.

188. Khanafer K. Computationarmodeling of cerebral diffusion-application; to stroke imaging / K Khanafer, K Vafai, A.Kangarlu // Magn Reson Imaging. -2003. Vol.21, №6. - P.651-61.

189. Kim C. Tailor Crystal structure of complex between the catalytic and regulatory (Rla)subunits of PKA / C.Kim., N. Xuong., S. Taelor // Science. 2005.- vol. 307, №5710. - P. 690-696.

190. Komatsu K. Encapsulation of molecular hydrogen in fullerene Cf,o by organic-synthesis/ K. Komatsu:, M. Murata., Ya. Murata // Science. -2005. vol. 307, №5707. - P. 238-240.

191. Koynova R Phases and phase transactions of the hydrates phosphatidykethanolamines;/ R. Koynova, M.Coffrey // Chem-phys. Lipids. 1994! - vol.69, №1. P.l-34.

192. Kuntz J.D., Kauzmann W. Hydration of proteins and polypeptides / J.D. Kuntz, W.Kauzmann // Adv. Protein Chem. -1974. Vol. 28. -P. 239-345.

193. Lemoff AS Binding energies of water to lithiated valine: formation of solution-phase structure in vacuo7 AS Lemoff, ER:Williams // J Am Soc Mass Spectrom. 2004; - vol; 15, №7. - P. 1014-24.

194. Leurs RN Calorimetric and spectroscopic studies of the polymorphic phase behavior of a homologous series of n-saturated 1,2-diaeyl phosphatidylethanolamines / RN Leurs, RN McElhaney // Biophys. -1993. vol.64, №4: - P. 1081-96.

195. Liposome/water lipophilicity: methods, information; content, and pharmaceutical applications / van Balen GP et al. // Med Res Rev. -2004. Vol.24, № 3. - P.299-324.

196. Liu K. Water clusters / K.Liu, J.D.Cruzan, R.J.Saykally // Science. -1996.- vol. 271.- P. 929-933.

197. Lohmann KL Lipopolysaccharide from Rhodobacter sphaeroides is an agonist in equine cells / KL Lohmann et al. // J Endotoxin Res. -2003.-vol. 9,№1.-P.33-7.

198. Lumri R. Conformational mechanisms for tree energy transduction in protein system: old ideas and new facts / R.Lumri // Ann. N.J:Acad. Sci.- 1974.-Vol. 227.-P. 46-73.

199. MacKinnon R. Voltage sensor meets lipid membrane / R. MacKinnon // Science. 2004: - vol: 306, №5700. - P. 1304-1305.

200. Mazerski J. Effect of the modifications of ionisable groups of amphotericin B on its ability to form complexes with sterols in hydroalcoholic media / J.Mazerski, J.Bolard, E.Borowski // Biochim Biophys Acta.- 1995; vol: 1236.- P. 170-176

201. Merzberg G. Infrared and Raman Spectre of Polyatomic Molecules, N.Y., 1945

202. Molecular basis of pH and; Ca2+ regulation: of aquaporin water, permeability / KL Nemeth-Cahalan, K Kaiman, JE.Hall // J Gen; Physiol. 2004.-Vol.123, №5.- P.573-80.

203. Molecular dissection of water and glycerol permeability of the aquaglyceroporin from Plasmodium falciparum by mutational analysis I E.Beitz et al. // Proc Natl Acad Sei USA. 2004. - Vol.101, №5. -P.l 153-8.

204. Mukhopadhyay P. Molecular dynamics simulation of a palmitoyl-oleoyl phosphatidylserine bilayer with Na+ counterions; and 1NAC1 / P.Mukhopadhyay, L.Monticelli,, D.P.Tielleman II Biophys. J. 2004. -vol.86, №3. - P. 1601-9.

205. Multivariate determination of glucose in venole blood by attenuated total reflection infrared spectroscopy / Heise H.Mi, et al. // Anal: Chem: 1989.-Vol. 61, N18.-P. 2009-2015.

206. Mustata G. Cluster analysis; of water molecules, in alanineracemase and their putative structural role / G Mustata, JM.Briggs // Protein Eng Des Sei. 2004. - vol.17, № 3. - P.223-34.

207. Pancosha P Frequency analysis of infrared absorption and vibrational circular dichroism of proteins in D20 solution / P. Pancosha, L. Wang,. T.A. Keiderling // Protein Sci. 1993. - vol. 26 №3. - P.411-9

208. Pathophysiology of the; adverse effects ofglucoactive corticosteroids; on calcium metabolism in man / A.Caniggia et al. II J. Steroid Biochem. 198 l.-Vol. 15.-P. 153-161.

209. Preparation of plasmenylcholine lipids; and plasmenyl-type liposome dispersions / DH Thompson et al.. // Methods Enzymol. 2004. -Vol.387. - P. 153-68.

210. Saier E.L. use of multiple internal reflection Spectroscopy in the Study and; identification; of Steroids / E.L.Saier // Appl. Spectroscopy. -1968. Vol. 22, N5.- part 1. P. 445-448.

211. Saier E.L. Use of multiple internal reflection Spectroscopy in the study and identification: of steroids / E.L.Saier // Appl: Spectroscopy. -1968. vol.22, N5. - P.445-448.

212. Sarpong S.B. Anovel mouse model of experimental asthma / S.B.Sarpong,. L.Y.Zhang, S.R.Kleeberger // Jnt. Artch Allergy Immunol. 2003. - Vol.132. №4.- P.346-54.

213. Secondary structure of spiralin in solution, at the air/water interface, and in interaction with lipid monolayers / Castano S et al. // Biochim Biophys Acta. 2002. - Vol.1562, №1-2.- P.45-56.

214. Shah J. Structure and Thermotropic Properties of 1 Stearoyl - 2 -Acetyl - Phosphatidylcholine Bilayer Membranes / J.Shah, RJ.Duclos, G.G.Shipley// Biophysical Journal. - 2003; - Vol.66. - P. 1469-1478.

215. Shibata M. Water molecules in the schiff base region of bacteriorhodopsin / M Shibata, T Tanimoto, H.Kandori // J Am Chem Soc. 2003. -Vol.125, №44. - P.13312-3.

216. Siva K.Ion permeation through the gramicidin channel: atomically detailed modeling by the Stochastic Difference Equation / K.Siva,. R.Elber // Proteins. 2003: - Vol.50, №1. - P.63-80.

217. Smith LJ Assessing equilibration and convergence in biomolecular simulations / LJ Smith, X Daura, van Gunsteren WF // Proteins. -2002. vol. 48, №3. - P.487-96.

218. Solvent mediated interactions in ¡the structure of the nucleosome core; particle at 1.9 a resolution / CA Davey et al;. 7/ J Mol Biol. 2002. -vol.319, №5. - P. 1097-113.

219. Solvent-induced micelle formation in a hydrophobic interaction model / S Moelbert et al. // Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. -2004. Vol.69, (6 Pt 1). - P.061924.

220. Sorensen T. Phosphoryl transfer and; calcium; lorn occlusion1 in the calcium; pump ? / T. Sorensen; J. V.". Moller, P. Nissen // Science: -2004. vol. 304, №5677.-P. 1672- 1675.

221. Structural studies of the putative helix 8 in the human beta(2) adrenergic receptor: an NMR study / M.Katragadda, MW Maciejewski, PL.Yeagle // Biochim Biophys Acta. 2004. - vol. 1663, №(1-2). — P.74-81.

222. S tructures and ; mechanisms of Nudix hydrolases / AS .Mildvan $ et al. II Arch Biochem Biophys. 2005. - Vol.433, №1. - P. 129-43.

223. Tanford C. The hydrophobic effect / Tanford C. 1980.- 2nd ed, N.Y., -233 p.

224. Temperature dependence of positronium reactivities with charge transfer molecules in bilayer membranes / Y.C.Jean et al. // J.Chem.Phys. 1984. - Vol.80, №4! - P.1671-1676.

225. The critical! role of leukotriene B4 in antigen-induced mechanical hyperalgesia in immunised rats / JM Cunha et al. // Br J Pharmacol. 2003.-Vol.139, №6. - P.l 135-45.

226. The structure of the first coordination shell in liquid water / Ph. Wernet et al. // Science. 2004. - vol. 304, №5673. -P. 995-999.

227. Toyoshima C. Crystal structure of the calcium pump with o bound ATP analogue / C.Toyoshima, T.Mizutani // Natura. 2004. -Vol.403, №6999. - P.529-35.

228. Vaskvsky V.E., Kostetsky E.Y. Modified spray for the detection pospholipids on thin-layer chromatograms/ V.E. Vaskvsky, E.Y.Kostetsky // J. Lipid. 1969. - vol. 9. - p.396-398.

229. Water-assissted highly efficient; synthesis of Impurity-free singlewalled carbon nanotubes / K. Hata et al. // Science. — 2004. — vol;, 306, №5700. P. 1362-1364

230. York J. D., Hunter T. Unexpected mediators of protein posphorylation; / J. D. York, T. Hunter. // Science. 2004. - vol.306, №5704. - P. 2053-2055.

231. Yoshioki S. Application of the independent molecule model to the calculation of free energy and rigid-body motions of water heptamers and octamers / S.Yoshioki // J Mol Graph Model. 2004. - vol.23, №2. - P.l 11-27.

232. Zubavicus; Ya., Grunze M. New insights info the structure of water with ultrafast probes / Y. Zubavicus, M. Grunze // Science. 2004. -vol. 304, №5673. - P. 973-976.

233. Zwier T. S. The structure of protonated water clusters / T. S. Zwier // Science. 2004. - vol. 304, №5674: - P. 1119-1120.