Анализ полиморфизма неструктурных областей генома варианта ВИЧ-1, доминирующего в России

Лаповок, Илья Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ полиморфизма неструктурных областей генома варианта ВИЧ-1, доминирующего в России
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ полиморфизма неструктурных областей генома варианта ВИЧ-1, доминирующего в России"

На правах рукописи

№

□и^чои«---

Лаповок Илья Андреевич

АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА НЕСТРУКТУРНЫХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОМА ВАРИАНТА ВИЧ-1, ДОМИНИРУЮЩЕГО В РОССИИ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 зг;;:—]

Москва - 2009

003460223

Работа выполнена в лаборатории вирусов лейкозов ГУ НИИ вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Марина Ридовна Бобкова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Светлана Юрьевна Комбарова

доктор медицинских наук, профессор Станислав Николаевич Кузин

Ведущая организация:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита диссертации состоится '/6 2009 г. в iЗ часов 00 минут на заседании

Диссертационного совета Д 001.020.01 в ГУ НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН (адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан « и » января 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Елена Ивановна Бурцева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

С момента открытия в 1983 г. вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) он является предметом пристального изучения. В связи с ростом эпидемии ВИЧ-инфекции, в том числе и в России, вопрос о разработке эффективных средств борьбы с заболеванием становится все более острым. Главными препятствиями в этой борьбе служат выраженный токсический эффект существующих препаратов и явление лекарственной устойчивости вируса к ним. Для преодоления этих проблем постоянно проводится поиск новых лекарственных препаратов, воздействующих на различные этапы жизненного цикла вируса. В качестве объектов воздействия будущей антиретровирусной терапии рассматриваются, в частности, регуляторные и вспомогательные белки ВИЧ-1. Другим многообещающим подходом может стать генная терапия ВИЧ-инфекции, непосредственной мишенью которой являются нуклеотидные последовательности генома вируса, и среди них - нетранслируемые области генома, необходимые для осуществления его жизненного цикла.

Для разработки средств воздействия на белки и гены вируса необходимы детальные сведения об их структуре, которая у ВИЧ-1 отличается высокой степенью изменчивости. Анализ структуры генома полиморфных вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в разных регионах мира, проводится постоянно, результатом чего стало создание обширных баз данных нуклеотидных последовательностей основных, в первую очередь структурных, генов вируса.

Среди областей генома ВИЧ-1, полиморфизм которых пока изучен недостаточно, можно выделить регион длинных концевых повторов (LTR, long terminal repeat) провируса. Этот регион содержит большое количество сайтов связывания для специализированных клеточных и вирусных факторов транскрипции и необходим для инициации вирусной транскрипции, а также вовлечен в процесс обратной транскрипции и интеграции, являясь, таким образом, контрольным центром генетической экспрессии ВИЧ-1. Несмотря на высокую консервативность этой области, описано явление полиморфизма LTR среди различных вариантов и подтипов ВИЧ-1.

Решающую роль в процессе специфической упаковки геномной РНК в нарождающиеся вирусные частицы играет регион, предшествующий gag-стартовому кодону РНК вируса, в составе которого выделяют три шпилечные структуры - DIS, SD и у, играющие важнейшую роль в процессе созревания вирионов и упаковки РНК в геноме вновь формирующихся вирусных частиц. В составе вирусной РНК эти регионы, имеющие специфическую вторичную структуру, образуют домены, отвечающие за процесс инициации димеризации двух цепей РНК, образования квадруплексов, стабилизирующих димеры, и упаковки генома ВИЧ-1 непосредственно в вирионы. Показано, что полиморфизм этой области может оказывать влияние на скорость репродукции вируса и. в конечном счете, на прогрессию ВИЧ-инфекции.

Значительным влиянием на различные этапы жизненного цикла ВИЧ-1 обладает вспомогательный вирусный белок Vpr (viral protein R). Этот белок оказывает свое влияние на процессы обратной транскрипции, интеграции провируса, транскрипции вирусных генов, а также на жизненный цикл клетки и процесс апоптоза. В литературе имеется описание некоторых мутаций гена vpr, влияющих на многообразные активности белка Vpr.

Несмотря на существование полиморфизма области 5'-LTR, региона РНК, предшествующего gag-стартовому кодопу, и гена vpr ВИЧ-1, данные литературы свидетельствуют о том, что они достаточно консервативны в условиях естественного развития инфекции, а значит, могут быть использованы для создания новых средств антиретровирусной терапии.

Цель и задачи исследования. Определение степени изменчивости региона 5'-LTR, области, предшествующей gag-стартовому кодону, а также гена vpr для варианта IDU-A подтипа А ВИЧ-1, доминирующего в России, и научное обоснование возможности использования этих областей генома в качестве мишеней для молекулярного мониторинга эпидемии ВИЧ-инфекции и для разработки новых методов лечения ВИЧ-инфекции.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Проанализировать нуклеотидные последовательности ДНК области 5'-LTR, нетранслируемой области перед gag-стартовым кодоном и области гена vpr в образцах варианта IDU-A подтипа А ВИЧ-1, выделенных в разных регионах России в период с 1996 по 2004 годы.

2. Провести филогенетический анализ и определить степень генетической изменчивости исследуемых областей варианта IDU-A подтипа А ВИЧ-1 в динамике эпидемии ВИЧ-инфекции в различных регионах России.

3. Оценить потенциальное влияние выявленных мутаций на эффективность репродукции вируса и прогрессию ВИЧ-инфекции.

4. Разработать алгоритм дифференциальной диагностики ранней и текущей ВИЧ-инфекции на основе серологических методов.

5. Провести сравнение исследуемых областей ВИЧ-1 в группах пациентов, находящихся на ранней и последующих стадиях ВИЧ-инфекции.

Научная новизна и практическая значимость работы. Продемонстрирован низкий уровень изменчивости области 5'-LTR, области шпилек DIS, SD и у и гена vpr варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего на территории России. Анализированные нуклеотидные последовательности ВИЧ-1 депонированы в GenBank под номерами: EU938080-EU938124 для области 5'-LTR (45 образцов), FJ437007 - FJ437028 и F.1503049-FJ503059 - для области шпилек DIS, SD и V (33 образца), FJ490707 -- FJ490751 - для гена vpr (45 образцов).

Показано, что в структуре 5'-LTR провирусной ДНК имеются участки, специфические для российского варианта ВИЧ-1 подтипа А. Данные результаты свидетельствуют о том, что область LTR варианта подтипа А ВИЧ-1, доминирующего в России, является характерной для данного подтипа, и анализ этого региона может быть использован для генотипирования наряду с анализом структурных генов gag и cnv. В частности, показано, что для всех образцов варианта IDU-A ВИЧ-1, выделенных от не употреблявших аитирегровирусную терапию людей, характерно наличие вставки в области так называемых «наиболее часто встречающихся длинных полиморфизмов» (MFNLP) в положении -118 внутри региона NF-kB-сайтов LTR, достаточно часто встречающейся среди штаммов ВИЧ-1 подтипов А, С, D, F, H и J по сравнению с подтипом В. В большинстве (43 из 45) исследованных образцов вставка размером в 12 нуклеотидов имела дополнительный сайт RBE III, связывающий фактор RBF-2, что потенциально способно оказывать отрицательный эффект на репликацию вируса в клетках.

В составе концевой петли шпильки DIS абсолютного большинства всех российских образцов (91%) обнаружен палиндром AG[GUGCAC]A, характерный для подтипа А ВИЧ-1. Единичные замены в составе концевой петли, обнаруженные у трех образцов, по всей вероятности, не оказывают значительного влияния на процесс димеризации и упаковки вирусной РНК. Также у двух из 33-х образцов выявлены мутации в 5-м положении шпильки SD, что потенциально может быть связано с ускоренным прогрессированием инфекции. Высокий уровень полиморфизма характерен для промежутка между шпильками SD и однако различия в этой области не способны оказать серьезного влияния на вторичную структуру шпилек.

Низкий уровень изменчивости области гена vpr вариантов ВИЧ-1 IDU-A делает его привлекательной целью для антиретровирусной терапии. В структуре гена vpr изученных образцов не было обнаружено мутаций, связь которых с изменением активностей белка Vpr доказана, при этом были отмечены некоторые характерные для российского варианта ВИЧ-1 подтипа А особенности, которые могут служить дополнительным инструментом в изучении молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции на территории России и потенциально способны влиять на функции белка. Так, обнаружена значительная вариабельность в 89-м аминокислотном положении Vpr. Также была выявлена вариабельность в 73-м и 80-м положении, а в одном образце обнаружена замена 16IV. Мутации в последних трех положениях могут оказывать влияние на проапоптозную активность Vpr, ослабляя ее и тем самым, замедляя патогенез инфекции. Кроме того, в ряде образцов имелись замены в положениях 25 и 63, критических для способности белка проникать в ядро клетки и накапливаться там; в трех образцах обнаружены делеции.

В целом, результаты работы могут служить научным обоснованием для использования областей 5'-LTR, 5'-UTR и гена vpr в качестве мишеней при разработке новых методов лечения ВИЧ-инфекции, включая генную терапию, и новых средств мониторинга ВИЧ-1 с дальнейшим внедрением их в клиническую и эпидемиологическую практику.

Положения, выносимые на защиту.

1. Анализ нуклеотидных последовательностей региона 5'-LTR, области, предшествующей gag-стартовому кодону, и гена vpr доминирующего в России варианта IDU-A ВИЧ-1 подтверждает его принадлежность к подтипу А вируса.

2. Строение и количество сайтов связывания NF-kB и Spl, а также структура ТАТАА-бокса в составе 5-LTR IDU-A являются типичными для всех вариантов подтипа А ВИЧ-1.

3. Характерной особенностью варианта IDU-A ВИЧ-1 является наличие области MFNLP размером 12 нуклеотидов, содержащей дополнительный сайт связывания для фактора RBF-2, в составе U3 региона LTR.

4. Вторичная структура участков, наиболее важных для репликации вируса, в составе региона, предшествующего gag-стартовому кодону вирусной РНК, характерна для подтипа А.

5. Мутации, ассоциированные, по данным литературы, с изменениями активностей белка Vpr, в составе варианта IDU-A ВИЧ-1 отсутствуют.

6. Разработан иммуноферментный метод дифференциальной диагностики ранней и текущей ВИЧ-инфекции.

7. Отсутствие ассоциации между сроком инфекции и структурой исследованных областей генома ВИЧ-1 позволяет рекомендовать их для молекулярного мониторинга эпидемии ВИЧ-инфекции.

Апробация работы. Апробация работы состоялась 30 октября 2008 на совместном заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ, Отделов молекулярной вирусологии и общей вирусологии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Результаты исследований представлены на постерных сессиях 4-ой Международной конференции по патогенезу, лечению и предупреждению ВИЧ (Сидней, 2007 г.), 18-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Барселона, 2008 г.), 2-ой Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии (Москва, 2008 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков, 4 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы из 206 ссылок.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Объект ii методы исследования

Всего в работе исследовано 66 образцов мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и сывороток крови ВИЧ-инфицированных лиц, полученных в период с 1996 по 2004 гг. из разных городов России. По данным последующего исследования 29 из них были идентифицированы как образцы пациентов, находящихся на стадии ранней инфекции. На момент забора крови обследуемым лицам никогда не назначались антиретровирусные препараты. Все они находились на стадии III («субклинической») ВИЧ-инфекции по российской классификации ВИЧ-инфекции, их возраст варьировал от 16 до 44 лет. Весь полученный клинический материал использовался с информированного согласия пациентов. Образцы вирусного материала (РНК плазмы или провирусная ДНК) были предварительно генотипированы по областям структурных генов gag и env как варианты IDU-A ВИЧ-1.

Нуклеотидные последовательности области 5'-LTR (позиция с -348 по +168) (координаты здесь и далее даны для варианта ВИЧ-1 НХВ2, регистрационный номер GenBank К03455), нетранслируемой области перед gag-стартовым кодовом (координаты с +186 по +368) и области гена vpr (с +5105 по +5396) анализировали методами гнездового ПЦР с последующим прямым автоматическим секвенированием. Работу по определению нуклеотндных последовательностей проводили совместно с А.Г. Прилиповым и Г.К. Садыковой на базе лаборатории молекулярной генетики ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями соответствующих областей генома вариантов ВИЧ-1 группы М из базы данных GenBank с помощью программы BioEdit 7.0.5.3. Филогенетический анализ нуклеотндных последовательностей проводили с помощью метода «ближайших соседей» с использованием программы Mega 3.1. Для получения данных о вторичной структуре (с минимальной свободной энергией) вирусной РНК исследуемых образцов использовали программу GeneQuest v. 7.1.0.

Для сравнительного изучения методов дифференциальной диагностики ранней и текущей ВИЧ-инфекции использовали дополнительную панель сывороток 82 пациентов. Эта панель состояла из сывороток крови 36 лиц, находящихся на стадии ранней ВИЧ-инфекции (неполный иммуноблот с подтвержденным впоследствии диагнозом «ВИЧ-инфекция») и 46 лиц, находящихся на стадии текущей инфекции (срок диагноза более двух лет). Образцы от пациентов на стадии ранней инфекции были получены из Института скорой помощи им. Н.В.Склифосовского, 30 образцов ог пациентов на стадии текущей инфекции были получены из Московского городского центра профилактики и борьбы со СПИДом Департамента здравоохранения города Москвы, еще 16 - из Медицинского информационно-аналитического центра РАМН.

2. Разработка метода дифференциальной диагностики ранней и текущей ВИЧ-инфекции

Для решения задач, поставленных настоящей работой, в частности, для определения возможной зависимости структуры исследуемых областей генома ВИЧ-1 от длительности инфицирования пациента, был разработан метод дифференциальной диагностики стадий ВИЧ-инфекции. При этом были исследованы три варианта ИФА и один вариант изотип-специфического иммуноблота, направленные на выявление различий в аффинности и авидности антител к антигенам вируса на стадиях ранней и текущей ВИЧ-инфекции.

25,00

Рисунок 1. Результаты чувствительного/низкочувствительного ИФА; по оси ординат приведены значения К<,п (отношения ОП образцов без разведения к ОП разведенных образцов) для «ранних» образцов (слева) и «текущих» (справа) образцов сывороток.

Первый вариант, так называемый чувствительный/низкочувствительный ИФА, заключался в том, что образцы сывороток крови ВИЧ-инфицированных пациентов последовательно разводили ВИЧ-отрицагельной донорской сывороткой до разведений 1:41:500 и анализировали в тест-системе КомбиБест-анти-ВИЧ-1,2 (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Параллельно с разведенными образцами исследовали образцы без разведения. Таким образом, было проанализировано 17 «ранних» образцов и 16 «текущих» образцов в разведениях 1:4, 1:50 и 1:500. «Текущие» образцы, содержащие антитела в высоких концентрациях, практически не реагировали на указанные разведения изменением оптической плотности (ОП). При этом ОП низкотитражных «ранних» образцов снижалась при разведении 1:50 в среднем в 9,9 раза, что позволяло уже в этих условиях дискриминировать «ранние» н «текущие» образцы. Разведение 1:500 повышало показатель отношения ОП образцов без разведения к ОП разведенных образцов (Кол) до среднего значения 23,1 (р < 0,00001) (рис. 1).

Во второй модификации ИФА - с использованием хаотропного агента все образцы сывороток предварительно разводили 1:4 8М раствором мочевины (Bio-Rad) и проводили анализ в тест-системах: КомбиБест-анти-ВИЧ-1,2, ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ («Диагностические системы» г. Нижний Новгород), ЭКОлаб-Вироностика 1.2+0 («ЭКОлаб» г. Электрогорск) и Рекомбинант-ВИЧ 1,2 ДСМ (ЗАО «МБС» г. Новосибирск).

8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00

Рисунок 2. Результаты ИФА с использованием 8М мочевины; по оси ординат приведены отношения Коп в ИФА с использованием тест-системы КомбиБест-анти-ВИЧ-1,2 при разведении «ранних» и «текущих» сывороток 8М раствором мочевины в отношении 1:4. Круглыми маркерами обозначаются «ранние» образцы, квадратными - «текущие».

В ИФА с использованием хаотропного агента было проанализировано 17 «ранних» и 30 «текущих» образцов, при этом предполагалось, что после обработки способность связываться с антигеном сохраняют только антитела с высокой авидностью у пациентов с текущей инфекцией. При использовании тест-системы КомбиБест-анти-ВИЧ-1,2 среднее Коп «теку щих» образцов было более чем в 4,5 раза ниже такого же отношения для «ранних» образцов (0,95 против 4,35, соответственно) (р < 0,00001) (рис. 2). Эти же сыворотки, исследованные с применением тест-системы ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ, не обнаружили таких четких различий между «ранними» и «текущими» образцами, которые были обнаружены при использовании первой тест-системы. Среднее К,„ «текущих» образцов было в 2,93 раза ниже такого же отношения для «ранних» образцов (1,37 против 4,00, соответственно), при этом интервалы значений Коп составили 0,92-7,09 и 0,93-5,75, соответственно. При использовании тест-систем Рекомбинант-ВИЧ 1,2 ДСМ и ЭКОлаб-Вироностика 1.2+0 результаты оказались неудовлетворительными: разброс значений Кш при использовании обеих тест-сисгем оказался еще больше (0,12-3,00 для «ранних» и 0,96-1,43 для «текущих»).

Третьей модификацией был адаптированный нами лабораторный вариант метода ИФА, описанный Barin с соавт. в 2005 году. В нем в качестве антигена использовали синтетический пептид, аналогичный эпитопу gp41 для всех подтипов ВИЧ-1. В опытах с этим вариантом ИФА использовали две панели «ранних» и «текущих» сывороток, по 35 и 33 образца, соответственно. Интервал значений ОП для «ранних» образцов составил от 0,069 до 0,311, для «текущих» образцов - от 0,242 до 3,056 (рис. 3). Средний уровень ОП для «текущих» образцов оказался более чем в 17 раз выше, чем для «ранних» образцов (2,42 против 0,14, соответственно) (р < 0,00001) (рис. 3).

О О о о ОООо°°

000000°00000000000°|

Рисунок 3. Результаты ИФА с использованием иммунодоминантного эпитопа £р41; по оси ординат приведены значения оптической плотности в ИФА с пептидом ИДЭ-§р41 «ранних» и «текущих» образцов. Круглыми маркерами обозначены «ранние» образцы, квадратными -«текущие».

В изотип-специфическом иммуноблоте использовали моноюганальный конъюгат иммуноглобулинов мыши к подклассу ^03 человека с пероксидазой хрена (ЗоиШетВЫесИ, 9210-05) для выявления антител к р24-антигену, которые, как известно из литературы, циркулируют в крови лишь в интервале 1-4 месяцев после инфекции, а наивысшей концентрации достигают в период с 5В по 86 день после инфекции. Нитроцеллюлозные стрипы с антигенами ВИЧ-1 получали элекгрофоретическим разделением белков вирусного материала культуры клеток МТ-4, инфицированной ВИЧ-1, с последующим элекгропереносом.

Методом изотип-специфического иммуноблота исследовали 20 «ранних» образцов и 6 «текущих» образцов. Из 20 «ранних» образцов два показали наличие 1$03 к р24, один образец -к р24 и р51 и один - к р51, остальные 16 «ранних» и все «текущие» образцы продемонстрировали отрицательный результат.

На основании полученных данных для решения задач настоящей работы был выбран вариант ИФА с синтетическим пептидом, аналогичным эпитопу gp41.

3. Филогенетический анализ области S'-LTR

В ходе исследования области 5'-LTR были проанализированы последовательности 45 образцов, среди которых 22 образца были получены на стадии ранней инфекции.

Нуклеотидные последовательности области 5'-LTR с -348-го по +181-Й иуклеотид всех проанализированных образцов ВИЧ-1, собранных на территории России, в 99-ти построениях из 100 кластеризовались на одной ветви филогенетического дерева, построенного методом «ближайших соседей» (рис. 4). С ними совместно образовывал подветвь и изолят 98UA0116, выделенный на территории Украины. Данный изолят очень близок к образцам, выделенным на территории России, и ранее уже использовался в сравнительном анализе российских образцов ВИЧ-1 подтипа А по области генома, кодирующей протеазу. Эти данные подтверждают опубликованные ранее результаты изучения структурных генов ВИЧ-1 (env, gag, pot), свидетельствующие о доминировании генетического варианта IDU-A ВИЧ-1 на всей территории России и граничащих с ней стран СНГ.

Среди всех изученных последовательностей LTR не было обнаружено общих черт, позволяющих объединить их в одну группу по территориальному признаку или длительности инфицирования пациента, от которого был получен биологический материал.

4. Анализ U3-, R- и 115-регионов 5'-LTR Результаты анализа структуры сайтов связывания для факторов транскрипции отражены в таблице 1. В ней приведен перечень исследованных сайтов, их положения в структуре LTR, наиболее распространенный состав и доля образцов, имеющая такой состав.

Во всех исследованных образцах не было обнаружено изменений в структуре ТАТАА-бокса, узнаваемого главным транскрипционным фактором TFIID, что подтверждает тезис о высокой консервативности этого участка. Однако у одного образца из Перми отмечалась замена А на Т в положении -29. Учитывая мнение ряда специалистов о том, что, помимо самого ТАТАА-бокса, функционально значимыми являются два предшествующих нуклеотида, можно предполагать, что данная замена способна влиять на вирусную транскрипцию.

—iqzb Roetov-na-Doml

— BZOKaraoandi

— 246 Rostov-on-Don

— 245 Rostov-on-Don

-|32 Karaganda —123 Karaaaodi

-вгм

— 338 Tver

— 993 Barnaul

— 996 Barnaul -872 Yekaterinburg

— 881 Yekaterinburg -1147 Perm -1139 Perm -1141 Perm

— 365 Moscow

— ШШ Ufaanovarall -B77Mcmcom4 -259 Tver -PHJTveJ -И1Реп4

— |g7<"Barnrnj

— 1109 Krasnoyarsk

— |12Э Krasnoyarsk

— KQSUnsDoyaol

— 1122 Krasnoyarsk -98UA0116A

~P7Tve|

-иишш

—191 Saratov -190 Saratov

— 207 Moscow

— 546 Irkutsk

- 553 Irkutsk

- 532 Irkutsk

- 550 Irkutsk

- 997 Altay -1172 Perm

-|U77T6mSl -1151 Peni

- iresPwH

- П" KrasnoyarMI

-вши

-92RW60A

-93tn68a

-93th253e

-95th83e

-97ke46c

-94et78c

- 97r0201f

- 97m236d -89zr56d -97ru51b -HXB2B -97th90b

Рисунок 4. Результат филогенетического анализа области 5'-LTR с -348-го по +181-Й нуклеотид варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего в России, методом «ближайших соседей» с последовательностями, полученными из GenBank. Исследуемые образцы выделены цветом (образцы ранней инфекции - желтым, образцы текущей - красным). Анализ проведен в программе MEGA 3.1.

Таблица 1

Результат анализа иуклеотидных последовательностей сайтов связывания фактором транскрипции на поверхности LTR среди российских образцов ВИЧ-1 подтипа Л

Сайты связывания Координаты Наиболее распространенная Доля

в регионах 5'-LTR сайтов в 5'-LTR структура от 5' к 3' концу LTR образцов (%)

U3 регнон 5'-LTR

ТАТАА-бокс с -24 до -28 ТАТАА 97,78

(САТАТАА-бокс) (с -30 до -28) (САТАТАА)

Spl (I) с-47 до -56 GGGGAGTGGC 86,67

Spl (II) с-58 до -67 TGGGCGGAGT 53,33

Spl (III) с-69 до-78 GAGGTGTGGT 84,44

NF-kB (I) с-82 до-91 GGGACTTTCC 95,56

NF-kB (II) с-96 до-105 GGGACTTTCC 86,67

MFNLP -118 GACTGCTGACAT 93,33

RBE III с-131 до -124 ACTGCTGA 100,00

TCF-la с-125 до-140 TTCTACAAAGACTGCT 88,89

Ядро NRE с-163 до-174 CTAACACACAGA 80,00

Е-бокс с-163 до-168 CACAGA 91,11

NF-AT III с-204 до-215 GAAAAAGAAGTG 80,00

NF-AT II с-255 до -273 AGAGGGAGAGAACAACAGC 48,89

NF-AT I с -274 до -290 AAGTAGAAGAGGCCAC 75,56

R регион 5'-LTR

TAR с +1 до +57 GGTCTCT[C/T]TGGTTAGACC AGAT[GT]GAGCCTGGGAGC TCTCTGG[C/T]TAGCTAGGG ААСС 73,33

AP-1 (I) с +86 до +94 TTGAGTGCT 84,44

U5 регнон 5'-LTR

AUG-связывающий с+105 до+115 TGTGCCCGTCT 86,66

АРЗ-подобный с+164 до +177 GTAAAAATCTCTA 84,44

AP-1 (II) с+117 до +125 TTGTATGAC 75,56

AP-1 (III) с+154 до +162 TCTAGGCGG 82,22

Примечание. В колонке «Доля образцов, %» представлена доля исследованных образцов, содержащая данную структуру сайта.

Из трех исследованных Sp-1 сайтов наиболее консервативным оказался сайт Sp-1 (I). Общая для А-подтипа структура 5'-GGGGAGTGGC-3' была незначительно изменена у шести из 45-ти образцов. Для 46,67% исследованных образцов были обнаружены единичные замены в структуре Sp-1 (II) сайта 5'-TGGGCGGAGT-3'. Сайт Sp-1 (III), имеющий для 37-ми из 45-ти образцов структуру 5'-GAGGTGTGGT-3', не проявлял такого высокого уровня изменчивости, как Sp-1 (II) сайт.

В составе всех исследованных образцов было выявлено присутствие двух сайтов связывания фактора NF-kB (5'-GGGACTTTCC-3'). Оба сайта NF-kB продемонстрировали высокую консервативность в составе варианта IDU-A ВИЧ-1. Лишь у одного образца была

обнаружена делеция ТСС-последователыюстн на 3'-конце сайта связывания NF-kB (I). Кроме того, у семи образцов были обнаружены единичные замены в 3'- или 5'- концах этих сайтов.

Среди сайтов связывания фактора NF-AT наиболее вариабельными оказались I и II сайты, по сравнению с сайтом NF-AT III, в структуре которого были обнаружены единичные замены лишь у 9-ти образцов.

Для области ядра негативного регуляторного элемента (NRE) в 80% (36/45) исследованных образцов была выявлена структура 5'-CTAACACACAGA-3', типичная для ВИЧ-1 подтипа А (5'-CTAA[A/C]ACACAGA-3'). Структура E-бокса, являющегося мишенью для фактора USF, в 41-ном из 45-ти исследуемых образцов имела вид 5'-CACAGA-3', также характерный для подтипа А.

Сайт связывания специфического для Т-клеток фактора (TCF-la) также проявлял консервативность. Среди исследованных нами образцов 40 имели в этой области последовательность 5 '-ТТСТАСAAAGACTGCT-3'.

Наиболее характерной особенностью всех исследованных образцов можно назвать вставку в области длинных полиморфизмов MFNLP в положении -118 внутри региона NF-kB-сайтов LTR, достаточно часто встречающихся среди штаммов ВИЧ-1 подтипов А, С, D, F, Н и J по сравнению с подтипом В. В 43-х из 45-ти исследуемых образцов вставка размером в 12 нуклеотидов имела дополнительный сайт RBE III (5'-ACTGCTGA-3'), связывающий фактор RBF-2, что потенциально способно оказывать отрицательный эффект на репликацию вируса в клетках, экспрессирующих RBF-2. Еще один образец, имеющий вставку размером в 10 нуклеотидов и делению 12-ти нуклеотидов ниже области MFNLP, тем не менее, сохранял дополнительный сайт связывания для RBF-2.

При исследовании вторичной структуры РНК области шпильки TAR было обнаружено, что у всех образцов IDU-A подтипа А, равно как и образцов подтипа А и Е, выделенных в других странах, имеется делеция нуклеотида Т в положении +24 (нуклеотида U вирусной РНК соответственно), образующая двухнуклеотидную выпуклость в ножке шпильки, известную как U25A (рис. 5, Б). Известно, что при заменах в регионе от +22 до +24 нуклеотида активность LTR снижается до 6% от обычной, однако для делеции в положении +24 такого явления не описано.

В одном из проанализированных образцов была обнаружена замена С на G в положении +36, меняющая вторичную структуру концевой петли (рис. 5, В). Еще у одного образца, полученного в 1997 году, была полностью деформирована структура шпильки (рис. 5, Г). Характерно, что ни у одного из образцов, собранных после 1997 года, не было обнаружено деформаций вторичной структуры шпильки, подобным тем, что были обнаружены у первых

двух описанных образцов. Это позволяет сделать предположение, что данные мутанты не получили распространения из-за своей низкой репликативной способности.

Кроме того, нами были обнаружены два образца из Москвы (рис. 6, Б), содержащие замену G на А в +33-М положении. Мы считаем, что эта замена способна отрицательно влиять на способность белка Tat связываться со шпилькой TAR. Так, описано снижение активности LTR до 2% от обычной при заменах в положениях от +29 до +34.

Вторичная структура шпильки TAR имеет значение для вирусной транскрипции, поэтому структура TAR особенно консервативна, а отдельные мутации обычно обнаруживают в ножке шпильки. Так, в 5-ти образцах, собранных в период с 1998 до 2004 года, нами были обнаружены умеренные дефекты стебля шпильки из-за специфических замен (рис. 6, В-Е). И хотя эти деформации не затрагивают концевой петли, такие особенности способны повлиять на репродукцию вируса. Так, для вариантов TAR с заменой в регионе от +7 до +18 нуклеотвда в структуре стебля шпильки описано явление снижения активности LTR до уровня 39% от обычной. Из пяти вышеназванных образцов лишь 4 (8,9%) - содержали деформации в промежутке от +7 до +18 нуклеотида.

G и'М

Рисунок 5. Вторичная структура области шпильки ТАК РНК ВИЧ-1: А - изолят НХВ2 ВИЧ-1 подтипа В, Б - типичный образец подтипа А ВИЧ-1, доминирующего на территории России, В - образец 96К1Л90 ВИЧ-1, Саратов, Г - образец 97RU246 ВИЧ-1, Ростов-на-Дону.

x'y" xV

/1 .n

1 A ' i'. A

Jf ^ Y*

в ife г // ""

л-v

r<V

I J-/

.рг rr:

! I «А Л

•И «-Л '-3 Я

iff Vi?

¿г*

►57 .A J"

Рисунок 6. Вторичная структура области шпильки TAR РНК ВИЧ-1: А - изолят НХВ2 ВИЧ-1 подтипа В, Б - образец 97RU207 ВИЧ-1, Москва, В - образец 02RU823 ВИЧ-1, Караганда, Г - образец 98RU337, Тверь, Д - образец 04RU1141, Пермь, Е - образец 98RU340, Тверь. Анализ проведен с помощью программы GeneQuest v.7.1.0. Области нуклеотидных замен, приводящих к значительным изменениям вторичной структуры шпильки, выделены кружками. Замена в положении +33 выделена красным. U25A - двухнуклеотидная выпуклость РНК, образованная в результате делеции уридипового остатка в положении +24.

Для нескольких образцов (для одного в положении +8, для трех - в положении +23 и для двух - в положении + 44) были обнаружены отдельные мутации, приводящие к заменам С на U в структуре ножки шпильки TAR вирусной РНК, что, однако не приводит к изменению вторичной структуры шпильки из-за возможности существования некомплементарных взаимодействий между нуклеотпдами U и G.

Сайт АР-1 (I) (5'-TTGAGTGCT-3') не имел изменений в 38-ми из 45-ти образцов. Среди остальных образцов были обнаружены в основном единичные замены.

Из всех сайтов связывания факторов в U5 регионе наименее изменчивым оказался АР-3-подобный сайт, связывающий фактор NF-AT. Этот сайт для большинства образцов подтипа А ВИЧ-1, выделенных на территории России, имел структуру 5'-GTAAAAATCTCTA-3'. Лишь у 7-ми из 45-ти исследуемых образцов были обнаружены единичные замены, делеции или инсерции.

Типичная для подтипа А структура сайта АР-1 (II) 5'-TTGTGTGAC-3' была обнаружена только у 4-х исследованных образцов. Характерно, что 34 образца из 45-ти имели замену 5-го нуклеотида G на А, что, по-видимому, является особенностью российского варианта IDU-A ВИЧ-1.

Сайт АР-1 (III), описанный для подтипа В как 5'-TTTAGTCAG-3', у одного российского образца имел структуру 5 '-TÇTAGGCAG-3 аналогичную структуре сайта изолята, выделенного на территории Украины в 1998 году и родственного российскому варианту подтипа А. У 44-х из 45-ти исследованных образцов обнаруживалась замена А на G в 8-м положении, из них 7 образцов имели дополнительные одиночные замены.

Изучена структура AUG-связывающего сайта, в составе вирусной РНК отвечающего за образование двойной спирали с регионом AUG, в районе сайта инициации трансляции гена gag. U5-AUG дуплекс стабилизирует вирусную РНК и несет основную нагрузку при формировании конфигурация ВМН, необходимой для упаковки РНК в вирусные частицы. Структуру этого сайта, способную образовывать прочный дуплекс, имели 39 из 45-ти образцов, а 5 образцов содержали лишь одиночные замены, значительно не влияющие на функции всего сайта.

5. Анализ области вирусной РНК, предшествующей gag-стартовому кодону

При исследовании области РНК, предшествующей gag-стартовому кодону, были проанализированы последовательности 33-х образцов лизатов IDU-A, из которых 13 относились к ранней инфекции. Нами бьиа проанализирована вторичная структура шпилек DIS, SD и vj/ в составе полученных последовательностей (рис. 7). Каких-либо значительных особенностей в структуре этого региона обнаружено не было. Высоко консервативной оказалась структура концевой петли шпильки DIS: AG[GUGCAC]A. Такая структура

палиндрома характерна для 84% изолятов ВИЧ-1 подтипа А, выделенных в различных регионах мира, и обнаружена во всех исследованных нами образцах, кроме трех. Концевой петлей шпильки DIS одного образца служила последовательность AG[GUGCAC]G. Еще для двух образцов была характерна структура AA[GUGCAC]A. Также лишь у одного образца имелся лишний G нуклеотид между 4-м и 5-м положением стебля шпильки SD, а еще один образец имел замену А на G в 5-м положении. Эта замена может быть связана со скоростью перехода ВИЧ-инфекции из фазы длительной непрогрессии в фазу быстрой прогрессивной инфекции.

Лишь один образец имел мутацию в составе функционального участка MSD шпильки SD, а именно - замену U на G в 7-м положении. Для этого же образца была характерна мутация G на А второго нуклеотида в составе палиндрома шпильки у.

Если структура самих шпилек была достаточно консервативна, то для последовательностей между ними был характерный некоторый полиморфизм, при этом самым изменчивым оказался регион между SD и у шпильками. Однако в 97% случаев данные различия не затрагивают нуклеотидные остатки, граничащие со шпильками, и, следовательно, не оказывают серьезного влияния на вторичную структуру шпилек. Для всех образцов регион между у-шпилькой и AUG-областью состоял из двух (AG) нуклеотидов, а сама AUG-область -из одиннадцати (AGAUGGGUGCG) нуклеотидов, соответственно, что характерно для изолятов группы М. Отсутствие полиморфизма среди образцов варианта IDU-A ВИЧ-1 было характерно также для фрагментов с +280 по +285, с +317 по +321, с +328 по +332 и с +362 по +367 нуклеотиды, участвующих в образовании квадруплексов при димеризации вирусной РНК.

В результате анализа в структуре региона, предшествующего gag-стартовому кодону, не было выявлено никаких характерных особенностей, ассоциированных со сроком инфекции и географическим регионом обнаружения вируса.

g *

a ms с

и-о

die-a SD (А)

а-с а

S-A ° »G

и-А (c)u.A £g

с"°а u-a

q о <п>а-и c-g

_ -G (С) а а а

в-с" а-с g а

(л)с-О C-G Л1ТГ!

(a/gg) и-а(лп)в-с <-/лл| у-а а С а i; Q а С - Q а г, С G -cuaaaqai) u-gaqagaugggugcg Н

Рисунок 7. Вторичная структура области, предшествующей gag-стартовому кодону варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего в России. Зеленым цветом выделены функциональные области, красным цветом - нуклеотиды, подвергающиеся изменениям. В скобках указаны варианты изменений выделенных красным нуклеотидов. Структура построена на основе данных, полученных в программе GeneQuest v. 7.1.0.

6. Филогенетический анализ области гена vpr

На основании метода «ближайших соседей» в программе MEGA 3.1. был проведен анализ гена vpr (положения с +5105-го по +5396-Й нуклеотид) 45 образцов лизатов IDU-A, из которых 22 были ранними. Было построено филогенетическое дерево (рис. 8).

98UА0116 sub A Ukraine

1172 Perm 197 Saratov 176 Krasnodar 160 Rostov-on-Don 03RU20-06-13 sub M Russia

993 Novoaltaysk

RU00051 sub A Russia

OOCMNYU1162 sub A/G Cameroon

94TH702-1E

P03GH175G19G

VI991 sub H Belgium

VI850F

A8023804C

US4 sub B USA

RU98001 sub AB Russia

HXB2 sub B

Рисунок 8. Результат филогентического анализа области гена vpr варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего в России, методом «ближайших соседей» с последовательностями, полученными из GenBank. Исследуемые образцы выделены цветом (образцы ранней инфекции - желтым, образцы текущей - красным). Анализ проведен в программе MEGA 3.1.

В 99-ти построениях из 100 образцы варианта IDU-A кластеризовались на одной ветви с изолятами ВИЧ-1 подтипа А, выделенными ранее на территории России (03RU20-06-13 и RU00051), и с ранее описанным украинским изолятом 98UA0116.

Полученные данные подтверждают тезис о высокой консервативности гена vpr. Постоянство структуры белка Vpr является необходимым условием для выполнения белком множества функций и может служить обоснованием для использования его в качестве цели для антиретровирусной терапии. Как и в случае области 5'-LTR, не было обнаружено никаких особенностей в структуре гена vpr у образцов, выделенных в разных регионах России, в различные периоды времени и на разной стадии инфекции.

7. Анализ мутаций в структуре гена vpr Был проведен анализ всех изученных последовательностей гена vpr российского варианта IDU-A ВИЧ-1 на предмет наличия в них мутаций, влияющих на репликативные особенности вируса (табл. 2).

Таблица 2

Анализ мутаций в структуре белка Vpr варианта IDU-A ВИЧ-1

Искомая мутация Действие мутации Обнаруженная мутация Доля образцов с данной мутацией, %

W54R | ошибок при обратной транскрипции, [ 1ЛИ-направленной транскрипции, | проапоптозной активности Нет 100

Е25К | способность Ург перемещаться в ядро клетки Е250 95,6

I63K 163Т 86,7

Q65E Нет 100

L67S Нет 100

R80A | способность Ург «арестовывать» клетки в С2-стадии R80K 26,7

R73A R73K 17,8

Q3R Нет 100

L64P, L64A или L64R | проапоптозной активности Нет 100

161А 1 действие мутации 1.64Р 161У 2,2

Примечание. В таблице приведены мутации, выбранные на основе анализа литературы,

мутации, обнаруженные нами в исследуемых образцах, и доля исследованных образцов, содержащая данные мутации.

Первой мутацией, возможность наличия которой была изучена, была мутация кодона TGG, приводящая к замене триптофана в 54-м положении белка на аргинин (W54R). Данная мутация деформирует петлю, связывающую вторую и третью а-спирали белка и необходимую для взаимодействия Vpr с WXXF-мотивом в составе таких факторов, как UNG2, TFIIB и ANT. Таким образом, варианты ВИЧ-1, содержащие такую мутацию, не имеют эффективного механизма защиты от ошибок, возникающих в процессе обратной транскрипции, имеют более

низкий уровень LTR-направленной транскрипции и, вероятно, не способны индуцировать апоптоз клеток. В результате репликация этого варианта вируса либо снижается, либо задерживается. В ходе нашей работы этой мутации обнаружено не было.

Следующими исследованными нами мутациями были замены Е25К, I63K, Q65E и L67S, присутствие которой ингибирует способность Vpr перемещаться в ядро клетки. Таких мутаций в структуре Vpr обнаружено не было, однако у 43-х из 45-ти исследованных образцов (95,6%) обнаружена мутация E25D, связанная с заменой кодона GAA на GAT. Лишь у 2-х образцов в положении 25 обнаружен кодон аминокислоты Glu (Е). Кроме того, 39 из 45-ти образцов имели мутацию I63T, связанную с заменой кодона АТТ на ACT.

Не было также обнаружено мутации R80A, ипгибирующей способность Vpr «арестовывать» клетки в 02-стадии, в результате чего способность вируса индуцировать апоптоз падает в среднем на 50%. Таким же свойством обладают не обнаруженные нами мутации R73A и Q3R.

Однако в этих положениях все же имелись замены. Так, в 12 образцах была обнаружена мутация R80K, возникающая в результате замены кодона AGA на AAA. Восемь образцов содержали мутацию R73K (замена кодона AGA на AAA).

Такие мутации, как L64P, L64A или L64R, усиливают проапоптозную активность Vpr. Для российского варианта ВИЧ-1 подтипа А мутации в этих положениях отсутствовали, равно как и мутация I61A, ингибирующая действие L64P. Лишь один образец 02RU832 имел в 61-м положении замену изолейцина на валин (замена ATA на GTA).

Интересные данные были получены для СООН-концевого региона Vpr от 84-го до 96-го аминокислотного остатка. В литературе описана значительная вариабельность этого региона, подтвержденная в нашем исследовании. Одним из наиболее изменчивых положений в структуре белка было положение 89. Тринадцать образцов имели в этом положении G, в двух была обнаружена делеция в этом положении, а остальные 30 имели V в положении 89. Некоторые образцы имели сразу две делеции в СООН-концевом регионе белка. Так, один образец с делецией в 89-м положении белка имел также делецию и в 90-м положении, а еще два образца содержали делеции в положениях 85 и 86. Известно, что потеря 12-ти СООН-концевых остатков не влияет на третичную структуру Vpr, но лишает белок способности связываться и с одно-, и с двухнитевой ДНК, индуцируя в дальнейшем ее разрушение.

8. Обсувдснне полученных данных анализа неструктурных областей генома

Регион LTR является контрольным центром генетической экспрессии ВИЧ-1, вовлеченным также в процесс обратной транскрипции и интеграции. Для осуществления всех функций 5"-LTR должен быть достаточно консервативен. Даже незначительные нуклеотидные замены, делеции или иисерцин в структуре сайтов связывания могут повлиять на активность

LTR, а значит, и на репродукцию вируса. Так, с дефектами LTR часто связывают явление длительной непрогрессии; кроме того, было обнаружено, что вирусы, выделенные от длительных непрогрессоров, имеют делении в Spl- и RBE III- сайтах. С другой стороны, удвоение Spl-сайтов связывания у подтипа В увеличивало активность LTR и повышало уровень вирусной репликации.

Среди образцов, принадлежащих к российскому варианту IDU-A ВИЧ-1, нами было обнаружено три Spl-сайта, что характерно для всех подтипов ВИЧ-1. В своей работе мы получили данные о высокой консервативности последовательностей сайтов Spl (I) и Spl (III), при этом был обнаружен высокий уровень изменчивости структуры Spl (П)-сайта, однородная структура которого была присуща только 53,3% образцов. Наши результаты не противоречат данным литературы и позволяют сделать вывод о том, что функции промоторного региона 5'-LTR, связанные со структурой Spl-сайтов, у варианта IDU-A ВИЧ-1 не нарушены.

Сайт RBE III, связывающий фактор RBF-2 и располагающийся в интервале с -131 до -124 положения, считается вторым предполагаемым «виновником» длительной непрогрессии. В составе LTR варианта IDU-A он не проявил никакой вариабельности, оказавшись самым консервативным из всех сайтов связывания в структуре U3. Это может служить доказательством важности поддержания постоянной структуры RBE III в жизненном цикле ВИЧ-1.

Важно заметить, что RBEIII-сайт в положении -131 в составе варианта IDU-A ВИЧ-1 оказался не единственным. Основной значительной особенностью более чем 97% исследованных нами образцов IDU-A стало наличие дополнительного сайта RBEIII в составе области MFNLP (положение -118). Такое явление не уникально для российского варианта IDU-А, оно было также обнаружено и описано для вариантов ВИЧ-1 других не-В-подтипов.

Наличие дополнительного сайта RBE III потенциально способно ограничивать транскрипцию вируса в клетках, экспрессирующих RBF-2, в частности, в моноцитах и активированных Т-клетках. Это можно объяснить тем, что на определенных этапах инфекции возникает необходимость снизить темп репликации вируса. Например, небольшое сокращение темпов экспрессии белков ВИЧ-1 заметно влияет на выживаемость инфицированных клеток на этапе их дифференциации или активации. Кроме того, описан компенсаторный эффект дополнительною сайга RBE III в составе MFNLP для вирусов, содержащих повреждения сайтов NF-kB или RBE III в положении -131. Последнее явление характерно для вариантов ВИЧ-1, содержащих делеции в гене rief, так этот ген перекрывается с U3 регионом LTR как раз в области сайта RBF. III.

Следуе г сказать, что область MFNLP вообще является наиболее вариабельной областью в составе 5'-LTR. Размер ее для различных вариантов ВИЧ-1 в среднем составляет от 15 до 34

нуклеотидных остатков. Распространенность этих вставок достаточно велика для подтипов А, С, D, F, Н и J по сравнению с подтипом В, для которого эта вставка не была описана. Зачастую именно факт присутствия MFNLP в основном и определяет полиморфизм LTR, в связи с этим некоторые ученые при проведении филогенетического анализа LTR не учитывают этот регион. Однако, по нашему мнению, такой подход не совсем верен по двум причинам. Во-первых, в составе MFNLP, помимо сайта RBE III, обнаруживают и другие важные сайты связывания. А во-вторых, если этот регион и проявляет полиморфизм среди различных вариантов ВИЧ-1, то в пределах одного варианта он может быть вполне консервативен, являясь, таким образом, одной из характеристик данного варианта.

Подтверждение последнего тезиса мы обнаружили в своей работе. Абсолютно для всех российских образцов ВИЧ-1 IDU-A была характерна вставка MFNLP, причем 93,3% всех исследованных нами образцов имели одинаковую вставку в 12 нуклеотидных остатков. Такая вставка была также характерна для изолята 98UA0116, выделенного на территории Украины и имеющего близкое родство с вариантом IDU-A, выделенным на территории России.

Данные об этой характерной особенности 5'-LTR варианта ВИЧ-1 подтипа, доминирующего в России, нашли свое подтверждение в филогенетическом анализе указанного региона. Все российские образцы образовывали подветвь отдельно не только от вирусов другого подтипа, но даже от других (нероссийских) вариантов подтипа А. Это говорит о высоком уровне специфичности 5-LTR российского варианта IDU-A и создает предпосылки для эффективного использования анализа нуклеотидной последовательности этого региона при гелотипировании вируса. Вместе с российским вариантом одну подветвь образовывал и упоминаемый ранее украинский изолят 98UA0116, что подтверждает тезис о доминировании генетического варианта IDU-A ВИЧ-1 на всей территории России и граничащих с ней стран СНГ.

Анализируя другие сайты связывания факторов транскрипции в составе U3 5'-LTR, необходимо подчеркнуть консервативность сайтов NF-kB и ТАТАА-бокса. Их структура и количество были типичными для подтипа А ВИЧ-1. Лишь один образец имел делению трех нуклеотидов сайта NF-kB I, а еще семь - отдельные замены в структуре сайтов. Эти замены касаются только крайних - последнего или первого нуклеотидного остатков в этих сайтах и, вероятно, не оказывают влияния на транскрипцию ВИЧ-1, а значит, и на вирусную репликацию. Относительно ТАТАА-бокса (положения с -24 до -28), лишь в одном образце была обнаружена замена нуклеотида А на Т в положении -29. Учитывая то, что ряд авторов обозначают этот сайт как САТАТАА-бокс (положения с -24 до -30), данная замена может оказывать влияние на транскрипцию вируса.

Высокий консерватизм обычно характерен для тех областей генома, которые в составе РНК способны образовывать сложную вторичную структуру. Для 5'-LTR такой областью является область TAR в составе региона R. Транскрибирующаяся на ее матрице цепь РНК в промежутке между +1 и +57 нуклеотидным остатком формирует шпильку TAR, которая связывается с белком Tat (трансакгиватором транскрипции) и с позитивным фактором элонгации транскрипции b (P-TEFb), которые также связаны между собой. P-TEFb состоит из фактора CycTl и киназы CDK9, которая фосфорилирует С-конец РНК-полимеразы II, что значительно увеличивает ее процессивность и усиливает LTR-направленную транскрипцию примерно в 135 раз.

Нами было обнаружено, что у всех образцов IDU-A ВИЧ-1, равно как и образцов подтипа А и Е, выделенных в других странах, имеется делеция нуклеотида Т в положении +24 (нуклеотида U вирусной РНК соответственно), образующая двухнуклеотидную выпуклость в ножке шпильке, известную как U25A (см. рис. 17, А, Б). Область U25A очень важна, поскольку она является одним из сайтов связывания Tat, что облегчает дальнейшее взаимодействие CycTl и Tat с концевой петлей. Что же касается самой концевой петли, то она выполняет основную функцию по связи с CycTl и Tat. Остаток U в +30-М положении связывается с доменом TRM (от англ. TAR recognition motif - мотивом опознавания TAR), образованным 251-260-ми аминокислотными остатками CycTl. С другой стороны, с нуклеотидным остатком G в +33 положении соединяется мотив ARM белка Tat.

Нами обнаружены два образца из Москвы (выделенные в 1997 и 2000 годах), содержащие замену G на А в +33-м положении. По нашему мнению, эта замена способна отрицательно влиять на эффективность связи белка Tat со шпилькой TAR. В качестве дополнительной возможности Tat связывается своим центральным доменом (1-48 аминокислотные остатки) с CycTl, а также отдельно с выпуклостью на стебле шпильки TAR. Эти два факта позволяют сделать вывод, что даже при наличии такой замены вирусная РНК способна связывать Tat, но с меньшей эффективностью, что потенциально способно отразиться на скорости вирусной репликации.

В двух образцах вируса были обнаружены мутации, приводящие к значительным деформациям вторичной структуры шпильки TAR, что затрудняло или делало невозможным взаимодействие TAR с P-TEFb и Tat. Подобные мутации не обнаружены нами среди образцов, выделенных на территории России в других регионах и в более позднее время. Исходя из этого, можно предположить, что данные мутантные варианты не получили широкого распространения из-за низкого уровня репликации. Это может служить дополнительным доказательством важности шпильки 1 AR для нормальной репродукции вируса.

Таким образом, мы можем заключить, что российский вариант IDU-A относится к вариантам ВИЧ-1, не содержащим значительных дефектов шпильки TAR (структура не содержала изменений в 80% образцов) и потенциально способным осуществлять транскрипцию на высоком уровне.

Результаты анализа региона U5 свидетельствуют, с одной стороны, о консервативности сайтов связывания факторов транскрипции в регионе U5, а с другой стороны - о существовании характерных особенностей структуры U5 LTR варианта IDU-A ВИЧ-1.

Одной из проблем, которая возникает перед исследователями, является проблема генотипирования, решение которой позволяет получить точную и достоверную информацию о развитии эпидемии в регионе и способствовать разработке адекватных средств профилактики и терапии. Область генома, удовлетворяющая требованиям к генетическим маркерам, должна проявлять отчетливый полиморфизм среди различных подтипов, с одной стороны, и консервативность в ходе патогенеза инфекции, с другой стороны. По нашим данным, область 5'-LTR полностью соответствует первому критерию.

Для проверки соответствия второму критерию и обоснования использования региона 5'-LTR в работах по эпидемиологическому мониторингу ВИЧ-инфекции нами был разработан метод дифференциальной диагностики ранней (период с момента инфицирования до -180 дней инфекции) и текущей ВИЧ-инфекции. При этом мы опирались на предположения о постепенном формировании гуморального иммунного ответа к вирусу, когда со временем растет титр и авидность антител. По результатам сравнительного анализа для скрининга нами был выбран метод ИФА с использованием синтетического пептида, аналогичного эпитопу gp41, антитела к которому появляются одними из последних. С помощью этого метода были отобраны образцы от пациентов, находящихся на ранней и текущей стадиях инфекции.

В ходе филогенетического и структурного анализа образцов, выделенных в различных регионах России от пациентов, находящихся на разных этапах инфекции, нами не было выявлено никаких особенностей структуры в зависимости от этого параметра. Среди всех изученных последовательностей 5'-LTR не было обнаружено общих черт, позволяющих объединить их в одну группу по территориальному признаку или длительности инфицирования пациента, от которого был получен биологический материал.

Таким образом, нами были подтверждены тезисы об отсутствии изменчивости 5'-LTR со временем инфекции и о существовании характерных особенностей этого региона среди различных вариантов ВИЧ-1, что позволяет нам рекомендовать анализ 5'-LTR для генотипирования ВИЧ-1.

Область шпилек DIS, SD и у имеет большое значение для процессов сплайсинга, димеризации и упаковки вирусной РНК, поэтому первичная и вторичная структура области,

предшествующей gag-стартовому кодону, может выступать в роли объекта для исследований молекулярной эпидемиологии ВИЧ-1. Нами было установлено, что для 30-ти из 33-х образцов структура концевой петли шпильки DIS имела вид AG[GUGCAC]A, что типично для ВИЧ-1 подтипа А. Это позволяет сделать заключение о высокой консервативности структуры шпильки DIS российского варианта IDU-A.

Лишь для трех образцов это правило нарушалось, но касалось только фланкирующих нуклеотидов - одиночная замена последнего А-нуклеотида на G или второго G-нуклеотида на А. Данные литературы говорят о способности шпильки DIS образовывать комплекс «целующихся петель» даже при множественных заменах одного пурина на другой пурин в позициях, окружающих палиндром. Поэтому мы считаем, что данная замена не оказывает влияния на процесс димеризации цепей РНК.

Также лишь у двух образцов в 5-м положении шпильки SD были найдены одиночная замена и инсерция, соответственно. Эти изменения не затрагивают функционально важный сайт MSD, т.е. непосредственно не влияют на процесс посттранскрипционных модификаций вирусной РНК. Однако доказана связь мутации A—»G в 5-м положении шпильки SD с процессом перехода ВИЧ-инфекции из фазы длительной непрогрессии в фазу быстрой прогрессивной инфекции. Нами был обнаружен только один образец с заменой в структуре MSD.

Никаких особенностей в структуре шпильки у и сайта AUG изученного нами варианта IDU-A ВИЧ-1 обнаружено не было. Данные области оказывают непосредственное влияние на образование конфигурации, содержащей шпилечные структуры (branched multiple hairprns, ВМН) пространственной конформации РНК и упаковки ее в вирионы. Наши результаты подтверждают тезис о консервативности этих областей, что является необходимым условием для осуществления их функций.

Высокий полиморфизм был характерен для областей между шпильками, однако этот факт не способен отразиться на вторичной структуре самих шпилек и на функции всего региона.

Полученные нами данные о консервативности внутри российского варианта ВИЧ-1 IDU-A фрагментов, образующих квадруплексы, может служить объяснением способности вирусной РНК димеризоваться даже при повреждениях шпильки DIS. Описанные фрагменты несут на себе основную нагрузку при димеризации, и, по-видимому, консервативность этих фрагментов является таким же необходимым условием для упаковки РНК в вирионы, как и консервативность шпилек DIS, SD и у.

В целях поиска новых средств терапии ВИЧ-инфекции разрабатываются новые классы лекарств, оказывающие ингибирующее влияние на разные белки вируса. Это позволяет воздействовать на вирус на всех этапах его жизненного цикла.

В качестве одной из новых целей антиретровирусной терапии может использоваться вспомогательный белок Ург ВИЧ-1. Несмотря на небольшой размер этого белка (96 аминокислотных остатков), он имеет сложную организацию и обладает большим количеством активностей. В связи с этим перед нами стояла задача исследовать структуру гена ург как с целью определения степени полиморфизма этого региона в составе доминирующего в России генетического варианта ВИЧ-1, так и для анализа наличия мутаций, описанных в литературе и связанных с потерей (или, напротив, с усилением) определенных активностей белка Ург.

Результаты филогенетического анализа гена ург продемонстрировали консервативность структуры этого региона. Все исследуемые образцы в 99 построениях из 100 кластеризовались на одной ветви филогенетического древа с изолятами подтипа А, выделенными ранее на территории России и на территории Украины. Это в очередной раз говорит о связи эпидемии ВИЧ-инфекции в России с эпидемией, разразившейся в 90-е годы 20-го века на территории Украины. Как и в случае 5ЧЛ'Я, не было обнаружено никаких существенных особенностей, которые бы позволили выделить в отдельную филогенетическую группу образцы по территориальному признаку или этапу инфекции. Полученные результаты подтверждают данные о низкой частоте мутаций гена ург, позволяющей белку Ург сохранять свою пространственную структуру и функции.

Низкий уровень изменчивости белка или отсутствие изменчивости вообще является важным условием для разработки средств терапии, мишенью которых является данный белок. Наши данные могут служить доказательством целесообразности начала подобной работы.

Нами был обнаружен ряд мутаций в исследуемых положениях гена Vрг, приводящих к заменам аминокислот в структуре Ург. В частности, в образцах варианта Ши-А ВИЧ-1 были обнаружены мутации белка в положениях 25, 61, 63, 73 и 80, но, по данным литературы, все эти мутации не связаны с потерей белком активностей или приобретением новых.

С-концевой регион размером в 12 аминокислотных остатков (положения с 84 до 96) во всех исследованных образцах отличался высокой вариабельностью, что часто наблюдается для него в вирусах различных вариантов. Хотя он и не участвует в процессе образования сложной вторичной и третичной структуры белка Ург, но при этом выполняет ряд важных функций. Так, вирусы, имеющие делецию этого региона, экснрессируют белок Ург, не способный связываться с клеточной ДНК. Если же Ург, напротив, имеет полноценный СООН-концевой регион, он способен вызывать разрушение клеточной ДНК, что, по мнению ряда авторов, приводит к развитию неоплазм. Кроме того, этот богатый аргинином и отрицательно заряженный регион, наряду с положительно заряженным К-концевым доменом, окружает а-спиралн Ург, участвуя в формировании устойчивой пространственной структуры. Среди обнарз-женных нами замен и делеций в гене ург, однако, не было выявлено вариаций, способных, по литературным данным,

повлиять на активности белка Vpr. В целом, полученные нами результаты говорят о том, что вариант IDU-A ВИЧ-1 экспрессирует полноценный белок Vpr, в то время как сам ген, особенно его структурные области, проявляет консервативность структуры.

ВЫВОДЫ

1. Результаты анализа последовательностей 5'-LTR и гена vpr варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего в ходе эпидемии ВИЧ-инфекции в России, указывают на принадлежность этого варианта к подтипу А вируса.

2. Типичными для всех вариантов подтипа А являются наличие в составе 5-LTR IDU-A ВИЧ-1 двух сайтов связывания для фактора NF-kB, структура ТАТАА-бокса и сайтов Spl.

3. Отличительной особенностью 5'-LTR российского варианта IDU-A ВИЧ-1 является вставка в 12 п.н. в области MFNLP, имеющая дополнительный сайт связывания для фактора RBF-2, способного уменьшать репликативные способности вируса.

4. В большинстве исследованных образцов варианта IDU-A ВИЧ-1 вторичная структура концевой петли шпильки DIS, шпилек TAR, SD и у, последовательности AUG и структур, образующих квадруплексы при димеризации РНК, также характерны для подтипа А ВИЧ-1 и не оказывают влияния на репликативные свойства вируса.

5. В структуре гена vpr российского варианта IDU-A ВИЧ-1 не выявлены мутации, по данным литературы ассоциированные с изменениями активностей белка Vpr.

6. Разработана методология дифференциальной диагностики ранней и текущей ВИЧ-инфекции на основе ИФА, которая может быть использована в эпидемиологической практике.

7. Консервативность 5'-LTR, области, предшествующей gag-стартовому кодону, и гена vpr IDU-A ВИЧ-1 и отсутствие ассоциации со сроком инфекции позволяют рекомендовать эти области генома для молекулярного мониторинга эпидемии ВИЧ-инфекции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ IIO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Адаптация тест-системы КОМБИБЕСТ-АНТИ-ВИЧ-1,2 для выявления ранней инфекции ВИЧ-1 с помощью хаотропного агента // Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 26-27 апреля 2007 года (в трех томах). - Сборник тезисов. - Т. 1. - С. 296-297.

2. Иммуноферментный метод выявления ранней ВИЧ-инфекции с применением синтетического пептида // Материалы Юбилейной российской научной конференции с международным участием, посвященная 175-летию со дня рождения С.П. Боткина, 29-31 мая 2007 года. - Сборник тезисов. - Т. 1. - С. 260-261.

3. Structure of the LTR U3 region of HIV-l subtype A circulating in Russia // 4th International Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention, Sydney, Australia, 22-25 July, 2007. - Abstract book. - Vol. 1. - P. 203. - Abstract WEPEA073.

4. Исследование области LTR ВИЧ-1 подтипа А, циркулирующего на территории России // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007», Москва, 28-30 ноября 2007 года (в трех томах). - Сборник тезисов. - Т. 1. - С. 124-125.

5. Лабораторные методы дифференциальной диагностики острой, ранней и текущей ВИЧ-инфекции // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - №12. - С. 25-32.

6. Structural analysis of the RNA region preceding Gag start codon in HIV-l type A variants circulating in Russia // Materials of 18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Barcelona, 19-22 April 2008. - Abstract book. - Vol. 1. - P. 1013. - Abstract P1013.

7. Структурный анализ области гена Vpr ВИЧ-1 подтипа А, циркулирующего в России // Вторая Конференция по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, 3-5 мая 2008 года. - Сборник тезисов. - Т. 1. - С. 25.

8. Сравнительный анализ лабораторных методов дифференциальной диагностики ранней ВИЧ-инфекции // Вопросы вирусологии. - 2008. -№53(5). - С. 46-49.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВМН - конфигурация РНК, содержащая множественные шпилечные структуры IDU-A - вариант ВИЧ-1, принадлежащий к подтипу А группы М и доминирующий на территории России и стран СНГ

LTR - длинный концевой повтор

MFNLP - область наиболее часто встречающихся длинных полиморфизмов

P-TEFb - позитивный фактор элонгации транскрипции b

TAR - регион присоединения Tat

Tat - трансактиватор транскрипции

TRM - мотав опознавания TAR

Vpr - вирусный белок R

ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека первого типа ИФА - иммуноферментный анализ МКПК - мононуклеарные клетки периферической крови ПЦР - полимеразная цепная реакция

Автор выражает искреннюю благодарность н глубокую признательность научному руководителю, заведующей лабораторией вирусов лейкозов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, д.б.н. М.Р. Бобковой за предоставление возможности проведения данной работы, научное руководство и ценные советы при написании оформлении диссертации. Автор выражает благодарность:

За участие в сборе н подготовке материалов для исследовании:

руководителю лабораторного отдела ГУЗМ НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, к.м.н. М.А. Годкову и научному сотруднику лаборатории клинической иммунологии того же института А.И. Баженову;

заведующему лабораторией Московского городского центра профилактики и борьбы со СПИДом Департамента здравоохранения города Москвы, к.м.н. А.Я. Ольшанскому;

руководителю Медицинского информационно-аналитического центра РАМН, к.м.н. Г.Г. Саламову.

За консультативную и методическую помощь в работе:

ведущему научному сотруднику лаборатории вирусов лейкозов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, д.б.н. Е.В. Казеиновой и всему коллективу лаборатории;

заведующему лабораторией молекулярной генетики ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, к.б.н. А.Г. Прилипову и научному сотруднику лаборатории Г.К. Садыковой;

старшему научному сотруднику лаборатории экологии вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, к.б.н. C.B. Альховскому;

заведующему лабораторией ЗАО «Вектор-Бест», к.б.н. Е.В. Кандрушину; старшему научному сотруднику отдела молекулярной и квантовой биофизики Института молекулярной биологии и генетики HAH Украины, к.б.н. М.И. Зарудной;

научному сотруднику Университета Томаса Джефферсона (США, Филадельфия), к.б.н. АЛ. Сухановой;

научному сотруднику лаборатории иммунологии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН А.Е. Гришечкину.

Для заметок

Заказ №67/14/01 Подписано в печать 14.01.2009 Тираж 90 экз. ООО «Копировальный МИР», тел (495)647-23-19; http://copy-prmt.i-u

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лаповок, Илья Андреевич

Введение.

Обзор литературы.

1. Открытие вируса иммунодефицита человека первого типа.

2. Строение вириона ВИЧ-1.

3. Организация генома ВИЧ-1.

3.1. Структура и функции ЬТЯ провирусной ДНК ВИЧ-1.

3.1.1. Структура и функции из-региона 5'-ЬТК провирусной ДНК.

3.1.2. Структура и функции Я-региона 5'-ЬТК провирусной ДНК.

3.1.3. Структура и функции Ш-региона 5'-1ЛИ провирусной ДНК.

3.2. Структура области вирусной РНК, предшествующей £а£-стартовому ко дону.

3.2.1. Вторичная структура и функции шпильки БК (БЫ) РНК ВИЧ-1.

3.2.2. Вторичная структура и функции шпильки ББ (8Ь2) РНК ВИЧ-1.

3.2.3. Вторичная структура и функции шпильки у (БЬЗ) РНК ВИЧ-1.

3.2.4. Шпилька БЬ4.

3.2.5. Ш-АШ-дуплекс.

3.2.6. Структура областей между шпильками.

3.2.7. Пространственная структура и упаковка геномной РНК ВИЧ-1.

3.3. Структурные гены ВИЧ-1.

3.3.1. Ген

3.3.2. Генро1.

3.3.3. Ген ет.

3.4. Гены и основные функции регуляторных и вспомогательных белков.

3.4.1. Строение Ург.

3.4.2. Положение и синтез Ург.

3.4.3. Функции Ург.

3.4.3.1. Влияние на точность обратной транскрипции.

3.4.3.2. Ург и импорт в ядро преинтеграционного комплекса.

3.4.3.3. Ург и клеточный цикл.

3.4.3.4. Разрушение двунитевой ДНК.

3.4.3.5. Ург и апоптоз.

3.4.3.6. Роль Ург в усилении 1ЛИ-направленной транскрипции.

4. Этапы ВИЧ-инфекции.

4.1. Ранняя и текущая инфекция.

4.1. Дифференциальная диагностика ранней и текущей инфекции.

5. Анализ полиморфизма ВИЧ-1 как инструмент эпидемиологического мониторинга „

5.1. Деление вируса на подтипы.

5.3. Природа изменчивости ВИЧ-1.

5.2. Полиморфизм вируса.

6. Молекулярный мониторинг ВИЧ-инфекции в России.

6.1. Эпидемия ВИЧ-инфекции в России.

6.2. Подтипы ВИЧ-1, обнаруживаемые в России.

7. Генная терапия ВИЧ-инфекции.

7.1. Терапии, базирующиеся на применении нуклеиновых кислот.

7.2. Терапия, базирующаяся на белках.

Экспериментальная часть.

1. Материалы и методы.

1.1. Объект исследования.

1.2. Сбор эпидемиологических данных.

1.3. Методы дифференциального анализа ранней и текущей инфекции.

1.3.1. Чувствительный/низкочувствительный иммуноферментный анализ (S/LS ELISA)

1.3.2. Иммуноферментный анализ с использованием хаотропного агента.

1.3.3. ИФА с использованием иммунодоминантного эпитопа gp41 (ИДЭ

§р41).

1.3.4. Изотип-специфический Western blot.

1.4. Метод получения «грубых» лизатов мононуклеарных клеток периферической крови

1.5. Анализ электрофоретической подвижности молекул в агарозном геле.

1.6. Применение метода гнездовой ПЦР для получения. ампликонов исследуемых областей ДНК.

1.6.1. Амплификация нуклеотидных последовательностей области 5-LTR.

1.6.2. Амплификация нуклеотидных последовательностей области,. предшествующей gag - стартовому ко дону.

1.6.3. Амплификация области гена vpr.

1.7. Метод очистки ДНК из геля методом Jetquick.

1.8. Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК.

2. Результаты.

2.1. Сравнительный анализ лабораторных методов дифференциальной диагностики ранней ВИЧ-инфекции.

2.1.1. Чувствительный/низкочувствительный ИФА.

2.1.2. ИФА с использованием 8М мочевины.

2.1.3. ИФА с использованием иммунодоминантного эпитопа gp41.

2.1.4. Изотип-специфический Western blot.

2.2. Анализ области 5-LTRпровирусной ДНК варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего на территории России.

2.2.1. Филогенетический анализ области 5'-LTR.

2.2.2. Анализ области U3.

2.2.3. Анализ области R.

2.2.4. Анализ области U5.

2.3. Анализ области вирусной РНК, предшествующей gag-стартовому кодону варианта IDU-A ВИЧ-1.

2.4. Анализ области гена vpr варианта IDU-A ВИЧ-1.

2.4.1. Филогенетический анализ области гена vpr.

2.4.2. Анализ мутаций в структуре гена vpr.

Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ полиморфизма неструктурных областей генома варианта ВИЧ-1, доминирующего в России"

Актуальность проблемы. С момента открытия в 1983 г. вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) он является предметом пристального изучения [Бобков и др., 2003]. В связи с ростом эпидемии ВИЧ-инфекции, в том числе и в России, вопрос о разработке эффективных средств борьбы с заболеванием становится все более острым. Главными препятствиями в этой борьбе служат выраженный токсический эффект существующих препаратов и явление лекарственной устойчивости вируса к ним. Для преодоления этих проблем постоянно проводится поиск новых лекарственных препаратов, воздействующих на различные этапы жизненного цикла вируса. В качестве объектов воздействия будущей антиретровирусной терапии рассматриваются, в частности, регуляторные и вспомогательные белки ВИЧ-1. Другим многообещающим подходом может стать генная терапия ВИЧ-инфекции, непосредственной мишенью которой являются нуклеотидные последовательности генома вируса, и среди них — нетранслируемые области генома, необходимые для осуществления его жизненного цикла.

Среди областей генома ВИЧ-1, полиморфизм которых пока изучен недостаточно, можно выделить регион длинных концевых повторов (LTR, long terminal repeat) провируса. Этот регион содержит большое количество сайтов связывания для специализированных клеточных и вирусных факторов транскрипции [Pereira et al, 2000; Van Opijnen et al, 2004] и необходим для инициации вирусной транскрипции, а также вовлечен в процесс обратной транскрипции и интеграции [Ramirez de Arellano et al, 2006], являясь, таким образом, контрольным центром генетической экспрессии ВИЧ-1. Несмотря на высокую консервативность этой области, описано явление полиморфизма LTR среди различных вариантов и подтипов ВИЧ-1 [Estable et al, 1996].

Решающую роль в процессе специфической упаковки геномной РНК в нарождающиеся вирусные частицы играет регион, предшествующий gag-стартовому кодону РНК вируса, в составе которого выделяют три шпилечные структуры - DIS, SD и Y, играющие важнейшую роль в процессе созревания вирионов и упаковки РНК в геноме вновь формирующихся вирусных частиц. В составе вирусной РНК эти регионы, имеющие 5 специфическую вторичную структуру, образуют домены, отвечающие за процесс инициации димеризации двух цепей РНК, образования квадруплексов, стабилизирующих димеры, и упаковки генома ВИЧ-1 непосредственно в вирионы. Показано, что полиморфизм этой области может оказывать влияние на скорость репродукции вируса и, в конечном счете, на прогрессию ВИЧ-инфекции.

Значительным влиянием на различные этапы жизненного цикла ВИЧ-1 обладает вспомогательный вирусный белок Vpr (viral protein R) [Le Rouzic et al, 2005]. Этот белок оказывает свое влияние на процессы обратной транскрипции, интеграции провируса, транскрипции вирусных генов, а также на жизненный цикл клетки и процесс апоптоза. В литературе имеется описание некоторых мутаций гена vpr, влияющих на многообразные активности белка Vpr.

Несмотря на существование полиморфизма области 5'-LTR, региона РНК, предшествующего gag-стартовому ко дону, и гена vpr ВИЧ-1, данные литературы свидетельствуют о том, что они достаточно консервативны в условиях естественного развития инфекции, а значит, могут быть использованы для создания новых средств антиретровирусной терапии.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

Научная новизна и практическая значимость работы. Продемонстрирован низкий уровень изменчивости области 5'-LTR, области шпилек DIS, SD и ц/ и гена vpr варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего на территории России. Анализированные нуклеотидные последовательности ВИЧ-1 депонированы в GenBank под номерами: EU938080-EU938124 для области 5'-LTR (45 образцов), FJ437007 - FJ437028 и FJ503049-FJ503059 - для области шпилек DIS, SD и у (33 образца), FJ490707 - FJ490751 ~ для гена vpr (45 образцов).

Показано, что в структуре 5'-LTR провирусной ДНК имеются участки, специфические для российского варианта ВИЧ-1 подтипа А. Данные результаты свидетельствуют о том, что область LTR варианта подтипа А ВИЧ-1, доминирующего в России, является характерной для данного подтипа, и анализ этого региона может быть использован для генотипирования наряду с анализом структурных генов gag и env. В частности, показано, что для всех образцов варианта IDU-A ВИЧ-1, выделенных от не употреблявших антиретровирусную терапию людей, характерно наличие вставки в области так называемых «наиболее часто встречающихся длинных полиморфизмов» (MFNLP) в положении -118 внутри региона NF-kB-сайтов LTR, достаточно часто встречающейся среди штаммов ВИЧ-1 подтипов А, С, D, F, H и J по сравнению с подтипом В [Estable et al, 1996; Ramirez de Arellano et al, 2006]. В большинстве (43 из 45) исследованных образцов вставка размером в 12 нуклеотидов имела дополнительный сайт RBE III, связывающий фактор RBF-2, что потенциально способно оказывать отрицательный эффект на репликацию вируса в клетках [Estable et al, 2007; Ramirez de Arellano et al, 2006].

В составе концевой петли шпильки DIS абсолютного большинства всех российских образцов (91%) обнаружен палиндром AG[GUGCAC]A, характерный для подтипа А ВИЧ-1 [Zarudnaya et al, 2006]. Единичные замены в составе концевой петли, обнаруженные у трех образцов, по всей вероятности, не оказывают значительного влияния на процесс димеризации и упаковки вирусной РНК. Также у двух из 33-х образцов выявлены мутации в 5-м положении шпильки SD, что потенциально может быть связано с ускоренным прогрессированием инфекции [Fang et al, 2001]. Высокий уровень полиморфизма характерен для промежутка между шпильками SD и v|/, однако различия в этой области не способны оказать серьезного влияния на вторичную структуру шпилек.

ВИЧ-1 подтипа А особенности, которые могут служить дополнительным инструментом в изучении молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции на территории России и потенциально способны влиять на функции белка. Так, обнаружена значительная вариабельность в 89-м аминокислотном положении Ург. Также была выявлена вариабельность в 73-м и 80-м положении, а в одном образце обнаружена замена 16IV. Мутации в последних трех положениях могут оказывать влияние на проалоптозную активность Ург, ослабляя ее и тем самым, замедляя патогенез инфекции [Ьиш е! а1, 2003; Лап е1 а1, 2003]. Кроме того, в ряде образцов имелись замены в положениях 25 и 63, критических для способности белка проникать в ядро клетки и накапливаться там [ТеПг1еп а1,1998; Моге11е1 е1 а1, 2003]; в трех образцах обнаружены делеции.

В целом, результаты работы могут служить научным обоснованием для использования областей 5'-ЬТЯ, 5'-11ТК и гена хрг в качестве мишеней при разработке новых методов лечения ВИЧ-инфекции, включая генную терапию, и новых средств мониторинга ВИЧ-1 с дальнейшим внедрением их в клиническую и эпидемиологическую практику.

Положения, выносимые на защиту.

1. Анализ нуклеотидных последовательностей региона 5'-ЬТ11, области, предшествующей £Я£-стартовому кодону, и гена ург доминирующего в России варианта ГОи-А ВИЧ-1 подтверждает его принадлежность к подтипу А вируса.

2. Строение и количество сайтов связывания №-кВ и 8р1, а также структура ТАТАА-бокса в составе 5'-ЬТК ГОи-А являются типичными для всех вариантов подтипа А ВИЧ-1.

3. Характерной особенностью варианта ГОИ-А ВИЧ-1 является наличие области МРЫЬР размером 12 нуклеотидов, содержащей дополнительный сайт связывания для фактора 11ВР-2, в составе Ш региона ЬТ11.

4. Вторичная структура участков, наиболее важных для репликации вируса, в составе региона, предшествующего £а£-стартовому кодону вирусной РНК, характерна для подтипа А.

5. Мутации, ассоциированные, по данным литературы, с изменениями активностей белка Ург, в составе варианта Ш11-А ВИЧ-1 отсутствуют.

6. Разработан иммуноферментный метод дифференциальной диагностики ранней и текущей ВИЧ-инфекции.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Лаповок, Илья Андреевич

Выводы

2. Типичными для всех вариантов подтипа А являются наличие в составе 5-LTRIDU-A ВИЧ-1 двух сайтов связывания для фактора NF-kB, структура ТАТАА-бокса и сайтов Spl.

7. Консервативность 5'-LTR, области, предшествующей ¿^-стартовому кодону, и гена vpr IDU-A ВИЧ-1 и отсутствие ассоциации со сроком инфекции позволяют рекомендовать эти области генома для молекулярного мониторинга эпидемии ВИЧ-инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лаповок, Илья Андреевич, Москва

1. Агол В.И., Богданов A.A., Гвоздев В.А. и др. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот (учеб. для биол. спец. Вузов) // М.: Высш. шк. 1990. - с. 308-315.

2. Бобков А.Ф., Казенова Е.В., Селимова JIM. и др. Нуклеотидные последовательности генов и изолятов вируса иммунодефицита человека типа 1, выявленных в России: обнаружение новых рекомбинантных вариантов // Вопр. вирусол. -2000. -№6. С. 17-20.

3. Бобков А.Ф., Казеннова Е.В., Бобкова М.Р. и др. Молекулярно-генетическая характеристика ВИЧ-1 на территории России // Вестник РАМН. 2002. - №8. — С.40-42.

4. Бобков А.Ф., Казеннова Е.В., Селимова Л.М., и др. Молекулярно-вирусологические особенности эпидемии ВИЧ-инфекции в России и других странах СНГ // Вестник РАМН. 2003. - № 12. - С. 83-85.

5. Бобков А.Ф., Покровский В.В. Терапевтические ВИЧ-вакцины // М., 2001 С. 10-15.

6. Бобков А.Ф., Покровский В.В., Селимова Л.М. и др. Генетическая характеристика вариантов вируса иммунодефицита человека первого типа, вызвавших эпидемию среди наркоманов в странах СНГ// Вопр. Вирусол. -1998. -№43. -С.253-256.

7. Бобкова М. Р. Иммунитет и ВИЧ-инфекция (популярные лекции). М.: Олимпия Пресс. 240 е., ил, 2006.

8. Бобкова М.Р., Казеннова Е.В., Лаповок И.А. Методологические основы раннего выявления ВИЧ-инфекции (методические рекомендации) // М., 2005 — С. 3-23.

9. Бобкова М.Р., Лаповок И.А. Лабораторные методы дифференциальной диагностики острой, ранней и текущей ВИЧ-инфекции (лекция) // Клин. лаб. диагн. 2007. - Т. 12. - С. 25 - 56.

10. Зарудная М.И., Потягайло А.Л., Говорун Д.Н. Структурная модель области димеризации генома вируса иммунодифецита человека HIV-1 // Biopolimery i kletka. -2003. Т. 19, N. l.-P. 37-42.

11. Казеннова E.B. Молекулярно-эпидемиологический анализ вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), циркулирующих в России, 19872003 г. Автореф. диссертации докт. биол. наук. М., 2005. 52 с.

12. Казеннова Е.В., Бобков А.Ф. Подтипы вируса иммунодефицита человека 1 типа: классификация, происхождение и распространение в Европе // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2003. №1. - С.90-96.

13. Казеннова Е.В., Бобков А.Ф., Селимова JIM. и др. Анализ субтипов гена gag вариантов ВИЧ-1, выделенных в России, методом сравнительной оценки электрофоретической подвижности гетеродуплексов // Вопр. Вирусол. 2001. -Т.46. - С.12-16.

14. Ладная Н. Н., Покровский В. В., Бобков А. Ф. и др. Распространение субтипов ВИЧ-1 в России // Эпидемиол. и инфекц. бол. — 1998. —№ 5. — С. 19—23.

15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 480 е., ил., 1984.

16. Научная деятельность ВОЗ. Вирус иммунодефицита человека// Бюллетень ВОЗ.1986,- Т.64, № I.-C.8-9.

17. Покровский В.В., Бобков А.Ф., Ладная П.Н. и др. Эпидемиологическая ситуация инфекции, вызываемая вирусом иммунодефицита человека, в России в 1991-1995 годах // Эпидемиол. и инфекц. бол. 1996. - №1. - С. 83-85 (а).

18. Покровский В.В., Ермак Т.Н., Беляева В.В., Юрин О.Г. ВИЧ-инфекция: клиника, диагностика и лечение. Под общ. ред. В.В. Покровского. — 2-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. —488 е.: 73 ил.

19. Покровский В.В., Ладная H.H., Соколова Е.В., Буравцова Е.В. ВИЧ-инфекция // Информационный бюллетень. 2004. - № 26. - 36 с.

20. Покровский В.В., Савченко И.Г., Ладная P.P. и др. ВИЧ инфекция.// Информационный бюллетень. — 1997. №8. - 19 с.

21. Покровский В.В., Янкина З.К. Эпидемиологическое расследование первого случая СПИД, выявленного у гражданина СССР// Журнал микробиологии.1987.- №12.- С.8-11.

22. Суханова А. Л., Казеннова Е. В., Рудинский Н. И. и др. Генетическая изменчивость области, кодирующей протеазу, у изолятов ВИЧ-1 подтипа А ирекомбинантов CRF03AB на территории СНГ // Вопр. вирусол. 2004. — № 6. — С. 4-9 (а).

23. Суханова A.JL, Казеннова Е.В., Бобкова М.Р. и др. Варианты вируса иммунодефицита человека типа 1, обнаруживаемые в России среди инфицированных половым путем // Вопр. вирусол. 2004. - № 49. - С. 4-7 (Ь).

24. Суханова A.JL, Бобков А.Ф. Генетическое тестирование лекарственной устойчивости при ВИЧ-инфекции: проблемы и перспективы // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2004. —N. 4. - С. 54-57 (с).

25. Филдс Б.Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А. и др. Вирусология (в 3-х томах) // М.: Мир. -1989.-Т. 1. — с. 442-459.

26. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. Спид. М.: Народная академия культуры и общечеловеческих ценностей, 354 е., ил, 1992.

27. Abbink Т.Е., Berkhout В. A Novel Long Distance Base-pairing Interaction in Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA Occludes the Gag Start Codon // J. Biol. Chem. -2003. Vol. 278, N. 13-P. 11601-11611.

28. Adelson M.E., Martinand-Mari C., Iacono K.T. et al. Suhadolnik Inhibition of human immunodeficiency virus (HIV-1) replication in SupTl cells transduced with an HIV-1 LTR-driven PKR cDNA construct // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 264. - P. 806815.

29. Aiken C, Konner J, Landau NR, et al. Nef induces CD4 endocytosis: Requirement for a critical dileucine motif in the membrane-proximal CD4 cytoplasmic domain// Cell -1994.-Vol.76.-P.853-864.

30. Andang M., Hinkula J., Hotchkiss G., et al. Dose-response resistance to HIV-l/MuLV pseudotype virus ex vivo in a hairpin ribozyme transgenic mouse model // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999. Vol. 96, N. 22. - P. 12749-12753.

31. Asante-Appiah E., Skalsa M. Molecular mechanisms in retrovirus DNA integration// Antiviral Res. -1997.-Vol.36. -P.139-156.

32. Ashorn P, McQuade TJ, Thaisrivongs S, et al. An inhibitor of the protease blocks maturation of human and simian immunodeficiency viruses and spread of infection// Proc Natl Acad Sci USA -1990. Vol.87. -P.7472-7476.

33. Bannwarth S. and Gatignol A. HIV-1 TAR RNA: The target of molecular interaction between the virus and its host // Curr. HIV Res. 2005. - Vol. 3. - P. 61-71.

34. Barbeau B., Robichaud G. A., Fortin J.-F., and Tremblay M.J. Negative regulation of the NFAT1 factor by CD45: implication in HIV-1 long terminal repeat activation // J. Immunol.-2001. Vol. 167. - P. 2700-2713.

35. Barin F., Meyer L., R. Lancar et al. Development and Validation of an Immunoassay for Identification of Recent Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infections and Its Use on Dried serum Spots // J Clin Microbiol. 2005. - Vol. 43, N. 9 - P. 4441-4447.

36. Barre-Sinoussi F., Cherman J.C., Rey F. et al. Isolation of T-lymphotrofic retrovirus from patient at risk to AIDS // Science. 1983. - Vol. 220. - P.868-871.

37. Beer B., Bailes E., Sharp P. et al. Diversity and evolution of primate lentiviruses. In HIV Sequence Compendium 2000, Los Alamos: Los Alamos National Laboratory.

38. Berkhout B. and wan Wamel J.L.B. Role of the DIS hairpin in replication of human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 1996. - Vol. 70, N. 10. - P. 6723 - 6732.

39. Berkhout B. and van Wamel J.L.B. The leader of the HIV-1 RNA genome forms a compactly folded tertiary structure // RNA. 2000. - Vol. 6, N. 2. - P. 282-295.

40. Bernacchi S., Ennifar E., Toth K., et al. Mechanism of hairpin-duplex conversion for the HIV-1 dimerization initiation site // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, N. 48 - P. 40112-40121.

41. Bobkov A. F., Kazennova E. V., Selimova L. M. et al. Temporal trends in the HIV-1 epidemic in Russia: predominance of subtype A // J. Med. Virol. — 2004. — Vol. 74, N. 2.-P. 191-196.

42. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Garaev M., et al. Identification of an env G subtype and heterogeneity of HIV-1 strains in the Russian Federation and Belarus // AIDS. 1994. Vol. 8, N. 12. - P. - 1649-1655.

43. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Selimiva L. et al. An HIV type 1 epidemic among injecting drug users in the former Soviet Union caused by a homogeneous subtype A strain // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1997. - Vol.13. - P.l 195-1201.

44. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Selimova L. et al. Genetic heterogeneity of HIV-1 type 1 in Russia: identification of H variants and relationship with epidemiological data// AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1996. - Vol.12. - P.1687-1690.

45. Bobkova M., Kazennova E., Selimova L. et al. Serological approaches to subtyping of HIV-1 in injecting drug users in Russia: evidence of subtype homogeneity at the main sites of the epidemic // Int. J. STD&AIDS. 2001. -Vol.12. - P.34-40.

46. Bourbigot S., Beltz H., Denis J. et al. The C-terminal domain of the HIV-1 regulatory protein Vpr adopts an antiparallel dimeric structure in solution via its leucine-zipper-like domain // J. Biochem. 2005. Vol. 387. - P. 333-341.

47. Bruns K., Fossen T., Wray V., et al. Structural characterization of the HIV-1 Vpr N terminus: evidence of cis/trans-proline isomerism // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, N. 44.-P. 43188-43201.

48. Bryant M, Ratner L. Myristoylation-dependent replication and assembly of human immunodeficiency virus 1// Proc Natl Acad Sei USA -1990. Vol. 87. -P.523-527

49. Burchell A.N., Calzavara L., Ramuscak N. et al. Symptomatic primary HIV infection or risk experiences? Circumstances surrounding HIV testing and diagnosis among recent seroconverters // Int J STD AIDS. 2003. - Vol. 14. - P. 601-608.

50. Bushman FD, Fujiwara T, Craigie R. Retroviral DNA integration directed by HIV integration protein in vitro// Science -1990. Vol. 249. -P. 1555-1558.

51. Capon DJ, Ward RH. The CD4-gpl20 interaction and AIDS pathogenesis// Annu Rev Immunol -1991. Vol.9. -P.:649-678.

52. Chowdhury I.H., Wang X.-F., Landau N.R., et al. HIV-1 Vpr activates cell cycle inhibitor p21/Wafl/Cipl: a potential mechanism of G2/M cell cycle arrest // Virology.- 2003. Vol. 305. - P. 371-377.

53. Clavel F., Guetard F., Brun-Vezinet S., et al. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS// Science. -1986. Vol.233. -P.343-346.

54. Clever J., Sassetti C., and Parslow T.G. RNA secondary structure and binding sites for gag gene products in the 5' packaging signal of human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 1995. - Vol. 69, N. 4. - P. 2101 - 2109.

55. Cohen EA, Dehni G, Sodroski JG, et al. Human immunodeficiency virus vpr product is a virion-associated regulatory protein// J Virol -1990. Vol. 64. -P.3097-3099.

56. Constantine N.T., Sill A.M., Jack N. Improved Classification of Recent HIV-1 Infection by Employing a Two-Stage Sensitive/Less-Sensitive Test Strategy // AIDS. -2003.-Vol. 32-P. 94-103.

57. Cosa G., Harbron E.J., Zeng Y., et al. Secondary structure and secondary structure dynamics of DNA hairpins complexed with HIV-1 NC protein // Biophys J. — 2004. -Vol. 87, N. 4.-P. 2759-2767.

58. Darlix JL., Gabus C., Nugeyre M., et al. Cis elements and trans-acting factors involved in the RNA dimerization of the human immunodeficiency virus HIV-l//J.Mol.Biol.-1990. Vol.216. - P.689-699.

59. Estable M. C. In search of a function for the most frequent naturally-occurring length polymorphism (MFNLP) of the HIV-1 LTR: Retaining functional coupling, of Nef and RBF-2, at RBEIII? // Int. J. Biol. Sci. 2007. - Vol. 3, N. 5. - P. 318-327.

60. Fang G., Burger H., Chappey C., et al. Analysis of transition from long-term nonprogressive to progressive infection identifies sequences that may attenuate HIV type 1 //AIDS Res. Hum. Retroviruses.-2001.-Vol. 17,N. 15.-P. 1395-1404.

61. Feilzien L.K., Woffendin C., Hottiger M.O., et al. HIV transcriptional activation by the accessory protein, VPR, is mediated by the p300 co-activator // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 5281-5286.

62. Feng S, Holland EC. HIV-1 tat trans-activation requires the loop sequence within tar// Nature -1988. Vol.334. -P.165-167.

63. Fischer U„ Pollard V. W., Luhrmann R., et al. Rev-mediated nuclear export of RNA is dominant over nuclear retention and is coupled to the Ran-GTPase cycle // Nucleic Acids Res. 1999. - Vol. 27, N. 21. - P. 4128-4134.

64. Franke EK, Luban J. Inhibition of HIV-1 replication by cyclosporine A or related compounds correlates with the ability to disrupt the Gag-cyclophilin A interaction// Virology -1996. Vol. 222. -P.279-282.

65. Franke EK, Yuan HE, Luban J. Specific incorporation of cyclophilin A into HIV-1 virions//Nature -1994. Vol. .372. -P.359-362.

66. Gallay P, Swingler S, Song J, et al. HIV nuclear import is governed by the phosphotyrosine-mediated binding of matrix to the core domain of integrase // Cell. — 1995. Vol. 83, N. 4. - P. 569-576.

67. Gallo R.C. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patient with AIDS and at risk for AIDS// Science. -1984. Vol.224. -P.500-503.

68. Gao F., Vidal N., Li Y., et al. Evidence of two distinct subsubtypes within the HIV-1 subtype A radiation// AIDS Res Hum Retroviruses. -2001. -Vol. 17. -P.675-688.

69. Gelderblom H.R. Assembly and morphology of HIV: potential effect of structure on viral function // AIDS. 1991. Vol. 5, N. 6. - P. 617-637.

70. Genesca J., Shih J.W., Jett B.W. et al. What do Western blot indeterminate patterns for human immunodeficiency virus mean in EIA-negative blood donors? // Lancet. -1989.-Vol. 28, N.2-P. 1023-1025.

71. Hamm T., Rekosh D., Hammarskjold M. Selection and characterisation of Human immunodeficiency virus type 1 mutants tha are resistant to inhibition by the transdominant negative RevMlO protein// J.Virol. -1999. -Vol.73. -P.5741-5747.

72. Hamy F., Felder E. R., Heizmann G. et al. An inhibitor of the Tat/TAR RNA interaction that effectively suppresses HIV-1 replication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 3548-3553.

73. Harrich D, Ulich C, Gaynor RB. A critical role for the TAR element in promoting efficient human immunodeficiency virus type 1 reverse transcription// J Virol -1996. — Vol.70.-P.4017-4127.

74. Harrison G.P, Lever A.M. The human immunodeficiency virus type 1 packaging signal and major splice donor region have a conserved stable secondary structure// J Virol -1992. Vol.66. -P.4144-4153.

75. He J., Choe S., Walker R., et al. Human immunodeficiency virus type 1 viral protein R (Vpr) arrests cells in the G2 phase of the cell cycle by inhibiting p34cdc2 activity // J. Virol. 1995. - Vol. 69, N. 11. - P. 6705-6711.

76. Heinzinger NK, Bukinsky MI, Haggerty SA, et al. The Vpr protein of human immunodeficiency virus type 1 influences nuclear localization of viral nucleic acids in nondividing host cells// Proc Natl Acad Sei USA -1994. Vol.91. -P.7311-7315.

77. Helga-Maria C., Hammarskjold M., Rekosh D. An intact TAR element and cytoplasmic localisation are necessary for efficient packing of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA// J.Virol.-1999. Vol.73.- P.4127-4135.

78. Hofinan B., Hasetline W.A. Molecular biology of the AIDS virus: ten years of discovery hope for the future// Science Challenging AIDS, Basel, Karger. -1992 -Vol .1. -P.71-106.

79. Hope TJ, McDonald D, Huang XJ, et al. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 Rev transactivator: Essential residues near the amino terminus// J Virol -1990. Vol.64. -P.5360-5366.

80. Huang L., Bosch I., HofmannW., et al. Tat protein induces human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) coreceptors and promotes infection with both macrophage-tropic and T-lymphotropic HIV-1 strain// J.Virol. -1998. -Vol.72. -P.8952-8960.

81. Jacks T, Power MD, Masiarz FR, et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 Gag-Pol expression//Nature -1988. Vol.331. -P.280-283.

82. Jeeninga R. E., Hoogenkamp M., Armand-Ugon M. et al. Functional differences between the long terminal repeat transcriptional promoters of human immunodeficiency virus type 1 subtypes A through G // J. Virol. 2000. - Vol. 74, N. 8.-P. 3740-3751.

83. Jian H. and Zhao L.-J. Pro-apoptotic activity of HIV-1 auxiliary regulatory protein Vpr is subtype-dependent and potently enhanced by nonconservative changes of theleucine residue at position 64 // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, N. 45. - P. 4432644330.

84. Jowett J.B.M., Planelles V., Poon B., et al. The human immunodeficiency virus type 1 vpr gene arrests infected T cells in the G2 + M phase of the cell cycle // J. Virol. — 1995.-Vol. 69, N. 10.-P. 6304-6313.

85. Kichler A., Pages J.-C., Leborgne C., et al. Efficient DNA transfection mediated by the C-terminal domain of human immunodeficiency virus type 1 viral protein R // // J. Virol. -2000. Vol. 74, N. 12. - P. 5424-5431.

86. Kim SY, Byrn R, Groopman J, et al. Temporal aspects of DNA and RNA synthesis during human immunodeficiency virus infection: Evidence for differential gene expression// J Virol -1989. Vol.63. -P.3708-3713.

87. Klimkait T, Strebel K, Hoggan MA, et al. The human immunodeficiency virus type 1-specific protein vpu is required for efficient virus maturation and release// J Virol -1990.-Vol.64.-P.621-629.

88. Kondo E., Mammano F., Cohen E., et al. The p6Gag domain of human immunodeficiency virus type 1 is sufficient for the incorporation of Vpr into heterologous viral particles//J.Virol.-1995. Vol.69. - P.2759-2764.

89. Krebs F. C., Hogan T. H., Quiterio S. et al. Lentiviral LTR-directed expression, sequence variation, and disease pathogenesis // HIV Database Rev. 2001. — P. 29-70.

90. Kumar S, Tamura K, and Nei M. Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA), version 1.01. Institute of Molecular Evolutionary Genetics, Pennsylvania State University. University Park, Pennsylvania, 1993.

91. Lapadat-Tapolsky M, De Rocquigny H, Van Gent D, et al. Interactions between HIV-1 nucleocapsid protein and viral DNA may have important functions in the viral life cycle//Nucleic Acids Res -1993. Vol.21. -P.831-839.

92. Le Rouzic E. and Benichou S. The Vpr protein from HIV-1: distinct roles along the viral life cycle // Retrovirology. 2005. - Vol. 2, N. 11. - P. 1-14.

93. Leitner T., Korovina G., Marquina S. et al. Molecular epidemiology and MT-2 cell tropism of Russian HIV type I variants // AIDS Res. Hum. Retrovirus. — 1996. — Vol. 12.-P. 1595-1603.

94. Lever A.M.L. Gene therapy for HIV // Sex Transm Infect. 2001. - Vol. 77. - N. 2. -P. 93-96.

95. Levy J., Hoffman S., Kramer J., et al. Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS// Science. -1984. -Vol. 225. -P.840-842.

96. Lewis P, Hensel M, Emerman M. Human immunodeficiency virus infection of cells arrested in the cell cycle// EMBO J -1992. Vol.11. -P.3053-3058

97. Liitsola K., I. Tashkinova, T. Laukkanen et al. HIV-1 genetic subtype A/B recombinant strain causing an explosive epidemic in injecting drug users in Kaliningrad//AIDS. 1998.-Vol.12. - P.1907-1919.

98. Lu M., Blackow S., Kim P. A trimeric structural domain of the HIV-1 transmembrane glycoprotein//Nature Struct.Biol. -1995. Vol.2. -P.1075-1082.

99. Lu M., Ji H., Shen S. Subdomain folding and biological activity of the core structure from human ummunodeficiency virus type 1 gp41 amplications for viral membrane fusion//J.Virol. -1999. Vol.73. -P.4433-4438.

100. Lum J.J., Cohen O.J., Nie Z., et al. VprR77Q is associated with long-term nonprogressive HIV infection and impaired induction of apoptosis // J. Clin. Invest. — 2003.-Vol. 111.-P. 1547-1554.

101. Luria S, Chambers I, Berg P. Expression of the type 1 human immunodeficiency virus Nef protein in T cells prevents antigen receptor-mediated induction of interleukin 2 mRNA// Proc Natl Acad Sci USA -1991. Vol.88. -P.5326-5330.

102. Malim MH, Hauber J, Le SY, et al. The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA// Nature -1989.-Vol.338.-P.254-257.

103. Mancebo H. S. Y., Lee G., Flygare J. et al. P-TEFb kinase is required for HIV Tat transcriptional activation in vivo and in vitro // Genes Dev. 1997. - Vol. 11, N. 20. — P. 2633-2644.

104. Mansky L.M., Temin H.M. Lower in vivo mutation rate of human immunodeficiency virus type 1 than that predicted from the fidelity of purified reverse transcriptase // J. Virol. 1995. - Vol. 69, N.8. - P.5087-5094.

105. Marquet R., Paillart J.-C., Skripkin E., et al. Dimerization of human immunodeficiency virus type 1 RNA involves sequences located upstream of the splice donor site //Nucleic Acids Res. 1994. - Vol. 22, N. 2. - P. 145-151.

106. Masur H., Michelis M.A., Greene J.B. et al. An outbreak of community-acquired Pneumocystis carinii pneumonia: initial manifestation of cellular immune dysfunction//N. Eng. J. Med. -1981. Vol .305. -P. 1431-1438.

107. Mc Rae B., Lange J.A., Ascher M.S., et al. Immune response to HIV p24 core protein during the early phases of human immunodeficiency virus infection // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1991. - Vol.7, N. 8 - P. 637-643.

108. McGowan J.P., Shah S.S., Small C.B. et al. Relationship of serum immunoglobulin and IgG subclass levels to race, ethnicity and behavioral characteristics in HIV infection // Med Sei Monit. 2006. - Vol. 12, N.l - P. 11-16.

109. Miller MD, Warmerdam MT, Gaston I, et al. The human immunodeficiency virus-1 nef gene product: A positive factor for viral infection and replication in primary lymphocytes and macrophages// J Exp Med -1994. Vol.179. -P.101-113.

110. Miller R., Sarver N. HIV accessory proteins as therapeutic targets// Nat.Med. -1997. -Vol.3. -P.389-394.

111. Mindel A. and Tenant-Flowers M. ABC of AIDS: Natural history and management of early HIV infection // BMJ. 2001/ - Vol. 322. - P. 1290-1293.

112. Morellet N., Bouaziz S., Petitjean P. and Roques B. P. NMR structure of the HIV-1 regulatory protein Vpr // J. Mol. Biol. 2003. Vol. 327. - P. 215-227.

113. Morison L. The global epidemiology of HIV/ADIS // Br. Med. Bull. 2001. - Vol. 58.-P. 7-18.

114. Muesing MA, Smith DH, Cabradilla CD, et al. Nucleic acid structure and expression of the human AIDS/lymphadenopathy retrovirus// Nature. -1985. Vol. 313. -P.450-458.

115. Myers G. Tenth anniversary perspectives on AIDS. HIV: between past and future // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1994. - Vol. 10. -P. 1317-1324.

116. Naghavi M. H., Schwartz S., Sonnerborg A. and Vahlne A. Long terminal repeat promoter/enhancer activity of different subtypes of HIV type 1 // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1999. - Vol. 15, N. 14. - P. 1293-1303.

117. Nath A., Conant K., Chen P., et al. Transient exposure to HIV-1 Tat protein results in cytokine production in macrophages and astrocytes// J.Biol.Chem. -1999. Vol.274. -P.17098-17102.

118. Nielsen MH, Pedersen FS, Kjems J. Molecular strategies to inhibit HIV-1 replication // Retrovirology. 2005. Vol. 2, N. 10. - P. 1-20.

119. Ooms M., Huthoff H., Russell R., et al. A Riboswitch Regulates RNA Dimerization and Packaging in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions // J. Virol. 2004. -Vol. 78,N. 19.-P. 10814-10819.

120. Parkin NT, Chamorro M, Varmus HE. Human immunodeficiency virus type 1 gag-pol frameshifting is dependent on mRNA secondary structure: Demonstration by expression in vivo// J Virol -1992. Vol.66. -P.5147-5151.

121. Patel C.A., Mukhtar M., and Pomerantz R.J. Human immunodeficiency virus type 1 Vpr induces apoptosis in human neuronal cells // J. Virol. 2000. - Vol. 74, N. 20. -P. 9717-9726.

122. Paxton W., Connor R.I., Landau N.R. Incorporation of Vpr into human immunodeficiency virus type 1 virions: requirement for the p6 region of gag and mutational analysis// J Virol. -1993. Vol.67. -P.7229-7237.

123. Pereira L. A., Bentley K., Peeters A. et al. A compilation of cellular transcription factor interactions with the HIV-1 LTR promoter // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28, N. 3. - P. 663-668.

124. Perkins N.D., Felzien L.K., Betts J.C., et al. Regulation of NF-kappaB by cyclin-dependent kinases associated with the p300 coactivator // Science. 1997. — Vol. 275, N. 5299. P - 523-527.

125. Piot P., Bartos M., Ghys P., et al. The global impact of HIV/AIDS// Nature. -2001. -Vol.410. -P.968-973.

126. Poon D., Li G., Aldovini A. Nucleocapsid and matrix protein contributions to selective human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA packaging// J.Virol. -1998. -Vol.72. -P.1983-1993.

127. Poznansky M, Lever A, Bergeron L, et al. Gene transfer into human lymphocytes by a defective human immunodeficiency virus type 1 vector// J Virol 1991. - Vol.65. -P.532-536.

128. Ramirez de Arellano E., Soriano V. and Holguhn A. Genetic analysis of regulatory, promoter, and TAR regions of LTR sequences belonging to HIV type 1 non-B subtypes // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2005. - Vol. 21, N. 11. - P. 949-954.

129. Ramirez de Arellano E., Soriano V., Alcami J. and Holguin A. New findings on transcription regulation across different H1V-1 subtypes // AIDS Rev. 2006. - Vol. 8.-P. 9-16.

130. Rasola A., Gramaglia D., Baccaccio C., et al. Apoptosis enhancement by the HIV-1 Nef protein// J.Immunol. -2001. Vol.166. -P.81-88.

131. Re F., Braaten D., Franke E.K. and Luban J. Human immunodeficiency virus type 1 Vpr arrests the cell cycle in G2 by inhibiting the activation of p34cdc2-cyclin B // J. Virol.-1995.-Vol. 69, N. 11.-P. 6859-6864.

132. Refaeli Y., Levy D.N., and Weiner D.B. The glucocorticoid receptor type II complex is a target of the HIV-1 vpr gene product // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92.-P. 3621-3625.

133. Reynolds L., Ullman C., Moore M. et al. Repression of the HIV-1 5' LTR promoter and inhibition of HIV-1 replication by using engineered zinc-finger transcription factors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, N. 4. - P. 1615-1620.

134. Richter S., Ping Y.-H. and Rana T. M. TAR RNA loop: A scaffold for the assembly of a regulatory switch in HIV replication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99,N. 12.-P. 7928-7933.

135. Robertson D., Anderson J., Bradac J. et al. A reference guide to HIV-1 classification // HIV Sequence Database. Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. — 2000 (a).

136. Robertson D.L., Anderson J.P., Bradac J.A., et al. HIV-1 nomenclature proposal // Science. -2000. Vol. 288. - P.55-56 (b).

137. Rodenburg C.M., Li Y, Trask S.A. et al. Near full-length clones and reference sequences from subtype C isolates of HIV Type 1 from three different continents // AIDS Res. Hum. Retrovir. -2001. Vol. 17, N. 2. - P. 161-168.

138. Rodriguez M. A., Shen C., Ratner D. et al. Genetic and functional characterization of the LTR of HIV-1 subtypes A and C circulating in India // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2007. - Vol. 23, N. 11. - P. 1428-1433.

139. Rossi J.J., June C.H., Kohn D.B. Genetic therapies against HIV // Nat. Biotechnol. -2007. Vol. 25, N. 12. - P. 1444-1454.

140. Roux P., Alfieri C., Hrimech M., et al. Activation of transcription factors NF-kB and NF-IL-6 by human immunodeficiency virus type 1 protein R (Vpr) induces interleukin-8 expression // J. Virol. 2000. - Vol. 74, N. 10. - P. 4658-4665.

141. Roy S, Delling U, Chen CH, et al. A bulge structure in HIV-1 TAR RNA is required for Tat binding and Tat-mediated trans-activation// Genes Dev -1990. — Vol .4. — P.1365.

142. Ruben S, Perkins A, Purcell R, et al. Structural and functional characterization of human immunodeficiency virus tat protein // J. Virol. -1989. Vol. 63, N.l. -P. 1-8.

143. Russell R.S., Liang C. and Wainberg M.A. Is HIV-1 RNA dimerization a prerequisite for packaging? Yes, no, probably? // Retrovirology. 2004. - Vol. 1, N. 23. - P. 1-14.

144. Saag M.S., Hahn B.H., Gibbons J. et al. Extensive variation of HIV-1 in vivo // Nature. 1988. - Vol. 334, N. 6181. - P. 440-444.

145. Sato A, Igarashi H, Adachi A, et al. Identification and localization of vpr gene product of human immunodeficiency virus type 1// Virus Genes -1990. Vol.4. -P.303-312.

146. Sawaya B.E., Khalili K., Gordon J., Taube R. and Amini S. Cooperative interaction between HIV-1 regulatory proteins Tat and Vpr modulates transcription of the viral genome // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, N. 45 - P. 35209-35214.

147. Schwartz O., Marechal O., Danos O., et al. Human immunodeficiency virus type 1 Nef increases the efficiency of reverse transcriptation i the infected eel// J.Virol. -1995. Vol.69. -P.4053-4059.

148. Schwartz S, Felber BK, Fenyo EM, et al. Env and Vpu proteins of human immunodeficiency virus type 1 are produced from multiple bicistronic mRNAs// J Virol -1990. Vol.64. -P.5448-5456.

149. Simon F., Mauclure P., Roques P., et al. Identification of a new human immunodeficiency virus type 1 distinct from group M and group Oil Nature.-1998. -Vol.4. -P.1032-1037.

150. Simon J., Sheeny A., Carpenter E., et al. Mutational analyses of the human immunodeficiency virus type 1 Vif protein//J.Virol .-1999. Vol.73. -P.2675-2681.

151. Skowronski J, Parks D, Mariani R. Altered T cell activation and development in transgenic mice expressing the HIV-1 nef gene// EMBO J -1993. Vol.12. -P.703-713.

152. Skripkin E., Paillart J.-C., Marquet R. et al. Identification of the primary site of the human immunodeficiency virus type 1 RNA dimerization in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 4945^949.

153. Somasundaran M., Sharkey M., Brichacek B., et al. Evidence for a cytopathogenicity determinant in HIV-1 Vpr // PNAS. 2002. - Vol. 99, N. 14. - P. 9503-9508.

154. Soroka S.D., Granade T.C., Candal D. et al. Modification of Rapid Human Immunodeficiency Virus (HIV) Antibody Assay Protocols for Detecting Recent HIV Seroconversion // Clin Diagn Lab Immunol. 2005. - Vol. 12, N. 8 - P. 918-921.

155. Strebel K, Daugherty D, Clouse K, et al. The HIV 'A' (sor) gene product is essential for virus infectivity// Nature -1987. Vol.328. -P.728-730.

156. Sundquist W.I. and Heaphy S. Evidence for interstrand quadruplex formation in the dimerization of human immunodeficiency virus 1 genomic RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 3393-3397.

157. Tachiwana H., Shimura M., Nakai-Murakami C. et al. HIV-1 Vpr induces DNA double-strand breaks // Cancer Res. 2006. - Vol. 66, N. 2. - P. 627-631.

158. Temin HM. Retrovirus variation and reverse transcription: abnormal strand transfers result in retrovirus genetic variation//Proc.Natl.Acad.Sci.USA. -1993. Vol. 90. -P.6900-6903.

159. Thali M, Bukovsky A, Kondo E, et al. Functional association of cyclophilin A with HIV-1 virions//Nature -1994. Vol.372. -P.363-365.

160. Thomas H.I.J., Wilson S., O'Toole C.M. et al. Differential maturation of avidity of IgG antibodies to gp41, p24 and pi 7 following infection with HIV-1 // Clin Exp Immunol.-1996.-Vol. 103-P. 185-191.

161. Ulich C., Dunne A., Parry E., et al. Functional domains of tat required for efficient human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptoin// J.Virol. -1999. — Vol.73. -P.2499-2508.

162. UNAIDS/06.29R // Объединенная программа Организации Объединенных Наций по ВИЧ/СПИДу (ЮНЭЙДС). 2006. - ISBN 92 9 173545 0. - С. 1-94.

163. Van Lint С., Ann Amelia С., Emiliani S. et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity // J. Virol. 1997. - Vol. 71, N. 8. - P. 6113-6127.

164. Van Opijnen Т., Kamoschinski J., Jeeninga R. E., and Berkhout B. The Human immunodeficiency virus type 1 promoter contains a CATA box instead of a TATA Box for optimal transcription and replication // J. Virol. 2004. - Vol. 78, N. 13. - P. 6883-6890.

165. Varin A., Manna S. K., Quivy V. et al. Exogenous Nef protein activates NF-kB, AP-1, and c-Jun N-terminal kinase and stimulates HIV transcription in promonocytic cells // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, N. 4. - P. 2219-2227.

166. Ventura M, Wang P, Franck N, Saragosti S. Ribozyme targeting of HIV-1 LTR // Biochem Biophys Res Commun. 1994. - Vol. 203, N. 2. - P. 889-898.

167. Verhoef K., Sanders R. W., Fontaine V. et al. Evolution of the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat promoter by conversion of an NFkB enhancer into a GABP binding site // J. Virol. 1999. - Vol. 73, N. 2. - P. 1331— 1340.

168. Verhoef K., Tijms M. and Berkhout B. Optimal Tat-mediated activation of the HIV-1 LTR promoter requires a full-length TAR RNA hairpin // Nucleic Acids Res. 1997. -Vol. 25, N. 3 — P. 496-502.

169. Wain-Hobson S. The fastest genome evolution ever described: HIV variation in situ // Curr. Opin. Genet Dev. 1993. - Vol. 3, N. 6. - P. 878-883.

170. Wang X. The expanding role of mitochondria in apoptosis // Genes. Dev. 2001. -Vol. 15.-P. 2922-2933.

171. Weeks K.M., Ampe C., Schultz S.C., Steitz T.A., Crothers D.M. Fragments of the HIV-1 Tat protein specifically bind TAR RNA // Science. 1990. - Vol. 249, N. 4974.-P. 1281-1285.

172. Wei P, Garber ME, Fang SM, Fischer WH, Jones KA. A novel CDK9-associated C-type cyclin interacts directly with HIV-1 Tat and mediates its high-affinity, loop-specific binding to TAR RNA// Cell. 1998. - Vol.92. -P.451-62.

173. Wen W, Meinkoth JL, Tsien RY, et al. Identification of a signal for rapid export of proteins from the nucleus// Cell 1995. - Vol.82. -P.463-473.

174. Willey R.L., Maldarelli F., Martin M.A., et al. Human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein induces rapid degradation of CD4// J.Virol. 1992. - Vol.66. -P.7193-7200.

175. Wilson K.M., Johnson E.I.M., Croom H.A. et al. Incidence immunoassay for distinguishing recent from established HIV-1 infection in therapy-naive populations // AIDS. -2004. Vol. 18 - P. 2253-2259.

176. Zapp MJI, Green MR. Sequence-specific RNA binding by the HIV-1 Rev protein// Nature 1989. - Vol.342. -P.714-716.

177. Zapp MJI, Hope TJ, Parslow TG, et al. Oligomerization and RNA binding domains of the type 1 human immunodeficiency virus Rev protein: A dual function for an arginine-rich binding motif/ Proc Natl Acad Sei USA -1991. Vol .88. -P.7734-7738.

178. Zarudnaya M. I., Kolomiets I. M., Potyahaylo A. L. and Hovorun D. M. The primary and secondary structures of HIV-1 genomic RNA region encompassing DIS, SD and y hairpins: in silico study // ISBN: 1-59454-506-5. -2006. P. 159-189.

179. Zarudnaya M.I., Potyahaylo A.L., Kolomiets I.M. and Hovorun D.M. Auxiliary elements of mammalian pre-mRNAs polyadenylation signal. // Biopolimery i kletka. — 2002.-Vol. 18,N. 1. P. 500-517.

180. Zhang L., Huang Y., Yuan H. et al. Genotypic and phenotypic characterization of long terminal repeat sequences from long-term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection // J. Virol. 1997. - Vol. 71, N. 7. - P. 5608-5613.

181. Zhou C., Rana TM. A bimolecular mechanism of HIV-1 Tat protein interaction with RNA polymerase II transcription elongation complexes // J Mol Biol. 2002. — Vol. 320.-P.925-942.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Лаповок, Илья Андреевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Анализ полиморфизма неструктурных областей генома варианта ВИЧ-1, доминирующего в России - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы