Анализ дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс на разных стадиях онтогенеза

Балан, Ольга Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс на разных стадиях онтогенеза
ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Анализ дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс на разных стадиях онтогенеза"

На правах рукописи

БАЛ АН ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ in vitro САТЕЛЛИТНЫХ КЛЕТОК И МИОБЛАСТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ОНТОГЕНЕЗА

03.00.30 - биология развития, эмбриология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з о дп?2::э

Москва 2009

003468201

Работа выполнена в лаборатории биофизики развития Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

ОЗЕРНЮК Николай Дмитриевич,

кандидат биологических наук ВОРОТЕЛЯК Екатерина Андреевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

АЛЕКСАНДРОВА Мария Анатольевна

доктор биологических наук ДОРОНИН Юрий Константинович

Ведущая организация: кафедра гистологии и эмбриологии лечебного факультета ГОУ ВПО «Российского государственного медицинского университета» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Защита диссертации состоится «20» . мая . 2009 г.. в1400 . часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. Сайт: Jittp://idbras.comcor.ru/.; e-mail: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан « {В» CVYi \о2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук .ele0806@yandex.ru

Абрамова Е.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Изучение процессов роста, дифференцировки и восстановления мышечной ткани за счет стволовых клеток представляет собой одно из актуальных направлений современной биологии развития, молекулярной и клеточной биологии. В литературе имеются данные, что стволовые клетки скелетных мышц представляют собой гетерогенную популяцию, в которой имеется два типа клеток. Первый тип — сателлитные клетки, формирующие популяцию коммутированных клеток-предшественников миогенной линии дифференцировки (Zammit, Beauchamp, 2001; Charge, Rudnicki, 2004); второй -мультипотентные предшественники сателлитных клеток, которые и являются собственно стволовыми клетками мышц (Seale, Rudnicki, 2000). Однако большинство авторов придерживается общепризнанной точки зрения, согласно которой процессы роста и регенерации скелетных мышц обеспечиваются за счет популяции сателлитных клеток (Bailey et al., 2001; Seale et al., 2001; Zammit, Beauchamp, 2001; Charge, Rudnicki, 2004). Сателлитные клетки мышечной системы являются перспективной моделью для изучения клеточных и молекулярно-генетических механизмов пролиферации, дифференцировки, апоптоза и других процессов, протекающих в ходе развития мышц.

Исследования, которые проводятся в области биологии сателлитных клеток, направлены на изучение формирования их пула в период развития мышечной ткани в эмбриогенезе (Seale, Rudnicki, 2000; Gros et al., 2005), регуляции самообновления и поддержания пула этих клеток в ходе индивидуального развития, контроля процессов активации, пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток (Cooper et ai, 1999; Anderson, 2000; Shen et al., 2002; Hill et al., 2003; Charge, Rudnicki, 2004; Shinin et al., 2006).

Поскольку сателлитные клетки образуются в эмбриогенезе в период формирования мышечной ткани и функционируют на протяжении всего онтогенеза, важно выяснить, существуют ли различия между сателлитными клетками, выделенными из мышц в эмбриональный и постнатальный периоды развития. Существенным является вопрос о том, способны ли сателлитные клетки к самоподдержанию в культуре, полученной из мышц животных на разных этапах индивидуального развития. Терминальный этап дифференцировки сателлитных клеток in vltro, как и in vivo - синтез белков сократительного аппарата, прежде всего миозина. Несмотря на многочисленные исследования генов различных изоформ миозина in vivo, в литературе отсутствуют данные о специфичности экспрессии этих генов в ходе дифференцировки in vitro миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - сравнительное исследование процесса дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц крыс на разных этапах онтогенеза.

В работе предстояло решить следующие задачи:

1. Получить культуры клеток из мышц крыс на 20-21 сут эмбриогенеза,

3-5 сут постнатального развития, а также из мышц взрослых половозрелых крыс;

2. Охарактеризовать полученные культуры с использованием иммуноцитохимических и молекулярно-генетических маркеров;

3. Сравнить адгезивные свойства и темпы дифференцировки миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных этапах индивидуального развития;

4. Исследовать экспрессию гена Рах7 - основного транскрипционного фактора, ответственного за самообновление и поддержание пула сателлитных клеток;

5. Провести сравнительный анализ экспрессии генов-маркеров миогенной дифференцировки клеток-предшественников, полученных из мышц животных на разных этапах онтогенеза;

6. Проанализировать экспрессию различных изоформ тяжелых цепей миозина (эмбриональную, перинатальную, Р- и 2а) при дифференцировке сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые проведено комплексное исследование дифференцировки сателлитных клеток и миобластов (миогенных клеток-предшественников), выделенных из бедренных мышц на 20-21 сут эмбриогенеза (20-21Э), на 3-5 сут постнатального развития (3-5П) и взрослых крыс (3 мес). Показано, что полученные культуры способны к самоподдержанию in vitro, о чем свидетельствует постоянство экспрессии гена транскрипционного фактора Рах7. Впервые выявлены различия в адгезивных свойствах и темпах дифференцировки in vitro миогенных клеток-предшественников, изолированных из мышц животных на разных этапах индивидуального развития. Эти различия обусловлены, по-видимому, особенностями микроокружения, в котором данные клетки находятся in vivo. Впервые показана последовательная экспрессия генов, кодирующих эмбриональные, перинатальные, (3- и дефинитивные 2а тяжелые цепи миозина в ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников из мышц животных на разных этапах онтогенеза. Модифицирован метод получения культуры миогенных клеток-предшественников, позволивший повысить эффективность выделения сателлитных клеток.

Полученные результаты могут быть использованы при чтении курсов лекций по биологии развития, клеточной биологии и биологии стволовых клеток, а также учитываться при проведении биомедицинских исследований.

Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи решены с применением современных иммуноцитохимических и молекулярно-генетических методов. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на II Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007 г.); на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова (Москва, 2007 г.); на XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 2008 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 3, глава в коллективной монографии - 1, тезисов докладов и материалов конференций -3.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 130 страницах, содержит 33 рисунка, 7 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 152 цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Работа проводилась на клеточных культурах, которые содержали сателлитные клетки и одноядерные миобласты. Культуры клеток получали из бедренных мышц крыс на 20-21 сут эмбрионального развития (20-21Э), на 3-5 сут постнаталыюго развития (3-5П) и из мышц взрослых крыс (3 мес.) неинбредной линии Wistar.

Получение и культивирование клеток. Изолированную мышечную ткань измельчали и помещали в 0.2% раствор коллагеназы I типа (Worthington, США) на 20-40 мин при 37°С, затем последовательно центрифугировали. Конечный осадок, содержащий миогенные клетки-предшественники, ресуспендировали в 1 мл среды культивирования. Количество клеток подсчитывали с использованием камеры Горяева. Суспензию миогенных клеток-предшественников высевали в кулмуральные флаконы (Greiner, Германия) для выделения тотальной РНК (плотность посева 2 х 105 кл/мл) и в 12 или 24-луночные планшеты (Greiner) для иммуноцитохимического анализа (плотность посева 2 х 104 кл/мл). Культивировали клетки в среде F12 (HyClone, Великобритания) или DMEM (Sigma, США) с содержанием 10% эмбриональной телячьей сыворотки (БиоЛот, Россия), 2.0 мМ L-глютамина, 10 ед/мл пенициллина-стрептомицина и 10 мг/мл гентамицина. Смену среды проводили каждые 3-4 сут. После пассирования миогенные клетки-предшественники культивировали без добавления антибиотиков.

Гистологическое исследование. Для гистологического анализа применяли методику окрашивания клеток азур-эозином по Романовскому-Гимза. Клетки промывали раствором Хэнкса (БиоЛот), фиксировали 96% этиловым спиртом в течение 10-15 мин и окрашивали в течение 40-45 мин азур-эозином (ПанЭко), приготовленным на 0.1 M фосфатно-солевом буфере (PBS) pH 6.8 из расчета 1 : 20. Гистологическую реакцию анализировали с помощью светового микроскопа Olympus АН-3 (Австрия).

Приготовление криосрезов. Мышечную ткань фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на 0.1 M PBS (pH 7.4), в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем отмывали в 3 сменах 0.1 M PBS и последовательно выдерживали в 5%, 10% и 20% сахарозе. Замораживали при -70°С в смеси Tissue Тес О.С.Т. (Leica, Германия) и 0,1 M PBS с 20% сахарозой в соотношении 1 : 1. На криостате получали поперечные срезы толщиной 7-10 мкм. Перед инкубацией с антителами срезы отмывали в 0.1 M PBS (30 мин).

Иммуноцитохимический анализ. Для иммуноцитохимических исследований культуры клеток фиксировали 4% параформальдегидом. После 10 минутной фиксации клетки промывали PBS и пермабилизировали в 0.25%-ном растворе Triton Х-100 30 мин. Для уменьшения неспецифического связывания антител клетки инкубировали в блокирующем растворе 3% бычьего сывороточного альбумина (Sigma). Список использованных антител, фирм производителей и разведения представлены в таблице 1. После инкубации с первичными антителами клетки промывали PB S и наносили вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 488 или 546 (Molecular Probes, США). Для окрашивания ядер клеток использовали Hoechst 33342 (1 : 1000, Sigma) или йодистый пропидий (PI) (1 : 100, Sigma). При использовании PI клетки предварительно обрабатывали РНКазой. Готовые препараты заключали под покровные стекла в глицерин. Специфичность антител подтверждали в контрольных экспериментах. Для анализа полученных результатов использовали флуоресцентный микроскоп Leica DM RXA2 (Германия), оснащенный набором светофильтров и фотокамерой Olympus DP70. Обработку результатов проводили с использованием программы ImageJ.

Таблица 1. Антитела, используемые для иммуноцитохимии.

Антитела Фирма Разведение

Mouse monoclonal anti Рах7 R&D Systems, UK 1 : 50

Mouse monoclonal anti CD34 Santa Cruz, USA 1 :20

Mouse monoclonal anti CD45 BioLegend, USA 1 : 100

Mouse monoclonal anti Desmin Abeam, UK 1 : 25

Mouse monoclonal anti M-Cadherin Abeam, UK 1 : 50

Mouse monoclonal anti Myosin Slow Skeletal Abeam, UK 1 : 100

Mouse monoclonal anti Myosin Fast Skeletal Abeam, UK 1 : 150

Mouse monoclonal anti Ki67 Chemicon, USA 1 : 100

Выделение тотальной РНК и мРНК. Тотальную РНК (тотРНК) выделяли из культур миогенных клеток-предшественников на разных стадиях дифференцировки in vitro. Выделение тотРНК осуществляли с помощью TRI® Reagent (Sigma) согласно протоколу производителя. Из тотРНК выделяли мРНК с использованием магнитных частиц (Силекс, Россия) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Получение и нормировка кДНК библиотек. Синтез первой цепи кДНК проводили на мРНК с помощью фермента M-MLV обратной транскриптазы и олиго(дТ)]5 праймеров (Силекс). Для оценки уровня экспрессии исследуемого

гена кДНК были предварительно отнормированы по гену глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH). Нуклеотидная последовательность праймеров к GAPDH, размер ПЦР-фрагмента представлены в таблице 2.

Конструирование праймеров. При конструировании праймеров для ПЦР использовали компьютерную программу DNAStar. Информацию о структуре исследуемых генов получали из международной базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI BLAST, GeneBank, США). Для исключения возможности получения ПЦР-продукта на матрице хромосомной ДНК праймеры обычно конструировали по нуклеотидной последовательности разных экзонов. Нуклеотидные последовательности и размер ПЦР-фрагментов представлены в таблице 2.

Полимеразная цепная реакция. ПЦР со специфическими праймерами проводили на матрице кДНК с использованием ColoredTaq-полимеразы (Силекс) на амплификаторе Mastercycler (Eppendorf, Германия). ПЦР-продукты разделяли электрофоретически в 1.5%-ном агарозном геле (Amersco, США) с добавлением бромистого этидия (Sigma, США). Уровень экспрессии генов оценивали на УФ-анализаторе гелей с использованием программы Quantity One® (BIO RAD, США) .

Таблица 2. Праймеры для ПЦР-анализа

Ген Нуклеотидная последовательность праймера Размер ПЦР-фрагмента, н.п.

Рах7 5' cgggaccggctgctgaaggac 3' (экзон 3) 5' aagttggtggaagacggccc 3' (экзон 6) 464

MyoD 5' ggagacatcctcaagcgatgc 3' (экзон 3) 5' agcacctggtaaatcggattg 3' (экзон 3) 105

M-Cadherin 5' atgtgccacagccacatcg 3' (экзон 12) 5' gccatacatgtccgccagc 3' (экзон 13) 256

Эмбриональные ТЦМ 5'agaaggccaaaaaggccat 3' (экзон 37) 5' atgtggaaaggggttacgt 3' (экзон 42) 683

Перинатальные ТЦМ 5' agaaggccaagaaagccat 3' (экзон 34) 5' agtcagcagtgggagaaaag 3' (экзон 38) 660

гцмр 5' acagaggaagacaggaagaacctac 3' (экзон 36) 5' gggcttcacaggcatccttag 3' (экзон 38) 288

ТЦМ 2 а 5' tatcctcaggcttcaagatttg 3' (экзон 37) 5' taaatagaatcacatggggaca 3' (экзон 39) 310

GAPDH 5' tgcagtgccagcctcgtctcatag 3' (экзон 1) 5'cccttttggccccacccttcag 3' (экзон 1) 378

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка результатов, полученных на основе данных иммуноцитохимии, проводилась в программе MS Excel. При обработке результатов оценивали значение средней величины, стандартное отклонение. При оценке достоверности различий показателей использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически достоверными, если уровень значимости был р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поведение миогенных клеток-предшественников в культуре.

Поведение клеток в культуре во многом обусловлено микроокружением (нишей), из которого эти клетки были выделены. В связи с этим интересным представлялась сравнительная характеристика миогенных клеток-предшественников, изолированных из мышц животных на разных стадиях индивидуального развития. Для изучения поведения миогенных клеток-предшественников in vitro культуры клеток были получены из фетальных (20-21Э), неонатальных (3-5П) и мышц взрослых крыс. Для культивирования миогенных клеток использовали питательные среды: F12 с содержанием 10% ЭТС и 0.2 мМ Са2+ и F12 или DMEM с содержанием 10% ЭТС и 2.0 мМ Са2+.

Анализ первичных культур, проведенный на первом этапе исследований, позволил выявить различия в адгезивных свойствах миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза. Было показано, что миогенные клетки-предшественники, выделенные из бедренных мышц крыс 20-21Э, обладают более выраженными адгезивными свойствами по сравнению с клетками из мышц 3-5П и взрослых животных. В первичной культуре прикрепление и распластывание клеток, изолированных из мышц крыс 20-21Э, происходит в течение первых 24 часов культивирования, тогда как для клеток, полученных из мышц 3-5П и взрослых крыс, это время составляет 48-72 часа. Адгезивные свойства клеток не зависели от типа используемых сред. Гистологическое окрашивание клеточных культур азур-эозином после первых суток инкубации в ростовой среде показало, что полученные культуры содержали два морфологических типа клеток: вытянутые, характерной для миобластов биполярной веретеновидной формы и более округлые с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, свойственным, как правило, сателлитным клеткам (рис. 1). Подобные различия могут быть связаны с разной степенью зрелости клеток. Однако для идентификации и характеристики этих клеток необходимо применение комплексного подхода с использованием молекулярно-генетических и иммуноцитохимических методов. Следует отметить, что миогенные клетки-предшественники отличались не только по морфологическим критериям, но и по адгезивным свойствам. Так вытянутые клетки веретеновидной формы обладали более выраженными адгезивными свойствами по сравнению с клетками округлой формы. Время прикрепления к субстрату после пересева составляла 5-10 мин. На основании различных адгезивных свойств были получены культуры клеток, в которых преобладали более округлые клетки с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением.

Рис. 1. Культуры миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц 20-21Э (А), 3-5П (Б) и взрослых (В) крыс. Окраска азур-эозином. Ув. х20.

В культуре миогенные клетки-предшественники проходят те же этапы дифференцировки, что и in vivo в процессе роста и восстановления мышечной ткани: активация сателлитных клеток, формирование миобластов, их слияние с образованием многоядерных миотуб, характеризующихся в дальнейшем сократительной активностью.

При использовании среды F12 с содержанием 10% ЭТС и 0.2 мМ Са2+ отмечалась только пролиферация клеток без признаков миогенной дифференцировки. Культивирование миогенных клеток-предшественников в среде DMEM с содержанием 10% ЭТС и 2.0 мМ Са2+ приводило к слиянию одноядерных миобластов с образованием двуядерных клеток, а впоследствии многоядерных миотуб (рис. 2). При дальнейшем культивировании отмечалось ритмичное сокращение сформировавшихся миотуб, которое продолжалось в течение нескольких суток. Подобное явление было характерно как для культуры клеток из мышц 20-21Э, так и для культур клеток из мышц 3-5П и взрослых животных.

В дальнейших исследованиях среда F12 с содержанием 10% ЭТС и 0.2 мМ Са2+ была использована в качестве ростовой, а среда DMEM с содержанием 10% ЭТС и 2.0 мМ Са2+- дифференцировочной.

*i ч

„.а.

Рис. 2. Дифференцировка in vitro миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц 20-21Э (А, Г, Ж), 3-5П (Б, Д, 3) и взрослых (В, Е, И) животных.

А, Б, В - образование двуядерных миобластов (указаны стрелкой). Окраска азур-эозином. Ув. х 20.

Г, Д, Е - слияние миобластов с образованием З^Ф-ядерных миотуб. Прижизненная съемка. Ув. х20.

Ж, 3, И - формирование многочисленных многоядерных

миотуб. Прижизненная съемка. Ув. х4.

Иммуноцитохимическая характеристика культур сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц крыс на разных стадиях

онтогенеза.

Иммуноцитохимическое исследование проводили с использованием специфических антител против Рах7, CD34, CD45, десмина и м-кадгерина. Антитела к Рах7 и CD34 были выбраны для выявления сателлитных клеток. Мембранный белок CD34 также присутствует в сателлитных клетках (Beauchamp et al., 2000), однако отсутствует в миобластах и в терминально дифференцированных миофибриллах. Антитела к CD45 были использованы в качестве негативного контроля. Для идентификации одноядерных миобластов как пролиферирующих, так и вышедших из клеточного цикла и коммитированных к слиянию, были использованы антитела к цитоплазматическому белку промежуточных филаментов десмину и Са2+-связывающему мембранному белку м-кадгерину.

Иммуноцитохимический анализ свидетельствует о том, что полученные нами клеточные культуры гетерогенны по своему составу и включают две популяции клеток: сателлитные клетки и одноядерные миобласты (рис. 3). Сравнительная характеристика полученных культур клеток на основе иммуноцитохимического анализа показала, что количество сателлитных клеток в культуре из мышц 20-21Э, 3-5П и взрослых животных значительно не отличалось. Так, культура миогенных клеток-предшественников, выделенная из мышц 20-21Э, содержала в среднем 86 ± 2,3% сателлитных клеток, из мышц 3-5П - 88 ± 2,6%, из мышц взрослых животных - 84 ± 2,7%. Остальную часть клеток составляли одноядерные миобласты.

и.

Рис. 3. Содержание сателлитных клеток (А) и миобластов (Б) в культуре миогенных клеток-предшественников, выделенных из фетальных (1), неонатальных (2) и мышц взрослых животных (3)

Субпопуляцию сателлитных клеток идентифицировали по наличию транскрипционного фактора Рах7 и мембранного белка CD34. Данные по иммуноцихимическому выявлению Рах7, CD34 приведены на рисунках 4 и 5. Одноядерные миобласты выявляли по окрашиванию антителами к десмину и м-кадгерину (рис. 6).

Рал7 Ч ч.

ч » . « \ *ч

El 50 рт

CD34 Hoechat 33342 - V. 50 рт CD45 jWci>st*33342 ' . « / 50 рт

□

CD34 Hoechst 53342 i % » \ ^ V 50 рт CD45 ■ ^ 50 рт

CD34 Hoechst 33342 ^ 50 рт CD45 ! Hoechet^33342 • • • . • ' . * ^ 50 рт"

Рис. 4. Иммуноцитохимическое выявление транскрипционного фактора Рах7 (а, б, в) в сателлитных клетках в культуре миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц 20-21Э (а), 3-5П (б) и взрослых (в) животных. Ядра клеток окрашены Hoechst 33342 (а', б', в').

Рис. 5. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами против CD34 (а, б, в) и CD45 (а1, б', в') миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц крыс 20-21Э (а), 3-5П (б) и взрослых (в) животных. Ядра клеток окрашены Hoechst 33342.

Согласно данным литературы источником миофибрилл в культуре могут служить не только сателлитные клетки и миобласты, но и мышечные SP (side-рори1айоп)-клетки (Asakura et al., 2002; Bachrach et al., 2006; Gussoni et al., 1999), поэтому было важно оценить присутствие в культуре клеток этого типа. Миогенные SP-клетки выявляются по коэкспресски CD34 и CD45, а также по способности выводить витальные красители, в частности, Hoechst 33342. Отрицательная реакция при окрашивании антителами к CD45 свидетельствует о том, что культуры клеток-предшественников не содержали миогенных SP-клеток (рис. 5а', б', в').

Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров миогенных клеток-

предшественников.

Важной задачей настоящей работы был сравнительный анализ экспрессии ряда генетических маркеров сателлитных клеток и миобластов в культурах миогенных клеток-предшественников, полученных из мышц животных на разных стадиях индивидуального развития.

Исследование экспрессии гена Рах7 в культурах миогенных клеток-предшественников. Из данных литературы известно, что важную роль в процессе самообновления и поддержания пула сателлитных клеток in vivo играет транскрипционный фактор Рах7. В связи с этим представлялось интересным сравнительное исследование экспрессии гена Рах7 в культурах

миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных 20-21Э, 3-5П и взрослых крыс. Для изучения экспрессии гена Рах7 были получены кДНК-библиотеки, синтезированные на мРНК из миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц крыс на разных стадиях индивидуального развития. Для получения ПЦР-фрагментов были сконструированы пары праймеров по нуклеотидным последовательностям гена Рах7 крысы. Результаты ПЦР-анализа экспрессии Рах7 в культурах миогенных клеток-предшественников представлены на рисунке 6. Существенных различий в уровне экспрессии Рах7 в культурах клеток, полученных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, не наблюдается.

Рис. 6. ПЦР-анапиз экспрессии Рах7 в культурах миогенных клеток-предшественников, полученных из мышц крыс 20-21Э (1), 3-5П (2) и из мышц взрослых животных (3). кДНК отнормированы по GAPDH.

1 i J

Pax 7 464 нп-

GAPDH 378

Иммуноцитохимический анализ экспрессии десмина и м-кадгерина в культурах сателлитных клеток и миобластов.

Как было отмечено выше, исследуемые клеточные культуры были гетерогенны и помимо сателлитных клеток включали субпопуляцию одноядерных миобластов. Идентификацию миобластов проводили по экспрессии специфического маркера

десмина. Известно, что цитоплазматический белок десмин в процессе дифференцировки впервые появляется в одноядерных миобластах и детектируется практически на протяжении всего миогенеза вплоть до формирования многоядерных миофибрилл. Использование антител к этому белку позволило идентифицировать все миобласты, входящие в эту субпопуляцию: это и пролиферирующие клетки, и

• Desmin V\ . - . \ V • \ ' v.n 4 ' ~ 10(Hjm V4 - HtwrtlM * 1)ема is * • » • л » ; ' s

Ki67 \ \ J^J 100 pm K167 \ \ 100 ym

M-Cadherin '•/У 100 pm \ M-Cadherln 'A — I "0 lim

Рис. 7. Иммуноцитохимическое выявление десмина (а), Ki67 (б) и м-кадгерина (в) в миобластах в культуре миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц крыс 20-21Э. а', б', в' - совмещение изображений результата флуоресцентного мечения и ядер клеток, окрашенных Hoechst 33342.

миобласты вышедшие из клеточного цикла и готовые к слиянию. Пролиферативную активность клеток оценивали по наличию в ядрах специфического белка Ю67, который присутствует на всех стадиях клеточного цикла за исключением фазы во (стадия пролиферативного покоя). Результаты иммуноцитохимического окрашивания антителами к десмину, Кл67 и м-кадгерину представлены на рисунках 7, 8 и 9.

Субпопуляция одноядерных миобластов в составе гетерогенной клеточной культуры была представлена пролиферирующими К167(+) клетками и закончившими деление м-кадгерин(+) клетками. Следует отметить, что уровень экспрессии К167 и м-кадгерина в миобластах, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, существенно отличался. Так, субпопуляция миобластов культуры из мышц животных 20-21Э была представлена в основном м-кадгерин(+) миобластами, и только единичные клетки давали положительное окрашивание на антитела к Ю67 (рис. 7). В культуре из мышц крыс 3-5П и взрослых животных, наоборот, преобладали миобласты с иммунопозитивной реакцией на Кл67, а незначительное количество клеток экспрессировали м-кадгерин (рис. 8, 9).

Рис. 8. Иммуноцитохимическое выявление десмина (а), Ki67 (б) и м-кадгерина (в) в миобластах в культуре миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц крыс 3-5П. а', б', в' - совмещение изображений результата флуоресцентного мечения и ядер клеток, окрашенных Hoechst 33342.

Рис. 9. Иммуноцитохимическое выявление десмина (а), Ki67 (б) и м-кадгерина (в) в миобластах в культуре миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц взрослых крыс, а', б', в' - совмещение изображений результата флуоресцентного мечения и ядер клеток, окрашенных Hoechst 33342.

Была проведена также визуальная оценка распределения десмина, м-кадгерина и Кл67 в миобластах, вьщеленных из мышц 20-21Э, 3-5П и взрослых животных (табл. 3). Исследование распределения маркеров м-кадгерина и Кл67 выявило различия в культурах клеток, вьщеленных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза. В субпопуляции миобластов в культуре клеток-предшественников, полученных из мышц животных 20-21Э, в отличие от клеток из мышц 3-5П и взрослых крыс, преобладают миобласты, коммитированные к слиянию.

Таблица 3.

Визуальная оценка распределения некоторых маркеров в миобластах в культуре миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц 20-21Э, 3-5П и взрослых животных.

Маркеры Уровень экспрессии маркера в миобластах из мышц крыс

20-21Э 3-5П и взрослые

Десмин высокий высокий

Ki67 низкий высокий

М-кадгерин высокий низкий

Влияние Са2+ на дифференцировку сателлитных клеток и одноядерных миобластов in vitro.

Поскольку кальций играет важную роль во многих клеточных процессах, одной из задач нашего исследования было изучение влияния внеклеточного Са2+ на дифференцировку сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц новорожденных и взрослых крыс.

При культивировании миогенных клеток-предшественников, вьщеленных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, в течение 3, 5, 7, 10 и 14 сут в среде F12 с низкой концентрацией Са2+ (до 0.2 мМ) слияния миобластов не наблюдалось. Повышение концентрации Са2+ в среде культивирования до 1.25 мМ приводило к слиянию миобластов с образованием двуядерных клеток, в которых иммуноцитохимическим методом было показано наличие м-кадгерина, характерного для сливающихся миогенных клеток (табл. 4). Появление двуядерных миобластов, экспрессирующих мышечную форму кадгерина, отмечалось в культуре клеток, вьщеленных из мышц крыс 20-21Э, 3-5П и взрослых животных. Культивирование сателлитных клеток и миобластов в среде F12 или DMEM с концентрацией Са2+ 2.0 мМ приводило к активации сателлитных клеток с последующим их делением (рис. 11) и слиянию миобластов с образованием многоядерных миотуб. При дальнейшем культивировании клеток в указанных выше условиях отмечалось ритмичное сокращение сформировавшихся многоядерных миотуб.

Источником формирования многоядерных миотуб и миофибрилл служат, очевидно, не только одноядерные миобласты, входящие в состав исходной гетерогенной клеточной культуры, но и активирующиеся сателлитные клетки, дающие начало миобластам. Таким образом, только наличие в среде

культивирования 2.0 мМ Са2+ приводит к образованию миофибрилл, экспрессирующих миозин.

Таблица 4.

Влияние различной концентрации Са2+ в среде культивирования на дифференцировку миобластов, выделенных из мышц животных на разных стадиях индивидуального развития.

Сроки культивирования, сут Концентрация Ca + в среде культивирования

0.2 мМ 1.25 мМ 2.0 мМ

20-21Э 3-5П и взрослые 20-21Э 3-5П и взрослые 20-21Э 3-5П и взрослые

3 одноядерные клетки Одноядерные клетки Одноядерные клетки Двуядерные миобласты Одноядерные клетки

5 одноядерные клетки Двуядерные миобласты Одноядерные клетки Многоядерные миотубы Одноядерные клетки

7 одноядерные клетки Двуядерные миобласты Двуядерные миобласты Многоядерные миотубы Двуядерные миобласты

10 одноядерные клетки Двуядерные миобласты Двуядерные миобласты Многоядерные миотубы Многоядерные миотубы

Таким образом, при наличии всех факторов роста в среде культивирования низкая концентрация внеклеточного Са2+ (0.2 мМ) служит ингибитором не только слияния миобластов и последующего образования многоядерных миотуб, но и активации сателлитных клеток. Повышение концентрации внеклеточного Са2+ до 2.0 мМ (концентрация близкая к физиологической концентрации во внеклеточной среде in vivo) способствует активации Са^-зависимых белков, участвующих в запуске дифференцировки сателлитных клеток и миобластов.

Темпы дифференцировки сателлитных клеток и одноядерных миобластов in vitro.

Были изучены также темпы дифференцировки сателлитных клеток и одноядерных миобластов, выделенных из бедренных мышц животных на разных стадиях онтогенеза. Стадии дифференцировки клеток миогенного ряда определяли по экспрессии специфических маркеров, определяемых иммуноцитохимически. Темпы дифференцировки при культивировании этих клеток существенно отличаются. Если одноядерные клетки (сателлитные

АХ 1 ) 50 1 аШ а* AS

шш KÍ67 50 чт ЕВ

31 ?М

Рл\~7 KÍ67 50 рш —г, »>""

О J

Рис. 11. Иммуноцитохимическое выявление Рах7 (а, б, в) и Ki67 (а', б', в') в пролиферирующих сателлитных клетках. Клетки выделены из мышц крыс 20-21Э (ряд а), 3-5П (ряд б) и взрослых животных (ряд в). Ядра клеток окрашены Hoechst 33342 (а", б", в").

клетки и миобласты) из мышц крыс 20-21Э превращаются в двуядерные миобласты на третьи сутки культивирования, то из мышц 3-5П и взрослых животных - только на 7 сут. Формирование многоядерных миотуб происходило на 5 сут (20-21Э) и 10 сут (3-5П и взрослые) дифференцировки in vitro миогенных клеток-предшественников (табл. 4). При дальнейшем культивировании этих клеток наблюдалось активное сокращение миотуб, которое отмечалось на 6-7 сут (20-21Э) и 12-14 сут (3-5П и взрослые).

Таким образом, миогенные клетки-предшественники из скелетных мышц животных 20-21Э отличаются от клеток-предшественников из мышц 3-5П и взрослых крыс как в отношении адгезивных свойств, так и темпов миогенной дифференцировки в культуре.

Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров миогенных клеток-предшественников в ходе дифференцировки in vitro.

Исследование экспрессии гена Рах7 в процессе дифференцировки сателлитных клеток in vitro. Анализ экспрессии гена Рах7 проводили на разных этапах дифференцировки сателлитных клеток и одноядерных миобластов, выделенных из мышц крыс 20-21Э, 3-5П и взрослых животных. Согласно полученным данным, которые представлены на рисунке 12, экспрессия гена Рах7 не претерпевает заметных изменений при культивировании сателлитных клеток в среде дифференцировки.

культура клеток Pax 7 |

из мыши

животных 20-21Э GAPDH 1

культура клеток Pax 7 I

КЗ мыши

животных 3-8П GAPDH I

культура клеток Pax 7 I

из мыши взрослых

ЖИВОТНЫХ GAPDH 1

I 464 н.п. 378 н.п.

I 464 н.п.

Рис. 12. ПЦР-анализ экспрессии гена Рах7 в культурах миогенных клеток-предшественников на стадиях дифференцировки: 1 - одноядерные клетки, 2 - двуядерные миобласты, 3 -многоядерные миотубы, 4 -сокращающиеся миотубы. кДНК отнормированы по GAPDH.

Таким образом, в ходе дифференцировки сателлитных клеток, выделенных из мышц крыс на разных этапах индивидуального развития, экспрессия гена Рах7 существенно не изменяется, что может свидетельствовать о сохранении сателлитными клетками способности к самоподдержанию.

Анализ экспрессия гена MyoD в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов. При изучении особенностей дифференцировки сателлитных клеток и миобластов in vitro представлялось интересным анализ экспрессии MyoD - мастер-гена миогенной дифференцировки, одного из представителей транскрипционных факторов сем.

bHLH. Известно, что активация экспрессии этого гена приводит к запуску программы дифференцировки в сателлитных клетках.

С использованием ПЦР-анализа были выявлены транскрипты MyoD на всех этапах дифференцировки миогенных клеток-предшественников. Результаты ПЦР-анализа экспрессии MyoD представлены на рисунке 13. Наличие транскриптов MyoD на стадии одноядерных клеток (рис. 13, колонка 1) указывают на тот факт, что в культуре уже присутствии клетки, более продвинутые в направлении миогенной дифференцировки. При культивировании клеток-предшественников в среде дифференцировки наблюдается заметное увеличение уровня экспрессии гена MyoD. Повышение уровня экспрессии исследуемого гена свидетельствует о запуске программы миогенеза. Максимальный уровень его экспрессии детектировался на стадии образования двуядерных миобластов, а далее отмечалось незначительное снижение. Полученные результаты подтверждают данные литературы, согласно которым in vivo транскрипционный фактор, кодируемый геном MyoD, участвует в регуляции только первых этапов миогенеза: активации сателлитных клеток и образования миобластов.

Рис. 13. ПЦР-анализ экспрессии гена MyoD в культуре миогенных клеток-предшественников на стадиях дифференцировки:

1 - одноядерные клетки,

2 - двуядерные миобласты,

3 - многоядерные миотубы,

4 - сокращающиеся миотубы.

кДНК отнормированы по GAPDH.

Рис. 14. ПЦР-анализ экспрессии гена м-кадгерин в культуре миогенных клеток-предшественников на стадиях дифференцировки:

1 - одноядерные клетки,

2 -двуядерные миобластов,

3 -многоядерные миотубы,

4 - сокращающиеся миотубы.

кДНК отнормированы по GAPDH.

Анализ экспрессии гена, кодирующего м-кадгерин, в ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников. Для подтверждения данных иммуноцитохимического исследования м-кадгерина был проведен ПЦР-анализ экспрессии гена, кодирующего этот белок. Транскрипты гена м-кадгерина были выявлены уже на стадии одноядерных клеток (рис. 14, колонка

культура клеток MyoD 105

из жышц ____

животных 20-21Э GAPDH 378 шл.

культура клеток MyoD '»»

ИЗ МЫШЦ

животных 3-5П GAPDH ^Э^З^З^З 378

культура клеток MyoD И" Д105н.п.

нз мышц взрослых

gapdh ^э^э^э^а^-

культуре клеток М-кадгераН 2S6h.ii. нз мыта

животных 20-213 GAPDH 378 н.п.

культура клеток М-кадгеран 256 нз мышц

животных 3-5П GAPDH 378 н.п.

культура клеток м-кадгерин 2S6 из мышц взрослых

GAPDH 378

1), что свидетельствует о наличии в культуре миобластов, коммитированных к слиянию. Следует отметить, что уровень экспрессии исследуемого гена в культуре клеток из мышц животных 20-21Э был несколько выше, чем в культуре клеток из мышц 3-5П и взрослых крыс. Таким образом, данные ПЦР-анализа подтверждают результаты иммуноцитохимического исследования, согласно которым в культуре клеток из мышц животных 20-21Э в субпопуляции миобластов преобладали клетки, вышедшие из клеточного цикла и готовые к слиянию. В культуре клеток из мышц 3-5П и взрослых крыс субпопуляция миобластов представлена в основном пролиферирующими клетками. Транскрипты гена м-кадгерина были выявлены на всех этапах дифференцировки сателлитных клеток и миобластов (рис. 14, колонки 2, 3, 4). Использование ПЦР-анализа позволило выявить различия в уровне экспрессии м-кадгерина. В ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников наблюдается заметное увеличение уровня экспрессии исследуемого гена. Максимальный уровень экспрессии м-кадгерина детектировался на стадии образования двуядерных миобластов, когда наблюдается активное слияние клеток. Начиная со стадии формирования многоядерных миотуб наблюдалось незначительное снижение уровня экспрессии этого гена.

Исследование экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов in vitro.

Поскольку основу миофибриллярного аппарата составляют сократительные белки, в частности миозин, исследованию экспрессии генов, кодирующих тяжелые и легкие цепи миозина, посвящено немало работ. Однако, данные представленные в литературе достаточно противоречивы. Поэтому следующий этап нашего исследования был связан с изучением особенностей экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина (ТЦМ) в ходе миогенеза in vitro.

Иммуноцитохимический анализ экспрессии медленной и быстрых изоформ ТЦМ. Использование специфических антител к ТЦМ позволило выявить наличие соответствующего белка на ранних этапах дифференцировки -в одноядерных миобластах до момента их слияния с последующим образованием многоядерных миотуб (рис. 15), что согласуется с данными, представленными в литературе. Медленная изоформа ТЦМ выявлялась в одноядерных миобластах на 4 сут дифференцировки миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц крыс 20-21Э (рис. 15а). В культуре клеток-предшественников из мышц 3-5П и взрослых животных медленная изоформа ТЦМ также была обнаружена в одноядерных миобластах, но на 5 сут инкубации в дифференцировочной среде (рис. 15а', а").

Рис. 15. Иммуноцитохимическое выявление медленных ТЦМ на разных стадиях дифференцировки сателлитных клеток и миобластов, полученных из мышц 20-21Э (а, б, в), 3-5П (а', б', в') и взрослых животных (а", б", в"). Одноядерные (ряд а), двуядерные (ряд б) миобласты (обозначены стрелками) и многоядерные миотубы (ряд в). Ядра клеток окрашены Hoechst 33342.

В дальнейшем экспрессия этой изоформы ТЦМ выявлялась также на стадии двуядерных миобластов (рис. 15, ряд б) и на стадии многоядерных миотуб (рис. 15, ряд в). Следует отметить, что локализация миозина в одноядерных миобластах отличалась от локализации этого белка в многоядерных миотубах. В одноядерных миобластах ТЦМ, по-видимому, еще не собраны в пучки миофиламентов, как это происходит в дефинитивных миофибриллах.

При окрашивании антителами к изоформам ТЦМ, характерным для быстрых мышечных волокон, иммунопозитивная реакция выявлялась только в сокращающихся многоядерных миотубах. Подобное явление наблюдалось в культуре клеток-предшественников, выделенных из мышц 20-21Э (6-7 сут дифференцировки) и из мышц 3-5П и взрослых животных (12-14 сут дифференцировки). Метод двойного иммунофлуоресцентного мечения позволил выявить колокализацию медленной и быстрых изоформ ТЦМ в сокращающихся миотубах (рис. 16) и отсутствие быстрых изоформ миозина в миотубах, не обладающих сократительной активностью, что соответствует данным, полученным с использованием ПЦР-анализа. Описанное явление в равной степени характерно как для культуры клеток, полученных из мышц крыс 20-21Э, так и для культуры клеток из мышц 3-5П и взрослых животных.

медленные ТЦМ быстрые ТЦМ

И 100 рт W 100 рт

в быстрые ТЦМ

1 ГУ 50 um

Рис. 16. Иммуиоцитохимическое окрашивание многоядерных миотуб антителами к медленным (а, б, в) и быстрым (а', б', в') ТЦМ. Многоядерные миотубы сформированы из миогенных клеток-предшественников, полученных из мышц 20-21Э (ряд а), 3-5П (ряд б) и взрослых животных (ряд в). Ядра клеток окрашены Hoechst 33342.

Для подтверждения данных иммуноцитохимического исследования, а также для выявления специфичности экспрессии генов, кодирующих различные изоформы ТЦМ в процессе дифференцировки миогенных клеток-предшественников, был проведен ПЦР.

Анализ экспрессии эмбриональной изоформы ТЦМ. Экспрессия гена эмбрионального миозина была выявлена в культуре клеток-предшественников из мышц крыс 20-21Э уже на 3 сут дифференцировки (рис. 17А), что согласуется с данными литературы об экспрессии этой изоформы ТЦМ в клетках, выделенных из мышц животных в эмбриональный период развития. Однако впервые транскрипты гена эмбриональной формы миозина были обнаружены и в культуре миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных 3-5П (рис. 16Б) и взрослых (рис. 16В). Ранее рядом авторов было показано наличие этой изоформы миозина только в многоядерных миотубах, которые были сформированы из клеток-предшественников, выделенных из мышц животных в эмбриональный период развития.

Экспрессия гена, кодирующего эмбриональную изоформу ТЦМ, в культуре клеток из мышц 3-5П и взрослых животных начинается позднее (4 сут дифференцировки), чем в клетках, полученных из фетальных мышц. Максимальный уровень экспрессии гена эмбрионального миозина выявлялся на 5 сут (20-21Э) и 10 сут (3-5П и взрослые) культивирования, которые

соответствуют образованию многоядерных миотуб. На 14 сут дифференцировки экспрессия исследуемого гена ТЦМ незначительно снижается, как в культуре клеток из мышц крыс 20-21Э, так и в культуре клеток из мышц 3-5П и взрослых животных.

А А

Рис. 17. ПЦР-анализ уровня экспрессии гена эмбриональных ТЦМ на разных стадиях дифференцировки в культуре клеток, полученных из мышц 20-21Э (А), 3-5П (Б) и взрослых животных (В). кДНК отнормированы по САРИН.

Рис. 18. Оценка уровня экспрессии гена перинатальных ТЦМ на разных стадиях дифференцировки в культуре клеток, полученных из мышц 20-21Э (А), 3-5П (Б) и взрослых животных (В). кДНК отнормированы по САРБН.

Экспрессия перинатальной изоформы ТЦМ. Использование ПЦР-анализа впервые позволило обнаружить не только транскрипты эмбриональной, но и перинатальной формы миозина в культуре клеток-предшественников, выделенных из мышц 20-21Э, 3-5П и взрослых животных (рис. 18). Экспрессия гена перинатального ТЦМ выявлялась в миогенных клетках-предшественниках, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, на 4 сут культивирования в дифференцировочной среде. Характер экспрессии гена перинатального ТЦМ отличался от экспрессии эмбрионального миозина. На протяжении всего процесса дифференцировки, от стадии одноядерных клеток до стадии активного сокращения сформировавшихся многоядерных миотуб, наблюдалось постепенное повышение уровня экспрессии гена перинатального миозина.

Анализ экспрессии ТЦМ-/}. С использованием специфических праймеров было выявлено наличие транскриптов гена /¡-миозина в культурах сателлитных клеток и одноядерных миобластов, полученных из мышц крыс на разных этапах индивидуального развития (рис. 19). Следует отметить, что экспрессия (¡-миозина, также как и перинатальной изоформы ТЦМ, выявлялась на 4 сут дифференцировки миогенных клеток-предшественников.

Таким образом, результаты исследования экспрессии эмбриональной, перинатальной и (3- изоформ тяжелых цепей миозина, полученные с использованием ПЦР, согласуются с данными иммуноцитохимического анализа.

тцм j¡ GAPDH

^ 3 от 4 сут 5 cyr 7 cyr 14 CYT

310 Н.П.

Рис. 19. ПЦР-анализ уровня экспрессии гена Рис. 20. ПЦР-анализ уровня экспрессии гена ТЦМ р на разных стадиях дифферснцировки ТЦМ 2а на разных стадиях диффсренцировки в культуре клеток, полученных из мышц 20- в культуре клеток, полученных из мышц 20-

21Э (А), 3-5П (Б) и взрослых животных (В). кДНК отнормированы по GAPDH.

Исследование экспрессии гена, кодирующего ТЦМ 2а. Известно, что существует три изоформы ТЦМ, характерные для дефинитивных быстрых мышечных волокон: 2а, 2в и 2х. Исследование экспрессии быстрых ТЦМ с использованием ПЦР-анализа выявило наличие транскриптов миозина 2а в миогенных клетках-предшественниках, выделенных из мышц 20-21Э, 3-5П и взрослые животных (рис. 20). Экспрессия миозина 2а впервые детектировалась на этапе активного сокращения сформировавшихся многоядерных миотуб (7 и 14 сут дифференцировки).

Полученные результаты ПЦР-анализа экспрессии эмбриональной, перинатальной, (3- и 2а изоформ миозина в ходе дифференцировки клеток-предшественников in vitro соответствуют данным литературы об особенностях экспрессии этих генов в период эмбрионального миогенеза. На основе полученных данных можно предположить, что при дифференцировке клеток-предшественников в ходе регенерации мышечной ткани характер экспрессии изоформ миозина будет сходным с отмеченной выше последовательностью экспрессии отдельных ТЦМ.

Таким образом, анализ дифференцировки in vitro миогенных клеток-предшественников, полученных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, выявил ряд отличий (особенности клеточного состава, экспрессия миогенных маркеров, адгезивные свойства, темпы дифференцировки, в том числе экспрессия различных изоформ миозинов), которые могут быть обусловлены спецификой их микроокружения в условиях in vivo.

выводы

1. В ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников (сателлитных клеток и одноядерных миобластов), выделенных из мышц животных на 20-21 сут эмбриогенеза, 3-5 сут постнаталыюго развития, а также из мышц взрослых крыс, экспрессия гена специфического транскрипционного фактора Рах7 не изменяется, что свидетельствует о сохранении сателлитными клетками способности к самоподдержаншо.

2. Впервые установлено, что уровень экспрессия генов MyoD и м-кадгерина в культуре клеток-предшественников, полученных из мышц животных на 20-21 сут эмбриогенеза, выше по сравнению с клетками, выделенными из мышц на 3-5 сут постнатального развития, а также из мышц взрослых крыс, что свидетельствует о преобладании в субпопуляции миобластов из фетальных мышц клеток, коммитированных к дифференцировке.

3. Обнаружено, что клетки-предшественники, изолированные из мышц животных на 20-21 сут эмбриогенеза, характеризуются более выраженными адгезивными свойствами и более высоким темпом дифференцировки по сравнению с клетками, полученными из мышц животных на 3-5 сут постнатального развития и мышц взрослых крыс.

4. Показано, что в культуре клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, повышение концентрации Са2+ (до 2.0 мМ) в среде культивирования приводит к активации сателлитных клеток, слиянию миобластов и последующему образованию многоядерных сокращающихся миотуб.

5. Впервые в ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников, изолированных из фетальных, неонатальных и мышц взрослых животных, выявлена специфичность экспрессии генов ТЦМ, кодирующих четыре изоформы: эмбриональную, перинатальную, (3- и 2а миозин.

Работа выполнена при поддержке Программ Президиума РАН: «Молекулярная и клеточная биология» и «Биоразнообразие и динамика генофондов».

Список работ опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах соответствующих Перечню ВАК:

1. Озернюк Н.Д., Балан О.В. Сателлитные клетки мышечной системы и регуляция восстановительного потенциала мышц // Известия РАН. Серия биологическая. 2007. № 6. С. 650-660.

2. Балан О.В., Воротеляк Е.А., Смирнова Т.Д., Озернюк Н.Д. Особенности сателлитных клеток и миобластов на разных стадиях онтогенеза крыс // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. № 2. С. 151-155.

3. Балан О.В., Мюге Н.С., Озернюк Н.Д. Анализ экспрессии тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс // Известия РАН. Серия биологическая. 2009. №3. С. 261-268.

Глава в коллективной монографии:

1. Озернюк Н.Д., Балан О.В. Биология сателлитных клеток мышц и механизмы восстановления мышечной системы // Биология стволовых клеток и клеточные технологии / Под ред. Пальцева М.А. М.: Медицина, Шико. 2009. Т.2. С. 36-52.

Тезисы конференций:

1. Балан О.В. Анализ дифференцировки сателлитных клеток из мышц крыс разного возраста. // Цитология. Тезисы докладов II Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. 2007. №49(9). С 713-714.

2. Балан О.В. Дифференцировка сателлитных клеток и миобластов в культуре. Анализ экспрессии миогенных маркеров. // Онтогенез. Тезисы докладов конференции молодых ученых ИБР РАН. 2008. №39(4). С. 309-310.

3. Балан О.В. Исследование экспрессии тяжелых цепей миозина в дифференцирующихся сателлитных клетках и миобластах из скелетных мышц зародышей и новорожденных крыс. // XV школа «Актуальные проблемы биологии развития». Звенигород 19-24 октября 2008. Сборник тезисов. С. 10-12.

Заказ № 97/04/09 Подписано в печать 17.04.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,3

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 ,1 ч-- I, \vviw. с(г. ги; е-таИ: т/о@с/г. т

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Балан, Ольга Викторовна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Сателлитные клетки как тканеспецифические стволовые клетки взрослого организма.

1.1.1. Идентификация сателлитных клеток и. их концентрация в мышцах.

1.1.2. Формирование пула сателлитных клеток.

1.1.3. Роль генов семейства Pax.

1.1.4. Альтернативные гипотезы происхождения мышечных сателлитных клеток в эмбриогенезе.

1.2. Дифференцировка сателлитных клеток.

1.2.1. Активация и асимметричное деление сателлитных клеток.

Роль белкового фактора Numb.

1.2.2. Роль факторов роста в процессе активации, пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток.

1.2.3. Слияние миобластов и формирование многоядерных миотуб.

Роль генов семейства bHLH в регуляции миогенеза.

1.2.4. Экспрессия мышечных генов и синтез структурных белков мышц в ходе миогенеза.

1.2. Сходство и различия миогенеза в эмбриональном развитии и при активации сателлитных клеток.

1.4. Роль Са в процессе дифференцировки. сателлитных клеток и миобластов.

1.5. Использование клеточных культур для изучения процессов миогенеза in vitro.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Объект исследования.

2.2. Получение и культивирование клеток.

2.3. Гистологическое окрашивание.

2.4. Приготовление криостатных срезов.

2.5. Иммуноцитохимический анализ.

2.6. Выделение тотальной РНК.

2.7. Определение концентрации тотРНК в пробе.

2.8. Выделение мРНК.

2.8 Синтез кДНК.

2.9. Конструирование праймеров.

2.10. Нормировка кДНК библиотек.

2.11. Полимеразная цепная реакция.

2.12. Выделение ДНК из агарозного геля.

2.13. Секвенирование.

2.14. Подсчет количества сателлитных клеток и миобластов. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Результаты исследований.

3.1. Поведение миогенных клеток-предшественников. в культуре.

3.2. Иммуиоцитохимическая характеристика культур миогенных клеток-предшеств енников, выделенных из мышц крыс па разных стадиях онтогенеза.

3.3. Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров. миогенных клеток-предшественников.

3.3.1. Исследование экспрессии гена Рах7.

3.3.2. Иммуноцитохимический анализ экспрессии. десмина и м-кадгерина.

3.4. Влияние Са2+ на дифференцировку сателлитных клеток и одноядерных миобластов in vitro.

3.5. Темпы дифференцировки миогенных клеток-предшествеников in vitro.

3.5. Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров миогенных клеток-предшественников в ходе дифференцировки.

3.5.1. Исследование экспрессии гена Рах7 в процессе дифференцировки сателлитных клеток in vitro.

3.5.2. Анализ экспрессия гена MyoD в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов.

3.5.3 Анализ экспрессии гена, кодирующего м-кадгерин, в ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников.

3.6. Исследование экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов in vitro.

3.6.1. Иммуноцитохимический анализ экспрессии медленной и быстрых изоформ ТЦМ.

3.6.2. Анализ экспрессии эмбриональной изоформы ТЦМ.

3.6.3. Экспрессия перинатальной изоформы ТЦМ.:.

3.8.3. Анализ экспрессии изоформы (3 ТЦМ.

3.8.4. Исследование экспрессии гена, кодирующего ТЦМ 2а.

Глава 4. Обсуждение результатов.

4.1. Сравнительная характеристика культур миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза.

4.1.1. Адгезивные свойства миогенных клеток-предшественников.

4.1.1. Экспрессия генов маркеров миогенных клеток-предшественников.

4.2. Влияние С а" на дифференцировку сателлитных клеток и одноядерных миобластов in vitro.

4.3. Темпы дифференцировки сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс на разных стадиях онтогенеза.

4.5. Особенности экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки миогенных клеток-предшественников in vitro.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс на разных стадиях онтогенеза"

Изучение процессов роста, дифференцировки и восстановления мышечной ткани за счет стволовых клеток представляет собой одно из актуальных направлений современной биологии развития, молекулярной и клеточной биологии. В литературе имеются данные, что стволовые клетки скелетных мышц представляют собой гетерогенную популяцию, в которой имеется два типа клеток. Первый тип — сателлитные клетки, формирующие популяцию коммитированных клеток-предшественников миогенной линии дифференцировкн (Zammit, Beauchamp, 2001; Charge, Rudnicki, 2004); второй - мультипотентные предшественники сателлитных клеток, которые и являются собственно стволовыми клетками мышц (Seale, Rudnicki, 2000). Однако большинство авторов придерживается общепризнанной точки зрения, согласно которой процессы роста и регенерации скелетных мышц обеспечиваются за счет популяции сателлитных клеток (Bailey et al., 2001; Seale et al., 2001; Zammit, Beauchamp, 2001; Charge, Rudnicki, 2004). Сателлитные клетки мышечной системы являются перспективной моделью для изучения клеточных и молекулярно-генетических механизмов пролиферации, дифференцировки, апоптоза и других процессов, протекающих в ходе развития мышц.

Исследования, которые проводятся в области биологии сателлитных клеток, направлены на изучение формирования их пула в период развития мышечной ткани в эмбриогенезе (Seale, Rudnicki, 2000; Gros et al., 2005), регуляции самообновления и поддержания пула этих клеток в ходе индивидуального развития, контроля процессов активации, пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток (Cooper et al., 1999; Anderson, 2000; Shen et al., 2002; Hill et al., 2003; Charge, Rudnicki, 2004; Shinin et al, 2006).

Поскольку сателлитные клетки образуются в эмбриогенезе в период формирования мышечной ткани и функционируют на протяжении всего онтогенеза, важно выяснить, существуют ли различия между сателлнтными клетками, выделенными из мышц в эмбриональный и постнатальный периоды развития. Существенным является вопрос о том, способны ли сателлитные клетки к самоподдержанию в культуре, полученной из мышц животных на разных этапах индивидуального развития. Терминальный этап днфференцировкп сателлитных клеток in vitro, как и in vivo - синтез белков сократительного аппарата, прежде всего миозина. Несмотря на многочисленные исследования генов различных изоформ миозина in vivo, в литературе отсутствуют данные о специфичности экспрессии этих генов в ходе дифференцировки in vitro миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза.

Цель настоящей диссертационной работы - сравнительное исследование процесса дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц крыс на разных этапах онтогенеза.

В работе предстояло решить следующие задачи:

1. Получить культуры клеток из мышц крыс на 20-21 сут эмбриогенеза, 3-5 сут постнатального развития, а также из мышц взрослых половозрелых крыс;

2. Охарактеризовать полученные культуры с использованием нммуноцитохимических и молекулярно-генетических маркеров;

6. Проанализировать экспрессию различных изоформ тяжелых цепей миозина (эмбриональную, перинатальную, р- и 2а) при дифференцировке сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза.

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Балан, Ольга Викторовна

Выводы

1. В ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников (сателлитных клеток и одноядерных миобластов), выделенных из мышц животных на 20-21 сут эмбриогенеза, 3-5 сут постнатального развития, а также из мышц взрослых крыс, экспрессия гена специфического транскрипционного фактора Рах7 не изменяется, что свидетельствует о сохранении сателлитными клетками способности к самоподдержанию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Балан, Ольга Викторовна, Москва

1. Балан О.В, Воротеляк Е.А., Смирнова Т.Д. и др. Особенности сателлитных клеток и миобластов на разных стадиях онтогенеза крыс // Изв. РАН Серия биол. 2008. №2. С. 151- 159.

2. Казанская О.В., Палъмбах Л.Р., Озернюк Н.Д. Развитие скелетной мускулатуры у карповых рыб // Журн. общей биологии. 1986. Том XLVII. №5. С. 656- 666.

3. Озернюк Н.Д. Регуляция миогенеза // Изв. РАН. Сер. биол. 1998. №3. С. 330-343.

4. Озернюк Н.Д. Сравнительные особенности миогенеза у беспозвоночных, низших и высших позвоночных животных // Онтогенез. 2004. Т. 35. № 6. С. 441-450.

5. Озернюк Н.Д., Балан О.В. Сателлитные клетки мышечной системы и регуляция восстановительного потенциала мышц // Изв. РАН. Серия биол. 2007. №6. С. 650- 660.

6. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Поляризация и асимметричное деление стволовых клеток // Цитология. 2007. Т. 49. № 11. С. 933.

7. Allen R.E., Sheehan S.M., Taylor R.G. et al. Hepatocyte growth factor activates quiescent skeletal muscle satellite cells in vitro // J. Cell. Physiol. 1995. V. 165. P. 307-312.

8. Anderson J.E. A role for nitric oxide in muscle repair: nitric oxide-mediated activation of muscle satellite cells // Mol. Biol. Cell. 2000. V. 11. P. 1859-1874.

9. Armand O., Boutineau A.M., Mauger A. et al. Origin of satellite cells in avian skeletal muscles // Arch. Anat. Microsc. Morphol. Exp. 1983. V. 72. P. 163-181.

10. Asakura A., Komaki M., Rudnicki M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation // Differentiation. 2001. V. 68. P. 245-253.

11. Avery G., Chow M., Holitzer H. An expressional analysis of the development of the spinal column // J. Exp. Zool. 1956. V. 132. P. 409.

12. Bailey P., Holowaez Т., Lassar A.B. The origin of skeletal muscle satellite cells // Current opinion in cell biology. 2001. V. 13. P.679.689.

13. Bark Т.Н., McNurlan M.A., Lang C.H., Garlick P.J. Increased protein synthesis after acute 1GF-1 or insulin infusion is localized to muscle in mice // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 1998. V. 275. P.1. El 18-E123.

14. Barton P., Buckingham M.E. The myosin alkali light chain proteins and their genes // Biochem. J. 1985. V. 231. P. 249.

15. Barton P.J.R., Robert В., Fiszman M.Y. et al. The same myosin alkali light chain is expressed in adult cardiac atria and in fetal skeletal muscle // J. Muscle Res. Cell Motil. 1985. V. 6. P. 461.

16. Barton-Davis E.R., Shoturma D.I., Sweeney H.L. Contribution of satellite cells to IGF-I induced hypertrophy of skeletal muscle // Acta Physiol. Scand. 1999. V. 167. P. 301-305.

17. Beauchamp J.R., Heslop L., Yu D.S. et al. Expression of CD-34 and Myf-5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. // J. Cell Biol. 2000. V. 151. P. 1221-1234.

18. Bischojf R. The satellite cell and muscle regeneration // Myogenesis Eds. Engel A.G., Franszini-Armstrong C. N. Y. McGraw-Hill. 1994. V. 2. P. 97-118.

19. Bittner R.E., Schofer С., Weipoltshammer К. Recruitment of bone-marrow-derived cells by skeletal and cardiac muscle in adult dystrophic mdx mice // Anat. Embryol. 1999. V. 199. P. 391-396

20. Bober E., Brand-Soberi В., Ebensperger C. et al. Initial steps of myogenesis in somites are independent of influence from axial structures //Development. 1994. V. 120. P. 3073-3082.

21. Bockhold K.J., Rosenblatt J.D., Partridge T.A. Aging normal and dystrophic mouse muscle: analysis of myogenicity in cultures of living single fibers // Muscle Nerve. 1998. V. 21. P. 173-183.

22. Braun Т., Buschhausen D.C., Bober E. et al. A novel human muscle factor related to but distinct from MyoDl induces myogenic conversionin 10T1/2 fibroblasts // EMBO J. 1989. V. 8. P. 701.

23. Braun Т., Bober E., Winter В., et al. Myf-6, a new member of the human gene family of myogenic determination factors: evidence for a gene cluster on chromosome 12 // EMBO J. 1990. V. 9. P. 821.

24. Buckingham M. Myogenic progenitor cells and skeletal myogenesis in vertebrates // Curr. Opin. Genet. Dev. 2006. V. 16. P. 525-532.

25. Buckingham M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes // C.R. Biologies. 2007. V. 330. P. 530-533.

26. Buckingham M., Relaix F. The Role of Pax Genes in the Development of Tissues and Organs: РахЗ and Pax7 Regulate Muscle Progenitor Cell Functions // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007. V. 23. P. 645-73.

27. Burkin D.J., Kaufman S.J. The alfa7betal integrin in muscle development and disease // Cell Tissue Res. 1999. V. 296. P. 183190.

28. Butler-Browne G.S., Bugaislcy L.B., Schwartz K. et al. Denervation of newborn rat does not block the appearance of adult fast myosin heavy chain//Nature. 1982. V. 299. P. 830-833.

29. Cantini M., Sartore S., Schiqffino S. Myosin types in cultured muscle // J. Cell. Biol. 1980. V. 85. P. 903-909.

30. Charge S.B.P., Rudnicki MA. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration // Physiol. Rev. 2004. V. 84. P. 209-238.

31. Charge S.B., Brack A.S., Hughes S.M. Aging-related satellite cell differentiation defect occurs prematurely after Ski-induced muscle hypertrophy // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2002. V. 283. P. C1228-C1241.

32. Chenn A., McConnell S.K. Cleavage orientation and asymmetric inheritance of Notch 1 immunoreactivity in mammalian neurogenesis //Cell. 1995. V. 82. P. 1111-1115.

33. Chen C.J., Chin J.E., TJeda K. et al. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdrl (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells // Cell. 1986. V. 47. P. 381-389.

34. Christ В., Brand-Saberi В., Grim M., Wilting J. Local signaling in dermomyotomal cell type specification // Anat. Embryol. 1992. V. 186. P. 505.

35. Conboy I.M., Rando T.A. The regulation of Notch signaling controls cell activation cell fate determination in postnatal myogenesis // Dev. Cell. 2002. V. 3.P. 380-392.

36. Cooper R.N., Tajbakhsh S., Mouly V. et al. In vivo satellite cell activation via Myf5 and MyoD in regenerating mouse skeletal muscle //J. Cell Sci. 1999. V. 112. P. 2895-2901.

37. Cornelison D.D. W., Wold B.J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells // Dev. Biol. 1997. V. 191. P. 270-283.

38. Cornelison D.D., Olwin B.B., Rudnicki M.A., Wold B.J. MyoD(-/~) satellite cells in single-fiber culture are differentiation defective and MRF4 deficient // Dev. Biol. 2000. V. 224. P. 122-137.

39. Cornelison D.D., Filla M.S., Stanley H.M. et al. Syndecan-3 and syndecan-4 specifically mark skeletal muscle satellite cells and are implicated in satellite cell maintenance and muscle regeneration // Dev. Biol. 2001. V. 239. P. 79-94.

40. Covault J and Sanes JR. Distribution of N-CAM in synaptic and extrasynaptic portion of developing and adult skeletal muscle // J. Cell Biol. 1986. V. 102. P. 716-730.

41. Crow M.T., Olson P.S., Stockdale F.E. Myosin light chain expression during avian muscle development// J. Cell. Biol. 1983. V. 96. P. 736.

42. Davis R. L., Weintraub H., Lassar A.B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts // Cell. 1987. V. 51. P. 987.

43. Day K., Shefer G., Richardson J.В., Enikolopov G., Yablonka-Reuveni Z.

44. Nestin-GFP reporter expression defines the quiescent state of skeletal muscle satellite cells // Dev Biol. 2007 V. 304. P. 246-259.

45. Delapeyriere O., Ollendorff V., Planche J. et al. Expression of the Fgf6 gene is restricted to developing skeletal muscle in the mouse embryo // Development. 1993. V. 118. P. 601-611.

46. Donalies M., Cramer M., Ringwold M., Starzinski-Powits A. Expression of M-cadherin, a member of the cadherin multigenefamily, correlates with differentiation of skeletal muscle cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 8024-8028.

47. Dusterhoft S., Yablonka-Reuveni Z., Pette D. Characterization of myosin isoforms in satellite cell cultures from adult rat diaphragm, soleus and tibialis anterior muscles // Differentiation. 1990. V. 45. P. 185-191.

48. Ecob M. S., Butler-Browne G. S„ Whalen R. G. The adult fast isozyme of myosin is represent in a nerve- muscle tissue culture system // Differentiation. 1983. V. 25. P. 84- 87.

49. Ecob M. S., Whalen R. G. The expression of myosin heavy chain isoforms in a nerve- muscle culture system // In Molecular Biology of Muscle Development, UCLA Symp. Mol. Biol. New Series. 1986. V. 29. P. 273-282.

50. Edmontson D.G., Olson E.N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoDl in expressed during myogenesis and it's sufficient to activate the muscle differentiation program // Genes Devel. 1989. V. 3. P. 628.

51. Feldman J.L., Stockdale F.E. Temporal appearance of satellite cells during myogenesis // Dev Biol. 1992. V. 153. P. 217-226.

52. Ferrari G., Cussela-De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors // Science. 1998. V. 279. P. 1528-1530.

53. Fiore F., Planche J., Gibier P. et al. Apparent normal phenotype of Fgf6-/— mice // Int. J. Dev. Biol. 1997. V. 41. P. 639-642.

54. Fiore F., Sebille A., Birnbaum D. Skeletal muscle regeneration is not impaired in Fgf6-/- mutant mice // Biochem. Biophys. Res. Comimm. 2000. V. 272. P. 138-143.

55. Frank D., Weeds A.G. The amino acid sequences of the alkali light chains of rabbit skeletal-muscle myosin // Eur. J. Biochem. 1974. V. 44. P. 317-334.

56. Gambke В., Lyons G. E., Haselgrove J. et al Thyroidal and neural control of myosin transitions during development of rat fast and slow muscles // FEBS Lett. 1983. V. 156. P. 335- 339.

57. Garry DJ, Yang Q, Bassel-Duby R, and Sanders Williams R. Persistent expression of MNF identifies myogenic stem cells in postnatal muscle // Dev Biol. 1997. V. 188. P. 280-294.

58. Gibson M.C., Schultz E. Age-related differences in absolute numbers of skeletal muscle satellite cells // Muscle Nerve. 1983. V. 6. P. 574580.

59. Gopinath S.D., Rando T.A. Stem cell review series: aging of the skeletal muscle stem cell niche // Aging cell. 2008. v. 7. P. 590-598.

60. Goulding M.D., Chalepakis G., Deutsch U. et al. Pax-3, a novel murine DNA binding protein expressed during early neurogenesis // EMBO J. 1991. V. 10. P. 1135-1147.

61. Goulding M.D., Lumsden A., Paquette A.J. Regulation of РахЗ expression in the dermamyotome and its role in muscle development // Development. 1994. V. 120. P. 957.

62. Greentree D., Marelli D., Ma F., Chiu R.C. Satellite cell transplantation for myocardial repair: labeling techniques // Transplant Proc. 1994. V. 26. P. 3357.

63. Gros P., Croop J., Housman D. Mammalian multidrug resistance gene: complete cDNA sequence indicates strong homology to bacterial transport proteins // Cell. 1986. V. 47. P. 371-380.

64. Gros J., Manceau M., Thome V., Marcelle C. A commom somitic origin for embryonic muscle progenitors and satellite cells // Nature. 2005. V. 435. P. 954-958.

65. Gussoni E., Soneoka Y., Strckland C.D. et al. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation // Nature. 1999. V. 401. P. 390-394.

66. Hauschka S.D. Clonal aspects of muscle development and the stability of the differentiated state // The stability of differentiated state / Ed. H. Ursprung. Berlin. 1968. P. 37-57.

67. Hawke T. J., Garry D.J. Myogenic satellite cell: physiology to molecular biology // J. Appl. Physiol. 2001. V. 91. P. 534-551.

68. Hill M., Werning A., Goldspink G. Muscle satellite (stem) cell activation during local tissue injury and repair // J. Anat. 2003. V. 203. P. 89- 99.

69. Jennische E., Ekberg S., Matejka G.L. Expression of hepatocyte growth factor in growing and regenerating rat skeletal muscle // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1993. V. 265 P. C122-C128.

70. Jesse TL, LaChance R, lademarco MF, and Dean DC. Interferon regulatory factor-2 is a transcriptional activator in muscle where it regulates expression of vascular adhesion molecule-1 // J. Cell Biol. 1998. V. 140. P. 1265-1276.

71. Jones N.C., Fedorov Y.V., Rosenthal R.S., Olwin B.B. ERK У2 is required for myoblast proliferation but is dispensable for muscle gene expression and cell fusion // J. Cell Physiol. 2001. V. 186. P. 104115.

72. Kachinsky AM, Dominov J A, Miller JB. Myogenesis and the intermediate filament protein, nestin // Dev. Biol. 1994. V. 165. P. 216-228.

73. Kastner S., Elias M.C., Rivera A.J., Yablonka-Reuveni Z. Gene expression patterns of the fibroblast growth factors and their receptors during myogenesis of rat satellite cells // J. Histochem. Cytochem. 2000. V. 48. P. 1079-1096.

74. Katagiri Т., Yamaguchi A,, Komaki M. et al. Bone morpliogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage // J. Cell Biol. 1994. V. 127. P. 1755-1766.

75. Kaufmann U., Kirsch J., Irintchev A., Wernig A., Starzinski-Powitzl A. The M-cadherin catenin complex interacts with microtubules in skeletal muscle cells: implications for the fusion of myoblasts // J. Cell Sci. 1999. V. 112. P 55-67.

76. Kelly A.M., Zaks S I. Neuromuscular development in intercostal•muscle of the fetal and newborn rat // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1968. V. 27. P. 109.

77. Kenny-Mobbs Т., Thorogood P. Autonomy of differentiation in avian brachial somites and the influences of adjacent tissues // Development. 1987. V. 100. P. 449-462.

78. Kiefer J.C., Hauschka S.D. Myf-5 is transiently expressed in nonmuscle mesodermand exhibit dynamic regional changes within the presegmented mesoderm and somites I-IV // Dev. Biol. 2001. V. 232. P. 77-90.

79. Konig S., Beguet A., Bader C.R. et al. The calcineurin pathway links hyperpolarization (Kir2.1) induced Ca signals to human myoblast differentiation and fusion // Development. 2006. V. 133. P. 31073114.

80. Kuang S., Gillespie M.A., Rudnicki M.A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation // Cell Stem Cell. 2008. V.2.P. 22-31.

81. Kuch С., Winnekendonk D., Butz S., Unvericht U., Kemler R., Starzinski-Powitz, A. M-cadherin-mediated cell adhesion and complex formation with the catenins in myogenic mouse cells I I Exp. Cell Res. 1997. V. 232. P. 331-338.

82. Lin H., Schagat T. Neuroblasts: a model for the asymmetric division of stem cells // Trends Genet. 1997. V. 13. P. 33-39.

83. Lyons G., Haselgrove J., Kelly A. et al. Myosin transitions in developing fast and slow muscles of the rat hindlimb // Differentiation. 1983. V. 25. P. 168-175.

84. Lyons G.E., Ontell M., Cox R. et al. The Expression of Myosin Genes in Developing Skeletal Muscle in the Mouse Embryo // J. Cell. Biol. 1990. V. 111. P. 1465-1476.

85. Maley M.A., Fan Y., Beilharz M.W., Grounds M.D. Intrinsic differences in MyoD and myogenin expression between primary cultures of SJL/J and BALB/C skeletal muscle // Exp. Cell Res. 1994. V. 211. P. 99-107.

86. Mansouri A., Goudreau G., Gruss P. Pax genes and their role in organogenesis // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 1707-1710.

87. Mar ell i D., Ma F., Chiu R.C. Satellite cell implantation for neomyocardial regeneration // Transplant Proc. 1992. V. 24. P. 2995.

88. Matsuda R., Spector D., Strohman R. Denervated skeletal muscle displays discoordinate regulation for the synthesis of several myofibrillar proteins //Proc/Natl. Acad. Sci. 1984. V. 1981. P. 11221125

89. Mauro A. Satellite cell of skeletal muscle fibers // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1961. V. 9. P. 493-495.

90. McGeachie J.K., Grounds M.D. Retarded myogenic cell replication in regenerating skeletal muscles of old mice: an autoradiographic studyin young and old BALBc and SJL/J mice // Cell Tissue Res. 1995. V. 280. P. 277-282.

91. McLennan I.S., Koishi K. The transforming growth factor-betas: multifaceted regulators of the development and maintenance of skeletal muscles, motoneurons and Schwann cells // Int. J. Dev. Biol. 2002. V. 46. P. 559-567.

92. McPherron A.C., Lawler A.M. Lee S.J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member // Nature. 1997. V. 387. P. 83-90.

93. Miller KJ, Thaloor D, Matteson S, and Pavlath GK. Hepatocyte growth factor affects satellite cell activation and differentiation in regenerating skeletal muscle // Am J. Physiol. Cell. 2000. V. 278. P. 174-181.

94. Minasi M.G., Riminucci M., De Angelis L. et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues // Development. 2002. V. 129. P. 2773-2783.

95. Moore R., Walsh F.S. The cell adhesion molecule M-cadherin is specifically expressed in developing and regenerating, but not denervated skeletal muscle // Development. 1993. V. 117. P. 14091420.

96. Munsterberg A.E., Kitajewski J., Bumcrot D.A. et al. Combinatorial signaling from Sonic hedgehog and Wnt family members induces myogenic bHLH gene expression in the somite // Genes Devel. 1995. V. 9. P. 2911.

97. Munsterberg A.E., Lassar A.B. Combinatorial signals from the neural tube, flooer plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite // Development. 1995. V. 121. P. 651.

98. Musaro A., McCullagh K.J., Nay a F.J. et al. IGF-1 induces skeletal myocyte hypertrophy through calcineurin in association with GATA-2 andNF-ATcl //Nature. 1999. V. 400. P. 581-585.

99. Nabeshima Y., Fujii Y., Muramatsu M., Ogata K. Alternative transcription and two modes of splicing result in two myosin light chains from one gene // Nature. 1984. V. 308. P. 333.

100. Narasawa M., Fitzimons R.B., Izumo S, et al. Slow myosin in developing rat skeletal muscle // J. Cell. Biol. 1987. V. 104. P. 447459.

101. Nguyen H.T., Gubitis R.M., Wydro R.M., Nadal-GinardB. Sarcomeric myosin heavy chain is coded by highly conserved multigene family // Proc. Natl. Acad. Sci. 1982. V.79. P. 5230-5234.

102. Naro F., De Arcangelis V., Coletti D. et al. Increase in cytosolic Ca2+ induced by elevation of extracellular С a" in skeletal myogenic cells // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2003. V. 284. P. C969-C976.

103. Olson E.N. Interplay between proliferation and differentiation within the myogenic lineage // Devel. Biol. 1992. V. 154. P. 261-272.

104. ObinataT., Masaki Т., Такапо H. Types of myosin light chains present during the development of fast skeletal muscle in chick embryo // J. Biochem. 1980. V. 87. P. 81.

105. Olson E.N., Klein W.H. bHLH factors in muscle development: dead lines and commitments, what to leave in and what to leave out // Gen. Devel. 1994. V. 8. P. 1-8.

106. Pourquie O., Coltey M., Breant C., Le Douarin N. M. Control of somite patterning by signals from the lateral plate // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 52. P. 3219-3223.

107. Relaix F., Rocancourt D., Mansouri A. et al. Divergent functions of murine РахЗ and Pax7 in limb muscle development // Genes Dev. 2004. V. 18. P. 1088-1105.

108. Reugels A.M., Boggetti В., Scheer N., Campos-Ortega J.A. Asymmetric localization of Numb: EGFP in dividing neuroepithelial cells during neurulation in Danio rerio // Devel. Dyn. 2006. V. 235. P. 934-948.

109. Rhodes S. J., Konieczny S.F. Identification of MRF4\ A new member of the muscle regulatory factor gene family // Genes Devel. 1989. V. 3.P. 2050.

110. Robert В., Daubas P., Akimenko M.A. et al. A single locus in the mouse encodes both myosin light chains 1 and 3, a second locus corresponds to a related pseudogene // Cell. 1984. V. 39. P. 129-140.

111. Rossi D.J., Weissman I.L. Pten, tumorigenesis, and stem cell self-renewal // Cell. 2006. V. 125. P. 229-231.

112. Sabourin L.A, Girgis-Gabardo A., Seale P. et al. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle // J. Cell Biol. 1999. V. 144. P. 631-643.

113. Saito Y. Muscle fiber type differentiation and satellite cell population in Werding-Hoffmann disease // J. Neurol. Sci. 1985. V. 68. P. 75-87.

114. Sanes J.R. The basement membrane/basal lamina of skeletal muscle // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 15. P.12601-12604.

115. Schmalbruch H., Hellhammer U. The number of nuclei in adult rat muscles with special reference to satellite cells // Anat. Rec. 1977. V. 189. P. 169-175.

116. Schultz E. Fine structure of satellite cells in growing skeletal muscle // Am. J. Anat. 1976. V. 147. P. 46-70.

117. Seale P., Rudnicki M.A. A new look at the origin, function, and "stem-cell" status of muscle satellite cells // Dev. Biol. 2000. V. 218. P. 115124.

118. Seale P., Sabourin L.A., Girgis-Gabardo A. et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells // Cell. 2000. V. 102. P. 777-786.

119. Seale P., Asakura A., Rudnicki M. The potential of muscle stem cells // Dev. Cell. 2001. V. 1. P. 333-342.

120. Semsarian C., Satrave P., Richmond D.R,. Graham R.M. Insulin-like growth factor (IGF-I) induces myotube hypertrophy associated with an increase in anaerobic glycolysis in a clonal skeletal-muscle cell model // Biochem. J. 1999. V. 339. P. 443-451.

121. Shefer G, Wleklinski-Lee M, Yablonka-Reuveni Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway // J Cell Sci. 2004. V. 117. P. 5393-5404.

122. Shen Q., Zhong W., Jan Y.N., Temple S. Asymmetric Numb distribution is critical for asymmetric cell division of mouse cerebral cortical stem cells and neuroblasts // Development. 2002. V. 129. P. 4843-4853.

123. Shinin V., Gayraud-Morel В., Gomes D., Tajbakhsh S. Asymmetric division and cosegregation of template DNA strands in adult muscle satellite cells //Nature Cell Biol. 2006. V. 8. № 7. P. 677-687.

124. Smith C.K., Janney M.J., Allen R.E. Temporal expression of myogenic regulatory genes during activation, proliferation and differentiation of rat skeletal muscle satellite cells // J. Cell Physiol. 1994. V. 159. P. 379-385.

125. Snow M.H. A quantitative ultrastructure analysis of satellite cells in denervated fast and slow muscles of the mouse // Anat. Rec. 1983. V. 207. P. 593-604.

126. Sreter R.A., Balint M., Gergely J. Structural and functional changes of myosin during development. Comparison with adult fast, slow and cardiac myosin // Devel. Biol. 1975. V. 46. P. 317.

127. Stocum D.L. Regenerative biology and medicine. N.Y.: Academic Press, 2006. 448 p.

128. Sweeney L., Kennedy J., Zak R et al. Evidence for expression of a common myosin heavy chain phenotype in future fast and slow skeletal muscle during initial stages of avian embryogenesis // Dev. Biol. 1989. V. 133. P. 361-374.

129. Tatsumi R., Anderson J.E., Nevoret C.J. et al. HGF/SF is present in normal adult skeletal muscle and is capable of activating satellite cells //Dev. Biol. 1998. V. 194. P. 114-128.

130. Tatsumi R., Hattori A., Ikeuchi Y. et al. Release of hepatocyte growth factor from mechanically stretched skeletal muscle satellite cells and role of pH and nitric oxide // Mol. Biol. Cell. 2002. V. 13. P. 29092918.

131. Teboul L., Gaillard D., Staccini L. et al. Thiazolidinediones and fatty acids convert myogenic cells into adipose-like cells // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 28183-28187.

132. Terada N., Namazaki Т., Oka M. et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion // Nature. 2002. V. 416. P. 542-545.

133. Torgan C.E., Daniels M.P. Regulation of myosin heavy chain expression during rat skeletal muscle development in vitro // Mol. Biol. Cell. 2001. V. 12. P. 1499-1508.

134. Vassilopulos G., Wang P.R. Rrussel D.W. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion //Nature. 2003. V. 422. P. 901-904.

135. Vivarelli E., Cossu G. Neural control of early myogenic differentiation in cultures of mouse somites // Dev. Biol. 1986. V. 117. P. 319-325.

136. Wada M.R., Inagawa-Ogashiwa M., Shimizu S. et al. Generation of different fates from multipotent muscle stem cells // Development. 2002. V. 129. P. 2987-2995.

137. Wang X., Willenbring H., Akkari Y. et al. Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes // Nature. 2003. V. 422. P. 897-901.

138. Watkins S.C., Cullen M.J. A quantitative study of myonuclear and satellite cell nuclear size in Duchenne's muscular dystrophy, polymyositis and normal human skeletal muscle //Anat. Rec. 1988. V. 222. P. 6-11.

139. Weeds A.G., Lowey S. Substructure of the myosin molecule. II. The light chain of myosin // J. Mol. Biol. 1971. V. 61. P. 701-725.

140. Whalen R.G., Butler-Brown G.S., Gross F. Identification of novel form of myosin light chain present in embryonic muscle tissue and cultured muscle cells // J. Mol. Biol. 1978. V. 126. P. 415.

141. Weydert A., Daubas P., Lazaridis L. et al. Genes for skeletal muscle myosin heavy chains are clustered and ate not located on the samemouse chromosome as a cardiac myosin heavy chain gene // Proc. Natl. Acad. Sci.1985. V. 82. P .7183-7187.

142. Weydert A. Myogenesis and gene expression // Bull. Inst. Pasteur. 1988. V. 86. P. 159-210.

143. Wolpert L. Stem cells: a problem in asymmetry // J. Cell Sci. 1988. Suppl. V. 10. P. 1-9.

144. Xu Q., Yu L., Cheung C.F. et al The p38 МАРК, CaMK and calcineurin-mediated signaling pathways transcriptionally regulate myogenin expression // Mol. Biol. Cell. 2002. V. 13. P. 1940-1952.

145. Yablonka-Reuveni Z., Rivera A.J. Temporal expression of regulatory and structural muscle proteins during myogenesis of satellite cells on isolated adult rat fibers // Dev. Biol. 1994. V. 164. P. 588-603.

146. Ying Q.L., Nichols J., Evans E.P. et al. Changing potency by spontaneous fusion //Nature. 2002. V. 416. P. 545-548.

147. Zammit P.S., Beauchamp J.R. The skeletal muscle satellite cell: stem cell or son of stem cell? // Differentiation. 2000. V. 68. P. 193-204.

148. Zammit P.S., Relaix F., Nagata Y. et al. Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells // J. Cell Sci. 2006. V. 119. P. 1824-1832.

149. Zhao P., Hoffman E.P. Embryonic myogenesis in muscle regeneration //Dev. Dynam. 2004. V. 229. P. 380-392.

150. Zibaitis A., Greentree D., Ma F., Marelli D., Duong M., Chiu R.C. Myocardial regeneration with satellite cell implantation // Transplant Proc. 1994. V. 26. P. 3294.

Информация о работе

Балан, Ольга Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.30

Диссертация

Анализ дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс на разных стадиях онтогенеза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Анализ дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс на разных стадиях онтогенеза - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы