Амилолитическая активность каталитических антител

Бобрикова, Дина Робертовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Амилолитическая активность каталитических антител
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Амилолитическая активность каталитических антител"

На правах рукописи

Бобрикова Дина Робертовна

АМИЛОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КАТАЛИТИЧЕСКИХ

АНТИТЕЛ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Петербургском институте ядерной физики им. Б.П.Константинова Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Неустроен Кирилл Николаевич.

Официальные оппоненты- доктор медицинских наук, профессор

Денисенко Александр Дорофеевич, доктор биологических наук, профессор Ямковой Виталий Иванович.

Ведущая организация Институт биоорганической химии РАН им.

Шемякина и Овчинникова

Защита состоится «

Л » -¿¿¿¿оЛ 2005 г. в /V часов на заседании диссертационного совета Д 001 022 03 при Г У «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН» по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71 (конференц-зал НИИЭМ)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН» по адресу 197376, С.-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12.

Автореферат разослан » 004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д001 022.03 доктор биологических наук, профессор

Л В. Пучкова

36 635

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Феномен наличия у иммуноглобулинов каталитических свойств активно исследуется в течение последних десятилетий. Это привело к возникновению нового направления в классической иммунологии и энзимологии, новой области биокатализа - абзимологии. (Антитела-энзимы были названы «абзимами» как аббревиатура от AntiBody и enZYME).

Впервые гипотеза, согласно которой антитела, комплементарные структуре переходного состояния химической реакции, должны катализировать эту реакцию, ускоряя достижение переходного состояния и стабилизируя его, была высказана в 1969 г, (Jenlcs W., 1969). Открытие природных каталитических антител, явившееся реальным подтверждением теории, произошло лишь в 1989г. (Paul et al., 1989) Столь значительное отставание практики от теории связано с уровнем развития методов выделения и очистки антител, а именно, с возможностью доказать принадлежность каталитической активности непосредственно антителам, а не каким-либо примесям ферментов. До этого считалось, что основная функция антител заключается только в связывании и элиминировании антигенов, а обнаруженная каталитическая активность принадлежит «ферментам, сорбированным на молекулах антител». Итак, в результате разработки методологии доказательства каталитической активности абзимов (Paul et al., 1989) (подробнее см. ниже), каталитические IgG и IgM, гидролизующие пептиды (Paul et al., 1989), белки (Kalaga et al., 1995), ДНК (Shuster et al., 1992; Gololobov et al., 1995), ДНК и РНК (Buneva et al., 1994) были обнаружены в сыворотке крови пациентов с различными аутоиммунными патологиями: бронхиальная астма, СКВ (системная красная волчанка), аутоиммунный тиреоидит, полиартрит, PC (рассеянный склероз). Также абзимы с различными каталитическими активностями были найдены в крови и молоке •здоровых матерей Препараты slgA, выделенные из человеческого молока, обладают протеинкиназной, ДНКазной или РНКазной активностями, а также IgG и slgA способны гидролизовть АТР.

В то же время антитела из крови здоровых доноров, а также больных гриппом, пневмонией, туберкулезом, тонзиллитом, язвой 12-перстной кишки и некоторыми онкологическими заболеваниями (рак матки, молочной железы, кишечника) не проявляли каталитических активностей.

Давно известно, что аутоиммунные заболевания ассоциированы с циркуляцией аутоантител, связь которых с основным патологическим процессом установить удается не всегда Так, ревматоидный фактор, который часто обнаруживают при ревматоидном артрите, представляет собой специфические антитела к сывороточному гамма-глобулину, но совершенно непонятно, почему они возникают и в чем заключается их действие. Аналогичным образом, при так называемых коллагенозах типа СКВ и дерматомиозита, часто находят циркулирующие антитела против ДНК или комплексов ДНК с гистонами, однако и в этом случае происхождение и функции аутоантител остаются неясными.

БИБЛИОТЕКА С.Пе О»

при беременности женщин, АИЗ, или других, пока еще не обнаруженных Перспективными направлениями дальнейших исследований в области биокатализа, обусловленного антителами, являются поиск новых каталитических активностей антител, расширение круга исследованных заболеваний, а также детальное сравнение абзимов у здоровых людей и пациентов с АИЗ. Такие данные могут прояснить роль каталитических антител в этиологии и/или патогенезе различных заболеваний (как и их возможную функцию в случае здоровых рожениц), расширить наши представления о путях метаболизма биологически активных соединений в организме человека, привести к расширению классических представлений о роли иммуноглобулинов и могут способствовать более глубокому пониманию причин и механизмов возникновения аутоиммунного ответа.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении амилолитической активности препаратов иммуноглобулинов, выделенных из сыворотки крови пациентов с АИЗ, здоровых доноров, а также из молока здоровых рожениц.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Протестировать на возможную гликозидгидролазную активность различные препараты иммуноглобулинов, используя в качестве субстратов крахмал, гликоген, мальтоолигосахариды, другие сахара (рЫр-а/р-О-глюкопиранозиды, рЫр-а/р-О-маннопиранозиды, рЫр-а/р-О-галактопиранозиды, р^-а/р- Ы-ацетилглюкоаминиды, р^-а-Ь-фукопиранозид, р^-р-Б-фукопиранозид и р^-а-О-ксилопиранозид).

2. Доказать принадлежность обнаруженной активности непосредственно антителам.

3. Определить рН-оптимум, кинетические параметры, тип действия, зависимость скорости гидролиза от длины субстрата для реакций, катализируемых препаратами антител.

4. Сравнить основные характеристики и свойства известных амилаз и гликозидгидролизующих антител.

Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе впервые было показано, что препараты человеческих антител обладают амилолитической активностью Чистые 1§М фракции, выделенные из крови нескольких десятков пациентов с РС или СКВ, имели специфическую амилолитическую активность, на три порядка превышающую активность препаратов ^М из крови здоровых доноров. РаЬ-фрагменты, соответствующие 1§0 и ^М фракциям антител, демонстрируют уровень активности, практически равный уровню ферментативной активности исходных иммуноглобулинов Фракции поликлональных абзимов от различных доноров состоят из различных моноклональных АТ с отличающимися физико-химическими параметрами для субстратов и демонстрируют каталитическую гетерогенность кинетических параметров и различные типы действия при гидролизе природных и искусственных субстратов. Часть абзимов проявляла только экзо-амилазную активность, в то время как другие обладали также и а-глюкозидазной Ни один из исследованных препаратов иммуноглобулинов не показал трансгликозидирующей активности.

> .. . -П4

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные вносят существенный вклад в наши представления о скрытых возможностях иммунной системы и имеют большое значение для дальнейшего изучения свойств, функций, физиологической и патофизиологической роли аутоантител, в частности, каталитических аутоантител, и, как следствие, более глубокого понимания механизмов возникновения аутоиммунного ответа, а также этиологии и патогенеза аутоиммунных заболеваний Результаты исследований позволяют предложить субстраты, позволяющие с большой чувствительностью определять амилолитическую активность абзимов, что может стать инструментом для диагностики аутоиммунных заболеваний. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Препараты IgG и IgM из сыворотки крови пациентов с различными АИЗ, IgG и slgA из молока здоровых матерей способны гидролизовать а-1,4-глюкозидные связи как в полимерных субстратах (крахмал, гликоген, амилоза), так и в мальтоолигосахаридах.

2. Ферментативная активность - внутреннее свойство человеческих абзимов

3. Изменение репертуара антител от индивида к индивиду - основная особенность поликлонапьных абзимов.

4. Характер действия абзимов отличается от характера действия типичных а-амилаз.

Личный вклад. Соискателем проведены эксперименты, доказывающие принадлежность амилолитической активности непосредственно антителам. Синтезированы специфические субстраты, обладающие хромо- и флуорогенными метками На основе использования этих субстратов разработан высокочувствительный метод исследования амилолитической активности антител, позволяющий, в частности, определить их кинетические параметры. С использованием синтетических субстратов проведены все описанные эксперименты с антителами; определены рН-оптимумы, кинетические параметры и типы действия изученных антител.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на I симпозиуме по семейству а-амилаз (Словакия, 2001), на симпозиуме «Человеческие антитела и гибридомы-2003» (Осака, Япония, 2003), на III съезде иммунологов России (Екатеринбург, 2004).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 105 стр. машинописного текста, содержит 11 таблиц и 27 рисунков.

Работа выполнена в лаборатории энзимологии ОМРБ ПИЯФ РАН

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реактивы и ферменты были куплены в Sigma (USA) или в Merck (Germany) Синтез субстратов. Все субстраты были синтезированы с применением хемо-энзиматического подхода Наборы меченых мальтоолигосахаридов с различными степенями полимеризации получены путем переноса фрагментов молекул ß-циклодекстрина на п-нитрофенил- (или метилумбеллиферил-) глюкозид с помощью фермента циклодекстрин глюкозилгрансферазы из Bacillus sp

Доноры и пациенты. Образцы молока были взяты у 35 (2001 г) и 24 (2002 г) здоровых человеческих матерей (19 - 35 лет) Молоко было собрано в период от 1 недели до 4 месяцев лактации

Препараты IgG были выделены из сыворотки крови-

пациентов с достоверным диагнозом РС (37 человек в 2002 г, 54 человека в 2003 г, 59 человек в 2004 г),

пациентов с достоверным диагнозом СКВ (25 человек), 57 здоровых доноров.

Выделение абзимов. Электрофоретически и иммунологичсски гомогенные IgG и slgA были получены из человеческого молока после хроматографии на колонках с протеин-А-сефарозой, DEAE-Toypearl и на колонках с анти-IgG и aHTH-sIgA-сефарозами

Для получения высокоочищенных препаратов IgG из крови пациентов с АИЗ и здоровых доноров была разработана схема, включающая осаждение сульфатом аммония, хроматографию на протеин-А-сефарозе, ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрации на колонке ToypearI HW-55 Заключительной стадией очистки была хроматография на анти-^0-сефарозе-4В Выделение IgM-фракций из крови здоровых доноров и пациентов с АИЗ осуществлялось в соответствии с процедурой, описанной выше, с аффинной хроматографией на анти-IgG- и aH-m-IgM-сефарозах 4В и FPLC- гель-фильтрации на Superóse 12 в условиях «кислого шока» в качестве финальных стадий очистки

Получение и очистка фрагментов Ig Для получения Fab-фрагментов антитела после стандартной процедуры очистки гидролизовали папаином Продукты гидролиза обессоливали на колонке с сефадексом G-25. После нанесения гидролизата белка на протеин-А-сефарозу фракцию, не обладающую сродством к сорбенту, собирали и подвергали дополнительной очистке последовательно на КМ-трисакриле и колонке с иммобилизованными антителами против легкой цепи соответствующих Ig Полученные Fab-фрагменты были электрофоретически гомогенны

Доказательство принадлежности амилолитической активности антителам. Для доказательства принадлежности амилолитической активности препаратам антител применялись следующие стандартные критерии

а) Полная адсорбция активности на анти-АТ-сефарозе и ее элюция буфером с низким рН Иммуноадсорбцию очищенных фракций антител проводили на соответствующих aHTH-Ig-сефарозах в 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, содержащем 0,025% Tween (об/об) в течение 1 часа при 12°С

б) Гель-фильтрация абзимов в условиях «кислого шока» (рН 2,6) или в присугствии 6 М гуанидин хлорида (в 50 мМ натрий фосфатном буфере, рН 6,5) не приводила к исчезновению активности, и пик активности полностью совпадал с пиком антител.

в) Электрофоретическая гомогенность абзимов Анализ фракций иммуноглобулинов с помощью ,ДСН-электрофореза в недиссоциирующих условиях проводился в 3 15% градиентных гелях (1 г/л ДСН), для полипептидов разделение осуществлялось в диссоциирующем 12% геле (в присутствии 1 г/л ДСН и 10 г/л 2-меркаптоэтанола) с последующей окраской серебром, согласно методу Лэммли Проверка активности. Измерения амилолитических активностей IgG, Fab, IgM и slgA проводили в 30 мМ буфере Трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ NaN3 при 37°С, при использовании 10"4—10'5 Ед иммуноглобулинов Одна единица активности определялась как количество абзимов, высвобождающее 1 мкмоль восстанавливающего сахара из pNpGlcr, (5 мМ) в минуту при 37°С в 30 мМ буфере Трис-HCl, рН 7,5 Активность по отношению к pNp- и MeUmb-субстратам оценивали с помощью ВЭЖХ-анализа продуктов реакции гидролиза Глюкозидазную активность определяли

спектрофотометрическим измерением при 400 нм количества свободного pNp, выделявшегося в результате катализируемого абзимами гидролиза pNpGlc Единица глюкозидазной активности определялась как количество абзимов, высвобождающее 1 мкмоль pNp из pNpGlc (5 мМ) в минуту при 37°С в 30 мМ буфере Трис-HCl, рН 7,5. Значения Км и кш вычисляли на основе стандартного метода начальных скоростей реакций для серий мапьтоолигосахаридов и рЫр-мальтоолигосахаридов; линеаризацию проводили по методу Лайнуивера-Берка Скорости реакций измеряли при 6-10 различных концентрациях субстрата в пределах от 0,2х Км до 4—6х Км . Каждое измерение дублировалось трижды Влияние рН на активность абзимов измеряли в интервале рН 3,0—8,0 в 30 мМ натрий фосфатном/цитратном и Трис-HCl буферах Реакции проводили при 37°С в течение 24 часов, в качестве субстрата использовали 5 мМ pNpGlcs После инкубации реакции останавливали замораживанием и продукты анализировали с помощью обратнофазной ВЭЖХ на колонке Lichrosorb С18 (20x4,8 мм), используя линейный градиент MeCN в воде со спектрофотометрическим детектированием при Я.=302 нм Количества образовавшихся продуктов рассчитывали интегрированием хроматографических пиков

Тип действия. Реакционную смесь, содержащую 10'4—10"5 единиц иммуноглобулина и 5 мМ мальтоолигосахарида (pNp-мальтоолигосахарида), инкубировали в 30 мМ Трис-HCl, рН 7,5 при 37°С в течение различных интервалов времени Олигосахаридные субстраты и продукты гидролиза анализировали методом ТСХ на Kieselgel 60 пластинках (Merck, Germany) в системе бутанол/уксусная кислота/вода (3 1 1). Дополнительно pNp-продукты реакции гидролиза анализировали обратнофазной ВЭЖХ на колонке Lichrosorb С18 (20x4,8 мм), используя линейный градиент MeCN в воде со спектрофотометрическим детектированием при >.=302 нм

Анализ трансгликозилирующей активности Трансгликозилирующую активность абзимов тестировали в реакциях, содержащих pNpGlc или pNpGlc3 при концентрациях субстрата 10, 50, 100, 150 мМ в 30 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 37°С Аликвоты реакционной смеси брали через фиксированные интервалы времени и анализировали с помощью ТСХ и ВЭЖХ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Электрофоретическая гомогенность препаратов абзимов. Отсутствие совместно выделенной а-амилазной активности в препаратах иммуноглобулинов было проверено в соответствии со стандартными критериями, описанными в секции Материалы и методы.

• Вся амилолитическая активность сорбировалась на соответствующих анти-1ц-сефарозах-4В и элюировалась 1М глициновым буфером, рН 2,3. Восстановление активности происходило после диализа против нейтрального буфера и выдерживания абзимов при 4°С в течение 2-4 недель.

• Элюционный профиль амилолитической активности был идентичен профилю пиков иммуноглобулинов при гель-фильтрации в условиях «кислого шока» (рН 2,6) или в присутствии 6 М гуанидин хлорида (в 50 мМ натрий фосфатном буфере, рН 6,5) (рис. 1).

Рис 1 Аналитическая гель-фильтрация ^ амилолитической активности IgG на колонке Sephacryl S-200 в 6 М гуанидин хлориде. ♦ -активность, — поглощение при 280 нм

й >5 100 »9 110 lis 120 13S Объем ЭЛХЖЩВ, МЛ

• Fab-фрагменты, полученные инкубацией очищенных препаратов иммуноглобулинов из сыворотки крови или молока с папаином, были пропущены через колонку Sephacryl S-200. Элюированный пик, соответствующий молекулярному весу 56 кДа был нанесен на колонку с иммобилизованным белком А. Несвязавшаяся фракция была собрана и идентифицирована как Fab-фракция Эта фракция демонстрировала амилолитическую активность по отношению к п-нитрофенил мальтопентаозе (рис. 2).

OJO

он

Рис. 2. Аналитическая гель-фильтрация амилолитической активности Fab-фрагмента на «?0,! колонке Sephacryl S-200 в 6 М гуанидин хлориде • 010 - активность; — - поглощение при 280 нм.

ООО

ВО U «О И 100 109 1 to 119 120 139

Результаты описанных экспериментов об»™ мю.™, ш

представлены в таблице 1.

Таблица 1. Изменения в уровне амилолитической активности препаратов IgM, IgG из крови пациентов с диагнозом PC и препаратов IgG и slgA из молока после «кислого шока», иммуноадсорбции и РаЬ-фрагментов, соответствующих IgG , IgM и IgG-молочным

Типы исследованных абзимов Количество протестированных образцов Процент от исходной активности

^М после иммуноадсорбции 8 95 ±5

1^0 после иммуноадсорбции 3 95 ±5

в^А после иммуноадсорбции 3 90 ± 5

^О-молочные после иммуноадсорбции 4 95 ±5

^М после гель-фильтрации в условиях «кислого шока» 4 90 ± 5

после гель-фильтрации в условиях «кислого шока» 2 90 ±5

в^А после гель-фильтрации в условиях «кислого шока» 3 80 ±5

^-молочные после гель-фильтрации в условиях «кислого шока» 3 85± 5

РаЬ-фрагменты 1^0 3 85 ±5

РаЬ-фрагмешы 1йМ 5 80 ±5

РаЬ-фрагменты ¡йС из молока 3 80 ±5

• Электрофорез в ПААГ в недиссоциирующих условиях демонстрирует электрофоретическую гомогенность фракций иммуноглобулинов; отсутствие каких-либо дополнительных белковых полос в диссоциирующих условиях еще раз подтверждает отсутствие белковых примесей в препарат! ах.

• Тестирование ферментативной активности в участке геля, соответствующею положению отдельного белка, после его электрофореза в присутствии ДСН, показало, что амилолитическая активность соответствует только зоне, принадлежащей олигомеру иммуноглобулина (рис 3 и 4).

В eMve amytoljte actely, % 2 0 40 SO 400

Refabve araytolytx adraly, ft 1 2 0 40 80 100

slgA.

slgA;

При исследовании IgG и slgA из молока тестирование активности IgG в геле показало амилолитическую активность только в единственной полосе белка, соответствующей полной, 150 кДа Н2Ь2-форме IgG (рис. 3). ДСН-электрофорез sIgA-фракции в диссоциирующих условиях с последующим окрашиванием серебром обнаружил две полосы белка (300 и 380 кДа), обе из которых имели положительную реакцию с анти-IgA антителами в процессе иммуноблоттинга (рис. 3).

Рис.3. ДСН-ПААГ-анализ амилолитической активности каталитических IgG (А) и slgA (В) из человеческого молока в геле После электрофореза гель был инкубирован в условиях для ренатурации белка, и затем амилолитическую активность IgG-fj»« |М " тестировали в экстрактах из 3 -

4 мм кусочков геля (активность показана справа) Другие линии того же геля были окрашены серебром (линия 2) или использованы для выявления позиции IgG и slgA с помощью иммуноблоттинга с

коньюгатами щелочной

фосфатазы со специфическими поликлональными анти-IgG (А) и анти-sIgA (В)

антителами (линия 1)

Как было показано ранее, sIgA-полоса с более низкой электрофоретической подвижностью соответствует по размеру 380 кДа (ЬгНгЬ JS-форме slgA, содержащей одну S-цепь, 72 кДа; четыре тяжелых цепи, 62 кДа; четыре легких цепи, 23 кДа и одну J-цепь, 23-26 кДа. 300 кДа форма антител с более высокой электрофоретической подвижностью не имеет одной из субъединиц полной формы slgA и соответствует slgAjTHny антител, в котором не все легкие цепи соединены с олигомером ковалентно-дисульфидными связями; такие молекулы могут терять легкие субъединицы в жестких условиях очистки абзимов. Элюция IgG и обеих sIgA-фракций с геля после ДСН-электрофореза и отмывания геля, позволила выделить фракции абзимов с амилолитической активностью (рис. 3).

Как видно из рисунка, амилолитическая активность строго соответствует электрофоретическим зонам иммуноглобулинов. Аналогичные результаты были получены для IgM-фракций от пациентов с PC и СКВ (рис. 4).

На основании проведенных контрольных экспериментов можно считать полностью доказанным тот факт, что наблюдаемая а-амилолитическая активность является внутренним свойством иммуноглобулинов, а не результатом действия примесных ферментов

Рис. 4 Анализ амилолитической активности и гомогенности 1{>М (А) и ^О (В) фракций, выделенных из сыворотки крови пациентов с РС с помощью ДСН-электрофореза в

недиссоциирующих условиях в 3 - 15% градиентном геле Экстракты 3 - 4 мм кусочков геля были инкубированы с 1 мМ раствором мальтоолигосахарида; параллельные линии использовали для определения позиции (А), (линия 1, В) и маркеров молекулярных масс

(линия 2, В) в геле при окрашивании серебром (С) - ДСН-электрофорез ^М (линия 1) и ^О (линия 2) в диссоциирующем 5 - 15% градиентном геле, Ь - легкая цепь, Н(§) и Н(т) соответствуют тяжелым цепям и ^М антител, соответственно Стрелочками показаны позиции маркеров молекулярных масс

Исследование амилолитической активности антител требует использования субстратов, обладающих хромогенными или флуорогенными группами. Это связано с определенными требованиями, налагаемыми кинетическими экспериментами с антителами. Для вычисления значений Км и кса мы использовали стандартный метод начальных скоростей реакций. Линеаризацию проводили по методу Лайнуивера-Берка, для чего скорости реакций измеряли при

6 — 10 различных концентрациях субстрата в пределах от 0,2х Км до 4 - 6х Км (см. Материалы и методы), т е не более порядка Ки Кинетические константы (Км) антител (соответственно, и концентрации субстратов, отвечающие требованиям кинетическим экспериментам с антителами) в среднем на 1 - 2 порядка ниже, чем соответствующие константы типичных ферментов. При таких концентрациях субстратов традиционные методы измерения скоростей реакций, катализируемых гликозидгидролазами, основанные на определении вновь образовавшихся восстанавливающих концов, оказываются недостаточно чувствительными Т е. точное измерение скоростей реакций гидролиза, катализируемых антителами, возможно лишь при использовании метода, основанного на измерении хромо- и флуорогенных меток. Эти метки позволяют измерять скорость гидролитических реакций при концентрациях субстратов порядка 10"6М/л.

Синтез субстратов. После инкубации реакционной смеси ССГ-катализируемой реакции переноса глюканозильных групп на рЫр(Ме11тЬ)С1с при 37°С в течение ночи и остановки реакции путем замораживания, полученную смесь рКр(МеишЬ)-мальтоолигосахаридов со степенями полимеризации от 1 до 8 подвергали лиофильной сушке, а затем разделению с помощью ВЭЖХ. Соотношение (моль/моль) получающихся продуктов можно оценить по рис 5

I» 'к

^ я

эш *

|дМ

< * « " | |оте2

-—г

29 42 67 94 ДО НХ

ша) н(т) ^

14 29 42 67 94 кОя

Рис 5. ВЭЖХ-разделение на колонке PREP-ODS (Gasukuro Kogio Inc., Japan) смеси pNp-мальтоолигосахаридов, полученной реакцией переноса молекул (3-циклодекстрина на pNpGlc.

Первыми элюируются циклодекстрин и свободные мальтоолигосахариды, затем pNp-продукты реакции в порядке уменьшения степени полимеризации, последним элюируется свободный л-нитрофенол.

Выходы реакции, проведенной при молярном соотношении акцептора о ю го зо 40 бо во 70 (pNpGlc) и донора (Р-циклодекстрин) 3:2, Время, мин представлены в таблице 2. Реакция

проводилась в 20 мМ буфере PIPES, рН 6,0, содержащем 20 мМ СаС12 при 37°С.

Таблица 2. Выходы (моль/моль) образования продуктов реакции энзим этического удлинения мальтоолигосахаридных цепей._____

Продукт pNp -Glc pNp G1c2 pNp Glcj pNp G1c4 pNp-Glc, pNpGlc. pNpGlc, pNpGlc,

Выход, % 25 23 18 13 9 4 3 1

Амилолитическая активность различных препаратов иммуноглобулинов.

Все человеческие антитела с амилолитической активностью способны гидролизовать а-1,4-глюкозидные связи как в полимерных субстратах (крахмал, гликоген, амилоза), так и в мальтоолигосахаридах с различной степенью полимеризации. В последнем случае основными продуктами гидролиза амилолитическими абзимами являются мальтоза, мальтотриоза и мальтотетраоза, аналогично а-амилазам из различных источников. Как и традиционные экзо-амилазы, фракции человеческих абзимов с амилолитической активностью гидролизуют синтетические субстраты, такие как и-нитрофенил-а-О-мальтоолигосахариды, п-нитрофенил-4,6-0-этилиден-а-0-

мальтоолигосахариды или МеитЬ-а-О-мальтоолигосахариды и МеишЬ-4,6-0-этилиден-а-В-мальтоолигосахариды. Часть тестированных образцов продемонстрировала а-глюкозидазную активность, т.е. способность гидролизовать п-нитрофенил-а-О-глюкозид, мальтозу и мальтотриозу. Разумеется, такие амилолитические абзимы образуют глюкозу наряду с короткими мальтоолигосахаридами при гидролизе полимерных и олигомерных субстратов. Именно глюкоза является конечным продуктом полного гидролиза, катализируемого человеческими амилолитическими абзимами такого типа действия (рис. 6).

Первоначально амилолитическая активность была обнаружена нами в и ^А фракциях человеческого молока Затем проводились исследования препаратов и ^М от пациентов с РС и СКВ.

Рис. 6. Экзо-амилолити-

ческая и а-глюкозидазная

активности человеческих абзимов

Специфические амилолитические активности всех протестированных

образцов иммуноглобулинов, полученных из человеческого молока были практически одного уровня - в пределах 0,15 - 0,25x10"2 Ед/мг - и, в среднем, немного выше для чем для ^О-фракций. Более высокие значения специфической

активности (около 1х10"2 Ед/мг) были зафиксированы для 1§М из крови пациентов с подтвержденным диагнозом РС или СКВ. Интересно, что стабильно повышенный уровень амилолитической активности демонстрируют только препараты ^М от пациентов с РС и СКВ, в то время как для ряда фракций при тех же патологиях он значительно ниже (примерно в 20 - 40 раз) (рис. 7). Следует отметить, что, по сравнению с ^М обладают также более высокой удельной ДНКазной (8Ьи$1ег е1 а1., 1992) и РНКазной (Андриевская и др., 1998) активностями. Известно, что ^М, в отличие от и других иммуноглобулинов, не подвергаются соматическому мутагенезу - У-области генов ^М очень сходны с фрагментами зародышевого генома, из которого они формируются. В принципе, возможно, что переключение от синтеза ^М к синтезу сопровождается

селекцией абзимов, обладающих более слабыми каталитическими свойствами.

Рис. 7. Набор значений специфических амилолитических активностей СКВ-абзимов в реакции гидролиза рЫр-мапьтогексаозы.

Эюо-аынлазшй

а-Глюкоэцддзнын \ш/

Для контроля были протестированы препараты ^О и ^М от 57 пациентов, не страдающих аутоиммунными заболевания Абсолютно во всех случаях уровень специфической амилолитической активности абзимов, полученных от здоровых доноров был на три порядка ниже уровня активности препаратов АТ, полученных от пациентов с аутоиммунными заболеваниями, и был в пределах 0,004 - 0,01x102 Ед/мг (таблица 3 и рис. 8).

Таблица 3. Средняя специфическая амилолитическая активность* различных

Амилолитическая

Доноры Количество Препараты активность

доноров антител (Ед/мг х 10"2)

Здоровые 57 ДО 0 007±0.003

доноры тм 0 007±0.003

Человеческое 59 до 0,20 ± 0,05

молоко 0,25 ±0,05

Рассеянный 150 до 0,08 ± 0,03

склероз ЩМ 1, 15 ±0,05

Системная 25 до 0,75 ± 0,05

красная 1ёМ 0,85 ± 0,05

волчанка

♦Специфическую амилолитическую активность определяли как количество иммуноглобулинов, требуемое для образования 1 мкмоль восстанавливающего сахара при рН 7,0, 37"С в реакции гидролиза и-нитрофенилмальтопентаозида

Рис. 8 Средняя специфическая амилолитическая активность различных препаратов человеческих абзимов

Подобный уровень

активности не менее чем на 2 порядка ниже, чем для традиционных а-амилаз и а-глюкозиДаз. Настолько же низкими, по сравнению с природными ферментами, были зафиксированные протеолитические и ДНК-гидролизующие активности исследуемых абзимов Следует помнить, что мы имеем дело с поликлональными препаратами, только часть которых проявляет каталитическую активность. С другой стороны, концентрация антител (1^) в крови очень велика - миллиграммы в миллилитре. Поэтому влияние абзимов на метаболические процессы может быть существенным, несмотря на низкую удельную активность.

|цс до 1(0 II\ес 1в0 до 1>о 18м

РаЬ-фрагменты были получены из очищенных ^О- и 1§М-препаратов и также обладали активностью по отношению к мальтопентаозе, мальтогексаозе и л-нитрофенил-мальтопентаозиду (таблица 4)

Таблица 4. Средняя амилолитическая активность РаЬ-фрагментов, соответствующих различным препаратам иммуноглобулинов в реакции гидролиза п-нитрофенил-мальтопентаозида Реакции проводились в 30 мМ буфере Трис-НС1, рН 7,5,

Доноры Исследованные Количество Амилолитическая

препараты антител образцов активность (Ед/мгхЮ'2)

Человеческое № 3 0,17 ±0,05

молоко

Рассеянный ДО 2 0,1± 0,05

склероз 1йМ 3 0,85 ± 0,05

Системная ДО 1 0,6 ± 0,05

красная 1 0,8 ± 0,05

волчанка

Гидролитические свойства амилолитических абзимов. Гидролитические параметры эГ^ и из человеческого молока, как и и от РС и СКВ пациентов были изучены в реакциях гидролиза крахмала, а-Б-мальтоолигосахаридов и рЫр- и МеишЬ-модифицированных а-О-мальтоолигосахаридов различной степени полимеризации.

• рН-завнсимость гидролиза субстратов. Значение рН-оптимума для гидролиза полимерных, олигомерных и искусственных субстратов не меняется и находится в пределах от 6,5 до 7,0 для большинства тестированных образцов. Только часть 1§М от пациентов с РС обладала более кислым рН оптимумом - 4,5 - 5,5 (рис 9 и 10). Т.е., в зависимости от значения рН-оптимума, можно разделить на две группы: те, что имеют рН-оптимум в районе 6,5 - 7,5, и те, чей оптимум при более низких значениях рН.

Рис 9 (слева) рН-зависимости гидролитической активности некоторых препаратов ДО и из молока разных доноров з^АЗ, з1{>А7, э^Ав, ДОЮ

Рис 10 (справа) рН-зависимости гидролитической активности некоторых препаратов 1§М от разных пациентов с РС в реакциях с рЫр-мальтопентаозидом Индексы относятся к номеру пациента

• Кинетические параметры гидролиза. Следует отметить, что во всех случаях гидролитические реакции подчинялись кинетике Михаелиса-Ментен, что подтверждалось линейностью зависимостей в координатах Лайнуивера-Берка (рис. 11). Т.к. все работы проводились с поликлональными антителами, представляющими собой большой набор антител и, соответственно, возможных абзимов, подчинение кинетики уравнению Михаэлиса-Ментен означает, что в смеси катализаторов проявляется активность одного из них, наиболее активного в данном виде измерения, и его активность заметно превосходит активности других. Соответственно, измеряемое значение Км соответствует реакции с участием этого абзима

Рис 11 Анализ гидролиза рМр-мальтопентаозида как функции от концентрации субстрата для ДО и антител из молока разных доноров по методу Лайнущера-Берка: ДОЮ.

1/lPNP-(Gtc)J. mmol '

Кинетические

данные

для гидролиза рКр-мальтопентаозида, катализируемого абзимами из человеческого молока и выделенными из крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями, представлены в таблице 5.

Таблица 5. Кинетические параметры гидролиза рЫр-мальтопентаозы,

Фракция иммуноглобулина* АГм. мМ 103, с"1 (мМ- с)'1 1% AbZ

1^2 (РС) 0.013 ±0.001 84 ±1 646 ± 1

1^4 (РС) 0.54 ±0.01 276 ±3 51 ±3

ДО, (РС) 0.16 ±0.01 105 ±3 63 ±3

1^3 (СКВ) 0.02 ± 0.001 290 ±3 145 ±3

ДОз (СКВ) 0.22 ± 0.01 205 ±3 93 ±3

1ёМ5 (СКВ) 0.44 ±0.01 805 ±3 183 ±3

ДО2(молоко) 0.16 ±0.01 54 ±1 33 ±1

(молоко) 0.14 ±0.01 10 ±1 8 ±0.5

Я^А^, (молоко) 0.12 ±0.01 25 ± 1 20 ± 1

(молоко) 0.14 ±0.01 28 ±1 21 ±1

•Индексы относятся к номеру пациента

По сравнению с slgA и IgG из человеческого молока, для которых значения Км были порядка 0,1 - 0,2 мМ, только некоторые препараты IgM из крови пациентов с PC и СКВ имели значения Км на два порядка ниже. Такие (микромолярного порядка) значения ^"м являются характерными для человеческих абзимов, обладающих протеин и ДНК-гидролизующей активностью. Самая важная характеристика гидролитических реакций, катализируемых абзимами, - это отношение ¿саДилсм, которое для амилолитических абзимов порядка 104 - 105, как и для большинства остальных абзимов.

Следует отметить, что переход от от необработанных IgG3 и IgG7 из крови пациентов с СКВ (Км - 0,02 и 0,12 мМ, соответственно) к их Fab-фрагментам (Км = 0,03 и 0,14 мМ, соответственно) практически не меняет значения Ки и kcа для реакции гидролиза pNpGlcj.

• Зависимость каталитической эффективности (kaJKM) от длины субстрата может быть использована для получения полной информации об активном центре деполимераз, а именно, о числе субстрат-связывающих сайтов для олигомерных субстратов.

Зависимость каталитических параметров ксш и Км от длины субстрата была исследована на примере IgM-фракций из крови пациентов с PC. Протестированные IgM не проявляли а-глюкозидазной активности и не были способны гидролизовать короткие субстраты pNp-мальтозу и мальтотриозу, хотя были активны по отношению к pNpGlc4 — Glcs, таким образом демонстрируя экзо-амилазный тип действия. Значения ксэт уменьшаются с увеличением степени полимеризации субстрата, в то время как влияние длины субстрата на АТМ более сложное. Зависимости скоростей гидролиза от степени полимеризации субстратов представлены на рис. 12 и в таблице 6.

Таблица 6. Кинетические параметры гидролиза PNPGe-s, катализированного IgMig.

Субстрат аг„ьмм 10j, c" l ICc* ■ loxm (c • мМ)"1

pnpg5 0.04 ± 0.001 400 ±4 100±4

pnpg6 0.01 ± 0.01 480 ±5 480 + 5

pnpgy 1.05 ±0.01 300±3 285 ±3

pnpgg 1.82 ±0.01 50 ± 0.5 27.5 ± 0.5

0,04-

Рис. 12. Сравнение величин относительной скорости ((мкмоль/мин/мг) 102) гидролиза мальтоолигосахаридов со степенью полимеризации 4 — 7, катализируемого несколькими отдельными иммуноглобулинами

SPNPG4 BRNPGi OPNPG6 BPNPG7

Тип действия. Тип действия абзимов исследовали на основе анализа продуктов гидролиза а-О-мальтоолигосахаридов и рЫр-а-В-мальтоолигосахаридов (модифицированных и немодифицированных) методами ТСХ (рис. 13 и 14) и ВЭЖХ (рис. 15).

Рис 13 Тонкослойная хроматография продуктов гидролиза мальтоолигосахаридов препаратами $1(5А5 и Показаны продукты э^А- и ^в-зависимого гидролиза мальтозы (1, 6), мальтотриозы (2, 7), мальтотетраозы (3, 8), мальтопентаозы (4, 9), мальтогексаозы (5, 10), соответственно, линии 11 — 15 показывают положение мальтозы (11), мальтотриозы (12), мальтотетраозы (13), мальтопентаозы (14),

мальтогексаозы (15). Пластинку обрабатывали, как описано в Материалах и методах.

Рис 14 Тонкослойная хроматография начальных продуктов гидролиза рЫр-мальтоолигосахаридов препаратом Показаны

продукты 1;^1-зависимого гидролиза рЫрОс? (3), рЫрас4 (4), р^асз (5), рЫрас2 (6), р^гасв (8) рЫрас7 (10) и рНр01с8 (12) Линии (1) и (6) показывают положения свидетелей - рИр-мальтоолигосахаридов с п = 1 — 8 Линии (2), (9), (И), (13) показывают положение исходных субстратов в контрольной реакции (в отсутствие антитела) Пластинку сначала посмотрели в УФ (карандашные линии), а затем обрабатывали, как описано в Материалах и методах

Рис 15 ВЭЖХ-анализ начальных продуктов гидролиза pNpGlcs, pNpGIc6, pNpGlc7 препаратом lgM37 с помощью колонки Lichrosorb С18 (20x4,8 мм) Реакции проводили в 30 мМ буфере Трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ NaNj при 37 °С

L I

• а-Глюкозидазная активность. Прежде всего, препараты амилолитических абзимов различаются по способности гидролизовать pNpGlc, т.е. по обладанию или нет а-глюкозидазной активностью. Активность IgG- и sIgA-препаратов из молока по отношению к EPS (4,6-0-этилиден-рНр01с5) и pNpGlc показана на рис. 16. а-Глюкозидазная активность препаратов IgG и IgM от пациентов с СКВ показана на рис 17. pNpGlc, pNpGlc5 и pNpGlc6 были протестированы в качестве субстратов для анализа гидролитической активности препаратов IgM из крови пациентов с PC. Различия в значениях специфической активности были использованы для оценки типов действия абзимов по отношению к этим субстратам (таблица 7).

Таблица 7. Специфические каталитические активности отдельных фракций IgM в гидролизе pNpGlc (а-глюкозидазная активность), pNpGlc5j и pNpGlc6 (а-амилазная активность)__

Фракция иммуноглобулинов* Специфическая каталитическая активность, (мкмоль/мин мг)

pNpGlc pNpGlcs pNpGlCi

IgM4 12 8±0 1 4.0 ± 0 1 3 9 ± 0 1

IgM, 12 1 ±0.1 5 0 ± 0.1 4 6 ± 0 1

IgM8 8 4 ± 0 1 3 8 ± 0 1 3 8±0 I

IgM)2 0 05 ± 0 01 5 2 ± 0.1 5 6 ± 0 1

IgM|9 <0 05 8 0±0 1 9 4 ± 0 1

IgMj, 0 10 ± 0.01 3.2 ±01 3.9 ± 0 1

lgM43 <0 05 3 4 ± 0 1 4.0 ±0.1

IgM52 <0 05 3.8 ±0 1 4.2 ±0.1

♦Индекс соответствует номеру пациента.

а-Глюкозидазную активность обнаружили четыре из восьми препаратов IgM, протестированных в этом эксперименте. Более того, для трех тестированных образцов активности в реакции гидролиза рЫр01с5 были выше, чем в реакции гидролиза рКр01с6, в то время как для пяти остальных ^М-фракций активности увеличивались с увеличением длины субстрата.

f 0 20 -| 0 16

"""...». 1д042 "">"..,«.• '»""...ДМ

1дМ( -3й, IgM, I0G, 1дМ„ |(Ю„ |дМ„ «в„ «м, IBQW

Рис 16 (справа) Специфическая амилолитическая (EPS) и а-глкжозидазная (pNpGlc) активности IgG и slgA из молока

Рис 17 (слева) а-Глюкозидазная активность препаратов IgG и IgM от пациентов с СКВ в реакции гидролиза pNpGlc

• Анализ конечных продуктов гидролиза. Четыре 1(>М-препарата, не обладающие глюкозидазной активностью, были изучены ВЭЖХ-определением (как описано в Материалах и методах) продуктов гидролиза таких субстратов как рЫрС1с4 — рЫрОсу (таблица 8).

Как видно из таблицы, все четыре образца, обладающие экзо-действием, не гидролизовали рЫрС1с2 — рЫр01с3 и не проявляли а-глюкозидазной активности. Наиболее значимая разница в типе действия - неспособность некоторых ^М гидролизовать р^01с4. Два препарата проявляли активность по отношению к этому субстрату, а два - нет.

Таблица 8. Выходы* продуктов гидролиза п-нитрофенил мальтоолигосахаридов, катализируемого отдельными 1йМ5 на момент 30 % конверсии субстрата_

Субстрат Продукты (моль/моль рЫр-продуктов)*'

р1Мр02 i рЫрвз | рЫрС4 рЫрвг | рЫрОз | рЫрв4

1ЕМ, 1ем2

рыро4 10 0 90 0 0 100

рырс5 82 5 17 5 0 82 7 173 0

рыроб 48.5 36.8 14 7 48 2 51 8 0

рырс7 26.5 17 56 5 Но Но Н.о.

12Мз 1йМ4

рмро4 0 0 100 3 0 97

рыр05 80 5 19 5 0 86 6 13.4 0

РЫРвб 49 9 37 13 1 52 5 26 9 20 4

риро7 22 7 182 59 1 22 5 21 57 5

♦Выходы даны как среднее для, как минимум, трех определений

• Сравнительный анализ начальных и конечных продуктов гидролиза субстратов. Для более ясной демонстрации типа действия был проведен сравнительный анализ начальных (30±2% конверсии) и конечных (80±3%) продуктов гидролиза субстратов.

Данные анализа продуктов гидролиза мальтоолигосахаридов с различной длиной цепи препаратами ^О и з1§А из молока представлены в таблице 9.

Таблица 9. Продукты гидролиза мальтоолигосахаридов, катализируемого несколькими различными препаратами 1§в и э^А из человеческого молока _

Субстрат

Нач прод Конечн прод. Нач прод Конечн прод Нач прод Конечн прод

Мальтоза - - - - 01" 01

Мальтотриоза - - - - 01,02

Мальтотетраоза в2 02 02 02 02

Мальтопентаоза вг.аз 02,03 02,03 02,03 02,03 01

Мальто-гексаоза 02,03,04 02,03 02,03,0 4 02,03 01,02,0 3,04,05 01

'Реакции проводились в 30 мМ/л Трис НС1, рН 7 5, 1 мМ/л №N3, при 37°С в течение 24 часов и 7 суток Концентрация мальтоолигосахаридов была 5 ммоль/мл Начальные и конечные продукты определялись после 24 часов и 7 суток, соответственно 01, глюкоза, в2, мальтоза, 03, мальтотриоза, 04, мальтотетраоза, 05, мальтопентаоза

Интересно, что большинство и все $1££А-фракции не гидролизуют короткие олигосахариды мальтозу и мальтотриозу (кроме в^А9), но проявляют активность по отношению к более длинным субстратам. Следует отметить, что конечные продукты гидролиза длинных (п>3) субстратов были различными для различных и sIgA препаратов. Результаты сравнительного анализа начальных и конечных продуктов гидролиза рКр01с6, катализированного двумя образцами 1§М, не обладающими а-гликозидазной активностью, приведены в таблице 10.

Таблица 10. Специфичность абзимов (1$М) от двух пациентов с РС в реакции

Продукт Фракция иммуноглобулина/Субстрат

Выход, %' Выход, %

Начальны й* Конечный8 Начальный Конечный

РЫТО: 10 15 10 25

РЫРвз 20 20 5 15

РЫР04 5 15 Но 1 5

Мальтоза Но Но 5 5

Мапьтотриоза 15 15 10 25

Мальтотетраоза Но Но 5 15

В процентах от первоначального количества субстрата ' Начальные продукты означают продукты, образовавшиеся через 1 — 3 дня ' Конечные продукты означают продукты, образовавшиеся через 10 дней ' Но - не определялось

Эти два препарата дали разные наборы продуктов гидролиза, что свидетельствует о существенных различиях в типе действия.

Различия в специфичности связывания субстратов препаратами антител из крови пациентов с СКВ. Доказательство микрогетерогенности в типе действия также может быть получено путем анализа гидролитических активностей абзимов из крови пациентов с СКВ по отношению к синтетическим субстратам - МеитЬ-а-О-мапьтоолигосахаридам с различной степенью полимеризации.

Таблица 11. Различия в типе действия образцов 1% из крови пациентов с СКВ в реакциях гидролиза МеитЬ-мальтоолигосахаридов *Единица активности' одна единица активности определялась как количество МеитЬ, высвобождаемого в течение

Абзим Активность, Ед/мг х 10'л

(ас)3-МеитЬ (01с)4-МеишЬ (01с)5-МеишЬ

ДО, 1 5 ±0 01 5 ±001 8 5 ±0 01

<0 1 <0 1 <0 1

№ <0 1 <0 1 <0 1

15 ±0 1 20 ±0 1 24 ±0 1

■ЕМ,, <0 1 <0 I <0 I

•Нижний индекс соответствует номеру пациента

Сравнение продуктов гидролиза МеишЬ-мальтотетраозы набором ^М, не способных гидролизовать рМрОс, приводит к разделению абзимов на две группы- первая способна отщеплять свободный МеИшЬ в процессе гидролиза в отличие от другой (таблица 11).

Следовательно, внутри группы с экзо-амилолитическим действием мы наблюдаем две подгруппы, различающиеся типом действия или специфичностью Первая не способна связывать МеЧтЬ сайтом +1 активного центра, в то время как вторая обладает этой способностью, приводящей к выделению свободного МеША в процессе гидролиза (рис. 18).

СаЫуК дгоир

-О-О-О О-О-О--

Рис. 18 Схематическая структура активного центра амилолитического абзима и его связывающих центров.

о-о-о-о

О-О О

О-О-О

О-О-МеитЬ СНО—О-МвитЬ О-МеишЬ

о-о-о о-о о

•1 «1

О-МеЧтЬ О-О-МеЦтЬ О-О—О-МеитЬ

Итак, различия в типе действия гораздо очевиднее демонстрируют каталитическую гетерогенность иммуноглобулинов, чем сравнение кинетических параметров антител. Наиболее явное различие в том, что часть препаратов демонстрируют экзо-амилазную активность, в то время как другие проявляют также и а-глюкозидазную, выражающуюся в способности абзимов гидролизовать короткие мальтоолигосахариды. Следовательно, все протестированные препараты иммуноглобулинов могут быть разделены на две основные группы в соответствии с их типом действия. Такие отличия зафиксированы для всех изученных типов иммуноглобулинов с амилолитической активностью. Анализ соотношения продуктов гидролиза внутри обеих групп (экзо-амилолитически и экзо-амилолитически/а-О-глюкозидазно действующие антитела) также обнаруживает каталитическую микрогетерогенность. Таким образом, некоторые препараты в^А и из человеческого молока, отнесенные к группе с экзо-амилазным действием, продемонстрировали различия в относительном содержании продуктов гидролиза мальтоолигосахаридов со степенью полимеризации 3 - 6 , проведенного в одинаковых условиях с использованием различных образцов абзимов (таблица 8). Другие важные проявления гетерогенности изученных антител заключаются в их способности гидролизовать рМрОсд, в различных выходах конечных продуктов гидролиза рКрСНс,;, различных зависимостях скоростей гидролиза от длины субстратов.

Наши данные по гетерогенности а-амилазной активности абзимов согласуются с опубликованными данными, касающимися энзиматической

неоднородности РНКазных и ДНКазных активностей абзимов из крови СКВ и РС пациентов и из человеческого молока.

С нашей точки зрения, самым надежным доказательством того, что амилолитическая активность принадлежит именно антителам, является вариабельность типов действия, демонстрируемая различными фракциями абзимов. Совершенно невероятно, чтобы такое разнообразие типов действия определялось присутствием примесных ферментов.

Другие гликозидгидролазные активности. Набор из 12 препаратов ^М от различных пациентов с РС был проанализирован на наличие других гликозидгидролазных активностей. В качестве контроля использовались образцы ^М от здоровых пациентов. рКр-а/р-О-глюкопиранозиды, рМр-а/р-О-маннопиранозиды, рКр-а/р-Б- галактопиранозиды, рИр-а/р- 14-

ацетилглюкоаминиды, рКра-Ь-фукопиранозид, рИр-Р-О-фукопиранозид и рИр-Р-О-ксипопиранозид были протестированы как возможные субстраты для ^М от пациентов с РС и здоровых доноров. Реакции проводились в 5 мМ фосфатном буфере, рН 6,8, при 37°С. Ни препараты ^М от пациентов с РС, ни соответствующие антитела от здоровых доноров не проявили заметной гликозидгидролазной активности по отношению ко всем этим субстратам. Трансгликозилирующая активность абзимов. Реакции субстратного трансгликозилирования были изучены для набора различных типов иммуноглобулинов, проявляющих амилолитическую активность. Как показал ВЭЖХ (колонка 1лс1ткогЬ С18) и ТСХ-анализ продуктов реакции, ни один из препаратов иммуноглобулинов не привел к образованию рИр-мальтоолигосахаридов с большей степенью полимеризации, чем субстрат, что должно было бы произойти в реакции трансгликозилирования. Более того, трансгликозилирующая активность препаратов иммуноглобулинов анализировалась при использовании pNpGlc4l pNpGlcs и рЫрС1с6 в 10 мМ концентрациях. Ни в одном случае не были зафиксированы продукты трансгликозилирования. ЯМР-анализ, широко используемый для установления стереохимии действия гликозидгидролаз, не может быть использован в случае абзимов из-за низкой специфической активности абзимов. Тем не менее, отсутствие трансгликозилирования препаратами иммуноглобулинов может служить косвенным доказательством того, что абзимы катализируют гидролиз глюкозидной связи с инверсией аномерной конфигурации.

Субстратная специфичность абзимов в сравнении с а-амилазами. Объединяя все полученные данные о каталитических свойствах амилолитических человеческих антител, мы можем продемонстрировать яркие различия между традиционными а-амилазами и амилолитическими антителами.

• а-Амилазы - это сохраняющие гликозидгидролазы, обладающие трансгликозилирующей активностью. Наоборот, амилолитические абзимы вообще не проявили трансгликозилирующей активности.

• Независимость начальной скорости гидролиза абзимами от длины субстрата, в то время как а-амилазы из слюны демонстрируют линейную зависимость начальной скорости гидролиза от степени полимеризации субстрата.

• Амилолитические антитела в некоторых случаях проявляют а-глюкозидазную активность, а-амилазы не способны гидролизовать pNpGlc и мальтозу.

Возможные пути образования амилолитических абзимов. Исходя из особенностей иммунного статуса пациентов с аутоиммунными заболеваниями, можно предложить два возможных механизма возникновения каталитической активности у антител: Антиидиотипический ■

Известно, что при аутоиммунных заболеваниях происходит спонтанная наработка первичных AT к белкам, нуклеиновым кислотам и их комплексам, а затем вторичных АТ2 (антиидиотипов) к уже наработанным первичным ATI и т д Если в рамках этой теории антигеном, «запускающим» антиидиотипическую цепочку, будет активный центр фермента, то логично предположить, что вторичные - антиидиотипические АТ2 - будут обладать белковой структурой, часть которой имитирует структуру активного центра фермента, и, следовательно, АТ2 могут обладать свойствами исходного фермента. В связи с этим в настоящее время высказывается гипотеза о спонтанном образовании каталитических антител как ангиидиогипов к ферментным эпитопам в условиях аутоиммунных патологий. Однако этот путь возникновения абзимов при АИЗ, по-видимому, не единственный.

Иммунный ответ на гаптен:

Некоторые абзимы являются антителами непосредственно к гаптену (белку, ДНК и т д), что предполагает возможность образования каталитических антител по пути, близкому к описанному для AT, индуцированных стабильными аналогами переходных состояний химических реакций, когда определенный конформер какого-либо из собственных компонентов организма может выступать в качестве аналога переходного состояния.

Возможно, что одинаковые механизмы осуществляются и в крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями, и в молоке здоровых рожениц, т к ферментативные свойства препаратов IgM и IgG из молока и крови пациентов с АИЗ совершенно одинаковые. Короткий обзор успешных попыток продуцировать моноклональные антитела с гликозидазной активностью in vitro может прояснить этот вопрос. Известный аналог переходного состояния гликзидгидролазной реакции - 1-дезоксинайримицин (ингибитор а-глюкозидаз и глюкоамилаз) несколько раз был использован для генерирования моноклональных антител Полученные абзимы демонстрировали каталитическую эффективность kcJKM порядка 100 - 1000 (смМ)"1 и обладали различными гликозидгидролазными специфичностями Например, были получены серии моноклональных антител с p-D-глюкозидазной, a/p-D-галактозидазной, (3-D-N-ацетилглюкозаминидазной, p-D-фукозидазной активностями, наряду с a-D-ппокозидазной функцией Такое отсутствие определенной специфичности может быть объяснено, если принять во внимание тот факт, что аналоги переходного состояния, имитирующие пиранозные кольца, не дают абсолютной специфичности по отношению к глюкозе при иммунном ответе В нашем случае, отсутствие дру|их гликозидгидролазных активностей в IgG/IgM фракциях, выделенных из крови аутоиммунных пациентов, дает основание предположить реализацию антиидиотипического механизма образования антител при АИЗ В

самом деле, этот подход может привести к высокой стереоспецифичности и стереоселективности абзимов, образующихся в человеческой крови и молоке

С другой стороны, удельные активности известных моноклональных антител, полученных иммунизацией аналогами переходных состояний, редко приближаются к значению удельных активностей соответствующих ферментов, а обычно на несколько порядков ниже. Считается, что связано это с тем, что редко удается получить антитела, у которых наряду со структурной стабилизацией переходного состояния были бы еще правильные каталитические группы в правильном месте В принципе, каталитических групп, как таковых, т.е. групп, осуществляющих гомогенный катализ, может не быть совсем. Если каталитических групп нет, то не должно быть и рН-зависимости активности как отражения процессов протонирования-депротонирования каталитических групп Наличие рН-зависимости (если это не является отражением влияния рН на общую структуру абзима) также говорит в пользу антиидиотипического происхождения абзимов.

ВЫВОДЫ

1.Уровень амилолитической активности препаратов и 1дМ из сыворотки крови пациентов с подтвержденным диагнозом «рассеянный склероз» и «системная красная волчанка» на три порядка выше, чем у препаратов антител из крови здоровых доноров.

2.Высокочувствительный метод, основанный на измерении хромо- и флуорогенных меток синтезированных нами субстратов, дает возможность измерять скорость гидролитических реакций, катализируемых абзимами, при концентрациях субстратов порядка 10"6 М/л (порядка Км для антител), что необходимо для вычисления кинетических параметров амилолитических антител на основе стандартного метода начальных скоростей реакций.

3.Основной особенностью поликлональных абзимов является каталитическая гетерогенность.

4. Характер действия абзимов отличается от характера действия типичных а-амилаз по стереоспецифичности, кинетическим параметрам, типу действия в реакциях гидролиза субстратов.

Список публикаций по теме диссертации

1. Ivanen, D.R., Kulminskaya, А А , Eneyskaya, E.V., Ershova, N.A., Shabalin, К А , Savel'ev, A.N., Kanyshkova, T.G., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A, Neustroev, K.N. (2002) Human autoantibodies with amylolytic activity. Biologia, Bratislava, vol. 57, Suppl. 11,253-260.

2. Saveliev, A.N., Ivanen, D.R., Kulminskaya, A.A., Ershova, N.A, Kanyshkova, T.G., Buneva, V.N., Mogelnitskii, A.S., Doronin, B.M., Favorova, O.O., Nevinsky, G.A., and Neustroev, K.N. (2003) Amylolytic activity of IgM and IgG antibodies from patients with multiple sclerosis. Immunol Lett., 86 (3), 291 — 297.

3. Neustroev, K.N., Ivanen, D.R., Kulminskaya, A.A., Brumer III, H, Saveliev, А N , Nevinsky, G.A. Amylolytic activity and catalytic properties of IgM and IgG antibodies from patients with systemic lupus enthematosus. Oral presentation at Human Antibodies

Antibodies and Hybridomas, 2003, Osaka, Japan, October 2003; published in Human Antibodies (2003) 12 (1,2):31 - 34.

4 Saveliev, A N , Kulminskaya, A. A , Ivanen, D.R., Nevinsky, G.A., Neustroev, K.N. (2004) Human autoantibodies with amylolytic activity, Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 16: 17 — 31.

5 Ivanen, D.R., Kulminskaya, A.A., Shabalin, K.A., Isaeva-Ivanova, L.S., Ershova, N A , Saveliev, A.N., Nevinsky, G.A., Neustroev, K.N. (2004) Catalytic properties of IgMs with amylolytic activity isolated from patients with multiple sclerosis. Med Sci. Monit. 10: 273 - 280.

Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю, безвременно ушедшему из жизни к.б.н. Кириллу Николаевичу 11еустроеву за неоценимую помощь на всех этапах выполнения данной работы.

Я выражаю благодарность д.б.н., профессору Г. А. Невинскому за любезно предоставленные препараты антител и к б.н. А.Н. Савельеву за любезно предоставленный фермент циклодекстрин глюкозилтрансферазу из Bacillus sp.

Я также хочу поблагодарить всех сотрудников лаборатории энзимологии ОМРБ ПИЯФ РАН за поддержку, помощь в работе над диссертацией и полезное обсуждение результатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 03-04-48756, 03-04-49741).

{ ;

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 441, тир. 70, уч-изд. л. 1,5; 14.12.2004 г.

РНБ Русский фонд

2005-4 36639

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бобрикова, Дина Робертовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна полученных результатов.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

1.6. Апробация работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Иммуноглобулины. Основные понятия.

2.1.1. Структура.

2.1.2. Типы иммуноглобулинов.

2.1.3. Генетические основы многообразия иммуноглобулинов.

2.1.4. Связывание гаптена.

2.1.5. Гибридомы и моноклональные антитела.

2.2. Абзимы — биокатализаторы с неограниченными возможностями.

2.2.1. Применение в медицине.

2.2.2.Применение в химии.

2.2.3. Возможная роль абзимов в химии углеводов.

2.3. Иммунная система обладает внутренним свойством генерировать абзимы при различных патологиях.

2.4. Возможные механизмы образования абзимов.

2.4.1. Анти-идиотипический.

2.4.2. Иммунный ответ на гаптен.

2.5. Доказательство принадлежности каталитической активности антителам.

2.6. Ферментативные свойства природных абзимов, гидролизующих нуклеиновые кислоты и фосфорилирующих белки.

2.7.Проблемы получения гомогенных препаратов абзимов.

2.8. Специфические субстраты для исследования глюкозидгидролаз.

2.8.1. Использование хромо- и флуорогенных меток.

2.8.2. Применение ферментативного подхода для синтеза субстратов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Реактивы и ферменты.

3.2. Синтез субстратов.

3.2.1. п-Нитрофенил-а-О-глюкопиранозид.

3.2.2. Индолэтил-Р-Т)-глюкопиранозид. 49 3.2.3 МеишЬ-, рЫр- и 1гк1-мальтоолигосахариды

3.2.4.рЫр-(МеишЬ)-4.6-0-бензилиден-(этилиден-)мальтоолигосахариды.

3.2.5. Индолэтил-Р-0-галактопиранозил-4-0-бис-(а-0-глюкопиранозил)-4-0-а-0-глюкопиранозид.

3.2.6. Индолэтил 6-М-6-(5-(2-аминоэтиламино)-1-нафталенсульфонат)-6-дезокси-Р-0-галактопиранозил-4-0-бис-(а-0-глюкопиранозил)-4-0-а-Б-глюкопиранозид.

3.3. Доноры и пациенты.

3.4. Выделение абзимов.

3.5. Получение и очистка фрагментов иммуноглобулинов.

3.6. Другие методы.

3.7. Анализ степени очистки антител методом электрофореза в денатурирующих условиях

3.8. Анализ амилолитической активности антител методом электрофореза в денатурирующих условиях

3.9. Доказательство принадлежности амилолитической активности антителам.

3.10. Проверка активности.

3.11. Тип действия.

3.12. Измерение флуоресценции.

3.13. Анализ траисгликозилирующей активности. 58 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Электрофоретическая гомогенность препаратов абзимов.

4.2. Синтез субстратов.

4.3. Амилолитическая активность различных препаратов иммуноглобулинов.

4.4. Гидролитические свойства амилолитических абзимов.

4.4.1. рН-зависимость гидролиза субстратов.

4.4.2. Кинетические параметры гидролиза.

4.4.3. Зависимость каталитической эффективности от длины субстрата.

4.5. Тип действия.

4.5.1. а-Глюкозидазная активность.

4.5.2. Анализ конечных продуктов гидролиза субстратов.

4.5.3. Сравнительный анализ начальных и конечных продуктов гидролиза субстратов.

4.5.4. Различия в специфичности связывания субстратов препаратами антител из крови пациентов с СКВ.

4.6. Другие гликозидгидролазные активности.

4.7. Анализ констант ингибирования.

4.8. Трансгликозилирующая активность абзимов.

4.9. Субстратная специфичность абзимов в сравнении с а- амилазами.

4.10. Возможные пути образования амилолитических абзимов у людей с аутоиммунными заболеваниями и в человеческом молоке.

4.11. Тестирование амилолитической активности — дополнительный критерий для диагностики аутоиммунных заболеваний.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Амилолитическая активность каталитических антител"

1.1. Актуальность проблемы.

Феномен наличия у иммуноглобулинов каталитических свойств активно исследуется в течение последних десятилетий. Это привело к возникновению нового направления в классической иммунологии и энзимологии, новой области биокатализа - абзимологии. (Антитела-энзимы были названы «абзимами» как аббревиатура от AntiBody и enZIME).

Впервые гипотеза, согласно которой антитела, комплементарные структуре переходного состояния химической реакции, должны катализировать эту реакцию, ускоряя достижение переходного состояния и стабилизируя его, была высказана Б.Дженксом в 1969г (Jencks, W. 1969).Он же предвидел возможность получения абзимов как антител к стабильным аналогам переходных состояний. Идеи Дженкса получили экспериментальное подтверждение; в целом за последние 30 лет с использованием рассмотренного подхода направленного синтеза абзимов были получены антитела, способные катализировать более 100 различных химических реакций.

Открытие природных каталитических антител, явившееся реальным подтверждением теории, произошло лишь в 1989г (Paul et al., 1989). Столь значительное отставание практики от теории связано с уровнем развития методов выделения и очистки антител, а именно, с возможностью доказать принадлежность каталитической активности непосредственно антителам, а не каким-либо примесям ферментов. До этого считалось, что основная функция антител заключается только в связывании и элиминировании антигенов, а обнаруженная каталитическая активность (Slobin, 1966., Kit et al., 1991., Кульберг и др., 1969) принадлежит «ферментам, сорбированным на молекулах антител» (Slobin, 1966., Кульберг и др., 1969). Итак, в результате разработки методологии доказательства каталитической активности абзимов (Paul et al., 1989) (подробнее см. ниже), каталитические IgG и IgM, гидролизующие пептиды (Paul et al., 1989), белки (Kalaga et al., 1995), ДНК

Shuster et al., 1992; Gololobov et al., 1995), ДНК и РНК (Buneva et al., 1994; Vlassov ci a!., 1998a, 1998b; Andrievskaia et al., 2000; Baranovskiy et al, 2001) были обнаружены в сыворотке крови пациентов с различными аутоиммунными патологиями: бронхиальная астма (Paul et al., 1989), СКВ (системная красная волчанка) (Shuster et al., 1992; Gololobov et al., 1995; Buneva et al., 1994; Vlassov et al., 1998a, 1998b; Andrievskaia et al., 2000), аутоиммунный тиреоидит, полиартрит (Kalaga et al., 1995; Vlassov et al., 1998a, 1998b), PC (рассеянный склероз) (Baranovskii et al., 2001). Также абзимы с различными каталитическими активностями были найдены в крови и молоке здоровых матерей (Buneva et al., 1998; Nevinsky et al., 1998, 2000a, 2000b). Препараты slgA, выделенные из человеческого молока, обладают протеинкиназной (Nevinsky et al., 1998), ДНКазной или РНКазной активностями (Kanyshkova et al., 1997; Buneva et al., 1998; Nevinsky et al., 2000b), а также IgG и slgA способны гидролизовть ATP (Semenov et al., 1998).

Давно известно, что аутоиммунные заболевания ассоциированы с циркуляцией аутоантител, связь которых с основным патологическим процессом установить удается не всегда. Так, ревматоидный фактор, который часто обнаруживают при ревматоидном артрите, представляет собой специфические антитела к сывороточному гамма-глобулину, но совершенно непонятно, почему они возникают и в чем заключается их действие. Аналогичным образом, при так называемых коллагенозах типа СКВ и дерматомиозита, часто находят циркулирующие антитела против ДНК или комплексов ДНК с гистонами, однако и в этом случае происхождение и функции аутоантител остаются неясными (Silverstein et al., 1987).

Перечисленные выше открытия каталитических функций у аутоантител поставили много дополнительных вопросов об их природе и возможной биологической роли. Можно предположить, что в каталитической активности абзимов запрограммированы дополнительные энзиматические возможности организма, появление которых происходит только в особых условиях, например, при беременности женщин, АИЗ, или других пока еще не обнаруженных случаях (Бешепоу ег а1., 1998). Перспективными направлениями дальнейших исследований в области биокатализа, обусловленного антителами, является поиск новых каталитических активностей антител, расширение круга исследованных заболеваний, а также детальное сравнение абзимов у здоровых людей и пациентов с АИЗ. Такие данные могут прояснить роль каталитических антител в этиологии и/или патогенезе различных заболеваний (так и их возможную функцию в случае здоровых рожениц), расширить наши представления о путях метаболизма биологически активных соединений в организме человека, привести к расширению классических представлений о роли иммуноглобулинов и могут способствовать более глубокому пониманию механизмов возникновения аутоиммунного ответа (АгкЫеузкша е1 а1.,1998).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бобрикова, Дина Робертовна

6. выводы.

1.Уровень амилолитической активности препаратов и ^М из сыворотки крови пациентов с подтвержденным диагнозом «рассеянный склероз» и «системная красная волчанка» на три порядка выше, чем у препаратов антител из крови здоровых доноров.

3.Основной особенностью поликлональных абзимов является каталитическая гетерогенность.

6. ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ivanen, D.R., Kulminskaya, A.A., Eneyskaya, E.V., Ershova N.A., Shabalin, K.A., Savel'ev, A.N., Kanyshkova, T.G., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A, Neustroev, K.N. (2002) Human autoantibodies with amylolytic activity. Biologia, Bratislava, vol. 57, Suppl. 11, 253-260

2. Saveliev, A.N., Ivanen, D.R., Kulminskaya, A.A., Ershova, N.A., Kanyshkova, T.G., Buneva, V.N., Mogelnitskii, A.S., Doronin, B.M., Favorova, O.O., Nevinsky, G.A., and Neustroev, K.N. (2003) Amylolytic activity of IgM and IgG antibodies from patients with multiple sclerosis. Immunol. Lett., 86 (3), 291 -297

3. Neustroev, K.N., Ivanen, D.R., Kulminskaya, A.A., Brumer III, H., Saveliev, A.N., Nevinsky, G.A. Amylolytic activity and catalytic properties of IgM and IgG antibodies from patients with systemic lupus erithematosus. Oral presentation at Human Antibodies and Hybridomas 2003, Osaka, Japan, October 2003; published in Human Antibodies (2003) 12 (l,2):31-34.

4. Saveliev, A.N., Kulminskaya, A.A., Ivanen, D.R., Nevinsky, G.A., Neustroev, K.N. (2004) Human autoantibodies with amylolytic activity, Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 16: 17-31.

5. Ivanen, D.R., Kulminskaya, A.A., Shabalin, K.A., Isaeva-Ivanova, L.S., Ershova, N.A., Saveliev, A.N., Nevinsky, G.A., Neustroev, K.N., Catalytic properties of IgMs with amylolytic activity isolated from patients with multiple sclerosis. Med. Sei. Monit. 2004. 10:273-280.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я хочу выразить огромную благодарность своему научному руководителю, безвременно ушедшему из жизни к.б.н. Кириллу Николаевичу Неустроеву.

Я выражаю благодарность д.б.н., профессору Г. А. Невинскому за любезно предоставленные препараты антител и к.б.н. А.Н. Савельеву за любезно предоставленный фермент циклодекстрин глюкозилтрансферазу из Bacillus sp.

Я также хочу поблагодарить всех сотрудников лаборатории энзимологии отделения молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ РАН за поддержку, помощь в работе над диссертацией и полезное обсуждение результатов. Особенно хочу поблагодарить к.б.н. Савельева А.Н. за критический анализ подготовленной диссертации и ценные замечания.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе впервые показано наличие амилолитической активности у препаратов IgG и IgM сыворотки крови пациентов с подтвержденным диагнозом рассеянный склероз и системная красная волчанка (Ivanen et al., 2002; 2004; Savel'ev et al.,2003), а также у препаратов IgG и slgA из человеческого молока (Ivanen et al., 2002; Savel'ev et al., 2003). Нами установлено, что фракции IgM, выделенные из крови пациентов с PC и СКВ, имеют амилолитическую активность, на три порядка превышающую активность IgM из крови здоровых доноров (Ivanen et 31^2002; 2004; Savel'ev etal., 2003).

Установлено, что за реализацию амилолитической активности препаратов антител в значительной степени отвечают Fab-фрагменты:

• Уровни активности исходных иммуноглобулинов и соответствующих им Fab-фрагментов практически равны (Ivanen et al., 2002; 2004; Savel'ev et al., 2003).

• Значения кинетических параметров Км и kcat в реакции гидролиза п-нитрофенил-мальтопентаозида, катализируемой препаратами IgG из крови пациентов с СКВ и соответствующими Fab-фрагментами практически не меняются (Neustroev et al., 2003).

Для исследования амилолитической активности антител (определения кинетических параметров и типа действия) нами были синтезированы и использованы специфические субстраты, представляющие собой мальтоолигосахариды, содержащие хромо- и флуорогенные метки. Подобные субстраты отвечают требованиям кинетических экспериментов с антителами т.к. позволяют измерять скорость гидролитических реакций, катализируемых абзимами, при концентрациях субстрата порядка 10"6 М/л (порядка Км для антител), что необходимо для определения кинетических параметров на основе стандартного метода начальных скоростей реакций.

В результате экспериментов, проведенных с использованием синтетических субстратов, обнаружено, что амилолитические абзимы, полученные от различных доноров^ демонстрируют изменение репертуара от индивида к индивиду (обладают различными рН-оптимумами; различными кинетическими параметрами; часть абзимов проявляет только экзо-амилолитическую активность, другие обладают также а-глюкозидазной; часть препаратов с экзо-амилолилтческим действием способны связывать агликон ф сайтом +1 активного центра и отщеплять его, а другая часть -нет). т

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бобрикова, Дина Робертовна, Санкт-Петербург

1. Avalle В., Thomas D., Friboulet A. 1998. Functional mimcry: elicitation of a monoclonal anti-idiotypic antibody hydrolyzing beta-lactams. FASEB J. 12: 1055.

2. Adachi K, Suzuki K, OhnoY, Sato B. Impaired amylase activities caused by binding of abnormal immunoglobulin A in patients with macroamylasemia. Clin. Chim. Acta. 1986; 154: 103-113.

3. Andrievskaia OA, Buneva VN, Naumov VA, Nevinsky GA. Catalytic heterogeneity of polyclonal RNA-hydrolyzing IgM from sera of patients with lupus erythematosus. Med Sei Monit 2000;6:460 -70.

4. Andrievskaya OA, Buneva VN, Yamkovoy VI, Nevinskii GA: Monoclonal antibodies to DNA hydrolyze RNA better than DNA. Dokl. Russian Akad. Nauk (Moscow), 1997; 355: 401-3

5. Andrievskaia OA, Buneva VN, Zabara VG, Naumov VA, Yamkovoi VI, Nevinskii GA: Immunoglobulins M from serum from peripheral blood of patients with lupus erythematosus effectively split RNA. Mol Biol (Mosk). 1998; 32: 908-15

6. Armand S, Drouillard S, Schülein M, Henrissat B, Driguez H. A 1997 bifunctionalized fluorogenic tetrasaccharide as a substrate to study cellulases. J Biol Chem;272:2709-13.

7. Armand S, Vielle C, Gey C, Heyraud A, Zeikus G. Henrissat B. 1996. Stereochemical course and reaction products of the action of beta-xylosidase from Thermoanaerobacterium saccharolyticum strain B6A-RI. Eur. J. Biochem. 236, 706-713.

8. Baranovskii AG, Kanyshkova TG, Mogilnitskii AS, Naumov VA, Buneva VN, Gusev EI, Boiko AN, Zargarova ТА, Favorova OO, Nevinsky GA:

9. Polyclonal antiobodies from blood and cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis effectively hydrolyze RNA and DNA. Biochemistry (Moscow), 1998; 63: 1459-69

10. Baranovskii AG, Matyushin VG, Vlassov AV, Naumov VA, Giege R, Buneva VN, Nevinsky GA: DNA- and RNA-hydrolyzing antibodies from blood of patients with various forms of viral hepatitis. Biochemistry (Moscow), 1997; 62: 1590-1599

11. Benkovic SJ. Catalytic antibodies. Annu. Rev. Biochem. 1992; 61: 29-54

12. Braun C, Brayer GD, Withers SG. Mechanism-based inhibition of yeast a-glucosidase and human pancreatic a-amylase by a new class of inhibitors: 2-deoxy-2,2-difluoro-a-glycosides. J Biol Chem 1995;270:26778-81.

13. Buneva VN, Kudryavtseva AN, Dubrovskaya VV, Khokhlova OV, Galenok VA, Nevinsky GA. Dynamics of nuclease activity level from blood of pregnant and parturient women. Biochemistry (Moscow) 2003;68:890-900.

14. Buneva VN, Andrievskaya OA, Romannikova IV, Gololobov GV, Yadav RP, Yamkovoi VI, Nevinskii GA: Interaction of catalytically active antibodies with oligoribonucleotides. Mol Biol (Moscow), 1994; 28: 738-43

15. Buneva VN, Kanyshkova TG, Vlassov AV, Semenov DV, Chlimankov DYu, Breusova LR, Nevinsky GA: Catalytic DNA- and RNA-hydrolyzing antibodies from milk of healthy human mothers. Appl. Biochem. Biotechnol, 1998;75:63-76

16. Bronstein I.B., Shuster A.M., Gromova I.I., Krashuk O.A., Geva O.N., Alekberova Z.S., Gabibov A.G. 1991. Anti-idiotypic antibodies to topoisomerase I in serum from patients with autoimmune diseases. Dokl. Akad. Nauk SSSR. 318: 1496.

17. Bronstein I.B., Shuster A.M., Gololobov G.V., Gromova I.I., Krashuk O.A., Belostotskaya K.M., Alekberova Z.S., Prokaeva T.B., Gabibov A.G. 1992. DNA-specific antiidiotypic antibodies in sera of patients with autoimmune diseases. FEBS Lett. 314:259.

18. Deng SX, de Prada P, Landry DW. 2002. Anticocaine catalytic antibodies. J. Immunol Methods, 269(1-2), 299-310.

19. Dupuy G, Hilaire G, Aubru C. 1987. Rapid determination of alpha-amylase activity by use of a new chromogenic substrate. Clin., Chem. 33/4, 524528.

20. Earnshaw WC, Rothfield N. Identification of a family of human centromere proteins using autoimmune sera from patients with scleroderma. Chromosoma. 1985;91:313-320

21. Eggert FM, Gurner BW. Reaction of human colostral and early milk antibodies with oral streptococci. Infect. Immun.1984; 44: 660-4.

22. Eneyskaya EV, Brumer H III, Backinowsky LV, Ivanen DR, Kulminskaya AA, Shabalin KA, Neustroev KN. Enzymatic synthesis of P-xylnase substrates: transglycosylation reactions of the P-xylosidase from Aspergillus sp. Carbohydr Res 2003;338:313-25.

23. Engvall T., Pesce AJ., Quantitative enzime immunoassay, 1978., Scand J. Immunol., 8(Suppl 7), 23.

24. Farkas E., Janossy L., Harangi J., Kandra L., Liptak A. 1997. Synthesis of chromogenic substrates of a-amylases on a cyclodextrin basis. 303., 407-415.

25. Friboulet A., Avalle B., Débat H., Thomas D. 1999. A possible role of catalytic antibodies in metabolism. Immunol. Today. 20: 474.

26. Gololobov GV, Chernova EA, Schourov DV, Smirnov IV, Kudelina IA, Gabibov AG. Cleavage of supercoiled plasmid DNA by autoantibody Fab fragment: application of the flow linear dichroism technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92: 254-257

27. Gololobov GV, Mikhalap SY, Starov AV, Kolesnikov AV, Gabibov AG. DNA-Protein complexes: Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. Appl. Biochem. Biotech. 1994; 47: 303-315

28. Gabibov AG, Gololobov GV, Makarevich Ol, Schourov DV, Chemova EA, Yadav RP. DNA-hydrolyzing autoantibodies. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994; 47: 293-303

29. Gregory RL, Kindle JC, Hobbs LC, Filler SS, Malmstrong HS. Function of anti-Streptococus mutants antibodies: inhibition of virulence factors and enzyme neutrolization.Oral Microbiol. Immunol. 1990; 5: 181-188

30. Guo J., Huang W., Zhou G. W., Fletterick R. J., Scanlan T. S. 1995, Mechanistically different catalytic antibodies obtained from immunization with a single transition-state analog. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 1694-1698.

31. Haegele EO, Kratzer M., Schaich E, Rauscher E. 1989. Mechanism of action of human pancreatic and salivary alpha-amylase on 4,6-ethylidene-alpha-4-nitrophenyl-maltoheptaoside substrate.Clin., Chem., 35, 188-199.

32. Haegele EO, Schaich E, Rauscher E, Lehmann P. 1982. Mechanism of action of human pancreatic and salivary alpha-amylase on alpha-4-nitrophenyl maltoheptaoside substrate. Clin., Chem., 28, 2201-2205

33. Hanson LA, Carlsson B, Cruz JR. Immune responce in the mammary glands. In: Ogra PL, Dayton DH, editors. Immunology of Breast milk. New York: Raven Press, 1979: 145-157.

34. Hanson LA, Hahn-Zoric M, Berndes M, et al. Breast feeding: overview and breast milk immunology. Acta Paediatr. Jpn. 1994; 36: 557-561

35. Harris H., Watkins JF. Hybrid cells derived from mouse and man: Artificial heterokaryons of mammalian cells from different species., 1965, 145, 709.

36. Hifumi E., Mitsuda Y., Ohara K., Uda T. 2002. Targeted destruction of the HIV-1 coat protein gp 41 by a catalytic antibody light chain. J. Immunol Methods. 269(1-2), 283-298.

37. Hifumi E., Okamoto Y., Uda T. 2001. How and why 41S-2 antibody subunits acquire the ability to catalyze decomposition of the conserved sequence of gp41 of HIV-1. Appl. Biochem. Biotechnol. 83: 209.

38. Hilvert D. Catalytic antibodies. Pyre Appl. Chem. 1992; 64: 1103-1113

39. Inaba T., Ohgushi T., Iga Y., Hasegava E. 1984. Sinthesis of 4-Methylcoumarin-7-yloxy Tetra-N-acetyl-b-chitotetraoside, a novel synthetic substrate for the fluorometric assay of Lysozyme. Chem. Pharm. Bull. 32(4) 1597 1603.

40. Ingana S. M., // S. J. Immunol. 1981., 13, 343.

41. Jencks W.P. Catalisis in chemistry and enzimology. N.Y.: McCraw -Hill, 1969. P 289.

42. Kakinuma YH, Fujii I, Nishi Y. 2002. Selective chemotherapeutic strategies using catalytic antibodies : a common pro-moiety for antibody-directed abzyme prodrug therapy. J. Immunol Methods. 269(1-2),269-281.

43. Kalaga R, James LL, O'Dell JR, Paul S. Unexpected presence of polyreactive catalytic antibodies in IgG from unimmunized donors and decreased levels in rheumatoid arthritis. J. Immunol. 1995; 155: 2695-2702

44. Kandra L, Gyemant G, Farkas E, Liptak A. Action patterns of porcine pancreatic alpha-amylase on three different series of P-maltooligosaccharide glycosides. CarbohydrRes 1997: 298:237-42.

45. Kandra L, Gyemant G. Examination of the active sites of human salivary a-amylase (HSA). Carbohydr Res 2000;329:579-85.

46. Kanyshkova TG, Semenov DV, Chlimankov DYu, Buneva VN, Nevinsky GA. DNA-hydrolyzing activity of the light chain of IgG antibodies from milk of healthy human mothers. FEBS Lett. 1997; 416: 23-27

47. Karush F., The interaction of purified anti-P-lactoside antibody with gaptens. 1957. J. Am. Chem. Soc., 79, 3380-3384.

48. Katayama S, Ikeuchi M, Kanazawa Y, et al. Amylase-producing lung cancer: case report and review of the literature. Cancer 1981; 48: 2499-2502

49. Katayama S., Ikeuchi M., Kanazava y., Akamuma Y., Kosaka K., Takeuchi T. And Nakayama T. 1981 Cancer, Amylase-producing lung cancer: case report and review of the literature.48, 2499-2502.

50. Kaufman RA, Dunca LJ, Hall LM. 1980. Recent advances in measurement of amylase activity—a comparative study. Clin., Chem., 26. 1018.

51. Kim K, Keller MA, Heiner DC. Immunoglobulin G subclasses in human colostrum, milk and saliva. Acta Paediatr.1992; 81: 113-118

52. Kimura A, Takewaki S, matsui H, Kubota M, Chiba S. Allosteric properties, substrate specificity, and subsite affinities of honeybee a-glucosidase I. J Biochem 1990;107:762-8.

53. Kit YuYa, Semenov DV, Nevinsky GA. Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobulin A. Biochem. Mol. Biol. Intern. 1996; 39: 521-527

54. Kit YuYa, Semenov DV, Nevinsky GA: Do catalytically active antibodies exist in healthy people. Mol Biol (Moscow), 1995; 29: 519-26

55. Kit Yu. Ya., Kim A.A., Sidirov V. N. 1991 Affinity-purified secretory immunoglobulin A possesses the ability to phosphorylate human milk casein. Biomed Sci., 2,201 -204.

56. Kitahama S., Ocada S., Fukui T. 1978. Acceptor specificity of the transglicozilation catalyzed by cyclodextrin glucosyltranaferase. Agric Biol Chem. 42, 2369-2374.

57. Kobayashi S., Kashiva K., Kavasaki T., Shoda S. 1991. The pH dependence of the action pattern in porcine pancreatic alpha-amylase-catalyzed reaction for maltooligosaccharide substrates. J. Am. Chem. Soc . 113, 3079-3084.

58. Kobayashi S.,Shimada J., Kashiva K., Shoda S. 1992. Enzimatic polymerization of a-D-Maltosyl Fluoride utilizing a-amilase as the catalyst: a new approach for the synthesis of maltooligosaccharides. Macromolecules, 25, 3237-3241.

59. Köhler G., Howe SC., Milstein C. Fusion between immunoglobulin secreting and non-secreting mieloma cell lines. 1976a. Eur. J. Immunol., 6, 292.

60. Köhler G., Milstein C. Derivation of specific antibody producing tissue culture and tuneor lines by cell fusion., 1976b. Eur. J. Immunol., 6, 611.

61. Lacroix-Desmazes S, Misra N, Bayry J, Villard S, Kazatchkine MD, Kaveri SV. Antibodies with hydro lytic activity towards factor VIII in patients with hemophilia A. J Immunol Methods 2002;269:251-6.

62. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680-685

63. Leatherbarrow RT. Enzifitter. A non-linear regression data analysis program for IBM-PC. Elsevier Biosoft, Cambridge, 1987.

64. Lerner RA, Benkovic SJ, Shultz PJ. At the crossro ads of chemistry and immunology: catalytic antibodies. Science 1991; 252: 659-667

65. Lerner RA, Tramontano A. Catalytic antibodies. Sei. Am. 1981; 258: 58-60

66. Li L, Paul S, Tyutyulkova S, Kazatchkine MD, Kaveri S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies. J. Immunol. 1995; 154: 3328-3332

67. Majima K, Teshima S, Hamada Y, Kikuchi T. 1995 Determination of alpha-amylase using a new blocked substrate (2-chloro-4-nitrophenyl 4(4)-0-beta-D-galactopyranosyl-beta-maltotetraoside). Clin., Chim Acta, 234, 177-179.

68. McCroskey T, Chang T, David H, Win E. 1982. Clin., Chem., 28, 17871791.

69. McGregor AW, Morgan JE, McGregor EA. 1992. C.R. 227, 301-313.

70. Maggro ED., ed. Enzime Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980.

71. Malet C., Viladot J. L., Ochoa A., Gallego B., Brösa C., Planas A. 1995. Sinthesis of 4-Methilumbelliferyl-b-D-glucan oligosaccharides as specific chromoforic substrates of (1 3),(1 - 4)-b-D-glucan 4-glucanohydrolases. C. R. 274.285-301.

72. Marshall JJ, Miwa I. Kinetic difference between hydroyses of y-cyclodextrin by human salivary and pancreatic a-amylases. Biochim. Biophys. Acta. 1981; 661: 142-147

73. Mestecky J, Russell MW, Jackson S, Brown TA. The human IgA system: a reassessment.Clin. Immunol. Immunopathol.1986; 40: 105-114

74. Mei S., Modi B., Eklund S. H., Paul S. 1991, Vasoactive intestinal peptide hydrolysis by antibody light chains.J. Biol. Chem., 266, 15571-15574.

75. Moreau V, Drigues H. 1996. Design and chemoenzymatic synthesis of thiooligosaccharide inhibitors of 1,3:1,4-beta-D-glucanases.J. Chem. Soc. Perkin. Trans. I 525-527.

76. Nevinsky GA, Kit YuYa, Semenov DV, Buneva VN. Secretoiy Immunoglobulin A from Human Milk Catalyzes Reaction of the Milk Proteins Phosphorylation. Appl. Biochem. Biotechnol. 1998; 75: 77-91.

77. Nevinsky GA, Kanyshkova TG, Semenov DV, Vlassov AV, Gal'vita AV, Buneva VN. Secretoiy immunoglobulin A from Healthy Human Mothers Milk Catalyzes Nucleic Acid Hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 2000; 83: 115-130

78. Nevinsky GA, Favorova OO, Buneva VN. Natural catalytic antibodies new characters in the protein repertoire. In: Golemis E, editor. Protein-protein interactions; a molecular cloning manual. Cold Spring Harbor: 2002; p. 523-34.

79. Nevinsky GA, Buneva VN. Human catalytic RNA- and DNA-hydrolyzing antibodies. J Immunol Methods 2002;269:235-45.

80. Nevinsky G. A, Kit Yu. Ya., Semenov D. V., Buneva B. N. 1998, Appl. Biochem. Biotechnol., 75, 77-91.

81. Nevinsky G.A., Kanyshkova T.G., Buneva V.N. Natural catalytic antibodies (abzymes) in normalcy and pathology. Biochemistry (Moscow), 65: 1245-1255,2000.

82. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Human catalytic RNA- and DNA-hydrolyzing antibodies, J. Immunol. Methods, 269: 235-245, 2002.

83. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Catalytic antibodies in healthy humans and patients with autoimmune and viral pathologies, J. Cell. Mol. Med., 7: 265-276, 2003.

84. Nevinsky GA, Buneva VN. Natural catalytic antibodies abzymes. In "Catalytic antibodies" (Ed. Ehud Keinan). VCH-Wiley press. 2004.

85. Newman J. How breast milk protects newborns. Sci. Am. 1995; 273: 76-79

86. Okada G., Genghof DS., Hehre EJ. 1979. The predominantly nonhydrolytic action of alpha amylases on alpha-maltosyl fluoride.C.R. 71, 287-298.

87. Omichi K, Hase S, Ikenaka T. Examination of aglycone-binding site of human salivary a-amylase by means of transglycosylation reactions. J Biochem (Tokyo) 1991;109:410-5.

88. Paul S. 1998. Mechanism and functional role of antibody catalysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 75: 37.

89. Paul S. Catalytic activity of anti-ground state antibodies, antibody subunits, and human autoantibodies. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994; 5: 241-255

90. Paul S., Voile D.J., Beach C.M., Johnson D.R., Powell M.J., Massey R.J. 1989. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. Science. 244: 1158.

91. Paul S., Li L., Kalaga R., Wilkins-Stevens P., Stevens FJ., Solom'on A. 1995. Natural catalytic antibodies: peptide-hydrolyzing activities of Bence Jones proteins and VL fragment. J. Biol. Chem. 270: 15257.

92. Paul S, Mei S, Mody B, et al. Cleavage of vasoactive intestinal peptide at multiple sites by autoantibodies. J. Biol. Chem. 1991; 266: 16128-16134

93. Paul S, Li L, Kalaga R. et al. Characterization of thyroglobulin-directed and polyreactive catalytic antibodies in autoimmune disease. J. Immunol. 1997; 159: 1530-1536

94. Paul S, Lan L, Kalaga R, O'Dell J, Dannenbring RE Jr, Swindells S, Hinrichs S, Caturegli P, Rose NR. Characterization of thyroglobulin-directed and polyreactive catalytic antibodies in autoimmune disease. J Immunol 1997;159:1530-6.

95. Paul W. E. 1987. Иммунология. M.: Мир.

96. Ponteverco C., Production of indefinitely multiplying mammaliam somatic cell hybrids by polyehtilene glicol (PEG) treatment. 1976. Somatic Cell Genet., 1,397.

97. Poser CM. The diagnosis of multiple sclerosis. Thieme-Stratton (NY): 1984; p. 3-13.

98. Potter M, Immunoglobulin-producing tumors and mieloma proteins of mice. 1972, Phisiol. Rev., 5, 631.

99. Reimer C, Raska I, Tan EM, Sheer U. Human autoantibodies: probes for nucleolus structu re and function. Virchows Arch. В Cell Patho.l Inch Mol. Pathol. 1987; 54: 131-143

100. Sastry L., Mubaraki M., Janda K. D., Bencovic S. J., Lerner R. A. 1991, Ciba Found. Symp., 159, 145-151.

101. Satomura S, Sacata Y, Omichi K, Ikenaka T. 1988. Alpha-amylase assay with use of a benzyl derivative of p-nitrophenyl alpha-maltopentaoside, BG5P. Clin Chem Acta, 174, 315-324.

102. Savel'ev AN, Eneyskaya EV, Isaeva-Ivanova LS, Shabalin KA, Golubev AM, Neustroev KN. The carbohydrate moiety of a-galactosidase from Trichoderma reesei. Glycocon. J. 1997; 14: 897-905

103. Savel'ev AN, Eneyskaya EV, Shabalin KA, Filatov MV, Neustroev KN. Autoantibodies with amylolytic activity. Prot. Pept. Lett. 1999; 6: 179-184

104. Savel'ev AN, Kanyshkova TG, Kulminskaya AA, Buneva VN, Eneyskaya EV, Filatov MV, Nevinsky GA, Neustroev KN. Amylolytic activity of IgG and slgA immunoglobulins from human milk. Clin Chim Acta 2001;314:141-52.

105. Schultz P. G., Lerner R. A., 1995, From molecular diversity to catalysis: lessons from the immune system.Science, 269, 1835-1842.

106. Shuster AM, Gololobov GV, Kvashuk OA, Bogomolova AE, Smirnov IV, Gabibov AG. DNA hydrolyzing autoantibodies. Science 1992; 256: 665-667 Biochemistry. 1966. 5, 2836 2841.

107. Silverstein R. 1987. Иммунология // Под редакцией У. Пола. М.: Мир.

108. Simiand С, Cottaz S, Bosso С, Drigues Н. 1992. Chemoenzimatic synthesis of modified maltooligosaccharides from cyclodecstrin derivatives. Biochimie. 74, 75-80.

109. Stewart JD, Bencovic SJ. Catalytic antibodies: Mechanistic and practical considerations. Chem. Soc. Rev. 1993; 22: 213-219

110. Suga H, Tanimoto N, Sinskey AJ, Masamune S. Giycosidase antibodies induced to a half-chair transition-state analog. J. Am. Chem. Soc. 1994; 116: 11197-11198

111. Suganuma T., Maeda Y., Kitahara K., Nagahama T. 1997. Stady of action of human salivary alpha-amylase on 2-choro-4-nitrophenyl-a-maltotrioside in the presence of potassium thiocyanate. C. R. 303., 219-227.

112. Suzuki H. Recent advances in abzyme studies. J. Biochem. 1994; 115: 623628

113. Takahashi N., Kakinuma H., Hamada K., Shimazaki K., Yamasaki Y., Matsushita H., Nishi Y. 2001. Improved generation of catalytic antibodies by MRL/MPJ-lpr/;pr autoimmune mice. J. Immunol. Methods. 235: 113.

114. Tawfik D.S., Chap R., Green B.S., Sela M., Eshhar Z. 1995. Unexpectedly high occurrence of catalytic antibodies in MRL/lpr and SJL mice immunized with a transition-state analog: is there a linkage to autoimmunity? Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:2145.

115. Teshima S, Mitshuhida N, Ando M. 1985. Determination of alpha-amylase using a new blocked substrate (3-ketobutylidene beta-2-chloro-4-nitrophenyl-maltopentaoside). 150, 165-174. Clin Chim Acta.

116. Teshima S, Hayashy Y. 1991. Determination of alpha-amylase in biological fluids using a new substrate (beta-2-chloro-4-nitrophenyl-maltopentaoside).Clin Chim Acta. 199, 23-32.

117. Towbin H, Staehen T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979; 76:4350-4354

118. Tramontano A, Janda KD, Lerner RA. Catalytic antibodies. Science 1986; 234.

119. Usui T, Murata T. Enzymatic synthesis of p-nitrophenyl a-maltopentaoside in an aqueous-methanol solvent system by maltotetraose-forming amylase: A substrate for human amylase in serum. J Biochem 1988;103:969-72

120. Usui T, Murata T, Yabuuchi Y, Ogawa K. Transglycosylation reaction of maltotriose-forming amylase from Streptomyces grisens. Carbohydr Res 1993;250:57-66.

121. Usui T., Ogawa K., Nagai H., Matsui H. 1992. Enzimatic sinthesis of p-nitrophenil 45-0-P-D-galactosyl-a-maltopentaoside as a substrate for human a-amylases. Analitical Biochemistry 202, 61-67.

122. Vlassov A, Florentz C, Helm M, Naumov V, Buneva V, Nevinsky G, Giege R: Characterization and selectivity of catalytic antibodies from human serum with RNase activity. Nucleic Acids Res, 1998; 26: 5243-50

123. Walker GJ, Whelan WJ. The mechanism of carbohydrase action. Biochem. J. 1960; 76: 257-263

124. Wallenfels K., Foldi P., Niermann H., Bender H., Linder D. 1978. The enzymic synthesis, by transglucosylation of a homologous series of glycosidically substituted maltooligosaccharides, and their use as amylase substrates. C. R. 61., 359-368.

125. Wang J, Han Y, Wilinson MF. An active immunization approach to generate protective catalytic antibodies. Biochem J 2001;360:151-7.

126. Yanahira S., Kobayashi T., Suguru T., Nakakoshi M., 1995. Formation of oligosaccharides from lactose by Bacillus circulans beta-galactosidase. Biosci., Biotech., Biochem. 59, 1021-1026.

127. Yu J, Choi SY, Moon K-D, Chung H-H, Youn HJ, Jeong S, Park. H, Schultz PG. A glycosidase antibody elicidated against a chair-like transition state analog by in vitro immunization. Proc Natl Acad Sei (USA) 1998;95:2880-4.

128. Zhou YX., Karle S., Taguchi H., Planque S. 2002. Prospects for immunotherapeutic proteolitic antibodies. J. Immunol Methods. 269(1-2), 257-268.

129. Андриевская О. А., Бунева В. Н., Забара В. Г., Наумов В. А., Ямковой В. И., Невинский Г. А., 1998, Иммуноглобулины класса M из сыворотки крови больных системной красной волчанкой эффективно расщепляют РНК. Мол. Биол., 32, 908-915.

130. Барановский А. Г., Канышкова Т. Г., Могельницкий А. С. Наумов В.

131. A., Бунева В. Н., Гусев Е. И., Бойко А. Н., Заргарова Т. А., Фаворова О. О., Невинский Г. А. 1998, Поликлональные антитела из крови и спинномозговой жидкости больных рассеянным склерозом эффективно гидролизуют ДНК и РНК. Биохимия, 63, 1459-1469.

132. Власов А. В., Барановский А. Г., Канышкова Т. Г., Принц А. В., Забара

133. B. Г., Наумов В. А., Бреусов А. А., Жьеже Р., Бунева В. Н., Невинский Г. А. 1998, Субстратная специфичность ДНК- и РНК-гидролизующих антител из крови больных полиартритом аутоиммунным тиреоидитом. Мол. Биол., 32, 559-569.

134. Иммунологические методы. / Под ред. Фриммеля. М.: Медицина, 1987., 406-407.

135. Невинский А. Г., Канышкова Т. Г., Бунева В. Н. 2000. Природные каталитически активные антитела (абзимы ) в норме и при патологии. Обзор. Биохимия. 65, 1473-1487.

136. Семенов Д. В., Канышкова Т. Г., Кит Ю. А., Хлиманков Д. Ю., Акимджанов А. М., Горбунов Д. А., Бунева В. Н., Невинский Г. А., 1998,

137. Иммуноглобулины класса в молока человека гидролизуют нуклеотиды. Биохимия. 63 1097-1106.

Информация о работе

Бобрикова, Дина Робертовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Амилолитическая активность каталитических антител - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы