Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность каталазы как показатель функционирования гетеротрофных звеньев искусственных экосистем различного типа

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сарангова, Антонина Борисовна, Красноярск

российская академия наук

ордена ленина сибирское отделение институт биофизики

На правах рукописи

САРАНГОВА Антонина Борисовна

активность каталазы как показатель функционирования гетеротрофных звеньев искусственных экосистем

различного типа

03.00.02 - Биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Печуркин Н.С.; кандидат биологических наук Сомова Л.А.

красноярск -1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................................................................4

Актуальность проблемы..............................................................................................................................4

Цель работы...................................................................................................................................................6

Основные задачи исследования заключались в следующем:...............................................................6

Научная новизна...........................................................................................................................................7

Практическая ценность...............................................................................................................................7

Положения, выносимые на защиту...........................................................................................................7

Структура работы..........................................................................................................................................8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................10

1.1. Необходимость разработки методов оценки состояния малых экосистем.............................10

1.2. Место и роль каталазы в метаболизме клетки................................................................................19

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................................................29

2.1. Объекты исследования......................................................................................................................29

2.2. Характеристика и методы выделения объектов исследования...................................................29

2.3. Методы исследования.......................................................................................................................32

2.4. Методы культивирования..................................................................................................................зз

4

2.5. Используемые среды..........................................................................................................................36

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ...............................................................................................40

3.1. Экспериментальные и теоретические исследования связи ме>кду активностью каталазы микроорганизмов количеством биомассы и потребленного ими питательного субстрата в условиях управляемого культивирования.............................................................................................40

3.1.1. Активность каталазы бактериальных монокультур при периодическом культивировании...............................................................................................................................40

3.1.2. Непрерывное культивирование.........................................................................................46

3.1.3. Математическая модель «субстрат - клетка - перекись водорода - каталаза»49

3.2. Активность каталазы звена редуцентов малых экосистем на основе микроорганизмов......57

3.2.1. Активность каталазы микроорганизмов, предполагаемых компонентов звена редуцента МЭС..................................................................................................................................57

3.2.2. Изучение вклада бактерий в динамику азота при помощи определения активности каталазы.....................................................................................................................62

3.2.4. Оценка функционирования звена редуцентов модельной системы «пробуцент-консумент-редуцент», замкнутой по газу и субстрату, при помощи активности каталазы....................................................................................................................69

3.3. Активность каталазы микроорганизмов активного ила как индикатор функционирования аэротенков...................................................................................................................................................78

3.3.1. Бактериальная природа активности каталазы смешанных сообществ..........78

3.3.2. Активность каталазы микроорганизмов смешанных сообществ, как характеристика физиологического состояния сообщества. Зависимость активности каталазы микроорганизмов активного ила от концентрации субстрата............................................................................................................................................81

3.3.3. Техногенная система биологической очистки сточных вод и активность каталазы микроорганизмов активного ила в аэротенках..................................................83

3.3.4. Метаболитное влияние на активность каталазы микроорганизмов активного ила.....................................................................................................................................87

3.3.5. Процессы, соответствующие режиму голодания активного ила.......................89

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.......................1..........................................................................98

ЛИТЕРАТУРА.................................................................................................................................................100

4

Введение

«Биосфера - это среда нашей жизни, это та «природа», которая нас окружает, та «природа», о которой мы говорим в разговорном языке и человек - прежде всего - своим дыханием, проявлением всех своих функций неразрывно связан с этой «природой», хотя бы он жил в городе или в уединенном домике.» Вернадский В.Н., 1920 г.

В настоящее время интенсивное развитие техногенной цивилизации оказывает отрицательное влияние на биосферу. Это послужило поводом к заявлениям о наступлении экологического кризиса и вступлении мира в эпоху экологической катастрофы. В конце 60-х годов развитые страны пришли к выводу о необходимости принятия срочных мер для предотвращения ухудшения

состояния, а в некоторых случаях и деградации окружающей среды. В на-

«

стоящее время для научного обоснования концепции устойчивого развития необходимо изучение законов организации и функционирования биосферы в целом. Для изучения фундаментальных основ функционирования экосистем различного типа необходимы новые, в том числе биофизические методы, позволяющие прогнозировать развитие систем на основе математического моделирования.

Актуальность проблемы.

Современный интерес исследователей к изучению процессов замыкания биотических циклов связан с противоречием между современной техносферой и биосферой. Уникальность биосферы не позволяет проводить над ней эксперименты, поэтому для изучения как частных, так и общих закономерностей

функционирования экосистем различного типа необходимы новые, в том числе биофизические методы, позволяющие прогнозировать развитие систем на основе математического моделирования. Объектами такого рода исследований служат модельные экспериментальные экосистемы на основе микроорганизмов с пространственно разделенными звеньями, а также техногенные системы биологической деструкции загрязнений с участием сообщества микроорганизмов активного ила.

Такие системы поддаются управлению, однако для управления необходима информация о концентрации субстрата (потребленного, остаточного) в ней. В экспериментальных экосистемах и в экосистемах очистных сооружений, так же как и в природных экосистемах, формируется сложный по составу многокомпонентный субстрат, который в основном утилизируется бактериальным звеном и трудно поддается определению. Традиционно применяемые методы для контроля за концентрацией интегрального субстрата в системе БПК и ХПК (биологическая и химическая потребность в кислороде), к сожалению не являются экспрессными. Поэтому очевидна необходимость разработки экспресс-методов контроля за количеством потребленного субстрата микроорганизмами, одна из функций которых в экосистеме заключается в высвобождении простых неорганических соединений, что способствует замыканию биотического цикла.

Функционирование микроорганизмов зависит от состояния их ферментной системы. Поэтому представляется целесообразным разрабатывать ферментативные методы для определения количества потребленного микроорганизма*

ми питательного субстрата. Для разработки быстрых методов на основе ферментативной активности микроорганизмов важны требования при выборе ключевого фермента-индикатора. Важно, чтобы фермент: 1) являлся конститутивным, 2) функционировал в ключевом звене клеточного метаболизма, 3) присутствовал во всех аэробных клетках, 4) допускал простое определение.

Фермент катал аза может служить таким индикатором по следующим причинам: 1) каталаза - конститутивный фермент, 2) ответственен за протекание единственной реакции разрушения перекиси водорода, образуется в одном из ключевых звеньев метаболизма - дыхательной цепи; 3) фермент присутствует во всех аэробных клетках, 4) измерение его активности достаточно просто.

Цель работы.

Исследовать зависимость между активностью каталазы количеством биомассы бактерий и количеством потребленного ими субстрата в условиях управляемого культивирования (периодического и непрерывного) для чистых и смешанных культур микроорганизмов. Разработать экспресс-метод контроля динамики концентрации субстрата и биомассы микроорганизмов на основе определения активности их каталазы.

Основные задачи исследования заключались в следующем:

1. Исследовать взаимосвязь активности каталазы с количеством биомассы бактериальной культуры и количеством потребленного микроорганизмами питательного субстрата.

2. Установить количественные закономерности связи между активностью каталазы бактерий и количеством потребленного ими питательного субстрата.

3. Показать возможность применения метода определения активности каталазы как для оценки функционирования гетеротрофного звена искусственных экосистем на примере малых лабораторных систем, так и экосистемы в целом на примере сложного сообщества микроорганизмов активного ила очистных сооружений.

4. Разработать метод контроля за развитием бактериального звена искусственных экосистем разного типа сложности: экспериментальные с разде-

ленными звеньями, техногенные на основе функционирования сообщества микроорганизмов.

5. Применить активность каталазы для оценки эффективности процесса биологической очистки сточных вод микроорганизмами активного ила аэро-тенков в любой, интересующий исследователя, момент времени.

Научная новизна.

Впервые установлены количественные закономерности связи между активностью конститутивного фермента каталазы бактерий и количеством потребленного ими питательного субстрата при помощи математической модели, разработанной на основе полученных экспериментальных результатов. На основании полученных закономерностей, метод активности каталазы бактерий может быть использован в качестве экспресс-метода оценки функционального состояния бактериального звена, искусственных экосистем различных типов.

Практическая ценность.

Разработан метод оценки количества потребленного субстрата бактериальной культурой на основе определения активности каталазы, который применен в практике контроля процесса биологической очистки сточных вод. Показана возможность применения данного метода для контроля функционирования гетеротрофного звена малых лабораторных экосистем, состоящего из микроорганизмов, с пространственно разделенными звеньями при исследовании законов устойчивого развития.

■т

Положения, выносимые на защиту.

Установлена линейная связь активности конститутивного фермента каталазы бактерий с количеством их биомассы и количеством потребленного ими субстрата.

Разработан подход с использованием фермента каталазы для решения практических задач определения количества потребленного субстрата бактериями, развивающимися в монокультуре, в гетеротрофном звене (бактериальном), модельных экспериментальных экосистем (на основе микроорганизмов с пространственно разделенными звеньями) и сложном сообществе микроорганизмов активного ила.

Показано, что активность каталазы может служить интегральным показателем функционирования всей экосистемы, т.к. в сложном сообществе микроорганизмов данный показатель отражает состояние бактериальной компоненты.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на всесоюзной конференции «Биотехнология и биофизика микробных популяций» (г. Алма-Ата, 1991), международном конгрессе «Экология и бизнес» (г. Красноярск, 1993), на 31-й и 32-й международных научных Ассамблеях СС^РАЯ (г. Бирмингем, 1996; г. Нагоя, 1998).

Публикации. По полученным данным опубликовано 7 работ.

Структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования и описания результатов экспериментов с их обсуждением, выводов и списка цитируемой литературы. В первой главе диссертации представлен обзор литературных данных, где обоснована необходимость разработки новых ферментативных экспресс-методов оценки состояния малых экосистем, состоящих из микроорганизмов, представлен обзор существующих методов определения остаточной концентрации органического субстрата в среде, сформулированы требования при выборе ключевого фермента-индикатора для разработки ферментативных методов контроля за динамикой концентрации субстрата в экосистеме. Там же сформулированы основные за-

дачи исследования. Во второй главе приводится описание объектов и методов исследования. Третья глава состоит из четырех разделов, в которых представлен экспериментальный и теоретический материал по динамике активности каталазы в чистых культурах микроорганизмов, в отдельных звеньях малых замкнутых экосистемах «продуцент-консумент-редуцент» и в сложном биоценозе активного ила аэротенков.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Необходимость разработки методов оценки состояния малых экосистем.

Современная техносфера не может органично вписываться в биосферу без разрушения последней. В настоящее время, когда развитие техногенной цивилизации наносит ущерб биосфере, необходимо изучать законы по которым она развивается. Очевидно также, что при изучении законов функционирования биосферы (как единого круговорота) немыслимо проведение над ней экспериментов любого рода. Одна из возможностей изучения, как частных законов развития отдельных звеньев экосистем, так и общих закономерностей развития всего биологического круговорота, заключается в создании и изучении малых моделей замкнутых экосистем на основе микроорганизмов, различной степени сложности и поддающиеся управлению (Печуркин Н.С., 1992).

Один из подходов (Печуркин Н.С., Брильков A.B., Рыгалов В.Е. и др, 1992) в понимании экосистемы заключается в том, что главная причина круговорота вещества в экосистеме (вещество т.е. субстрат, как основная характеристика экосистемы) обусловлена постоянным потоком энергии и как следствие этого - образование циклов и подциклов, вращающихся под действием этого потока энергии. Такая точка зрения позволяет представить биосферный (планетарный) круговорот вещества как биотический цикл, для замыкания которого достаточно иметь два звена: автотрофное и гетеротрофное. Функции автотрофного звена с целью синтеза органических соединений, как правило выполняют растения. А функции гетеротрофного звена сводятся к высвобождению простых неорганических соединений для последующего использования автотрофом.

и

Однако такой цикл через цепи разложения работает медленно. Введение в цикл звена консументов, как правило, значительно увеличивает скорость работы цикла. Консументы потребляют живую биомассу, тем самым ускоряя процесс распада органических веществ на простые неорганические, которые используются автотрофами для последующего синтеза органических соединений.

Каждый трофический уровень любой природной экосистемы выполняет свою функцию, а именно, синтез, потребление, деструкция и имеет хорошо отлаженный механизм (Печуркин Н.С., 1992).

Примерами экологических систем на основе микроорганизмов можно считать малые лабораторные экосистемы, состоящие из микроорганизмов (МЭС), и техногенные системы биологической очистки сточных вод. Первым типом экосистем могут служить малые экспериментальные модели экосистем с пространственно разнесенными звеньями, что позволяет обеспечивать контроль за каждым звеном (Письман Т.И., Сомова Л.А., Печуркин Н.С. и др., 1992). В таких системах функцию продуцента выполняют микроводоросли, редуцента - бактерии, дрожжи грибы и т.д., а консумента - простейшие.

К другому типу экосистем можно отнести искусственные техногенные экосистемы сообщества микроорганизмов активного ила аэротенков.

Развитие промышленных технологий поставило проблему очистки сбрасываемых загрязнений. Одним из решений этой проблемы явилось создание систем интенсивной очистки сточных вод на основе ассоциаций микроорганизмов. По сути дела сообщество микроорганизмов активного ила можно отнести к искусственно созданному звену редуцентов биосферы, т.к. ими выполняется функция интенсивной биологической деструкции чужеродных биосфере химических соединений. Активный ил представлен бактериями, которые несут основную нагрузку по очистке сточных вод, грибами, водорослями (описание количественного и качественного состав