Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Активность и теплоустойчивость некоторых ферментов amoeba proteus при изменении температуры культивирования амеб
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации по теме "Активность и теплоустойчивость некоторых ферментов amoeba proteus при изменении температуры культивирования амеб"
На правах рукописи
ПОДЛИПАЕВА ЮлияИгоревна
РГБ ОД - 3 Ш £
АКТИВНОСТЬ И ТЕПЛОУСТОЙЧИВОСТЬ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ AMOEBA PROTEUS ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ТЕМПЕРАТУРЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АМЕБ
03.00.25 - клеточная биология
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
АВТОРЕФЕРАТ
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2000
Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург
Научный руководитель: Официальные оппоненты:
Ведущее учреждение:
доктор биологических наук А.Л. Юдин
доктор биологических наук, профессор Б.Н. Кудрявцев Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.
доктор биологических наук, профессор В.В. Хлебович Зоологический институт РАН, Санкт-Петербург.
Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета.
Защита состоится" " лЛУ 2000 года в 13 час на
заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.
Факс (812) 247 03 41.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН
Автореферат разослан ". " марта 2000 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
д.б.н. с Л.Н. Писарева
1Ъ91 О
1.0бщая характеристика работы
Среди многочисленных абиотических факторов внешней среды, оказывающих влияние на жизнедеятельность организмов, одним из важнейших является температура. Проблема приспособления организмов к изменяющимся температурным условиям среды важна как с практической (например, акклиматизация животных и растений к новым местам обитания), так и с теоретической (например, экология отдельных видов и их адаптивная радиация в процессе эволюции) точек зрения. Адаптация животных и растении к температурным условиям внешней среды осуществляется на разных уровнях организации - популяционном, организменном, тканевом, клеточном и молекулярном.
Термином «адаптация» принято обозначать любые свойства и признаки организма, обеспечивающие его жизнеспособность (НосЬасЬка, 1998). Важнейшим элементом адаптационного процесса является акклимация, которая представляет собой компенсаторное изменение, возникающее в организме в ответ на длительное отклонение какого-либо фактора внешней среды от первоначального уровня, или «....фенотипический сдвиг,происходящий в лабораторных условиях в ответ на экспериментальное варьирование какого-либо одного параметра среды» (Проссер, 1977, стр. 19). Иногда акклимация может выглядеть инадаптивной, что, скорее всего, свидетельствует о незавершенности процесса (Прехт, 1964), который в своем завершенном виде всегда адаптивен (Хлебович, 1981).
При характеристике результатов воздействия той или иной температуры на изучаемый организм большое значение имеет определение диапазона температурной толерантности данного организма (ДТ) и его температурного оптимума (Борта, 1976; Александров, 1985; Сопина, 1986). Механизмы компенсаторных реакций организмов на воздействия субоптимальной температуры, находящейся в пределах ДТ, и стрессовой температуры (сублетальной или летальной) различны. В случае реакции на стрессовые температурные воздействия значительная роль отводится синтезу белков теплового шока.
В процессе интенсивного изучения повреждающего действия субоптимальной температуры на организмы, клетки и их компоненты было сформировано понятие «теплоустойчивость», ставшее неотъемлемым элементом экспериментальных исследований и теоретических построений (см.: Ушаков, 1989). Под первичной теплоустойчивое- « тью клеток или организмов подразумевается их устойчивость, опре-
деляемая сразу после краткосрочного интенсивного нагрева (Александров, 1975). Уровень теплоустойчивости организмов и их клеток традиционно служил критерием адаптации к температурным условиям. Показано, что при смене температуры окружающей среды теплоустойчивость эктотермных организмов изменяется в широких пределах, а теплоустойчивость отдельных клеток такого организма представляет собой консервативный показатель и может служить цито-физиологическим критерием того или иного вида животных или растений (см.: Александров, 1985).
У эктотермных организмов имеются многообразные биохимические приспособления, направленные на минимизацию повреждений, вызванных изменениями температуры. Среди биологических макромолекул (белков, нуклеиновых кислот, липидов), являющихся «мишенями» повреждающего действия температуры, особое внимание традиционно уделялось белкам, а среди белков - ферментам. Это связано с тем, что именно ферментные системы обеспечивают необходимую интенсивность метаболизма при различных температурах и, кроме того, их активность представляет собой удобный для регистрации маркерный признак. В основе компенсации температурных влияний на обмен лежат количественный и качественный (Marek, 1982; Хочачка, Сомеро, 1988; Ciardiello, 1997; Feller et al., 1997; Picrce, Crawford, 1997 ) способы регуляции работы ферментов, направленные на коррекцию их активности и каталитической эффективности, в том числе путем конформационных изменений. Кроме того, в качестве показателя протекания адаптивных процессов принято использовать данные об изменении теплоустойчивости белков, в частности, белков-ферментов (см.: Александров, 1975; Константинова, 1983).
Простейшие представляют собой эктотермные одноклеточные организмы, сочетающие в себе свойства клеток и организмов. В отличие от реакции на изменение температуры изолированных клеток многоклеточного организма реакции простейших более лабильны. Их теплоустойчивость при изменении температурного режима изменяется: при повышении температуры культивирования она повышается и, за некоторыми исключениями (Полянский и др., 1967), при пониженной температуре снижается (Полянский, 1957; Осипов, 1966; Сопина, 1968; Суханова, 1968, и др.).
Актуальность проблемы. Количество сведений о биохимических способах температурной компенсации работы ферментных систем у простейших крайне невелико (Сопина, 1987,1991,1997). Активность и теплоустойчивость белков простейших так же, как и у многокле-
точных организмов, исследовалась и в сравнительном плане - у представителей разных видов (популяций, клонов), и в процессе аккли-мации простейших одного вида к разным температурам. Однако, в отличие от данных по многоклеточным организмам, сведения, касающиеся простейших, крайне немногочисленны.
Имеющиеся данные об активности и теплоустойчивости ферментов одноклеточных организмов свидетельствуют о наличии положительной корреляции между теплоустойчивостью ферментов и тепло-любивостью видов (Janovy, 1972) или внутривидовых группировок (Лозина-Лозинский, 1961; Сопина, 1986). Однако каких-либо общих закономерностей в поведении теплоустойчивости ферментов при акклимации животных одного вида к различным температурам культивирования выявить не удавалось (Серавин и др., 1965; Березина,. 1970; Сопина, 1991). Не исключено, что поведение ферментов, различных по своей первичной структуре, термолабильности, конфор-мационным потенциям и другим свойствам, при смене температурного режима не подчиняется общей схеме. В связи с этим для выявления роли изменений свойств ферментов при адаптации простейших к изменившимся температурным условиям актуальным было бы исследование влияния температуры на активность и теплоустойчивость ферментов возможно большего числа видов простейших для накопления фактов в этой области.
Свободноживущие пресноводные амебы, не имеющие в своем жизненном цикле полового процесса, представляют особый интерес для исследования их приспособлений к температурному фактору, так как отсутствие полового процесса позволяет четко отделить моди-фикационные изменения, вызванные сменой температуры, от наследственных вариаций.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлся анализ модификационных изменений, происходящих на уровне активности и теплоустойчивости некоторых ферментов при акклимации амеб Amoebaprotens к различным температурам, лежащим в пределах диапазона температурной толерантности исследуемого штамма. Кроме того предполагалось оценить генотипические межштаммовые (внутривидовые) различия по указанным свойствам ферментов, сохраняющиеся в ряду многих поколений клеток. Для этого следовало определить активность и теплоустойчивость некоторых ферментов у амеб одного штамма, культивируемых при разных температурах, а также сравнить активность и теплоустойчивость этих ферментов у штаммов амеб, различающихся по температурным оптимумам раз-
множения. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
а) найти оптимальный вариант методики спектрофотометричес-кого выявления и определения удельной активности термостабильного (суммарные водорастворимые эстеразы) и термолабильного (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа) ферментов у амеб;
б) выяснить, являются ли активность фермента и его теплоустойчивость (остаточная ферментативная активность после прогрева) штаммоспецифичными признаками и определить, связаны ли эти показатели с температурным оптимумом размножения (теплолюби-востью) штамма амеб; проследить изменения этих признаков в процессе культивирования амеб при различных температурах, входящих в диапазон температурной толерантности данного штамма;
в) проверить, существует ли связь между активностью и теплоустойчивостью одного из ферментов амеб - глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназы и особенностями электрофоретического спектра этого фермента и теплоустойчивостью его отдельных электроморф при сравнении двух штаммов амеб и при культивировании одного из штаммов при различных температурах;
г) попытаться выявить у амеб белки теплового шока и выяснить, влияет ли повышенная температура, превышающая верхнюю границу диапазона температурной толерантности штамма, на уровень их содержания в клетке.
Основные положения, выносимые на защиту.
1 .Теплоустойчивость двух изученных ферментов у Amoeba proteus, культивируемых при 25 °С, положительно коррелирует с теплолю-бивостью штамма амеб. Активность и теплоустойчивость ферментов могут служить у амеб штаммовой характеристикой.
2. Акклимация амеб к повышенной температуре (28°С), лежащей на границе диапазона температурной толерантности исследованного штамма, не приводит к изменению активности и теплоустойчивости их Г6ФДГ.
3. Акклимация амеб к относительно низкой температуре (10°С) не влияет на теплоустойчивость их суммарных водорастворимых эсте-раз и приводит к повышению теплоустойчивости и активности их Г6ФДГ. Повышение активности этого фермента позволяет предполагать активизацию пентозофосфатного пути усвоения глюкозы у амеб.
Научная новизна работы. Впервые методом спектрофотометрии выявлена и измерена активность суммарных водорастворимых эсте-раз у амеб вида Amoeba proteus, а также активность одного из фер-
ментов пентозофосфатного (фосфоглюконатного) пути усвоения глюкозы -глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ). Разработана комплексная оценка теплоустойчивости Г6ФДГ, включающая в себя спектрофотометрическое определение остаточной ферментативной активности этого фермента и выявление его электрофоретического спектра после тестирующего прогрева. Используя ее, удалось охарактеризовать особенности терморезистентности Г6ФДГ и ее отдельных электрофоретических фракций у двух штаммов амеб, различающихся по теплолюбивое™ (температурному оптимуму размножения), и продемонстрировать достоверное повышение удельной активности Г6ФДГ у амеб, акклимированных к пониженной температуре, входящей в диапазон температурной толерантности исследуемого штамма амеб. Методом иммуноблоттинга впервые у амеб Amoeba proteus выявлен конститутивно присутствующий белок теплового шока семейства HSP70 и установлены условия, при которых происходит повышение уровня его содержания (индукция) в клетке.
Теоретическое значение работы. Выявленные особенности поведения термостабильного и термолабильного ферментов у амеб Amoeba proteus, относящихся к штаммам с различными температурными оптимумами размножения, позволяют продолжить углубленный цитофизиологический анализ биохимических изменений, сопровождающих температурные адптации у эктотермных организмов. Данные об отсутствии однонаправленных изменений теплоустойчивости ферментов при изменении температуры культивирования амеб следует учитывать при анализе связи теплоустойчивости белков с теплоустойчивостью клеток простейших.
Практическое значение работы. Разработанная методика спект-рофотометрического выявления и измерения активности ГбФДГ в надосадочной жидкости водорастворимых гомогенатов амеб вида Amoeba proteus и предложенный на примере Г6ФДГ амеб способ анализа изменений свойств фермента, сочетающий количественную (методом спектрофотометрии) и качественную (методом нативного электрофореза) оценку его теплоустойчивости у амеб разных штаммов и амеб одного штамма, культивируемых при различных температурах, могут быть рекомендованы в лабораторной практике при проведении цитофизиологичсских экспериментов. Полученные данные могут быть использованы в курсах лекций по биологии клетки, зоологии беспозвоночных, гидробиологии и др. в высших учебных заведениях.
Апробация работы. Результаты работы доложены: в 1987 г. - на
IV съезде ВОПр в г. Ленинграде; в 1988 г. - на Конференции молодых специалистов Института цитологии АН СССР; в 1991 г. - на Всесоюзном совещании «Клеточные механизмы адаптации» в г. Чернигове; в 1992 г. - на V съезде ВОПр в г. Витебске; в 1999 г. - на совместном семинаре лаборатории цитологии одноклеточных организмов и лаборатории морфологии клетки ИНЦ РАН и заседании Санкт-Петербургского отделения Российского общества протозоологов при РАН. По теме диссертации опубликовано 11 работ.
. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав и выводов. Диссертация иллюстрирована 19 рисунками и включает 6 таблиц. Список цитированной литературы насчитывает 185 источников, в том числе 86 - на русском языке.
2. Материалы и методы
2.1.Штаммы амеб и их культивирование
В работе использовали три штамма амеб вида Amoeba proteus из коллекции лаборатории цитологии одноклеточных организмов Института цитологии РАН. Штамм В получен из Медицинского университета (Будапешт, Венгрия) в 1959 г. Штамм Petrozavodsk выделен из небольшого пруда в окрестностях Петрозаводска (Карелия, Россия) в 1968 г. Штамм Da поступил в коллекцию из Саутгемитон-ского университета (Саутгемптон, Великобритания) в 1970 г. Температурный оптимум размножения амеб штамма В находится в диапазоне 25 - 28 °С (Сопина, 1976). Для амеб штамма Da оптимальной является температура 22 °С (Сопина, 1986); для штамма Petrozavodsk температурный оптимум определен не был.
Амеб культивировали по методу Прескогта и Кэрьера (Prescott, Carrier, 1964). Культуральную среду меняли 1 раз в сутки. Перед тем, как использовать клетки амеб для приготовления гомогената, амеб не кормили по крайней мере 72 ч. Амеб штамма В культивировали при температурах 10 и 25 °С; амеб штамма Da - при 10, 25 и 28 °С; штамма Petrozavodsk - при 10 и 25 °С.
2.2. Получение гомогенатов амеб и определение активности ферментов
Перед получением гомогената амеб тщательно отмывали от куль-туральной среды путем их трехкратного центрифугирования при 1000 - 1500 об./мин. Осажденные клетки гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Для определения активности водорастворимых эстераз в гомогенатах амеб полученный гомо-
генах оставляли на ночь при 4 °С, а затем центрифугировали при 33000 об./мин в течение 1 ч при 4 °С. При определении активности Г6ФДГ гомогенаты амеб сразу после их получения центрифугировали при 12000 об./мин в течение 30 мин при 4 °С и в дальнейшем использовали суиернатант. Концентрацию белка в супернатанте определяли но методу Лоури (Ьочугу е1 а1., 1951)
Активность эстераз в гомогенатах амеб определяли по модифицированному методу Гомори (вотои, 1952). К 0.2 мл супернатанта добавляли 2 мл субстратной смеси, в состав которой входили: Трис-малеатный буфер, рН 7.0 -7.1,1 мг прочного синего РР и 0.4 мг (3-нафтилацетата, предварительно растворенного в ацетоне для УФ-микроскопии. Ферментативную реакцию проводили при 37 °С в течение 20 мин и останавливали добавлением 1 мл 2%-ного раствора додецилсульфата (лаурилсульфата) натрия. Сразу же после этого окрашенные в вишневый цвет пробы фотометрировали на фотоэлектрическом колориметре с зеленым фильтром при длине волны 530 нм; значения оптической плотности использовали для вычисления активности суммарных водорастворимых эстераз, которую выражали в условных единицах (у.е.) - микрограммах Р-нафтола, выделившегося в расчете на 1 мг белка за 20 мин при 37 °С. Мы не могли с уверенностью вычислить удельную эстеразную активность в количестве р-нафтола, выделившегося за 1 мин, так как пробы колори-метрировали один раз через 20 мин после окончания их инкубирования при 37 °С и нет доказательств того, что выделение р-наф гола в течение этого периода времени происходило с постоянной скоростью.
Гомогенаты для опытов по определению активности Г6ФДГ так же, как и в случае с суммарными водорастворимыми эстеразами, собирали по крайней мере из трех разных порций клеток массовой культуры амеб; в одном опыте проводили не менее трех измерений активности фермента. Активность Г6ФДГ определяли на спектрофотометрах СФ-16 и 8реко1-211 по скорости восстановления никоти-иамидцинуклеотидфосфата (НАДФ) при длине волны 340 нм. Реакционная смесь содержала 0.075 мМТрис-НС1 буфер, рН 9.1, 0.63 М М§С12, 1.15мМглюкозо-6-фосфатанатрия(Г6Ф)и 1.19мМНАДФв 1 мл. Все компоненты реакционной смеси, кроме субстрата, вносили в пробирку с пробой непосредственно перед измерением активности. Ферментативная реакция начиналась после добавления в смесь субстрата (Г6Ф). Измерения проводили в течение первых 3 - 5 мин протекания реакции с интервалом 0.5 -1.0 мин; предварительно было
установлено, что в этом интервале количество восстановленного НАДФ возрастает прямолинейно. Измеренную оптическую плотность использовали для вычисления удельной активности Г6ФДГ и выражали ее в нанномолях НАДФ-Н, выделившегося за 1 мин в расчете на 1 мг белка (ед.).
2.3. Определение теплоустойчивости ферментов
Для определения теплоустойчивости ферментов пробы прогревали при различных температурах, определяли активность фермента в прогретых пробах и выражали ее в процентах от активности фермента в непрогретых пробах (остаточная ферментативная активность). В одном опыте при каждой тестирующей температуре прогревали не менее грех проб. Проводили не менее грех опытов.
При определении теплоустойчивости суммарных водорастворимых эстераз пробы гомогената прогревали в стеклянных пробирках при температурах 45, 50, 55 и 60 °С в течение 30 мин. При определении теплоустойчивости Г6ФДГ пробы прогревали при температурах 39, 42,45 и 48 СС в течение 10 мин. Пробы объемом 0.015 - 0.020 мл , содержавшие 150 - 200 мкг белка, прогревали в полиэтиленовых пробирках объемом 1.5 мл. Непрогретые контрольные пробы (не менее 3) хранили при 4 °С в холодильнике, куда после прогрева помещали и опытные пробы.
По результатам определения остаточной ферментативной активности строили графики зависимости величины этой активности от температуры, которые служат характеристикой теплоустойчивости фермента.
При оценке теплоустойчивости эстераз использовали также такой показатель, как время их 50%-ной инактивации при данной температуре прогрева. В этом случае пробы прогревали при 50, 55 и 60 °С в течение 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин, определяли остаточную ферментативную активность для каждого срока прогрева и таким образом определяли время, за которое активность снижалась на 50%.
2.4. Статистическая обработка данных
При статистической оценке различий теплоустойчивости ферментов разных штаммов амеб или одного штамма, акклимированного к разным температурам, использовали не отношение активности фермента в прогретой и непрогретой пробе, поскольку статистическая оценка достоверности различий отношений переменных связана с определенными трудностями (Зайдель, 1985), а разности величин активности фермента в непрогретой и прогретой пробах. Для таких разностей, полученных в различных опытах, в каждом из которых был
использован гомогеиат, полученный из одной порции амеб, рассчитывали среднюю разность и ее стандартную ошибку.
При сравнении активности фермента у амеб из разных культур использовали значения его удельной активности; в некоторых случаях сравнивали активность фермента, выраженную в условных единицах - значениях оптической плотности, полученных при спектро-фотометрическом определении активности. Как и в случае сравнения величин остаточной активности ферментов, использовали средние значения активности, полученные в разных опытах (не менее 3 измерений в одном опыте).
При определении достоверности различий активности и теплоустойчивости ферментов амеб разных штаммов или амеб одного штамма, культивировавшихся при разных температурах, использовали уровень значимости 0.05. Для статистической обработки данных использовали пакет SYSTAT, для построения графиков - программу EXCEL.
2.5. Проведение нашивного электрофореза
Для выявления электрофоретических форм водорастворимой Г6ФДГ проводили нативный электрофорез супернатанта гомогена-тов амеб в вертикальной пластине 7%-ного полиакриламидного геля (ПААГ) размером 120 х 90 х 1.5 мм в трис-глициновой системе (Laemmli, 1970). НАДФ в электродный буфер недобавляли. На старг наносили 100 - 140 мкг белка, утяжеленного 60%-ной сахарозой, в объемном соотношении 1.5: 1. Для оценки теплоустойчивости отдельных электрофоретических форм Г6ФДГ в стартовые «карманы» одного геля вносили непрогретую контрольную пробу и пробы, прогретые при тех же тестирующих температурах, при которых прогревали и пробы, использовавшиеся для спектрофотометрии. Для выявления активности Г6ФДГ гели по окончании электрофореза окрашивали в соответствующей инкубационной смеси (Серов и др., 1977) в течение 30 - 40 мин при 37 °С. Окрашенные гели фиксировали 7.5%-ной уксусной кислотой и сканировали на денситометре MD -100 («Карл Цейсс», Германия). Фракции фермента нумеровали в порядке снижения их электрофоретической подвижности.
2.6. Выявление и очистка белка теплового шока 70кДа у амеб Амеб штамма Da, культивировавшихся при 22 °С, подвергали тепловому шоку, помещая культуры амеб в термостаты при температурах 28, 32 и 37 °С на 1 ч. Непосредственно после теплового шока (0 час) и через некоторое количество часов после него (разное в разных опытах) порции амеб центрифугировали при 1000 об./мин и одина-
ковое количество осадка из каждой порции гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе. Экстракционный буфер, используемый при гомогенизации амеб, включал в себя 20 мМ Трис НС1, рН 7.5,20 мМ NaCl, 0.1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 0.5 мМ дитиотриетола (DTT) и 0.2 мМ фенилметилсульфонилфлуорида (PMSF). Полученные гомогенаты, а также гомогенат, полученный из амеб, не подвергавшихся тепловому воздействию, помещали в холодильник при температуре -20 °С, затем после размораживания все гомогенаты одновременно центрифугировали при 15000 об./мин в течение 45 мин при 4 °С и в дальнейшем использовали суперна-тант.
Белковый состав проб анализировали методом SDS-электрофо-реза в 7 и 10%-ном ПААГ в трис-глициновой системе Лэммли. После электрофореза гели фиксировали в смеси формальдегида, спирта и уксусной кислоты, окрашивали 0.25%-ным раствором красителя Кумасси бриллиантового синего в течение 1 ч и отмывали в 7%-ной уксусной кислоте. Для выявления белков теплового шока (БТШ) сразу после проведения электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозу с использованием техники электроблоттинга (Towbin et al., 1979). Блоты обрабатывали поликлональными кроличьими антителами, полученными против БТШ HSP70 крупного рогатого скота (КРС) и обладавшими широкой перекрестной реакцией с аналогичными белками из различных видов животных (Margulis et al., 1991), и моноклональными антителами против БТШ HSP70 КРС, узнающими только индуцибельный компонент семейства БТШ 70 кДа. Зоны связывания анти-ШР70 антител с тестируемыми белками окрашивали при помощи антител AT-II, конъюгированных со щелочной фосфатазой или пероксидазой, путем проведения ферментативной реакции. Для идентификации молекулярных масс выявляемых полипептидов использовали высокомолекулярные маркеры (Sigma).
При очистке БТШ HSP70 получали гомогенат, для чего осадок клеток амеб смешивали с экстракционным буфером в соотношении 1:3 и гомогенизировали на льду в стеклянном гомогенизаторе. Буфер содержал 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 20 мМ NaCl, 0.1 мМ EDTA, 0.5 мМ DTT, 0.2 мМ PMSF и 0.5% нонидета-40. Гомогенат центрифугировали 30 мин со скоростью 14000 об./мин при 4 °С, удаляли супернатант, после чего к осадку прибавляли еще один объем экстракционного буфера и повторяли центрифугирование. Супернатан-ты, полученные после первого и второго центрифугирований, объединяли. Для очистки белка HSP70 применяли АТФ-агарозную хро-
матографию; после хроматографии белковый состав отдельных фракций анализировали методом SDS-электрофорсза в 10- и 12%-ном полиакриламидном геле.
3. Результаты и обсуждение
3.1. Активность и теплоустойчивость суммарных водорастворимых эстераз у двух штаммов амеб, культивируемых при температуре 25 "С.
Изучение активности и теплоустойчивости белков ферментов у двух штаммов амеб Amoebaproteus с разными температурными оп-тимумами размножения было начато с суммарных водорастворимых эстераз. Эстеразы - ферменты с широкой субстратной специфичностью, основная функция которых в метаболизме - расщепление экзогенных субстратов. Решающими факторами при выборе этой группы ферментов для работы были: легкость выявления и спектрофото-метрического (колориметрического) определения их активности, высокая удельная активность эстераз у ряда животных (Правдина, 1970) и установленный на нескольких штаммах A. proteus внутривидовой полиморфизм электрофоретического спектра этих ферментов (Сопина, 1973).
Имеется довольно много исследований, посвященных активности и теплоустойчивости эстераз у близких видов животных, обитающих в различающихся температурных условиях; несколько меньше данных о свойствах этих ферментов у различных подвидов и популяций одного вида, а внутривидовые различия в теплоустойчивости эстераз у агамных организмов на примере клонов (штаммов) с различными температурными оптимумами размножения практически не изучены. Для штамма В A. proteus, культивируемого при 25 °С, значение удельной эстеразной активности составляет 87.5±2.7 (п= 16), а для штамма Da, культивируемого при той же температуре,-78.1 ±2.0 (n= 12) у.е. Различия величин удельной активности фермента у двух штаммов амеб статистически достоверны.
Результаты определения теплоустойчивости эстераз у двух штаммов амеб, культивируемых при 25 °С, представлены на рис. 1 (стр.23). Оказалось, что зависимость остаточной ферментативной активности от температуры 30-минутного прогрева носит прямолинейный характер в интервале от 45 до 60 °С для амеб штамма Вив интервале от 50 до 60 °С для амеб штамма Da. Видно, что у амеб В эстеразы более устойчивы к нагреву, чем у амеб Da. Среднее время 50%-ной инактивации эстераз, определенное при температурах прогрева 50 и
55 °С, для амеб Иа оказалось, меньше (24 и 13.5 мин соответственно), чем для амеб В (46.5 и 24 мин).
Достоверность различий величин удельной активности эстераз у двух штаммов амеб позволяет говорить о том, что данная характеристика является штаммоспецифичной. Наряду со сведениями о различиях в электрофоретических спектрах суммарных эстераз у амеб разных штаммов (Сопина, 1973,1986,1995) этот факт дополняет наши представления о внутривидовом полиморфизме биохимических признаков у агамно размножающихся амеб А. рго1ет.
Продемонстрированные межштаммовые различия в теплоустойчивости эстераз амеб двух штаммов свидетельствуют о том, что теплоустойчивость суммарных водорастворимых эстераз может служить штаммовой характеристикой амеб так же, как и удельная активность фермента. Методом микроэлектрофореза в ПААГ было показано, что межштаммовые различия в теплоустойчивости суммарных эстераз амеб штаммов В и Оа обусловлены различиями в спектрах электрофоретических форм эстераз: наличием дополнительных теплоустойчивых фракций у штамма В и дополнительной термолабильной фракции у штамма Ба (Сопина, 1986).
Наши данные о различии теплоустойчивости суммарных эстераз у двух штаммов амеб, различающихся по своим температурным оп-тимумам размножения и культивирумых при 25 °С, показывают, что теплоустойчивость этих ферментов положительно коррелирует с уровнем теплолюбивости штамма амеб. Таким образом, эти данные находятся в согласии с известной закономерностью, по которой теплоустойчивость белков особей вида или внутривидовых категорий коррелирует с теплолюбивостью этих таксонов (см.: Александров, 1985; Хочачка, Сомеро, 1988; Ушаков, 1989)
3.2. Активность и теплоустойчивость эстераз двух штаммов амеб, акклимированных к 10 "С.
Амебы штаммов В и Ба, культивируемые при 25 °С, были в течение 14 сут акклимированы к температуре 10 °С. Ниже представлены результаты измерения удельной активности суммарных водорастворимых эстераз (у.е.) у двух штаммов амеб, культивировавшихся при 25 и 10 °С:
В 25 °С В 10 °С Ба 25 °С Ба 10 °С
87.5^2.7 80.7±2.4 78.Ш.0 110.1±3.9
Средние значения активности эстераз у амеб штамма Ба достоверно различаются между собой - для амеб, акклимированных к 10°, они выше, чем для амеб, содержавшихся при 25 °С. Различия в акгивнос-
ти эстераз амеб штамма В, культивировавшихся при 10 и 25 °С, недостоверны.
Результаты определения теплоустойчивости суммарных водорастворимых эстераз у амеб, содержавшихся при разных температурах, приведены в табл. 1.
Таблица 1
Теплоустойчивость эстераз двух штаммов амеб, акклимированных
к разным температурам
Темпера- Ферментативная активность
тура (% от контрольной) после прогрева
Штамм культиви- проб при разных температурах
рования, °С 45 °С 50 °С 55 °С 60 °С
Па 10 64.1 39.9 30.7 22.9
25 64.3 40.7 29.6 20.8
В 10 74.7 57.6 45.6 28.6
25 76.7 60.2 45.9 27.0
Во всех случаях, кроме одного (амебы штамма Оа, прогрев при 60 °С), различия между средними недостоверны. Амебы, культивируемые при 10 и 25 °С, не различаются между собой и по среднему времени потери 50% эстеразной активности при температурах прогрева 50 и 55 °С. Таким образом, у амеб, содержавшихся при разных температурах, не было обнаружено различий в теплоустойчивости их суммарных водорастворимых эстераз.
При оценке полученного результата следует принимать во внимание то, что электрофоретический спектр суммарных эстераз (водо-и тритонорастворимых) представлен у обоих штаммов большим количеством электроморф - от 16 до 20 при различных способах получения гомогената и использовании различных субстратов при окрашивании гелей (Сопина, 1986, 1995).
Отсутствие изменений теплоустойчивости эстераз после аккли-мации амеб в течение 14 сут к температуре, находящейся в пределах ДТ, при спектрофотометрическом определении активности эстераз может быть отражением того факта, что суммарная теплоустойчивость этого фермента представляет собой результирующую разнонаправленных изменений теплоустойчивости многих электроморф (Сопина, 1997).
3.3. Активность, теплоустойчивость и электрофоретические формы водорастворимой ГбФДГу двух штаммов амеб, культивируемых при 25 °С.
Г6ФДГ катализирует первую реакцию фосфоглюконатного (пен-тозофосфатного) метаболического пути, основное назначение которого состоит в том, чтобы генерировать в цитоплазме НАДФ в восстановленной форме (НАДФН), использующийся главным образом для синтеза жирных кислот и липидов, а также пентозы, необходимые для синтеза нуклеиновых кислот и некоторых коферментов. Спектрофотометрически наличие этого фермента у амеб А. рго1еж ранее не демонстрировалось. Поэтому в первую очередь следовало имеющиеся многочисленные варианты количественного определения активности Г6ФДГ методом спектрофотометрии адаптировать к данному объекту. После экспериментального подбора оптимальных условий для проведения реакции была измерена удельная активность Г6ФДГ, которая составила у амеб штамма Ба 40.1±0.8 ед.(п=10), а у амеб штамма В - 33.1+0.9 ед. (п=10) ед. Штамм Оа, для которого характерно более высокое значение удельной активности фермента, характеризуется и большим сродством фермента к субстрату (константа Михаэлиса, Кга - 5.7-10 6 М/мл), чем штамм В (Кш - 7.510"6М/мл). Различие средних значений удельной активности Г6ФДГ у двух штаммов амеб статистически достоверно, что позволяет считать этот показатель штаммовой характеристикой.
На рис.2 (стр.23) представлен график зависимости остаточной ферментативной активности ГбФДГ амеб двух штаммов от температуры прогрева гомогената. Теплоустойчивость Г6ФДГ амеб штамма В (оптимум размножения - 25-28 °С) оказалась выше теплоустойчивости этого фермента у амеб штамма Ва (оптимум - 22 °С). Различия величин потери ферментативной активности, полученные для амеб двух штаммов, статистически достоверны при всех температурах прогрева, кроме 48 °С. Наибольшие различия в теплоустойчивости Г6ФДГ амеб двух исследованных штаммов получены после прогрева проб при 42 °С. Существенным является тот факт, что более устойчивой к нагреву оказалась Г6ФДГ штамма амеб, характеризующегося более низким уровнем ее активности в контроле. Это позволяет предполагать, что более высокая терморезистентность Г6ФДГ амеб штамма В - это штаммоспецифичное свойство данного белка, а не следствие высокого исходного уровня активности Г6ФДГ перед тестирующим прогревом. Таким образом, теплоустойчивость водорастворимой Г6ФДГ двух штаммов амеб с различными температурными оптимумами раз-
множения коррелирует с теилолюбивостыо этих штаммов.
Электрофоретические спектры водорастворимой Г6ФДГ обоих штаммов не отличаются друг от друга по числу и месту расположения фракций - одной основной, на которую приходится наибольшая доля активности фермента, и трех минорных. Пики на денситограм-мах, соответствующие минорным фракциям, чаще всего полностью не разделяются, так как в геле эти фракции расположены близко друг к другу. Поэтому количественная оценка каждой отдельной минорной фракции затруднена и для выявления возможных различий в термоинактивации разных фракций Г6ФДГ после экперименталь-ного прогрева гомогенатов амеб можно оценивать лишь соотношение основной и совокупности минорных фракций и возможные его изменения после прогревов при разных температурах.
Главная потеря активности фермента у амеб обоих штаммов после прогрева проб при тестирующих температурах происходит за счет инактивации основной фракции, снижение активности минорных фракций при повышении температуры прогрева гомогенатов визуально не прослеживается.
По-видимому, основная и минорные фракции Г6ФДГ амеб штаммов В и 1)а различаются по кинетике их термоинактивации. В контроле доля минорных (предположительно более терморезистентных) фракций в общей активности Г6ФДГ у штамма В больше, чем у штамма Оа. Возможно, именно этим объясняется более высокая теплоустойчивость Г6ФДГ амеб штамма В по сравнению с теплоустойчивостью этого фермента у амеб штамма Оа.
Штаммы В и Ба, послужившие объектом наших исследований, получены в разное время из других лабораторий, а ранее - выделены из природы в разных географических точках. Обнаружение различия в теплоустойчивости Г6ФДГ у штаммов амеб различного происхождения после длительного культивирования обоих штаммов в стандартных лабораторных условиях позволяет считать теплоустойчивость Г6ФДГ, так же как и теплоустойчивость эстераз, штаммо-вой характеристикой, а более высокую теплоустойчивость белков (ферментов) более теплолюбивого штамма - примером генетической адаптации в ее классическом проявлении (Хочачка, Сомеро, 1988) 3.4. Активность, теплоустойчивость и электрофоретические формы Г6ФДГ амеб, акклимированных к 10 °С.
В опытах по влиянию акклимации амеб к относительно низким температурам на активность и теплоустойчивость Г6ФДГ по сравнению с подобными опытами по изучению эстераз время акклима-
ции амеб к 10 °С было увеличино с 14 до 30 сут. Поскольку не удалось культивировать при 10 °С амеб штамма В в количествах, необходимых для проведения биохимических исследований, в этих опытах использовались штаммы Da и Petrozavodsk. Удельная активность водорастворимой ГбФДГамеб обоих штаммов, содержавшихся при 10 °С (Da - 55.6+1.4, n=20 ; Petrozavodsk - 41.4+0.9, п=15 ед.) оказалась достоверно выше, чем у амеб, культивировавшихся при 25 °С (Da - 45.6±0.8, п=20 ; Petrozavodsk - 35.2±1.3, п--15 ед.).
У амеб штамма Da, акклимированных в течение 30 сут к 10 °С, теплоустойчивость Г6ФДГ при всех температурах прогрева оказалась достоверно выше, чем у амеб этого штамма, культивируемых при 25 °С (табл. 2).
Таблица 2
Теплоустойчивость Г6ФДГ амеб штамма Da, акклимированных к
разным температурам
Температура культивирования, °С Ферментативная активность (% от контрольной) после прогрева проб при разных температурах
39 °С 42 °С 45 °С 48 °С
10 90 81 31 9
25 78 63 20 6
10—>25 79 66 23 7
Если амеб, акклимированных к 10 °С, перенести обратно в 25 °С, то через 30 сут культивирования теплоустойчивость Г6ФДГ таких амеб перестает отличаться от теплоустойчивости фермента амеб, все время культивировавшихся при 25 °С (табл. 2). Изменения активности и теплоустойчивости Г6ФДГ, произошедшие в процессе аккли-мации к этой температуре, если и носят приспособительный характер, не являются наследуемыми.
Спектры электрофоретических форм водорастворимой Г6ФДГ амеб штамма Ба, культивируемых при 25 и 10 °С, не различаются и представлены одной основной и тремя минорными фракциями. После прогрева при 42, 45 и 48 °С у основной фракции Г6ФДГ "10-градусных" амеб появляется дополнительная субфракция. Кинетика инактивации основной и минорных фракций фермента после прогрева различна: потеря активности Г6ФДГ амеб, культивируемых при обеих температурах, происходит, главным образом, в результате инактивации основной фракции.
Повышение активности Г6ФДГ при холодовой адаптации нео-
днократно отмечалось в литературе (Fudge et al., 1997; Jagdale, Gordon, 1997). У гольца (Yamauchi et al., 1975) и бельдюги (Campbell, Davies, 1978) оно связывалось авторами с усилением липогенеза при пониженных температурах. Липиды являются антиоксидантами, то есть они обеспечивают нейтрализацию свободных радикалов, образующихся вследствие действия на организм каких-либо повреждающих факторов, одним из которых может быть пониженная температура, и вызывающих цепные реакции окисления биологических субстратов (Соколовский, 1984). Один из ферментов антиоксидантной системы - глутатионредуктаза - для восстановления окисленного глута-тиона использует НАДФН, образовавшийся в результате реакции, катализируемой Г6ФДГ. Между уровнями активности Г6ФДГ и глу-татионредуктазы существует корреляция (Garcia-Alfonso et al., 1998) и, таким образом, повышение активности Г6ФДГ у амеб, культивируемых при 10 °С, можно квалифицировать как модификационное адаптивное изменение, происходящее при холодовой акклимации амеб. Такое повышение активности Г6ФДГ может указывать на активизацию адаптивной системы антиоксидантной защиты у амеб при пониженной температуре культивирования.
Повышение при этом теплоустойчивости данного фермента, противоречащее представлению об однонаправленности изменений свойств какого-либо белка и температурных условий, не подлежит, на наш взгляд, однозначной трактовке. Оно, возможно, указывает па то, что теплоустойчивость данного фермента у амеб зависит от соотношения температуры культивирования, температурного оптимума штамма и границ диапазона его температурной толерантности и не зависит от того, в каком направлении (в сторону повышения или понижения) происходит изменение температурных условий обитания или культивирования исследуемого организма. 3.5. Теплоустойчивость и электрофоретические формы ГбФДГу амеб, акклимироваипых к 28 °С.
Представляло интерес выяснить, как ведет себя признак «теплоустойчивость Г6ФДГ» у амеб, культивируемых при температуре выше 25 °С, при которой амебы, тем не менее, сохраняли бы способность к размножению. Такой температурой можно считать 28 °С -она является для амеб штамма Da верхней границей ДТ. При этой температуре скорость размножения амеб Da сравнима со скоростью их размножения при оптимальной температуре культивирования (22 °С), но эффективность клонирования гораздо ниже - возрастает число погибающих амеб и субклонов (Сопина, 1986). Амеб штамма
Ба содержали при температуре 28 °С в течение 30 сут. После этого определяли теплоустойчивость их Г6ФДГ Средние значения остаточной активности Г6ФДГ таких амеб после прогрева проб при всех четырех тестирующих температурах не отличались от соответствующих средних значений для «25-градусных» амеб.
Анализ электрофоретического спектра Г6ФДГ у амеб, культивируемых при 28 °С, показал, что в нем сокращается число быстропод-вижных фракций. Основная потеря активности Г6ФДГ после прогрева при 39, 42, 45 и 48 °С происходит за счет инактивации основной фракции, а пик на денситограмме, соответствующий минорной фракции, не только не претерпевает видимого ослабления, но даже слегка повышается после прогрева при всех тестирующих температурах.
Изменение электрофоретического спектра фермента при смене температуры культивирования было отмечено для суммарных три-тонорастворимых эстераз амеб штамма В (Сопина, 1997) и тритоно-растворимой Г6ФДГ (Борта, 1989). Кроме того, было показано, что при получении клонов амеб - потомков внутриштаммовых трансплантантов исчезновение быстроподвижиых фракций Г6ФДГ может быть индуцировано воздействиями, связанными с операцией по пересадке ядер (Сопина, Юдин, 1993).
Несколько неожиданный результат был получен при определении теплоустойчивости Г6ФДГ амеб, которых в течение 30 сут содержали при 28 °С, а затем стали вновь культивировать при 25°С. Теплоустойчивость Г6ФДГ амеб, возвращенных в 25° после культивирования их при 28 °С, даже через 3 мес культивирования их при 25° С отличалась от таковой как 25-, так и 28-градусных амеб и оказалась достоверно выше, чем у тех и других. Появление нового наследуемого фенотипа может быть проявлением характерного для амеб осообого типа изменчивости, сочетающего в себе черты как мо-дификационной, так и наследственной изменчивости и являющейся, предположительно, эпигенетической (Юдин, 1982).
Таким образом, можно предположить, что температура 28 °С, лежащая на границе ДТ штамма Ба, изменяет какие-то свойства Г6ФДГ амеб данного штамма. При отсутствии изменений теплоустойчивости Г6ФДГ у амеб, культивируемых при 28 °С, эти свойства обусловливают повышение теплоустойчивости фермента после возвращения культуры амеб в исходные температурные условия.
3.6. Стрессовые температурные воздействия и белки теплового шока у амеб.
Обсуждая в настоящее время проблему температурных адаптации, недостаточно было бы рассмотреть влияние на организм температур, лежащих в пределах его ДТ, и обойти вниманием стрессовые температурные воздействия. Иными словами, нельзя не коснуться вопроса о белках теплового шока у амеб.
Амебы штамма Da, культивировавшиеся при температуре 22 "С, были подвергнуты тепловому шоку при 37 °С в течение 1 ч и через разные сроки после окончания воздействия из амеб были получены гомогенаты. После SDS-злектрофореза белки были перенесены на нитроцеллюлозу. В результате обработки полученных блотов поли-клональными анти-ШР70 антителами, обладающими перекрестной реакцией с БТШ многих видов животных (Margulis et al., 1991), и окрашивания их вторичными антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой и пероксидазой, на каждом из них была выявлена хорошо окрашиваемая зона, соответствующая полипептиду с молекулярной массой, несколько превышающей 66 кДа (рис.3 а, б; стр.23). Есть основания считать выявляемый таким образом белок одним из белков семейства HSP70. Проведение АТФ-агарозной хроматографии показало, что белок 70 кДа из амеб обладает свойством связываться с АТФ, что также является подтверждением его принадлежности к БТШ (Welch, Feramisco, 1985.) При визуальной оценке интенсивности окрашивания зон локализации белка HSP70 на блотах не удалось выявить зависимость количества этого белка от времени, прошедшего после теплового шока. Не были также обнаружены различия в интенсивности окрашивания зоны локализации HSP70 не-прогретых амеб и амеб, подвергнутых тепловому шоку.
Другая серия опытов была направлена на поиск возможно более адекватной температуры для проведения теплового шока. Кроме температуры 37 °С, которая является для амеб данного штамма сублетальной, были испытаны температуры 28 и 32 °С; температура 28 °С является верхней границей ДТ для амеб данного штамма. В одном геле проводили электрофорез гомогенатов непрогретых амеб и го-могенатов, полученных из амеб через 4 ч после того, как они были подвергнуты тепловым воздействиям при температурах 28, 32 и 37 °С в течение 1 ч. На блоте выявлено существенное снижение интенсивности окрашивания зоны, соответствующей HSP70 в гомоге-нате, полученном через 4 ч после теплового шока, проведенного при 37 °С.
Были также проведены опыты по выявлению БТШ амеб с помощью моноклональных антител, узнающих только индуцибельный компонент семейства HSP70. После того, как амебы были в течение 1 ч прогреты при температурах 32 и 37 °С, и гомогенаты прогретых и контрольных амеб подвергнуты SDS-электрофорезу с последующим электроблотгингом, блоты были обработаны моноклональными анти-Н8Р70 антителами. Удалось выявить индукцию белка HSP70 в гомогенатах, полученных из амеб через 4 ч после их прогрева при 32 °С, и заметное снижение интенсивности окрашивания соответствующей зоны в гомогенатах, полученных из амеб через 4 ч после их прогрева при 37 °С (рис. 3 в). Высокий уровень конститутивно содержащейся у амеб индуцибельной формы БТШ семейства HSP70, описанный, в частности, для некоторых тканей человека (Demidov et al., 1999), вызывает несомненный интерес и предполагает продолжение исследований в этой области.
В единственной известной нам работе, посвященной БТШ у амеб вида Amoeba proteus (Kalinina et al., 1988), показано, что при повышении температуры от 22 до 32 °С у амеб происходит синтез белков семейства HSP70. К сожалению, различия в использованных методах и несопоставимые схемы проведения экспериментов не позволяют напрямую сравнивать полученные нами результаты с этими данными. 4. Выводы
1. В гомогенатах амеб Amoeba proteus, культивируемых при 25°С, методами колориметрии и спектрофотометрии выявляется высокая эстеразная активность и активность глюкозо-6-фосфатдегидрогена-зы (Г6ФДГ). Активность фермента является у амеб штаммоспеци-фичным признаком.
2. Электрофоретические спектры Г6ФДГ двух штаммов амеб, различающихся по теплолюбивости, не отличаются друг от друга и состоят из 4 фракций, которые различаются по кинетике своей термоинактивации.
3. Теплоустойчивость как термостабильных эстераз, так и термолабильной Г6ФДГ положительно коррелирует с теплолюбивостью штамма амеб.
4. Активность и теплоустойчивость Г6ФДГ повышаются при акк-лимации амеб к относительно низкой температуре 10 °С и не изменяются при акклимации к 28 °С - температуре, являющейся верхней границей диапазона температурной толерантности исследованного штамма.
5. В клетках амеб конститутивно содержится белок теплового шока семейства Н8Р-70. После экспозиции культуры амеб при температуре, превышающей верхнюю границу диапазона температурной толерантности исследуемого штамма, происходит повышение уровня содержания (индукция) этого белка.
Рис 2. Теплоустойчивость ГбФДГ двух штанное амеб, культивируемых при температуре 25 °С
^ 80 6 «
I
X 40
<9
1 30
температура, 'С
Рис. а. Окраска Ьлотов после оьраьотки их поликлональными (а, 6) и монокло-нальными (в) анти-НвР 70 антителами.
К " 0 2 4 6
б
К 3 6 24 ббкДа
а, б - прогрев амеб штамма 0а при 37 'С в течение 1 ч в
32" 0 32° 4 К 37" 0 37" 4
в - прогрев амеб штамма Оа при 32 и 37 "С в точение 1 ч
на старте: а-10;б-8;в-7 мкг белка К - контроль (непрогретые амебы); 0, 2, 3, 4, 6 и 24 - время (ч), прошедшее после теплового шока;» - маркер 66 кДа_
а
5. Список работ, опубликованных по теме диссертации.
Сопина В. А., Подлипаева Ю. И. 1984. Теплоустойчивость эсте-разной активности гомогенатов амеб, культивируемых при различных температурах. Цитология 26(2): 143-149.
Подлипаева Ю. И. 1987. Активность глюкозо-6-фосфатдегидро-геназы в гомогенатах амеб. В сб.: Современные проблемы протозоологии. JL: Наука: 45.
Сопина В. А., Подлипаева Ю. И. 1989. Ферменты фосфоглюко-натного пути у амеб. Цитология 31(1): 85-96.
Подлипаева Ю. И. 1991. Активность и теплоустойчивость глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) в гомогенатах амеб. Цитология 33(5): 125.
Podlipaeva J. I. 1992. The activity and thermoresistance of glucose-6-phosphatedehydrogenase (G6PD) in Amoeba proteus. Proc. 1 Europ. Congress of Protozoology, Reading, England: 30.
Подлипаева Ю. И. 1992. Активность и теплоустойчивость глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы у двух штаммов амеб Amoeba proteus. Цитология 34(3): 89-96.
Подлипаева Ю. И. 1992. Активность глюкозо-6-фосфатдегидро-геназы у амеб, культивируемых при различных температурах Цитология 34(4): 120.
Подлипаева Ю. И. 1994. Активность, теплоустойчивость и элек-трофоретические формы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у амеб, культивируемых при разных температурах. Цитология 36(4): 378-383.
Podlipaeva Yu. I., Kinev A. V. 1996. The major inducible heat shock protein of 70 kDa in Amoeba proteus. Molecular Biology of the Cell 7:1038.
Podlipaeva Yu. I. 1997. Hereditary and environmentally determined changes in some characteristics of glucose-6-phosphatedehydrogenase in Amoeba proteus (Pallas, 1766), Leidy, 1878. Доповщ! Нацюнально1 АкадемП Наук УкраГни.: 184-188.
Podlipaeva Yu. Gromov D. 1998. 70 kDa heat shock protein content in Amoeba proteus cells. Molecular Biology of the Cell. 9: 129a.
6. Список литературы.
Александров В. Я. 1975. Клетки, макромолекулы и температура. Л.: Наука. - Александров В. Я. 1985. Реактивность клеток и белки. Л.: Наука. - Березина И. Г. 1970. Цитохимическое исследование клеточного метаболизма некоторых свободноживущих простейших, культивируемых при разных температурах. Автореф. канд. дис. Л. - Зайдсль А. Н. 1985.Погрешности измерений физических величин. Л.: Наука. - Константинова М. Ф. 1983. Влияние температуры выращивания на активность и теплоустойчивость карбоксилэстера-зы озимой пшеницы Мироновская 808. Физиол. биохим. культ, растений 15(1): 28-32. - Лозина-Лозинский Л. К. 1961. Устойчивость к различным внешним агентам парамеций, адаптированных к жизни в горячем радиоактивном источнике. Цитология 3(2): 154-166. - Осипов Д. В. 1966. Теплоустойчивость клонов Paramecium caudatum, выделенных из разных природных популяций. Вести. ЛГУ 3(1): 107-115. - Полянский Ю. И. 1957. Температурные адаптации у инфузорий. I Зависимость теплоустойчивости Paramecium caudatum от температурных условий существования. Зоол. ж. 36(11): 1630-1646. - Полянский Ю. И., Суханова К. М., Сопина В. А., Юдин А. Л. 1967. Устойчивость Amoeba proteus к действию летальной температуры и этилового спирта. В сб.: Изменчивость теплоустойчивости клеток животных в онто- и филогенезе. М., Л., Наука: 43-62. - Правдина К. И. 1970. Теплоустойчивость водорастворимых эстераз пойкилотермных животных. Цитология 12(1 2): 1541-1549. - Прехт Г. (Precht H.) 1964. Обзор экспериментальных данных по адаптивным изменениям устойчивости. В кн.: Клетка и температура среды. М.; Л., Наука : 206213. - Проссер К. Л. (Prosser К. L.) 1977. Сравнительная физиология животных. М.,Мир,т. I. - Серавин ЛЛ1., СкоблоИ.И., Осипов Д. В. 1965.Влияние температурной адаптации на теплоустойчивость ферментов инфузорий Paramecium caudatum. В сб.: Теплоустойчивость клеток животных. М., Л., Наука: 161-170. - Серов О. Л., Корочкин Л. И., Мапченко Г.П. 1977. Генетика изоферментов. M.: Наука. -Соколовский В. В. 1984 . Окислительно-восстановительные процессы в биохимическом механизме неспецифической реакции организма на действие экстремальных факторов внешней среды. В кн.: Анти-оксиданты и адаптация Л.: 5-19.-Сопина В. А. 1968. Межклоповые различия по теплоустойчивости у амеб. Цитология 10(2): 207-217,- Соннна В. А. 1973. Эстеразы трех штаммов амеб. Цитология 15(10): 1308-1312. - Сопина В. А. 1986. Теплоустойчивость клеток, суммарных эстераз и отдельных электрофо-ретических фракций эстераз у двух штаммов Amoeba proteus. Цитология 28(11): 1211-1221.-Сопина В. А. 1987. Спектр и теплоустойчивость отдельных элект-рофоретических форм тритонорастворимых эстераз у амеб, культивируемых при различных температурах. Цитология 29(3): 321-330. - Сопина В. А. 1991.Спектр электрофоретических форм глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы и глюкозо-дегидрогеназы у амеб, культивируемых при различных температурах. Цитология 33(7): 104-109. - Сопина В. А. 1995. Эстеразы у Amoeba proteus. Цитология 37(4): 345-355. - Сошша В. А. 1997. Эстеразы у амеб Amoeba proteus, культивируемых при различных температурах. Цитология 39(9): 763-774. - Сопина В. А., Юдин А. Л. 1993. Индуцируемые наследуемые изменения в спектрах электрофоретичеких форм глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы у амеб. Генетика 29(3): 435-443. - Суханова К. М. 1968. Температурные адаптации у простейших. Л., Наука. - Ушаков Б. П. , 1989. Физиология клетки и проблема вида у пойкилотермных животных. Л.: Наука. -ХлебовичВ. В. 1981. Акклимация животных организмов. Л.: Наука.
- Хочачка II., Сомеро Дж. 1988. Биохимическая адаптация. М.:Мир. - Юдин
A. Л. 1982. Ядерно-цитоплазматические взаимоотношения и клеточная наследственность у амеб. JI.: Наука. - Campbell С. M.,DaviesP. S. 1978.Tempcrature acclimation in the teleost Blennius folis: changes in enzyme activity and cell structure. Сотр. Bioehem. Physiol. 618: 165-167. Ciardiello M. A., Camardella L., Carratorc V., Diprisco G. 1997. Enzymes in antarctic fish - glucose-6-phosphate dehydrogenase and glutamate dehydrogenase. Сотр. Bioehem. Physiol. 118A(4): 1031 -1036. - Dcmidov O. N., Tyrenko V. V., Svistov A. S., Komarova Yc.Yu., Karpishenko A. I., Margulis
B. A., Shcvchenko Yu. L. 1999. Heat shock proteins in cardiosurgery patients. Europe J. Cardio-thor. Surg. 16: 444-449. - Feller G., Arpigny J. L., Gcrday С. 1997. Molecular adaptations of enzymes from psychrophilic organisms. Сотр. Bioehem. Physiol. 118A(3): 495-499. - Fudge D. S., Stevens E. D., Ballantyne J. S. 1997. Enzyme adaptation along a heterothermic tissue - the visceral retia mirabilia of the blufin tuna. Amer. Journ. Physiol. 41(6): R1834-R1840. - Garcia-Alfonso C., Repetto G., San/. P., Rcpctto M„ Lopez-Barea J. 1998. Direct determination of gluthatione S-transferase and glucose-6-phosphate dehydrogenase activities in cclls cultured in microtitre plates as biomarkers for oxidative stress. ATLA 26(3): 321-330. - Gomori G. 1953. Human esterases. J. Lab. Clin. Med., 42: 335-453. -Iiochachka P. VV. 1998. Mechanism and evolution of hypoxia-tolerance in humans. J. Exp. Biol. 201 (8): 1243-1254. - Jagdale G. В., Gordon R. 1997. Effect of temperature on the activities of glucose-6-dehydrogenase and hexokinase in entomopathogenie nematodes (Nematoda, Steinemematidae). Сотр. Bioehem. Physiol. 118A(4): 1151-1156. - Janovy J. 1972. Temperature and metabolism in Leishmania. III. Some dehydrogenases of L. donovani, L. mcxicana and L tarentolae. Exp. Parasitol. 32:196-205. - Kalinina L. V., Khrebtukova LA., Podgornaya O. L., Wasik A., Sikora J. 1988. Heat shock proteins in Amoeba. 1. Effect of high temperature on Amoeba proteus and Amoeba horokensis. Eur op. J. Protistol. 24: 64-68. -LaemmliU. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. - Lowry О. H., Rosenbrough N. J., Farr A. L., Randall R. F. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275. - Margulis B. A., Nacharov P. V., Isvetkova O. L., Welsh M., Kinev A. V. 1991. The characterization and use of different antibodies against the HSP70 major heat shock protein family for the development of an immunoassay. Electrophoresis 12(9): 670-673. - Marck M. 1982. Influence of cooling on the profile of proteins and esterases in tissues of some endopterygote insects. Сотр. Bioehem. Physiol. 73B: 951-956. - Pierce V. A., Crawford D. L. 1997. Phylogenetic analysis of thermal acclimation of the glycolytic enzymes in the genus Fundulus. Physiol. Zoology 70(6): 597-609. - Prescott D. M., Carrier R.F. 1964. Experimental procedures and cultural methods for Euplotes eurystomus and Amoeba proteus. In: Methods in cell physiology. New York; London: Acad. Press I: 85-95. -Sopina V. A. 1976. The multiplication rate of amoebae related to the cultivation temperature. J. Thermal Biology 1: 199-204. - Sopina V. A. 1989. Polymorphism of glucose-6-phosphate dehydrogenase in free-living Amoebidae. Arch. Protistenkd. 137: 131-141. -Towbin II., Staehcln Т., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad Sci USA 76: 4350-4354. - Welch W. J., Feramisco J. R. 1985. Rapid purification of mammalian 70.000-dalton stress proteins: affinity of the proteins for nucleotids. Mol. Cell Biol. 5: 1226-1229. - Yamauchi Т., Stegeman J. J., Goldberg L. 1975. The effects of starvation and temperature acclimation on pentose phosphate pathway dehydrogenases in brook trout liver. Arch. Bioehem. Biophys. 167: 13-22.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Подлипаева, Юлия Игоревна
Оглавление 2
Введение
1.Обзор литературы 6
1.1.Биохимические изменения при смене температурного режима 7
1.1.1. Теплоустойчивость белков
1.1.2. Количественный способ регуляции работы ферментов при изменении температуры среды
1.1.3. Изменение каталитической эффективности ферментов при смене температурного режима
1.2. Влияние температуры среды на одноклеточные организмы 21
1.2.1. Теплоустойчивость простейших
1.2.2. Биохимические особенности реакции одноклеточных организмов на изменение температурного режима
2. Цель и задачи исследования
3. Материал и методика 41
3.1. Амебы - объект исследования 41
3.1.1. Происхождение амеб, использованных в работе
3.1.2. Культивирование амеб
3.2. Гомогенат и супернатант 42
3.2.1. Получение гомогената
3.2.2. Получение супернатанта
3.3. Определение активности ферментов 43
3.3.1. Определение активности суммарных водорастворимых эстераз
3.3.2. Определение активности ферментов фосфоглюконатного пути
3.4. Определение теплоустойчивости ферментов 46
3.4.1. Определение теплоустойчивости суммарных водорастворимых эстераз
3.4.2. Определение теплоустойчивости глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ)
3.4.3. Статистическая обработка данных
3.5. Анализ электрофоретических форм ферментов 48
3.5.1. Проведение нативного электрофореза
3.5.2. Обработка гелей после электрофореза
3.6. Выявление белков теплового шока Н8Р70 у амеб 49
3.6.1. Воздействие тепловым шоком и получение гомогената и супернатанта
3.6.2.Проведение8В8-электрофореза 50 3.6.3 .Иммуноблоттинг 51 3.6.4. Очистка белка ШР70 51 4. Результаты и обсуждение 52
4.1. Суммарные водорастворимые эстеразы (СВЭ) 52
4.1.1. Активность и теплоустойчивость СВЭ у двух штаммов амеб, культивируемых при 25 °С
4.1.2. Активность и теплоустойчивость СВЭ у амеб, акклимированных к пониженной температуре 10 °С
4.2. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ) 68
4.2.1. Активность Г6ФДГ у амеб и особенности ее определения методами спектрофотометрии и электрофореза в ПААГ
4.2.2. Теплоустойчивость водорастворимой Г6ФДГ двух штаммов амеб, культивируемых при 25 °С
4.2.3. Активность Г6ФДГ у амеб, акклимированных к относительно низкой температуре 10 °С
4.2.4. Теплоустойчивость Г6ФДГ амеб штамма акклимированных к 10 °С
4.2.5. Теплоустойчивость Г6ФДГ амеб штамма Ба, акклимированных к повышенной температуре 28 °С
4.3. Белок теплового шока семейства Н8Р70 у амеб штамма Ба 105
4.3.1. Выявление белка ШР70 методом иммуноблоттинга
4.3.2. Выделение белка Н8Р70 методом хроматографии 113 Выводы 114 Список литературы 115
Введение Диссертация по биологии, на тему "Активность и теплоустойчивость некоторых ферментов amoeba proteus при изменении температуры культивирования амеб"
Среди многочисленных абиотических факторов внешней среды, оказывающих влияние на жизнедеятельность организмов, одно из основных мест принадлежит температуре. Проблема приспособления к изменяющимся температурным условиям среды важна как с практической (акклиматизация животных и растений к новым местам обитания), так и с теоретической (экология отдельных видов и их адаптивная радиация ) точек зрения. Приспособления животных и растений к температурным условиям внешней среды осуществляются на разных уровнях организации - популяционном, организмен-ном, тканевом, клеточном и молекулярном.
У эктотермных организмов имеются многообразные биохимические приспособления, направленные на минимизацию повреждений, вызванных изменениями температуры. Среди биологических структур (белков, нуклеиновых кислот, липидов), являющихся «мишенями», на которые может быть направлено повреждающее действие температуры, особое внимание уделялось белкам, а среди белков - ферментам. Это связано с тем, что именно ферментные системы обеспечивают необходимую интенсивность метаболизма при различных температурах и, кроме того, их активность представляет собой удобный для регистрации маркерный признак. Различные способы компенсации повреждающего действия температуры направлены на коррекцию активности ферментов и их каталитической эффективности. Кроме того, в качестве критерия протекания адаптивных процессов принято использовать изменение теплоустойчивости белков, в частности, белков-ферментов.
Количество сведений, иллюстрирующих различные биохимические способы температурной компенсации работы ферментных систем у простейших крайне невелико (Сопина, 1987,1991, 1997). Так же, как и в случае с многоклеточными организмами, активность и теплоустойчивость белков простейших исследовалась как в сравнительном плане - на представителях разных видов (популяций, клонов), так и в процессе акклимации представителей одного вида к разным температурам. Однако следует заметить, что, в отличие от данных по многоклеточным организмам, сведения, касающиеся простейших крайне немногочисленны.
Данные о теплоустойчивости ферментов одноклеточных организмов позволяют проследить положительную корреляцию между теплоустойчивостью фермента и теплолюбивостью вида (7апоуу, 1972) или внутривидовых группировок (Лозина-Лозинский, 1961; Сопина, 1986). Однако каких-либо общих закономерностей в поведении этого признака при акклимации животных одного вида к различным температурам культивирования выявить не удавалось (Серавин и др., 1965; Березина, 1970; Сопина, 1991). Не исключено, что поведение ферментов, различных по своей структуре, термолабильности, конфор-мационным потенциям и другим свойствам, и не подчиняется общей схеме при смене температурного режима. Для накопления фактов в этой области более эффективным было бы проведение адекватного анализа теплоустойчивости как можно большего числа ферментов у разнообразных организмов.
Свободноживущие пресноводные амебы, не имеющие в своем жизненном цикле полового процесса, представляют особый интерес для исследования их приспособлений к температурному фактору, так как отсутствие полового процесса позволяет четко отделить модификационные изменения, вызванные сменой температуры, от наследственных вариаций.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Термином «адаптация» принято обозначать любые свойства и признаки организма, обеспечивающие его жизнеспособность (НосЬасЫса, 1998). Важнейшим элементом адаптационного процесса является акклимация, которая представляет собой компенсаторное изменение, возникающее в организме в ответ на длительное отклонение какого-либо фактора внешней среды от первоначального уровня, или «.фенотипический сдвиг, происходящий в лабораторных условиях в ответ на экспериментальное варьирование какого-либо одного параметра среды» (Проссер, 1977, стр. 19). Иногда акклимация может выглядеть инадаптивной, что, скорее всего, свидетельствует о незавершенности процесса (Прехт, 1964), который в своем завершенном виде всегда адаптивен (Хлебович, 1981).
Очень важными для анализа комплекса реакций исследуемого организма на изменения температуры среды являются сведения о диапазоне температурной толерантности (ДТ) данного организма и его температурном оптимуме. У разных объектов приняты разные критерии для определения этих понятий. Иногда ДТ характеризуется как диапазон активности 100% особей (Бергер, 1971), иногда - как диапазон, в пределах которого возможно «полноценное существование организма» (Александров, 1985). Понятие диапазона температурной толерантности и его определение имеет также большое значение при характеристике воздействия, которое та или иная температура оказывает на изучаемый организм. Температуры, лежащие в пределах и на границах ДТ (субоптимальные температуры), оказывают более мягкое действие, чем стрессовые, лежащие вне его и являющиеся часто сублетальными и летальными. Механизмы компенсаторных реакций организмов будут различны в первом и втором вариантах (Korhonen, Lagerspetz, 1996).
Воздействие повышенной температуры на любые клетки или организмы стимулирует транскрипцию высококонсервативного набора генов и синтез белков теплового шока (heat-shock proteins - HSP), относимых к разным семействам в зависимости от их молекулярного веса (Lindquist, Craig, 1988). Наряду с HSP, синтезирующимися при действии теплового шока (индуци-бельными), имеются гомологичные им белки, нормально присутствующие в интактных клетках (конститутивные). В отсутствие стрессовой ситуации количество конститутивных стрессовых белков в клетках может существенно варьировать (Lindquist, Craig, 1988).
В процессе интенсивного изучения приспособлений животных и растений, направленных на компенсацию повреждающего действия температуры, было сформировано понятие «теплоустойчивость», ставшее неотъемлемым элементом экспериментальных исследований и теоретических построений. Под «первичной теплоустойчивостью» подразумевается устойчивость клеток или организмов, определяемая сразу после краткосрочного интенсивного нагрева (см.: Александров, 1985, стр. 170). Уровень теплоустойчивости организмов и их клеток традиционно служил критерием их адаптации к температурным условиям. Многими работами классиков цитоэкологии было показано, что теплоустойчивость многоклеточного организма весьма лабильна, и что она изменяется при сдвигах температуры среды в пределах ДТ, обеспечивая существование организма в условиях колебания температуры (Ушаков, 19 73). Это положение оказалось справедливым для большого количества видов разнообразных эктотермных животных, позвоночных и беспозвоночных (Жирмунский, 1959; Арронет, 1960; Ушаков, Кусакина, 1960; Жирмунский, Шляхтер, 1963).
Напротив, теплоустойчивость отдельных клеток многоклеточных организмов, в отличие от теплоустойчивости организма в целом, оказалась консервативной величиной. Различный уровень теплоустойчивости клеток, характерный для каждого вида, возник и закрепился в процессе эволюции и является, по мнению Б. П. Ушакова, одним из критериев вида (Ushakov, 1964). По результатам многих исследований был сформулирован вывод о том, что «в природе.имеет место соответствие между температурной экологией вида и теплоустойчивостью клеток.организма» (Александров, 1985, стр. 187).
Что же касается модификационных изменений теплоустойчивости клеток в процессе акклимации организма к изменяющимся температурным условиям, то, за некоторыми исключениями (Камшилов, 1960; Дрегольская, 1963), у большинства многоклеточных организмов изменения окружающей температуры, не выходящие за пределы их ДТ, не вызывают сдвигов в уровне теплоустойчивости их клеток. Таким образом, клетки многоклеточного организма обладают более низкой акклимационной подвижностью, чем организм в целом (Ушаков, 1973).
Супероптимальный нагрев может способствовать возникновению временной термотолерантности (повышению теплоустойчивости) клеток (1л, 1989). Наряду с фактами, говорящими о том, что в приобретении клетками такой повышенной теплоустойчивости участвуют НБР (Копке1 е1 а1., 1998; МсКесИ-ш а1., 1998), имеются данные, не подтверждающие ключевой роли НБР в процессе повышения терморезистентности клеток после гипертермии (На11Ье^, На11Ье^, 1996). В. Я. Александров и И. М. Кислюк в обзоре, посвященном физиологическому аспекту реакции клеток на тепловой шок, делают заключение, что вопрос о механизме реактивного повышения теплоустойчивости клеточных функций и белков при тепловом шоке «пока остается без ответа» (Александров, Кислюк, 1994).
Особенно зависимы от колебаний температуры эктотермные (пойкило-термные) организмы, температура тела которых непостоянна и близка к температуре окружающей среды. Эктотермные животные обладают минимальной способностью физиологически регулировать температуру тела (Хочачка, Сомеро, 1977). Для эктотермных животных характерны два типа, или, точнее, уровня регуляции в ответ на колебания температуры. Первый - это поведенческий, направленный на то, чтобы при кратковременных колебаниях температуры среды найти подходящую микросреду для под держания температуры тела, близкой к оптимальной. Регуляция второго уровня связана с адаптация-ми биохимических систем организма при длительных, например сезонных, колебаниях температуры.
В основе компенсации температурных влияний на обмен лежат количественный и качественный способы регуляции работы ферментов. Первый способ - это изменение содержания ферментов в клетках. Второй способ, направленный на коррекцию каталитической эффективности ферментов, включает в себя конформационные изменения белков-ферментов, поддержание постоянства константы Михаэлиса для субстратов и кофакторов и выработку различных изо- и аллоформ фермента, более пригодных для функционирования в соответствующих температурных условиях (Хочачка, Сомеро, 1988). Показателем того, состоялись или нет адаптивные процессы, принято считать также изменение теплоустойчивости белков, в частности, белков-ферментов.
Поскольку основные понятия, затронутые в настоящей главе, были разработаны применительно к многоклеточным, в дальнейшем обзоре литературы мы подробнее остановимся на каждом из вышеперечисленных способах биохимической компенсации воздействия температуры на многоклеточный организм. Кроме того, будет сделана попытка проанализировать особенности температурных приспособлений одноклеточных организмов (простейших) в терминах, обозначенных выше.
Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Подлипаева, Юлия Игоревна
ВЫВОДЫ
1. В гомогенатах амеб Amoebaproteus, культивируемых при 25°С, методами колориметрии и спектрофотометрии выявляется высокая зсте-разная активность и активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
Г6ФДГ). Активность фермента является у амеб штаммоспецифичным признаком.
2. Электрофоретические спектры Г6ФДГ двух штаммов амеб, различающихся по теплолюбивости, не отличаются друг от друга и состоят из 4 фракций, которые различаются по кинетике своей термоинактивации.
3. Теплоустойчивость как термостабильных эстераз, так и термолабильной Г6ФДГ положительно коррелирует с теплолюбивостью штамма амеб.
4. Активность и теплоустойчивость Г6ФДГ повышаются при аккли-мации амеб к относительно низкой температуре 10 °С и не изменяются при акклимации к 28 °С - температуре, являющейся верхней границей диапазона температурной толерантности исследованного штамма.
5. В клетках амеб конститутивно содержится белок теплового шока семейства НЗР 70. После экспозиции культуры амеб при температуре, превышающей верхнюю границу диапазона температурной толерантности исследуемого штамма, происходит повышение уровня содержания (индукция) этого белка.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Подлипаева, Юлия Игоревна, Санкт-Петербург
1. Александров В. Я., Кислюк И. М. 1994. Реакция клеток на тепловой шок: физиологический аспект. Цитология 36(1): 5-60.
2. Арронет Н. И. 1959. Клеточная и организменная теплоустойчивость Rana temporaria L. и Unió crassus Philipsson в разные сезоны года. Цитология 1(4): 443-449.
3. Бейер Т. В., Сидоренко Н. В. 1973. Цитохимическое исследование гемо-грегарин из рептилий Армении. III. Активность дегидрогеназ у гемогрегарин из периферической крови скальных ящериц и в зараженных эритроцитах. Цитология 15(5): 598-606.
4. Бергер В. Я. 1971. Адаптации к изменениям солености среды беломорского моллюска Hydrobia ulvae (Pennant), обработанного ингибиторами синтеза РНК и белка. В кн.: Отчетная научная сессия по итогам работ 1970 г. Зоол. ин-та АН СССР. Л., Наука: 3-4.
5. Березина И. Г. 1969. Определение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и -глицерофосфатдегидрогеназы у Spirostomum ambiguum, адаптированных к различным температурам. Матер. II научн. конф. молодых специалистов Инта цитологии АН СССР. Л.: Наука: 5.
6. Березина И. Г. 1970а. Цитохимическое исследование клеточного метаболизма некоторых свободноживущих простейших, культивируемых при разных температурах. Автореф. канд. дис. Л.
7. Березина И. Г. 19706. Цитохимическое исследование некоторых дегидро-геназ у Amoebaproteus, адаптированных к высокой и низкой температуре. Acta protozool., 7: 277-286.
8. Виноградова А. Н. 1963. Теплоустойчивость и температурный оптимум аденозинтрифосфатазной активности актомиозина черноморских и баренце-воморских скатов и крабов. В сб.: Проблемы цитоэкологии животных М., Л.: 189-195.
9. Глазко В. И., Созинов И. А. 1993. Генетика изоферментов животных и растений. Киев, Урожай.
10. ГлушанковаМ. А. 1965. Теплоустойчивость аденилаткиназы травяной и озерной лягушек. В сб.: Теплоустойчивость клеток животных М., JL: 200-202.
11. Глушанкова М. А., Кусакина А. А. 1967. Теплоустойчивость некоторых белков у представителей различных популяций такырной круглоголовки. В сб.: Изменчивость теплоустойчивости клеток животных в онто- и филогенезе. Л.:Наука: 114-118.
12. Дрегольская И. Н. 1963. Теплоустойчивость мерцательного эпителия жабр черноморских мидий в разные сезоны года. В сб.: Проблемы цитоэкологии животных М., Л.: 43-50.
13. Еремин А. Н., Метелица Д. И. 1986. Стабильность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и пероксидазы хрена в системах фермент-ПАВ-вода-гептан, моделирующих мембранные липид-белковые ансамбли . Биохимия 51(10): 1612-1623.
14. Зайдель А. Н. 1985 Погрешности измерений физических величин. JL: Наука.
15. Иваненков В. В., Коробцов Г. Н. 1976. Теплоустойчивость ацетилхолин-эстеразы и неспецифических эстераз в развитии гибридов морских ежей Strongylocentrotus droebachiensisи S. intermedius. Онтогенез 7(4): 341-347.
16. Ирлина И. С. 1960. Изменение теплоустойчивости некоторых свободножи-вущих простейших под влиянием предшествующего температурного режима. Цитология 2(2): 227-234.
17. Калинина JI. В. 1967. Наследственные изменения, вызываемые у амеб рентгеновским облучением. Цитология 9(12): 1543-1549.
18. Калинина JI. В. 1968. Наследуемые изменения у амеб, вызываемые действием актиномицина D. Цитология 10(12): 1589-1597.
19. Калинина JI. В., Горюнова JI. Б. 1975а. Изменения наследственных свойств амеб при микрургическом воздействии во время деления (метафаза ранняя анафаза). Цитология 17(4): 474-476.
20. Калинина Л. В., Горюнова Л.Б. 19756. Изменения наследственных свойств амеб при микрургическом воздействии во время деления (анафаза ранняя телофаза). Цитология 17(5): 580-582.
21. Камшилов М. М. 1960. О «системном» и «клеточном» приспособлении. Труды Мурманского морского биологического института 2(6): 226-235.
22. Ковалева Н. Е. 1968. Зависимость активности некоторых дегидрогеназ у Paramecium caudatum, адаптированных к пониженной и повышенной температуре, от возраста массовой культуры. Цитология 10(9): 1171-1179.
23. Константинова М. Ф. 1983. Влияние температуры выращивания на активность и теплоустойчивость карбоксилэстеразы озимой пшеницы Мироновская 808. Физиол. биохим. культ, растений 15(1): 28-32.
24. Константинова М. Ф., Григорьева Г. М. 1969. Теплоустойчивость ацетил-холинэстеразы двух видов лягушек. ДАН СССР 184(4): 972-974.
25. Кусакина А. А. 1961. Зависимость скорости снижения холинэстеразной активности гомогенатов печени травяной и озерной лягушки от темепературы. ДАН СССР 139(5): 1258-1261.
26. Кусакина А. А. 1962. О соответствии теплоустойчивости мышц и холинэ-стеразы температурным условиям обитания вида у некоторых рыб. Цитология 4(1): 68-71.
27. Кусакина А. А. 1965. Теплоустойчивость гемоглобина и холинэстеразы мышц и печени у представителей трех подвидов серой жабы (Bufo bufo L.). В сб.: Теплоустойчивость клеток животных. JI.: Наука: 208-211.
28. Кусакина А. А. 1967. Теплоустойчивость альдолазы и холинэстеразы у близких видов пойкилотермных животных. В сб.: Изменчивость теплоустойчивости клеток животных в онто- и филогенезе. JL: Наука: 142-148.
29. Кусакина А. А. 1973 . Сопряженные уровни теплоустойчивости альдолазы и холинэстеразы мышечных гомогенатов близких видов пойкилотермных животных. Экология (4): 89-93.
30. Кусакина А. А., Глушанкова М. А., Васянин С. И. 1971. Теплоустойчивость некоторых белков у представителей внутривидовых групп байкальских омулей и хариусовю. Цитология 13(8): 994-1004.
31. Лозина-Лозинский Л. К. 1961. Устойчивость к различным внешним агентам парамеций, адаптированных к жизни в горячем радиоактивном источнике. Цитология 3(2): 154-166.
32. Осипов Д. В. 1966. Теплоустойчивость клонов Paramecium caudatum, выделенных из разных природных популяций. Вестн. ЛГУ 3(1): 107-115.
33. Подлипаева Ю. И. 1987. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогена-зы в гомогенатах амеб. В сб.: Современные проблемы протозоологии. Л.: Наука: 45.
34. Подлипаева Ю. И. 1991. Активность и теплоустойчивость глюкозо-6фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) в гомогенатах амеб. Цитология 33(5): 125. >j
35. Подлипаева Ю. И. 1992а. Активность и теплоустойчивость глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у двух штаммов амеб Amoeba proteus. Цитология 34(3): 89-96.
36. Подлипаева Ю. И. 19926. Активность глюкозо-6-фосфатдегидроге-назы у амеб, культивируемых при различных температурах Цитология 34(4): 120.
37. Подлипаева Ю. И. 1994. Активность теплоустойчивость и электро-форетические формы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у амеб, культивируемых при разных температурах. Цитология 36(4): 378-383.
38. Полянский Ю. И. 1957. Температурные адаптации у инфузорий. I Зависимость теплоустойчивости Paramecium caudatum от температурных условий существования. Зоол. ж. 36(11): 1630-1646.
39. Полянский Ю. И. 1978. Формы фенотипической изменчивости простейших, их адаптивное значение и биологические механизмы. В кн.: Вопросы экологии простейших. JL: Наука: 5-25.
40. Полянский Ю. И., Орлова А. Ф. 1948. Об адаптивных изменениях и длительных модификациях у инфузорий Paramecium caudatum, вызванных действием высоких и низких температур. ДАН СССР 59(5): 1025-1028.
41. Полянский Ю. И., Суханова К. М., Сопина В. А. и Юдин A. JL 1967. Устойчивость Amoeba proteus к действию летальной температуры и этилового спирта. В сб.: Изменчивость теплоустойчивости клеток животных в онто- и филогенезе. М., Л., Наука: 43-62.
42. Правдина К. И. 1970. Теплоустойчивость водорастворимых эстераз пойки-лотермных животных. Цитология 12(12): 1541-1549.
43. Прехт Г. (Precht Н.). 1964. Обзор экспериментальных данных по адаптивным изменениям устойчивости. В кн.: Клетка и температура среды. М.; Л., Наука: 206-213.
44. Проссер К. Л. (Prosser К. L.). 1977. Сравнительная физиология животных. М.,Мир, т. 1.
45. Серавин Л. Н., Скобло И. И. и Осипов Д. В. 1965. Влияние температурной адаптации на теплоустойчивость ферментов инфузорий Paramecium cauda-tum. В сб.: Теплоустойчивость клеток животных. М., Л., Наука: 161-170.
46. Серов О. Л., Корочкин Л. И., Манченко Г.П. 1977. 1965. Генетика изофер-ментов. М.: Наука.
47. Соколовский В. В. 1984. Окислительно-восстановительные процессы в биохимическом механизме неспецифической реакции организма на действие экстремальных факторов внешней среды. В кн.: Антиоксиданты и адаптация Л.: 5-19.
48. Сопина В. А. 1968. Межклоновые различия по теплоустойчивости у амеб. Цитология 10(2): 207-217.
49. Сопина В. А. 1973. Эстеразы трех штаммов амеб. Цитология 15(10): 13081312.
50. Сопина В. А. 1976. Зависимость теплоустойчивости амеб от температуры их культивирования. Экология 4: 74-77.
51. Сопина В. А. 1978. Роль ядра и цитоплазмы в наследовании спектра эсте-раз у амеб. XIV Междунар. генетич. конгресс. М.: Наука: 25.
52. Сопина В. А. 1986. Теплоустойчивость клеток, суммарных эстераз и отдельных электрофоретических фракций эстераз у двух штаммов Amoeba proteus. Цитология 28(11): 1211-1221.
53. Сопина В. А. 1987. Спектр и теплоустойчивость отдельных электрофоре-тических форм тритонорастворимых эстераз у амеб, культивируемых при различных температурах. Цитология 29(3): 321-330.
54. Сопина В. А. 1989. Внутривидовой полиморфизм глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназы у амеб Amoebaproteus. Цитология 31(2): 237-244.
55. Сопина В. А. 1991. Спектр электрофоретических форм глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы и глюкозо-дегидрогеназы у амеб, культивируемых при различных температурах. Цитология 33(7): 104109.
56. Сопина В. А. 1995а. Теплоустойчивость амеб и термостабильность их тритонорастворимых эстераз. Цитология 37(4): 339-344.
57. Сопина В. А. 19956. Эстеразы у Amoeba proteus. Цитология 37(4): 345-355.
58. Сопина В. А. 1997. Эстеразы у амеб Amoeba proteus, культивируемых при различных температурах. Цитология 39(9): 763-774.
59. Сопина В. А., ПодлипаеваЮ. И. 1984. Теплоустойчивость эстеразной активности гомогенатов амеб, культивируемых при различных температурах. Цитология 26(2): 143-149.
60. Сопина В. А., Подлипаева Ю. И. 1989. Ферменты фосфоглюконатно-го пути у амеб. Цитология 31(1): 85-96.
61. Сопина В. А., Юдин A. JI. 1993. Индуцируемые наследуемые изменения в спектрах электрофоретичеких форм глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у амеб Генетика 29(3): 435-443.
62. Суханова К. М. 1959. Температурные адаптации у паразитических простейших амфибий. Цитология 1 (5): 587-600.
63. Суханова К. М. 1963. Исследование температурных адаптации и особенностей морфологии некоторых видов инфузорий Astomata из олигохет Восточного Мурмана. В сб.: Морфол. и физиол. простейших М., Л., Наука: 75-90.
64. Суханова К. М. 1968. Температурные адаптации у простейших. Л., Наука.
65. Ушаков Б. П. 1973. Лабильность и эволюционная консервативность теплоустойчивости организма, клеток и белков пойкилотермных животных при изменении температуры среды. Успехи соврем, биологии 76(2)(5): 264-278.
66. Ушаков Б. П., Кусакина А. А. 1960. О лабильности и консервативности адаптации клеток животных, обнаруживаемой на белковом уровне. Цитология 2(4): 428-441.
67. Ушаков Б. П., Виноградова А. Н., Глушанкова М. А., Кусакина А. А., Правдина К. И. 1966. Зависимость между уровнями теплоустойчивости разных белков у одного и того же вида в ряду пойкилотермных животных. Цитология 8(3): 358-364.
68. Фельдман Н. Л., Константинова М. Ф. 1979. Сравнение теплоустойчивости главной фракции растворимых белков и изозимов эстеразы из листьев двух видов Leucojum (Amaryllidaceae). Ботан. журнал 64(6): 890-894.
69. Фельдман Н. Л., Денько Е. И., Каменцева И. Е., Константинова М. Ф. 1981. Теплоустойчивость клеточных функций и белков двух сортов пшеницы с разной агробиологической характеристикой. Цитология 23(11): 1275-1283.
70. Фельдман Н. Л., Каменцева И. Е. 1982. Теплоустойчивость изоферментов малатдегидрогеназы из листьев огурца и дыни. Физиол. растений 29(6): 10371044.
71. Хлебович В. В. 1981. Акклимация животных организмов. Л.: Наука.
72. ХочачкаП., Сомеро Дж. 1977. Стратегия биохимической адаптации. М.: Мир.
73. ХочачкаП., Сомеро Дж. 1988. Биохимическая адаптация. М.:Мир.
74. Щербакова А. М. 1972. Теплоустойчивость глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназы из листьев озимой пшеницы, закаленной теплом и холодом. ДАН СССР 205(4): 993-997.
75. Юдин А. Л. 1975. Амеба (Amoeba). В кн.: Объекты биологии развития, М.: Наука:5-12.
76. Юдин А. Л. 1979. Механизмы дестабилизации наследственных признаков у амеб. II. Наследуемые изменения, индуцированные некоторыми антибиотиками. Acta protozool. 18(4): 571-579.
77. Юдин A. JI. 1982. Ядерно-цитоплазматические взаимоотношения и клеточная наследственность у амеб. JL: Наука.
78. Alahiotis S., Miller S., Berger E. 1977. Natural selection at the GDH locus in Drosophila. Nature 269: 144-145.
79. Andersen K. A., Britigan В. E., Wilson M. E. 1996. Short report regulation of inducible heat shock protein 70 genes in Leishmania chagasi. Amer. J. Tropic. Med. Hyg. 54(5): 471-474.
80. Argos P., Rossman M. G., Grau U. M., Zuber H., Frank G., Tratschin J. D. 1979 Thermal stability and protein structure. Biochemistry 18: 5698-5703.
81. Baldwin E. 1970. An introduction to comparative biochemistry. Cambridge, Cambridge University Press.
82. Baldwin J., Hochachka P. W. 1971. Functional significance of isoenzymes in thermal acclimatization: Acetylcholinesterase from trout brain. Biochem. J. 116: 883-887.
83. Bangs J. D., Uyetake L., Brickman M.J., Balber A E., Boothroyd J. C. 1993. Molecular cloning and cell localization of BiP homologue in Trypanosoma brucei. J. Cell Sci. 105: 1101-1113.
84. Beutler E., Morrison M. 1967. Localization and characteristics of hexose-6-phosphate dehydrogenase (glucose dehydrogenase). J. Biol. Chem. 242: 52895293.
85. Bianco A. E., Favaloro J. M., Burkot T. R., Culvenor J. G., Crewther P. E., Brown G. V., Anders R. F., Coppel R. L., Kemp D. J. 1986. A repetitive antigen of
86. Plasmodium falciparum teat is homologous to heat shock protein 70 of Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8713-8717.
87. Blanquet R. S. 1972. Temperature acclimation in the medusa, Chrysaora quinquec-irrha. Comp. Biochem. Physiol. 43B: 717-723.
88. Budin K., Philippe H. 1998. New insights into the phylogeny of eukaryotes based on ciliate Hsp70 sequences. Mol. Bio. Evol. 15(8): 943-956.
89. Campbell C. M., Davies P. S. 1978. Temperature acclimation in the teleost Blennius folis: changes in enzyme activity and cell structure. Comp. Biochem. Physiol. 618: 165-167.
90. Ciardiello M. A., Camardella L., Carratore V., Diprisco G. 1997. Enzymes in antarctic fish glucose-6-phosphate dehydrogenase and glutamate dehydrogenase. Comp. Biochem. Physiol. 118A(4): 1031-1036.
91. Demidov O. N., Tyrenko V. V., Svistov A. S., Komarova Ye.Yu., Karpishenko A. I., Margulis B. A., Shevchenko Yu. L. 1999. Heat shock proteins in cardiosur-gery patients. Europ. J. Cardio-thor. Surg. 16: 444-449.
92. Deutch J. 1983. Glucose-6-phosphate dehydrogenase. Meth. Enzym. Anal. 3: 190-198.
93. Drzymalla C., Schroda M., Beck C.F. 1996. Light-inducible gene HSP70B encodes a chloroplast-localized heat shock protein in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Mol. Biol. 31(6): 1185-1194.
94. Dziewulska-Szwajkowska D., Lozinska-Gabska M., Dzugai A. 1997. Rana esculenta L. liver FRU-1,6-P(2)ase and G-6-Pase activity and FRU-2,6-P-2concentration after acclimation at 5 and 25 °C. Comp. Biochem. Physiol. 118A(3): 745-751.
95. Eggleston L. V., Krebbs H. A. 1974. Regulation of the pentose-phosphate cycle. Biochem. J. 138: 425-435.
96. Ekberg D. R. 1962. Anaerobic and aerobic metabolism in gills of the crucian carp adapted to high and low temperatures. Comp. Biochem. Physiol. 5: 123-128.
97. Fan J. Y., Davidson E. A. 1996. Molecular cloning and antigenic mapping of heat-shock protein 70 from the malaria species Plasmodium berghei. Amer. J. Tropic. Med. Hyg. 55(5): 570-576.
98. Feller G., Arpigny J. L., Gerday C. 1997. Molecular adaptations of enzymes from psychrophilic organisms. Comp. Biochem. Physiol. 118A(3): 495-499.
99. Flickinger Ch. J. 1977. Relationships between membranous organelles in amoebae studied by electron microscopic cytochemical staining. Cell Tissue Res. 180: 139-154.
100. Frandsen J. C. 1976. Partial purification and some properties of glucoses-phosphate dehydrogenase from Eimeria steidai. Comp. Biochem. Physiol. 54B: 537-541.
101. Fudge D. S., Stevens E. D., Ballantyne J. S. 1997. Enzyme adaptation along a heterothermic tissue the visceral retia mirabilia of the blufin tuna. Amer. Journ. Physiol. 41(6): R1834-R1840.
102. Garcia-Alfonso C., Repetto G., Sanz P., Repetto M., Lopez-Barea J. 1998.
103. Direct determination of gluthatione S-transferase and glucose-6-phosphate dehydrogenase activities in cells cultured in microtitre plates as biomarkers for oxidative stress. ATLA 26(3): 321-330.
104. Germot A., Philippe H. 1999. Critical analysis of eukaryotic phylogeny: a case study based on the HSP70 family. J. Eukaryot. Microbiol. 46(2): 116-124.
105. Ghosh D. K., Honigberg B. M. 1976. Activities of glucose-6-phosphate, 6-phosphogluconate and isocitrate dehydrogenases from Leishmania donovani cultivated at 25 and 37 C. J. Protozool., 23: 450-455.
106. Gomori G. 1953. Human esterases. J. lab. clin. med., 42: 335-453.
107. Graves J. E., Somero G. N. 1982. Electrophoretic and functional enzymic evolution in four species of eastern Pacific barracudas from different thermal environments. Evolution 36: 97-106.
108. Grigor M. 1984. Multiple molecular forms of rat mammary glucose-6-phosphate dehydrogenase: proposed role in turnover of the enzyme. Arch. Biochem. Biophys. 229: 612-622.
109. Hallberg E. M., Hallberg R. L. 1996. Translational thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae. Cell Stress and Chaperones 1(1): 70-77.
110. Hand S. C., Somero G. N. 1983. Phosphofructokinase of the hibernator, Citellus beecheyr. Temperature and pH regulation of activity via influences on the tetramer-dimer equilibrium. Physiol. Zool. 56: 380-388.
111. Harman D. 1992. Free radical theory of aging. Mutat. Res. 275: 257-266.
112. Hazel J. 1969. The effect of thermal acclimation upon brain acetylcholinesterase activity of Carassius auratus and Fundulus heteroclitus. Life Sci. 8: 775-784.
113. Hilker D. M., White A. G. 1959. Some aspects of the carbohydrate metabolism of Entamoeba histolytica. Exp. Parasitol. 8: 539-548.
114. Hut R. P., Healy B., Vossbrinck C. R., Canning E. U., Embley T. M. 1997. A mitochondrial Hsp70 orthologue in Vairimorpha necatrix. molecular evidence that microsporidia once contained mitochondria. Curr. Biol. 7(12): 995-998.
115. HochachkaP. W. 1998. Mechanism and evolution of hypoxia-tolerance in humans. J. Exp. Biol. 201(8): 1243-1254.
116. Hochachka P. W. and Hayes F. R. 1962. The effect of temperature acclimation on pathways of glucose metabolism in the trout. Can. J. Zool. 40: 261-270.
117. HochachakaP. W., Clayton-Hochachka B. 1973. Glucose-6-phosphate dehydrogenase and thermal acclimation in the mullet fish. Mar. Biol. 18: 251-259.
118. Hubel A., Krobitsch S., Horant A., Clos J. 1997. Leishmania majorHSP100 is required chiefly in the mammalian stage of the parasite. Mol. Cell Biol. 17(10): 5987-5995.
119. Johnston I. A., Walesby N. J., Davison W., Goldspink G. 1975. Temperature adaptation in myosine of Antarctic fish. Nature 254: 74-75.
120. Jurss K., Bittorf Th., Volker Th and Waske R. 1987. Effects of temperature, food deprivation and salinity on growth, RNA/DNA ratio and certain enzyme activities in rainbow trout (SaJmo gairdneriRichardson). Comp. Biochem. Physiol. 87B: 241-253.
121. Kalinina L. V., Khrebtukova I.A., Podgornaya O. L., Wasik A., Sikora J. 1988. Heat shock proteins in Amoeba. 1. Effect of high temperature on Amoeba proteus and Amoeba borokensis. Europ. J. Protistol. 24: 64-68.
122. Katiyar S. S., Tapas K. D. 1990. Solubilization and activation of yeast glucose-6-phosphate dehydrogenase in reverse micelles of mixed surfactants in organic solvents. Biochem. Int. 20: 1127-1134.
123. Konkel M. E., Kim B. J., Klena J. D., Young C. R., Ziprin R. 1998. Characterization of the thermal stress response of Campylobacter jejuni. Infection and Immunity 66(8): 3666-3672.
124. Korhonen I. A., Lagerspetz K. Y. H. 1996. Heat shock response and thermal acclimation in Asellus aquaticus. J. Therm. Biol. 21(1): 49-56.
125. Kornberg A., Horecker B. L. 1955. Assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase. Methods in enzymology. New York: Acad. Press 1: 323-325.
126. Marek M. 1982. Influence of cooling on the profile of proteins and esterases in tissues of some endopterygote insects. Comp. Biochem. Physiol. 73B: 951-956.
127. Margulis B. A., Welsh M. 1991. Isolation of hsp70-binding proteins from bovine muscle. Biochem. Biophys. Res. Com. 178(1): 1-7.
128. Margulis B. A., Nacharov P. V., Tsvetkova O. L., Welsh M., Kinev A. V. 1991. The characterization and use of different antibodies against the HSP70 major heat shock protein family for the development of an immunoassay. Electrophoresis 12(9): 670-673.
129. MatsuokaN., Hori S. 1980. Immunological relatedness of hexose-6-phosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase in echinoderms. Comp. Biochem. Physiol. 65B: 191-198.
130. McMullin Th. W., Hallberg R. L. 1987. A normal mitochondrial protein is selectively synthesized and accumulated during heat shock in Tetrahymena thermophila. Mol. Cell Biol. 7(12): 4414-4423.
131. Mg-Naughton S. J. 1974. Natural selection at the enzyme level. Amer. Natur. 108: 616-625.
132. Ord M. J. 1973. Chemical mutagenesis. In: The biology of Amoeba. N.Y., London, Acad. Press: 349-369.
133. Page F. C., Kalinina L. V. 1984. Amoeba leningradensis n. sp. (Amoebidae): a taxonomic study incorporating morphological and physiological aspects. Arch. Protistenkd. 128: 37-53/
134. Podlipaeva J. I. 1992. The activity and thermoresistance of glucose-6-phosphatedehydrogenase (G6PD) in Amoeba proteus. Proc. 1 Europ. Congress of Protozoology, Reading, England: 30.
135. Podlipaeva Yu. I. 1997. Hereditary and environmentally determined changes in some characteristics of glucose-6-phosphatedehydrogenase in Amoeba proteus (Pallas, 1766), Leidy, 1878. Доповад Нацюнально! Ака-демП Наук УкраГни. : 184-188.
136. Podlipaeva Yu. I., Kinev A. V. 1996. The major inducible heat shock protein of 70 kDa in Amoeba proteus. Molecular Biology of the Cell 7:1038.
137. Podlipaeva Yu. Gromov D. 1998. 70 kDa heat shock protein content in Amoeba proteus cells. Molecular Biology of the Cell. 9: 129a.
138. Peyretaillade E., Broussole V., Peyret P., Metenier G., Gouy M., Vivares C. P. 1998. Microsporidia, amitochondrial protists, possess a 70-kDa heat shock protein gene of mitochondrial evolutionary origin. Mol. Biol. Evol. 15(6): 683-689.
139. Pierce V. A., Crawford D. L. 1997. Phylogenetic analysis of thermal acclimation of the glycolytic enzymes in the genus Fundulus. Physiol. Zoology 70(6): 597-609.
140. Place A. R., Powers D. A. 1979. Genetic variation and relative catalytic efficiencies: Lactate dehydrogenase В allozymes of Fundulus heteroclitus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 2354-2358.
141. PollaB. S. 1991. Heat shock proteins in host-parasite interactions. Parasitology Today 7(3): A38-A41.
142. Prescott D. M., Carrier R.F. 1964. Experimental procedures and cultural methods for Euplotes eurystomus and Amoebaproteus. In: Methods in cell physiology. New York; London: Acad. Press 1: 85-95.
143. Requena J. M., Jimenez-Ruiz A., Soto M., Assiego R., Santaren J. F., Lopez M., Patarroyo E., Alonso C. 1992. Regulation of hsp70 expression in Trypanosoma cruziby temperature and growth phase. Mol. Biochem. Parasitol. 53: 201-211.
144. Requena J. M., Lopez M. C., Jimenez-Ruiz A., de la Torre J. C., Alonso C. 1988. A head-to-tail tandem organization of the hsp70 genes in Trypanosoma cruzi. Nucleic acid Research 16(4): 1393-1405.
145. Requena J. M., Soto M., Guzman F., Maekelt ANoya O., Patarroyo M. E. A. 1993. Mapping of antigenic determinants of the T. craz/hsp70 in chagasic and healthy individuals. Mol. Immunol. 30: 1115-1121.
146. Sanchez-Moreno M., Rodriguez-Cabezas N., Feraandez-Becerra C., Mesavalle C., Osuna A. 1997. Induction of stress proteins in the plant trypanosome Phytomo-nas characias. Parasitol. Res. 83(8): 771-775.
147. Schmukler M. 1970. The heterogeneity and molecular transformation of glucose-6-phosphate dehydrogenase of the rat. Biochim. Biophys. Acta 214: 309317.
148. Seddon W. L. 1997. Mechanisms of temperature acclimation in the channel catfish Ictaluruspunctatus isoenzymes and quantitative changes. Comp. Biochem. Physiol. 118(3): 813-820.
149. Shaklee J. B., Christiansen J. A., Sidell B. D., Prosser C. L., Whitt G. S. 1977.
150. Molecular aspects of temperature acclimation in fish: Contributions of changes in enzyme activities and isozyme patterns to metabolic reorganization in the green sunfish. J. Exp. Zool. 201: 1-20.
151. Silva N. M., Gazzinelli R. T., Silva D. A., Ferro E. A., Kasper L. H., Mineo J. R. 1998. Expression of Toxoplasma gondii-spQcific heat shock protein 70 during in vivo conversion of bradyzoites to tachyzoites. Infect. Immun. 66(8): 3959-3963.
152. Singleton R., Jr., Middaugh C. R., MacElroy R. D. 1977. Comparison of proteins from thermophilic and nonthermophilic sources in terms of structural parameters inferred from amino acid composition. Int. J. Peptide Protein Res. 10: 39-50.
153. Sopina V. A. 1976. The multiplication rate of amoebae related to the cultivation temperature. J. Thermal Biology 1: 199-204,
154. Sopina V. A. 1989.Polymorphism of glucose-6-phosphate dehydrogenase in free-living Amoebidae. Arch. Protistenkd. 137: 131-141
155. Sopina V. A. 1991. The electrophoretic patterns of glucose-6-phosphate, 6-phosphogluconate and glucose dehydrogenases in Amoebaproteus (Pallas, 1766; Leidy, 1878), cultured at different temperatures. Comp. Biochem. Physiol. 100B: 605-615.
156. Steele M., Young W., Childs B. 1968. Glucose-6-phosphate dehydrogenase in Drosophila melanogaster: starch gel electrophoretic variation due to molecular instability. Biochem. Genet. 2: 159-175.
157. Sustr V., Block W. 1998. Temperature dependence and acclimatory response of amylase in the high arctic springtail Onychiurus arcticus (Tullberg) compared with the temperate species Protaphorura armata (Tullberg). J. Insect Physiol. 44(10): 991-999.
158. Swezey R. R., Somero G. N. 1982. Polymerization thermodinamics and structural stabilities of skeletal muscle actins from vertebrates adapted to different temperatures and hydrostatic pressures. Biochemistry 21: 4496-4503.
159. Ulmasov Kh. A., Shammakov S., Karaev K., Evgen'ev M. 1992. Heat shock proteins and thermoresistance in lizards. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 16661670.
160. Ushakov B. P. 1964. Thermostability of cells and proteins of poikilotherms and its significance in speciation. Physiol. Revs. 44(3): 518-560.
161. Van der Ploeg L., Giannini S., Cantor Ch. 1985. Heat shock genes: regulatory role for differentiation in parasitic protozoa. Science 228: 1443-1446.
162. Wallace G. R., Ball A. E„ MacFarlane J., el Safi S. H., Miles M. A., Kelly J. M. 1992. Mapping of a visceral leishmaniasis-specific immunodominant B-cell epitope of Leishmania donovaniHsplO. Infection and Immunity 60: 2688-2693.
163. Ward A. P. 1985. Electrophoretic assessment of taxonomic relationships within the genus Acanthamoeba (Protozoa, Amoebida). Arch. Protistenk. 130: 329-342.
164. Weiss L. M., Ma Y. F., Takvorian P. M., Tanowitz H. B., Wittner M. 1998. Bradyzoite development in Toxoplasma gondii and the hsp70 stress response. Infect. Immun. 66(7): 3295-3302.138
165. Welch W. J., Feramisco J. R. 1985. Rapid purification of mammalian 70.000-dalton stress proteins: affinity of the proteins for nucleotids. Mol. Cell Biol. 5: 1226-1229.
166. Wilson F. R., Somero G. N., Prosser C. L. 1974. Temperature metabolism relations of two species of Sebastes from different thermal environments. Comp. Biochem. Physiol. 47B: 485-491.
167. Yamauchi T., Stegeman J. J., Goldberg E. 1975. The effects of starvation and temperature acclimation on pentose phosphate pathway dehydrogenases in brook trout liver. Arch. Biochem. Biophys. 167: 13-22.
168. Zavodsky P., Kardos J., Svingor A., Petsko G. A. 1998. Adjustment of conformational flexibility is a key event in the thermal adaptation of proteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95(13): 7406-7411.
169. ZietaraM. S., Skorowski E. F. 1995. Thermostability of lactate dehydrogenase LDH-A(4) isoenzyme effect of heat shock protein DnaK on the enzyme activity. Int. J. Biochem. Cell Biol. 27(11): 1169-1174.
170. Я признательна Сергею Орестовичу Скарлато за ценные советы и всем сотрудникам Лаборатории цитологии одноклеточных организмов, дружеское отношение и поддержку которых высоко ценю.
171. Хочу с благодарностью вспомнить наших учителей Юрия Ивановича Полянского и Игоря Борисовича Райкова.
-
Подлипаева, Юлия Игоревна
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2000
-
ВАК 03.00.25
- Голые амебы (LOBOSEA, GYMNAMOEBIA) из донного грунта пресноводного озера остора Валаам
- Динамика статистических показателей при тестировании функциональной активности мышц химическим воздействием
- Получение и некоторые свойства искусственной эндоцитобиотической ассоциации амеб и хлорелл
- ПОЧВЕННЫЕ ПРОСТЕЙШИЕ ( PROTOZOA) КАК КОМПОНЕНТ ПОЧВЕННОЙ БИОТЫ
- Биологические основы селекции радужной форели по теплоустойчивости
