Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Адено-адено гибриды: получение, биологические свойства и молекулярно-генетический анализ
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Адено-адено гибриды: получение, биологические свойства и молекулярно-генетический анализ"

На правах рукописи УДК 578.5:578.826

Савицкая Наталья Владимировна

АДЕНО-АДЕНО ГИБРИДЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛШ

Специальность 03.00.26 - "молекулярная генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в лаборатории генетики вирусов Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, засл. деятель науки РФ,

акад. РАЕН, профессор А.Д. Альтштейн

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН,

профессор Н.В. Каверин

Доктор биологических наук, профессор С.Л. Киселёв

Ведущая организация:

ГУ НИИ вирусных препаратов им. О.Г. Анджапаридзе РАМН

Защита диссертации состоится "/£ 2003 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова 32.

Автореферат разослан 2003 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук

Л.С. Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Аденовирусы (Ас!) - это ДНК-содержащие вирусы, вызывающие респираторные, кишечные и другие заболевания у человека и животных. Эти вирусы широко распространены и являются интересным объектом для изучения молекулярной биологии не только вирусов, но и клеток. Большое значение имело открытие онкогенности аденовирусов, которые в настоящее время широко используются для изучения молекулярных механизмов возникновения злокачественных опухолей.

В последние годы усилилось внимание к аденовирусам в связи с возможностью использования их в качестве векторных систем для переноса чужеродных генов. Особенно большой интерес аденовирусы имеют для разработки генной терапии -направления, возникшего в конце восьмидесятых годов 20-го века и быстро развивающегося в настоящее время. Важное преимущество аденовирусных векторов для генотерапии заключается, во-первых, в их низкой патогенности для организма человека, во-вторых, в способности таких векторов проникать в клетки независимо от стадии клеточного цикла и, в-третьих, накапливаться в клеточных культурах в очень высоких титрах. Аденовирусы стабильны и интегрируют с клеточным геномом с очень низкой эффективностью. В этой связи возникает задача детального изучения генома аденовирусов, а также характеристика отдельных частей вирусной ДНК с целью выявления областей, существенных для создания эффективных и безопасных векторов. - ~

Одной из проблем, важных для понимания аденовирусной инфекции и использования аденовирусов в качестве векторов, является видоспецифичность этих вирусов. Известно, что аденовирусы, выделяемые от человека и животных, способны вызывать продуктивную инфекцию только у гомологичных организмов. Это не относится к абортивной инфекции, которая развивается и в гетерологичных организмах и клетках. Механизмы видоспецифичности, по-видимому, разнообразны и изучены недостаточно. Для использования аденовирусов в качестве векторов для генной терапии важно научиться управлять их ткане- и видоспецифичностью.

Одна из интереснейших моделей для изучения видоспецифичности

;ловека и

1АЯ

БИБЛИОТЕКА

аденовирусов - это аденовирусы человека и обе

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ

С.Петер^Г г ; ОЭ

обезьяны хорошо размножаются в культуре клеток гомологичного вида и плохо - в гетерологичных клетках. Блок размножения аденовируса человека в обезьяньих клетках преодолевается при совместной инфекции обезьяньих клеток аденовирусом человека и обезьяньим полиомавирусом SV40, а также при совместной инфекции этих клеток аденовирусами человека и обезьяны. Ранее было показано, что при совместном размножении высокоонкогенного аденовируса обезьян SA7(C8) и аденовирусов человека группы С в первичных обезьяньих клетках наблюдается комплементация, фенотипическое смешивание и образование дефектных адено-адено гибридов (Altstein, Dodonova, 1968; Altstein et al., 1968). Адено-адено гибриды представлены дефектными вирионами, которые служат вирусом-помощником для размножения аденовируса человека в клетках обезьяны. В свою очередь, аденовирус человека помогает дефектному адено-адено вириону размножаться в клетках, предоставляя ему белки для построения капсида. Природа адено-адено гибридов оставалась неясной. Исследование этой проблемы затрудняется тем, что гибридная популяция состоит из двух типов частиц: 1) полных вирионов аденовируса человека и 2) дефектных гибридных адено-адено вирионов. Разделить эти два типа частиц в обезьяньих клетках невозможно, так как они составляют взаимно комплементирующую пару. Между тем, адено-адено гибридные частицы должны содержать ген(ы) аденовируса обезьяны, способные помогать продуктивной инфекции аденовируса человека в обезьяньих клетках. Природа этих генов оставалась полностью неясной. Очевидно, что изучение молекулярной природы гибридных частиц может пролить свет на роль определенных аденовирусных генов в видоспецифичности их размножения. Кроме того, изучение адено-адено гибридов способно помочь в понимании механизма аденовирусного канцерогенеза и природы опухолевых антигенов [tumor (Т) и tumor specific transplantation antigens (TSTA)].

Цель и задачи исследования

В связи с вышеизложенным в настоящем исследовании были поставлены следующие задачи:

1. Получить дефектные адено-адено гибриды при совместном размножении высокоонкогенного обезьяньего аденовируса SA7(C8) и аденовируса человека типа 2 (Ad2) в перевиваемых клетках обезьяны.

2. Получить несколько десятков клонов этих гибридов и изучить природу их генома методом молекулярной гибридизации, определить гены аденовируса обезьяны, локализованные в геноме гибридных частиц, выяснить их связь с видоспецифичностью репродукции аденовирусов.

3. Изучить взаимодействие аденовируса обезьяны SA7(C8) и аденовируса человека Ad2 в перевиваемых клетках человека. Определить природу вирионов, образующихся при смешанной инфекции в этой системе.

Научная новизна и практическое значение работы

В результате проведенной работы было показано, что адено-адено гибриды, полученные в обезьяньих клетках, содержат левую половину генома аденовируса человека и правую часть генома аденовируса обезьяны. В последней локализованы два аденовирусных гена, Е4 и Е2а, потенциально способных участвовать в определении видоспецифичности аденовирусной репродукции. Роль одного из них, гена Е4, была доказана экспериментально. При изучении совместной инфекции аденовирусов обезьяны и человека в клетках человека впервые была установлена комплементация между ними и способность генома аденовируса человека "переодеваться" в капсид аденовируса обезьяны (транскапсидация). Был выявлен дефектный адено-адено гибрид, способный служить помощником для аденовируса обезьяны в клетках человека. Природа его генома отличалась от природы генома гибридов, полученных в клетках обезьяны.

Изучение проблем видоспецифичности и механизмов формирования аденовирионов может быть полезно для конструирования аденовирусных векторов, используемых для генотерапии.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: Xlth International Congress of Virology. Sydney, Australia, 1999

Актуальные проблемы медицинской вирусологии. Институт полиомиелита и

вирусных энцефалитов РАМН, Москва, 1999

Xllth International Congress of Virology. Paris, France, 2002

Molecular genetics of eukaryotes. Institute of Gene Biology RAS, Moscow, 2003

Публикации

По теме диссертации опубликованы 2 статьи и тезисы 4 конференций.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на /¿3 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 10 рисунками. Библиографический указатель содержит ссылки на2У /источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Клеточные культуры. В работе использовали перевиваемые клетки почки эмбриона человека (ПЭЧ) линии 293, перевиваемые клетки почки зеленой мартышки (ПЗМ) линии CV-1, перевиваемые клетки линий VK-10-9 и С1 (клетки линии 293, дополнительно трансформированные генами Е4 и Е2а вируса Ad5, соответственно).

Вирусы. Аденовирус человека типа 2, Ad2, и аденовирус обезьян SA7(C8) получены из Института вирусологии им. Д.И. Ивановского и размножены в клетках 293 и CV-1, соответственно.

В работе были использованы следующие методы исследования: культивирование клеток in vitro, заражение клеток вирусами, накопление и титрование вирусов, нейтрализация вирусов, выделение вирионной ДНК, выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом, гидролиз ДНК рестрикционными эндонуклеазами, фракционирование фрагментов ДНК в агарозном геле и перенос ДНК на фильтры по Southern, гибридизация иммобилизованной ДНК с 32Р-меченным зондом и радиоавтография.

Результаты исследования

Размножение и комплементация аденовирусов человека и обезьяны в перевиваемых клетках обоих видов.

Эксперименты по получению адено-адено гибридов, проведенные ранее (Altstein et al., 1968, Altstein, Dodonova, 1968), были выполнены с использованием первичных культур клеток обезьяны и человека. Полученные гибриды не сохранились. Поэтому было необходимо получить их заново, используя имеющиеся в нашем распоряжении клеточные линии, так как работа с первичными клеточными культурами человека и обезьяны затруднена. Поскольку перевиваемые линии клеток могут существенно отличаться по своим свойствам от первичных клеток, было необходимо воспроизвести полученные ранее результаты в новых условиях.

Было показано, что аденовирус SA7(C8) не образует бляшек в клетках человека линии 293, a Ad2 не образует бляшек в клетках обезьяны линии CV1. При смешанной инфекции клеток этими вирусами в возникшей популяции можно раздельно определить содержание каждого компонента по его бляшкообразующей активности: в

клетках СУ1 определяется титр аденовируса обезьяны, а в клетках 293 - титр аденовируса человека.

Было показано, что вирус БА7(С8) хорошо размножается в клетках С\М и плохо - в клетках 293 (но лучше, чем в первичных клетках почки эмбриона человека); А6.2 хорошо размножается в клетках 293 и плохо - в клетках СУ1 (но лучше, чем в первичных клетках почки зеленой мартышки). При совместной инфекции наблюдалось резкое усиление репродукции вируса Ас12 в клетках обезьяны и менее значительное, но достоверное увеличение репродукции вируса 8А7(С8) в клетках человека. Таким образом, можно утверждать, что имеет место комплементация между этими вирусами в обоих типах перевиваемых клеток.

Получение дефектных адено-адено гибридов в клетках обезьяны СУ1.

На рисунке 1 представлена общая схема получения адено-адено гибридов Ас12С8.

Клетки заражали одновременно аденовирусом обезьян 8А7(С8) (~1 БОЕ/клетка) и аденовирусом человека, тип 2 (Ас12) (-10 БОЕ/клетка). После полной вирусспецифической дегенерации клеток смешанный вирусный урожай собирали и пассировали дважды в клетках СVI, каждый раз обрабатывая вирусный материал анти-ЗА7(С8) сывороткой. Этот материал обозначали как неклонированный адено-адено гибрид «Ас12С8». Вируссодержащий материал после 2-го пассажа обрабатывали анти-8А7(С8) сывороткой для устранения возможных следовых количеств этого вируса и клонировали методом бляшек, включая в агарозное покрытие анти-8А7(С8) сыворотку.

Биологические свойства Ас12С8

Была изучена способность неклонированного («А<12С8») и клонированного (Ас12С8) вируса размножаться в клетках человека и обезьяны, образовывать бляшки в этих клетках и нейтрализоваться иммунными сыворотками к вирусам 8А7(С8) и Ас12. Было показано, что клоны А(12С8 размножались в клетках СУ1 и 293 и образовывали бляшки, как обезьяний аденовирус, но нейтрализовались иммунной сывороткой к Ай2, а не к 8А7(С8). Они также образовывали бляшки в клетках человека 293, как обычный аденовирус человека. Результаты нейтрализации вирусов при добавлении

б

Ас12

БА7С8

Т

клетки обезьяны С\/-1

вируссодержащии материал "А<Э2+С8"

+ анти-С8 сыворотка

>

2 пассажа

I материал из | Iотдельных бляшек)

СУ-1

+ анти-С8 сыворотка

клоны Ad2C8

Рисунок 1. Схема получения гибридов между аденовирусами человека и обезьяны в клетках обезьяны

иммунной сыворотки к вирусному материалу позволяют полагать, что капсид вирионов гибридной популяции тождественен капсиду АА2 (таблица 1). Отсутствие нейтрализации вирионов при добавлении сыворотки анти-5А7(С8) показывает, что вирионы не содержат полного генома или рекомбинантного генома, способного индуцировать образование капсидных белков вируса 8А7(С8), отвечающих за специфичность нейтрализации.

Таким образом, гибридная популяция Ас}2С8 способна вызывать образование бляшек как в клетках обезьяны, так и в клетках человека. Было изучено 5 клонов вируса, полученных из бляшек, образованных в клетках обезьяны, и 8 клонов, полученных из бляшек, образованных в клетках человека. Контролем служили клоны исходных вирусов Ас12 и 8А7(С8), полученных в гомологичных клетках. Каждый клон проверяли на щггопатогенную активность в клетках обезьяны и человека и нейтрализацию этой активности сыворотками против этих вирусов. Контрольные клоны, как и следовало ожидать, проявляли цитопатогенную активность в гомологичных клетках и нейтрализовались только гомологичной сывороткой. Клоны, полученные из гибридного вируса в клетках человека, вели себя как полный аденовирус Ас12. В то же время клоны, полученные в клетках обезьяны, проявляли цитопатическую активность и в клетках человека, и в клетках обезьяны, но нейтрализовались только сывороткой анти-А<12.

Была изучена зависимость числа бляшек, образуемых гибридным и исходными вирусами в клетках человека и обезьяны, от разведения вируса. Обычно для вирусов характерна одноударная зависимость, то есть одна вирусная частица дает одну бляшку. При титровании Аё2С8 в клетках СУ1 наблюдалась двуударная кривая зависимости числа бляшек от разведения вирусного материала, то есть для образования бляшки необходимо было попадание в клетку двух частиц. Такая зависимость характерна для вирусной популяции, состоящей из двух типов взаимно комплементирующих частиц. При титровании в клетках 293 наблюдалась обычная для вирусов одноударная кривая, которая была характерна также для титрования вируса 8А7(С8) в клетках СУ1.

Таблица 1. Нейтрализация бляшкообразования гибридных аденовирусов Аё2С8 иммунными сыворотками, добавленными к вирусу или включенными в агарозное покрытие

Вирус Клетки Нейтрализация образования бляшек

При смешивании вируса и сыворотки При включении сыворотки в агарозное покрытие

Анти- Ас12 Анти-С8 Анти- А <12 Анти-С8

«Аё2С8» СУ1 + - + -

А<12С8 СУ1 + - + -

А.62 293 + - + -

ЭА7(С8) СУ1 - + - +

+ - нейтрализация бляшкообразования

- - отсутствие нейтрализации бляшкообразования «А(12С8» - неклонированный гибридный вирус Ас12С8 - клонированный гибридный вирус

Совокупность полученных данных (бляшкообразующая активность, нейтрализация, поведение клонов, полученных в разных типах клеток, двуударная кривая зависимости "доза - ответ") позволяют прийти к выводу о том, что популяция гибридного вируса состоит из двух типов частиц, взаимно комплементирующих в клетках обезьяны, но не человека. Одна из частиц представляет собой полный аденовирус Ас12, а другая - дефектный вирион Ас12С8. Дефектный вирион служит помощником для размножения Ас12 в клетках обезьяны, а Ас12 предоставляет дефектному вириону белки для построения капсида. Компонент А&2 можно было выделить как самостоятельный клонированием в клетках человека. Выделение второго компонента в чистом виде оказалось невозможным.

Для выяснения природы гибридного компонента было проведено изучение его молекулярно-генетических свойств методом молекулярной гибридизации.

Молекулярно-генетические свойства гибрида Ad2C8.

Вирусные клоны, полученные при клонировании исходного гибридного вируса Ad2C8 в клетках CV-1, размножали в чашках Петри с этими клетками. Культуральную жидкость удаляли и выделяли тотальную ДНК из клеток, зараженных каждым клоном или контрольными вирусами SA7(C8) и Ad2. ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикциии. Для анализа использовали следующие рестриктазы: BamHI, Sali, Hindlll, BglH. Фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в агарозных гелях и исследовали в блот-гибридизации по Southern, используя в качестве зондов 32Р-ДНК либо Ad2, либо SA7(C8). ДНК Ad2 и SA7(C8) для зондов выделяли из препаратов очищенных вирионов. Таким способом были исследованы 68 клонов гибридов Ad2C8, после чего были отобраны наиболее типичные 16. На рис. 2 представлены результаты исследования ДНК из вирусов Ad2, SA7(C8) и из 16 клонов Ad2C8, обработанной рестриктазой BamHI.

Как видно из рисунка, несмотря на некоторую перекрестную реактивность обоих зондов, можно четко различить фрагменты, относящиеся к геному Ad2 или SA7(C8). Видно, что все клоны содержат полный набор фрагментов ДНК Ad2 и лишь часть фрагментов ДНК SA7(C8). При исследовании ДНК клонов Ad2C8 с использованием рестриктаз Sali, BamHI, Hindlll и BglH было показано, что все клоны содержат полный набор фрагментов ДНК вируса Ad2 и часть фрагментов ДНК вируса SA7(C8).

13 3

Щ -

А

V

Б

Рисунок 2. Гибридизация ВашН1 фрагментов ДНК из вирусов Ад2, БА7(С8) и клонов Ас12С8 с зондами Ай2 (А) и БА7(С8) (Б).

Дорожки 1 - ДНК А<12, 2-ДНК 8А7(С8), 3-18-ДНК клонов Ас12С8.

Сопоставляя данные гибридизационного анализа с физическими картами геномов вирусов Ас12 и 8А7(С8), можно определить, какая часть генома вируса 8А7(С8) присутствует в рекомбинантах. Этот результат представлен в таблице 2, в которой указан размер минимального обнаруженного фрагмента генома 8А7(С8) и его локализация.

Таблица 2 Сводные данные по локализации фрагментов генома вируса 8А7(С8) в гибридах.

Рестриктаза Размер минимального обнаруженного фрагмента генома 8А7(С8), т.п.о. Локализация фрагмента в геноме 8А7(С8)

ВатН1 13.7 Крайние правые -40%

НикНП 13.6 Крайние правые ~40%

БаИ 15.8 Крайние правые -45%

Вё1Н ~ 21 Крайние правые -60%

7 9 11 13 15 17

— цМШЯли *» *мЯ1вШМЙЯ! *

- ** ш

1 3 5 7 9 11 13 15 17

я» М

И

На рисунке 3 графически представлены обобщенные результаты анализа гибридных клонов Ас12С8 и размер фрагментов ДНК 8А7(С8), обнаруженных в геноме гибридов.

ЕЗ -►

Е1А __

'_ М2

,....!------------1----1----1..............1----1----(----(----1----1---------(----}----[

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 .................... -*

Е2В

Е2А

А<)2 ЗА7(С8)

Е4

_ А<12С8

Рисунок 3. Схема геномов А<12 и Ас12С8

Стрелками показано расположение и направление транскрипции генов, Е1-Е4 -"ранние" гены, Ь1-Ь5 - "поздние".

Как видно из рисунка, все обнаруженные фрагменты вируса 8А7(С8) локализованы в правой части генома. Не было найдено ни одного клона, содержащего менее 40% генома 8А7(С8).

Получение дефектных адено-адено гибридов в клетках человека 293 и его биологические свойства.

В настоящей работе впервые были получены данные о комплементации аденовирусов человека и обезьяны в клетках человека. Представляло интерес изучить генетическое взаимодействие вирусов в этой клеточной системе.

Клетки почки эмбриона человека, линия 293, заражали одновременно аденовирусом человека Ас12 (~ 1 БОЕ/клетку) и аденовирусом обезьян 8А7(С8) (~1 БОЕ/клетку). После полной вирусспецифической дегенерации клеток собирали смешанный урожай вируса и проводили три пассажа в клетках 293, обрабатывая каждый раз вирусный материал иммунной анти-А<12 сывороткой. Полученный вирус («С8А<12») нейтрализовался анти-С8, но не анти- Ас12 сывороткой. После

дополнительной обработки анти-Ас12 сывороткой вирус клонировали методом бляшек в клетках 293. После первого клонирования было отобрано 33 клона. ДНК каждого клона была исследована методом молекулярной гибридизации. Несмотря на неспособность нейтрализоваться анти- Ad2 сывороткой и нейтрализуемость анти-С8 сывороткой, все эти клоны содержали полные геномы обоих аденовирусов и нейтрализовались при добавлении анти-Аё2 сыворотки в агарозное покрытие. Пример молекулярного исследования клонов показан на рисунке 4 (дорожки 3-4), где видно, что эти клоны содержат полный геном Ad2. Наблюдалась разница между клонами «Ad2C8» и «C8Ad2». Вирионы «C8Ad2» в клетках человека нейтрализовались сывороткой анти-С8, но не сывороткой aimi-Ad2, добавленной к вируссодержащему материалу. При включении сыворотки airni-Ad2 в агарозное покрытие наблюдалась нейтрализация образования бляшек. Этот результат так же, как и результат молекулярно-генетического анализа, означал, что клоны этого вируса содержали полный геном Ad2. Следовательно, имело место «переодевание» генома Ad2 в капсид обезьяньего вируса (транскапсидация). Аналогичный феномен не наблюдался в системе «Ad2C8» - клетки CV1. Следовательно, не происходило переодевания полного генома SA7(C8) в капсид аденовируса человека.

Было проведено троекратное клонирование исходного вируса «C8Ad2» в клетках 293 с обработкой материала, используемого для заражения, aHTH-Ad2 сывороткой и с включением последней в агарозное покрытие для нейтрализации вирионов с полным геномом Ad2. В результате удалось получить только один стабильный клон вируса, не нейтрализуемый анти-Ас12 сывороткой при ее двойном применении (перед заражением и при включении в агарозное покрытие). Были получены 4 субклона этого клона, обозначенные как C8Ad2-l, C8Ad2-2, C8Ad2-3, C8Ad2-4) и состоящие из вирионов, способных размножаться как в клетках человека, так и обезьяны.

Адено-адено гибрид C8Ad2 и его клоны размножались в клетках 293 и образовывали бляшки, как аденовирус человека, но нейтрализовались иммунной сывороткой к вирусу SA7(C8), а не к Ad2. Они также образовывали бляшки в клетках обезьяны CV1. Интересно, что в клетках обезьяны наряду с мелкими бляшками (0,51,5 мм в диаметре), характерными для вируса SA7(C8), наблюдались крупные бляшки, которые по размерам характерны для вируса Ad2 в клетках человека (3-5 мм

в диаметре). Анализ потомства этих бляшек показал, что мелкие бляшки содержат вирус SA7(C8), а крупные бляшки содержат смесь двух типов вирионов - SA7(C8) и гибрида C8Ad2.

Количественная оценка нейтрализуемости гибрида C8Ad2 анти-С8 сывороткой была достоверно ниже, чем исходного вируса SA7(C8), что особенно проявлялось при изучении нейтрализации вируса в клетках 293. Эти данные указывают на включение какого-то (каких-то) белков вируса Ad2 в капсид дефектных частиц, а также частиц вируса SA7(C8). Этот белок (белки) делает структуру капсида не строго идентичной капсиду вируса SA7(C8), что приводит к снижению его нейтрализуемости. Не вызывает сомнения, что главный капсидный белок вируса Ad2, отвечающий за нейтрализацию (белок отростка), отсутствует в гибридных вирионах.

При титровании гибрида C8Ad2 в клетках 293 методом бляшек наблюдалась двухударная кривая зависимости числа бляшек от разведения вирусного материала, что характерно для вирусной популяции, состоящей из двух типов взаимно комплементирующих частиц. При титровании в клетках CV1 наблюдалась обычная для вирусов одноударная кривая, которая была характерна также для титрования вируса Ad2 в клетках 293. Гибрид C8Ad2 в этом отношении вел себя так же, как и гибрид Ad2C8.

Таким образом, популяция гибридного вируса, полученного в клетках человека, состояла из двух взаимно комплементирующих частиц - C8Ad2 и SA7(C8). Последний компонент можно было выделить как самостоятельный клонированием в клетках обезьяны (из мелких вирусных бляшек). Компонент C8Ad2 является дефектным и самостоятельно не клонируется в обоих типах клеток. Он служит помощником для вируса SA7(C8) в клетках человека, а последний предоставляет дефектным вирионам свои капсидные белки.

Для выяснения природы гибридного компонента было проведено изучение его молекулярно-генетических свойств методом молекулярной гибридизации.

Молекулярно-генетический анализ ДНК гибрида C8Ad2.

Для проведения анализа из каждого субклона гибрида выделяли ДНК и обрабатывали ее эндонуклеазами рестрикциии. Для анализа использовали следующие рестрикгазы: BamHI, EcoRI, Sali, Xhol. Разделение фрагментов ДНК и

14

)

гибридизационный анализ проводили так же, как и для анализа гибридов Ас12С8. Таким образом были исследованы 4 субклона гибрида С8Аё2.

Рисунок 4. Гибридизация BamHI фрагментов ДНК из вирусов Ad2, SA7(C8), клонов «Ad2C8» и субклонов C8Ad2 с зондами Ad2 (А) и SA7(C8) (Б). Дорожки 1 - ДНК Ad2, 2- ДНК SA7(C8), 3-4 - ДНК клонов «Ad2C8», 5-8- ДНК субклонов Ad2C8.

При исследовании ДНК клонов C8Ad2 с использованием рестриктаз BamHI (см. рис. 4), Sali, EcoRI и Xhol было показано, что все клоны содержат полный набор фрагментов ДНК вируса SA7(C8) и большую часть фрагментов ДНК вируса Ad2.

При анализе полученных данных было обнаружено, что геном гибридов C8Ad2 содержит как правую часть генома Ad2, так и его левую часть, и только среднюю часть (50% - 60%) генома SA7(C8) (рис. 5).

Е1В Е1А-»

ЕЗ

_ мг

|—,—,—,—1—, —,—| — |—|—|—,—1.........

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 •*.......................................4-

Е2В +--Е4

Е2А

мм С8Ас)2

А<12 5А7(С8) М2

Рисунок 5. Схема геномов Аё2 и С8Ас12

Стрелками показано расположение и направление транскрипции генов, Е1-Е4 -"ранние" гены, Ы-Ь5 - "поздние".

Роль аденовирусного гена Е4 в видоспецифичности репродукции аденовирусов.

При изучении гибридов Ас12С8 было показано, что левая часть генома гибридной частицы берется из аденовируса человека, а правая (по крайней мере, 40%) - из аденовируса обезьяны. В этой части аденовирусного генома локализованы три ранних гена, Е2а, ЕЗ и Е4. Известно, что ген ЕЗ не нужен для размножения аденовирусов в культуре клеток. Ген Е2а кодирует ДНК-связывающий белок, а ген Е4 мультифункционален и кодирует не менее 6 вирусспецифических белков. В этой же области генома располагается часть поздних генов, которые в адено-адено гибридах не функционируют. Поэтому есть основания считать, что за видоспецифичность размножения аденовирусов отвечает один из ранних генов (Е2а или Е4) или оба вместе. Для экспериментального решения этого вопроса был использован следующий подход. Наша лаборатория располагает двумя линиями клеток 293: 1 -клетки УК-10-9, дополнительно трансформированные геном Е4 аденовируса человека, тип 5, принадлежащего к той же группе аденовирусов, что и А<12 (группа С), 2 - клетки С1, трансформированные геном Е2а того же вируса (клетки любезно предоставлены д-ром В. Кругляком, США). Ген Е4 в клетках УК-10-9 находится под контролем индуцибельного промотора вируса рака молочных желез мышей. Экспрессия гена активируется дексамеггазоном. В клетках С1 ген Е2а находится под контролем промотора, активность которого подавляется тетрациклином. Были проведены эксперименты по способности вируса 8А7(С8) образовывать бляшки в

I

1 1

клетках УК-10-9. Было показано, что при заражении этих клеток вирусом 8А7(С8) репродукция вируса незначительна и образования бляшек не происходит. Однако, если включить в агарозное покрытие дексаметазон, наблюдается образование четко видимых бляшек (таблица 3), что указывает на усиление размножения этого вируса в клетках человека. Декасаметазон не влиял на образование бляшек аденовирусом 8А7(С8) в клетках 293 и СУ1, в которых не было индуцибельного аденовирусного гена Е4. Таким образом, одна из функций гена Е4 необходима для видоспецифичности репродукции аденовирусов.

Таблица 3. Влияние аденовирусного гена Е4 на образование бляшек аденовирусом обезьян 8А7(С8) в клетках человека.

Аналогичные эксперименты с клетками С1 не дали положительного результата: активация гена Е2а после удаления тетрациклина не приводила к усилению бляшкообразующей активности вируса ЗА7(С8).

Таким образом, в перевиваемых клетках обезьяны СУ1 был воспроизведен феномен комплементации и образования адено-адено гибридов между высокоонкогенным аденовирусом обезьян 8А7(С8) и аденовирусом человека группы С А<12. Было показано, что популяция гибридного вируса состоит из двух типов

Клетки Дексаметазон Образование Титр вируса

(1цМ) бляшек (БОЕ/мл)

СУ1 (обезьяны) - + 10м

+ + 107'2

293 (человека) - 0 <10"

+ 0 <103'7

УК-10-9 (человека)' - 0 <10"

+ + 105'5

* Клетки содержат ген Е4 аденовируса человека, тип 5, экспрессируемый под контролем промотора вируса рака молочных желез мышей в присутствии дексаметазона, включаемого в агарозное покрытие.

частиц - полного аденовируса человека и дефектного гибридного компонента, обозначенного А<12С8. Дефектный гибридный вирус размножался в клетках обезьяны и человека, и помощником для его репродукции служил аденовирус человека. В свою очередь аденовирус человека размножался в клетках обезьяны благодаря комплементации с дефектным гибридным компонентом, а в клетках человека -самостоятельно. Аденовирус человека предоставляет дефектному вириону белки для построения капсида, а дефектный вирион предоставляет аденовирусу человека какой-то фактор(ы), помогающий преодолевать последнему транскрипционно-трансляционный блок поздних генов при репродукции в клетках обезьяны.

Впервые было показано, что аденовирус человека А(12 усиливает репродукцию аденовируса обезьян 8А7(С8) в клетках человека. В этой культуре наблюдалось полное переодевание генома Ас12 в капсид 5А7(С8) (транскапсидация). Образование адено-адено гибридов в этой системе отличалось низкой эффективностью, но был получен один клон такого гибрида, обозначенного С8Ас12, и его субклоны. Популяция клона содержит два типа частиц - полный аденовирус БА7(С8) и дефектный компонент С8Ас12. 8А7(С8) предоставляет дефектному вириону белки для построения капсида, а компонент С8А(12 предоставляет аденовирусу обезьяны фактор(ы), необходимые для репродукции в клетках человека. Гибридная популяция С8Аё2+БА7(С8) практически не нейтрализуется анти-Ас!2 сывороткой, нейтрализуемость этой популяции анти-С8 сывороткой снижена по сравнению с нейтрализуемостью исходного вируса 8А7(С8). Сниженная нейтрализуемость гибридной популяции антителами к вирусу 8А7(С8) указывает, что какие-то капсидные белки вируса Ас12, имеющие значение для структуры капсида, синтезируются в клетках, зараженных гибридными вирионами. По-видимому, имеет место фенотипическое смешивание при образовании как дефектных вирионов, так и вируса БА7(С8), при котором в состав капсида включаются не только белки ЗА7(С8), но и белки вируса Ас12. Точная природа белков, включаемых в гибридные вирионы, остается неясной. Предположительно, речь может идти о белках, участвующих в образовании основания пентона.

При совместном размножении аденовирусов человека и обезьяны в клетках человека после нейтрализации смешанной популяции вирусов сывороткой к аденовирусу человека выявлялась большая фракция вирионов, которые представляли

собой геном аденовируса человека, "переодетый" в капсид аденовируса обезьяны. Интересно отметить, что такой феномен не был обнаружен при совместном размножении аденовирусов человека и обезьяны в обезьяньих клетках при обработке смешанной популяции сывороткой к аденовирусу обезьяны. Известно, что инкапсидация аденовирусного генома зависит от сигнальной последовательности, локализованной на его левом конце. Можно предполагать, что сигнальная последовательность аденовируса 8А7(С8) непригодна для включения генома этого вируса в капсид А<32. В то же время сигнальная последовательность А<12 подходит для включения генома этого вируса в капсид БА7(С8). Механизм инкапсидации и транскапсидации аденовирусных геномов представляет интерес для использования

О

аденовирусов как векторов генетической информации при генотерапии. При первичном введении векторного вируса происходит образование нейтрализующих »1 антител против него, и при следующем введении вируса желательна смена капсида

при сохранении структуры генома, несущего терапевтический ген.

Молекулярно-генетический анализ дефектных адено-адено гибридов Ас12С8 показал, что они являются рекомбинантами между геномами аденовируса человека и обезьяны, причем левая часть генома (до 60%) принадлежит вирусу А<12, а правая (не менее 40%) - вирусу ЭА7(С8). Минимальная область генома аденовируса ЯА7(С8), входящая в состав рекомбинантного генома и отвечающая за комплементацию с аденовирусом человека, содержит как ранние (Е2а, ЕЗ и Е4), так и поздние гены (Ь4 и Ь5). По-видимому, поздние гены вируса БА7(С8), продукты которых входят в состав «> капсида и отвечают за нейтрализацию вириона антителами, не экспрессируются, так

как антитела к вирусу БА7(С8) совершенно не способны нейтрализовать гибридный вирус. Ген ЕЗ не нужен для репродукции аденовируса в культуре клеток. Следовательно, остаются два гена, Е2а и Е4, участие которых в комплементации нельзя исключить. Все клоны гибридов А<12С8 были построены одинаково - левая часть генома А<32 и правая часть генома 8А7(С8), хотя доли геномов в разных клонах варьировали. Процесс образования рекомбинантов этого типа происходил с высокой эффективностью (от 1 до 5% вирионов, возникающих при смешанной инфекции, ' относились к этому типу). Известно, что геномы аденовирусов млекопитающих

имеют значительную степень гомологии и поэтому легко рекомбинируют в условиях смешанной инфекции. Природа рекомбинантов, получаемых в условиях,

использованных в настоящей работе, определяется двумя факторами: 1) гомологией между двумя геномами, благодаря которой происходят рекомбинационные события; 2) условиями отбора рекомбинантов. В использованных условиях отбираются рекомбинанты, не способные нейтрализоваться антителами к вирусу 8А7(С8) и способные помогать аденовирусу человека размножаться в клетках обезьяны. По-видимому, наибольшая гомология между геномами этих вирусов имеет место в центральной части их геномов. При этом обязательно сохраняются гены, необходимые для комплементации. Вероятно, с этим связан однообразный характер полученных рекомбинантов.

Молекулярно-генетический анализ дефектного гибрида С8Ас!2 показал, что он сохраняет около 90% генома А<!2, но имеет вставку из генома вируса 8А7(С8) в центральной части генома. По-видимому, эта вставка нарушает экспрессию поздних генов аденовируса человека, по крайней мере, тех из них, которые отвечают за способность вириона нейтрализоваться антителами. Рекомбинация в этой системе в использованных условиях отбора рекомбинантов, была низкоэффективной - удалось выявить только один рекомбинантный клон. В этом клоне в принципе проявился тот же эффект, что и в клонах А(12С8, то есть у рекомбинанта нарушена функция поздних генов и сохранена функция ранних генов (в том числе, Е4 и Е2а), необходимая для комплементации. В настоящее время сложно объяснить разницу в эффективности и результате рекомбинационных событий в обеих системах.

Природа видоспецифичности аденовирусов представляет интерес как для понимания механизма аденовирусной инфекции, так и для использования аденовирусов в качестве векторов для генотерапии. В настоящей работе впервые показано, что ген Е4 аденовируса человека, экспрессируемый в клетках человека, способен комплементировать размножение аденовируса обезьян в этих клетках и, следовательно, участвует в определении видоспецифичности репродукции аденовирусов.

Ген Е4 является мультифункциональным геном, кодирующим не менее 6 полипептидов. Вопрос, какой из этих полипептидов участвует в определении видоспецифичности аденовирусов, остается нерешенным. По-видимому, в клетках имеется клеточный фактор(ы), влияющий на размножение аденовирусов. Эти факторы видоспецифичны. Факторы клеток обезьян подавляют репродукцию

аденовируса человека, факторы клеток человека подавляют репродукцию аденовируса обезьяны. Вирусные факторы, ответственные за видоспецифичность репродукции аденовирусов, позволяют последним преодолеть блок, за который отвечают клеточные факторы. Природа клеточных факторов и механизм их взаимодействия с вирусными факторами нуждаются в дальнейшем изучении.

Известно, что вирус SA7(C8) высоко онкогенен для сирийских хомяков. Эксперименты по онкогенности адено-адено гибридов Ad2C8 для хомяков дали четкие отрицательные результаты (Цетлин, 1970, Kaplan et al., 1970, Гриненко и др., 2003). Данные по структуре гибридного генома Ad2C8 позволяют объяснить эти результаты отсутствием в популяции гибридного вируса левого конца генома SA7(C8), содержащего известные аденовирусные онкогены Е1а и Elb. Следует отметить, что появились данные о возможном участии гена Е4 в опухолевой трансформации клеток (Javier et al., 1992, Dobner et al., 1996). Можно определенно утверждать, что этот ген высокоонкогенного вируса SA7(C8) недостаточен для индукции опухолей у хомяков.

Известно, что в опухолях, индуцированных полиома- и аденовирусами, можно обнаружить два типа опухолевых антигенов, Т (tumor antigen) и TSTA (tumor specific transplantation antigen). Оба типа этих антигенов обнаружены в опухолях, индуцированных вирусом SA7(C8) (Altstein et al., 1968, Цетлин, 1970, Бабакова, 1969, Гриненко и др., 2003). Используя сыворотку хомяков-носителей опухоли, Т-антиген вируса SA7(C8) можно было выявить в клетках почки зеленой мартышки, зараженных вирусом SA7(C8), или вирусом Ad2C8 (Цетлин, 1970, Гриненко и др., 2003). Вирус Ad2C8 обладал способностью индуцировать трансплантационный иммунитет к клеткам опухоли, индуцированной вирусом SA7(C8), и, следовательно, кодировал TSTA, специфичный для вируса SA7(C8). Принято считать, что опухолевые антигены (Т и TSTA) кодируются вирусными онкогенами - геном Т-антигена полиомавирусов и онкогенами Е1а и Elb аденовирусов. Полученные в настоящей работе данные позволяют считать, что аденовирусные гены, локализованные в правой части генома (Е2а, ЕЗ, Е4), также принимают участие в кодировании этих антигенов.

выводы

1. Подтвержден феномен образования дефектных адено-адено гибридов Ас12С8 при смешанной инфекции аденовируса человека А<12 и обезьяны БА7(С8) в перевиваемых клетках обезьяны. Показано, что дефектный вирион А<12С8 размножается с помощью вируса А<12 не только в клетках обезьяны, но и человека, и служит помощником для вируса Ас!2 в клетках обезьяны.

2. Впервые описано образование дефектных адено-адено гибридов С8А<12 при смешанной инфекции вирусов 8А7(С8) и Ас!2 в перевиваемых клетках человека. Показано, что дефектный вирион С8Ас12 размножается с помощью вируса БА7(С8) в клетках человека и обезьяны и служит помощником для вируса 8А7(С8) в клетках человека.

3. Показана возможность полного "переодевания" генома аденовируса человека А(12 в капсид вируса обезьян 8А7(С8) (транскапсидация). Геном вируса 8А7(С8) не способен "переодеваться" в капсид вируса Аё2.

4. При исследовании генома дефектных гибридов Ас12С8 методом молекулярной гибридизации показано, что адено-адено гибриды Ас12С8 имеют рекомбинантную природу и сохраняют не менее 40% генома вируса 8А7(С8). Этот фрагмент содержит гены, ответственные за помощь вирусу Ас12 при репродукции в клетках обезьяны.

5. При исследовании генома дефектного гибрида С8А(12 методом молекулярной гибридизации показано, что гибрид имеет рекомбинантную природу, сохраняет правую и левую части генома А<32 и имеет встройку около 10% генома вируса 8А7(С8) в средней части генома. Эта встройка нарушает экспрессию, по крайней мере, части поздних генов вируса Ас12. Гибридные частицы, по-видимому, содержат белки не только вируса 8А7(С8), но и А<12.

6. Впервые показано, что ранний мультифункциональный аденовирусный ген Е4 принимает участие в определении видоспецифичности репродукции аденовирусов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Anatoly Altstein, Nadezhda Grinenko, Natalia Minaeva (Savitskaya), Galina Pashvykina. Adeno-adeno hybrids: biological properties and molecular studies. Xlth International Congress of Virology. Sydney, Australia, 1999, abstr. p. 167.

2. H.B. Минаева (Савицкая), Н.Ф. Гриненко, Г.В. Пашвыкина, А.Д. Альтштейн. Молекулярно-генетический анализ дефектных гибридов аденовирусов человека и обезьяны (адено-адено гибридов). Актуальные проблемы медицинской вирусологии. Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва, 1999, стр.90.

3. Савицкая Н.В., Гриненко Н.Ф., Пашвыкина Г.В., Народицкий Б.С., Альтштейн А.Д. Роль аденовирусного гена Е4 в видоспецифичности размножения аденовирусов. ДАН, 2000, Т. 375, № 6, стр. 834-836.

4. A. Altstein, N.F. Grinenko, N.V. Savitsky, G.V. Pashvykina. Biological and molecular perculiarities of defective recombinants (adeno-adeno hybrids) between human and simian adenoviruses. Xllth International Congress of Virology. Paris, France, 2002, abstr. p.77.

5. N.V. Savitskaya, G.V. Pashvykina, N.F. Grinenko. Comparative analysis of defective adeno-adeno hybrids. Molecular genetics of eukaryotes. Institute of Gene Biology RAS, Moscow, 2003, abstr. p.29.

6. Н.Ф. Гриненко, H.B. Савицкая, Г.В. Пашвыкина, А.Д. Альтштейн. Гибриды аденовирусов человека и обезьяны (адено-адено гибриды), способные размножаться в клетках обезьяны: биологические и молекулярно-генетические особенности. Генетика, 2003, 39 (6), с. 725-731.

1

»

«

Гарнитура Times. Формат 60V90/16. Бумага офсетная 80 г. Печать офсетная. Уч .-изд. л 1,0 Усл.печл 1,5. Тираж 100 экз. Отпечатано с готового Оригинал-макета в ООО "Знаменка".

ТZfjf

Р 16 979

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савицкая, Наталья Владимировна

Список сокращений.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Аденовирусы: краткий обзор.

2.1.1. Строение вириона.

2.1.2. Белки вириона.

2.1.3. Аденовирусный геном.

2.2. Полный цикл репродукции аденовирусов.

2.3. Видоспецифичность размножения аденовирусов и абортивная инфекция клетки.

2.4. Взаимодействие аденовирусов в условиях смешанной инфекции.

2.5. Аденовирусный ген Е4 и его функции.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы и методы.

3.1.1. Материалы.

3.1.1.1. Химические реактивы.

3.1.1.2. Вирусы и клеточные культуры.

3.1.1.3. Ферменты.

3.1.2. Методы.

3.1.2.1. Титрование вирусов.

3.1.2.2. Нейтрализация вирусов.

3.1.2.3. Очистка и концентрирование вирионов.

3.1.2.4. Выделение вирионной ДНК.

3.1.2.5. Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом.

3.1.2.6. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

3.1.2.7. Фракционирование фрагментов ДНК в агарозных гелях.

3.1.2.8. Перенос ДНК на фильтры (блоттинг).

3.1.2.9. Приготовление зонда.

3.1.2.10. Гибридизация иммобилизованной на фильтрах ДНК с меченой *2Р ДНК.

3.1.2.11. Радиоавтография.

3.2. Результаты.

3.2.1. Размножение и комплементация аденовирусов человека и обезьяны в перевиваемых клетках обоих видов.

3.2.2. Гибриды Ас12С8, полученные в клетках обезьяны.

3.2.2.1. Биологические свойства Ас12С8.

3.2.2.2. Молекулярно-генетический анализ гибрида Ас12С8.

3.2.3. Адено-адено гибриды С8Ас12, полученные в клетках человека.

3 .2.3.1. Получение адено-адено гибрида С8А<12 и его биологические свойства.

3.2.3.2. Молекулярно-генетический анализ гибрида С8Ас12.

3.2.4. Роль аденовирусного гена Е4 в видоспецифичности репродукции аденовирусов.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Адено-адено гибриды: получение, биологические свойства и молекулярно-генетический анализ"

Аденовирусы (Ad) это ДНК-содержащие вирусы, вызывающие респираторные, кишечные и другие заболевания у человека и животных. Эти вирусы f широко распространены и являются интересным объектом для изучения молекулярной биологии не только вирусов, но и клеток. При изучении репликативного цикла аденовирусов были получены сведения об общих внутриклеточных процессах. Так, в процессе изучения биогенеза вирусных иРНК было открыто явление сплайсинга. Кроме того, были разработаны методики картирования геномной локализации иРНК Ad, применявшиеся затем для изучения 1 многих вирусных и эукариотических систем. Большое значение имело открытие I онкогенности аденовирусов. Первый описанный случай, когда патогенный вирус человека индуцировал злокачественные опухоли у животных (Ad 12 вызывал появление опухолей у грызунов), послужил толчком к изучению онкогенного потенциала аденовирусов. Хотя к j 1 I настоящему времени не установлено человека, четкой связи между аденовирусами (а злокачественными опухолями изучение аденовирусного также полиомавирусного) канцерогенеза дало очень много в понимании молекулярных механизмов возникновения злокачественных опухолей. Эти наблюдения, а также некоторые другие, позволяют использовать аденовирусы в качестве удобного биологического инструмента при изучении сложных процессов в эукариотических системах. В последние годы усилилось внимание к аденовирусам в связи с возможностью использования их в качестве векторных систем для переноса чужеродных генов. Особенно большой интерес аденовирусы имеют для разработки генной терапии направления, возникшего в конце 80-х годов 20-го века и быстро развивающегося в настоящее время. Важное преимущество аденовирусных векторов для генотерапии заключается, во-первых, в их низкой патогенности для организма человека и, во-вторых, в способности таких векторов проникать в клетки независимо от стадии клеточного цикла (другая удобная векторная система для генотерапии, ретровирусы, лишена этого преимущества ретровирусы заражают только делящиеся клетки). Другим преимуществом аденовирусов как векторов является их способность накапливаться в очень высоких титрах; аденовирусы гораздо стабильнее ретровирусов и, в отличие от последних, почти не интегрируют с клеточным геномом. В этой связи возникает задача детального изучения генома аденовирусов, а также характеристика отдельных частей вирусной ДНК с целью выявления областей, существенных для создания эффективных и безопасных векторов. Одной из проблем, важных для понимания аденовирусной инфекции, является видоспецифичность этих вирусов. Известно, что аденовирусы, выделяемые от человека и животных, способны вызывать продуктивную инфекцию только у гомологичных организмов. Это не относится к абортивной инфекции, которая развивается и в гетерологичных организмах и клетках. Механизмы видоспецифичности, по-видимому, разнообразны и изучены недостаточно. Для использования аденовирусов в качестве векторов для генной терапии важно научиться управлять их ткане- и видоспецифичностью. Одна из интереснейших моделей для изучения видоспецифичности аденовирусов это аденовирусы человека и обезьяны. Аденовирусы человека и обезьяны хорошо размножаются в культуре клеток гомологичного вида и плохо в гетерологичных клетках. Блок размножения аденовируса человека в обезьяньих клетках преодолевается при совместной инфекции обезьяньих клеток аденовирусом человека и обезьяньим полиомавирусом SV40, а также при совместной инфекции этих клеток аденовирусами человека и обезьяны. Ранее было показано, что при совместном размножении высокоонкогенного аденовируса обезьян SA7(C8) и аденовирусов человека группы С в первичных обезьяньих клетках наблюдается комплементация, фенотипическое смешивание и образование дефектных адено-адено гибридов (Altstein, Dodonova, 1968; Altstein et al., 1968). Адено-адено гибриды представлены дефектными вирионами, которые служат вирусомпомощником для размножения аденовируса человека в клетках обезьяны. В свою очередь, аденовирус человека помогает дефектному адено-адено вириону размножаться в клетках, предоставляя ему белки для построения капсида. Природа адено-адено гибридов оставалась неясной. Исследование этой проблемы затрудняется тем, что гибридная популяция состоит из двух типов частиц: 1) полных вирионов аденовируса человека и 2) дефектных гибридных адено-адено вирионов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Савицкая, Наталья Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Подтвержден феномен образования дефектных адено-адено гибридов Ас12С8 при смешанной инфекции аденовируса человека Ас12 и обезьяны 8А7(С8) в перевиваемых клетках обезьяны. Показано, что дефектный вирион Ас12С8 размножается с помощью вируса Ас12 не только в клетках обезьяны, но и человека, и служит помощником для вируса Ас12 в клетках обезьяны.

2. Впервые описано образование дефектных адено-адено гибридов С8Ас12 при смешанной инфекции вирусов 8А7(С8) и Аё2 в перевиваемых клетках человека. Показано, что дефектный вирион С8Ас12 размножается с помощью вируса БА7(С8) в клетках человека и обезьяны и служит помощником для вируса 8А7(С8) в клетках человека.

3. Показана возможность полного "переодевания" генома аденовируса человека А<12 в капсид вируса обезьян 8А7(С8) (транскапсидация). Геном вируса 8А7(С8) не способен "переодеваться" в капсид вируса Ас12.

4. При исследовании генома дефектных гибридов Аё2С8 методом молекулярной гибридизации показано, что адено-адено гибриды А<12С8 имеют рекомбинантную природу и сохраняют не менее 40% генома вируса 8А7(С8). Этот фрагмент содержит гены, ответственные за помощь вирусу Ас12 при репродукции в клетках обезьяны.

5. При исследовании генома дефектного гибрида С8Ас12 методом молекулярной гибридизации показано, что гибрид имеет рекомбинантную природу, сохраняет правую и левую части генома Аё2 и имеет встройку около 10% генома вируса 8А7(С8) в средней части генома. Эта встройка нарушает экспрессию, по крайней мере, части поздних генов вируса Аё2. Гибридные частицы, по-видимому, содержат белки не только вируса 8А7(С8), но и Аё2.

6. Впервые показано, что ранний мультифункциональный аденовирусный ген Е4 принимает участие в определении видоспецифичности репродукции аденовирусов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савицкая, Наталья Владимировна, Москва

1. Альтштейн А.Д. Дефектность онкогенных вирусов и вирусный канцерогенез (Экспериментальное исследование на модели папова- и аденовирусов обезьян). Дисс. докт. М., 1970.

2. Альтштейн А.Д. Общая характеристика онкогенных вирусов. В кн. "Канцерогенез". М.: Научный мир. 2000.

3. Бабакова C.B. Изучение иммунитета к аденовирусным опухолям хомяков. Дисс. канд. М.: 1969.

4. Вихнович Э.М., Дрейзин P.C., Золотарская Э.Е. и др. Изучение инфекционности и онкогенности ДНК аденовируса обезьян SA7(C8) и инфекционности ДНК аденовируса человека типа 6. Вопр. Вирусол. 1978, 2, с. 176-179.

5. Дрейзин P.C. Семейство Adenoviridae. В кн. "Общая и частная вирусология". М.: Медицина. 1982.

6. Дяченко Н.С., Нас И., Беренчи Д. и др. Аденовирус, клетка, организм. Киев: Наукова думка. 1988,232 с.

7. Народицкий Б.С. Структурно-функциональная организация генома аденовирусов и конструирование вектора для эукариотических клеток. Дисс. док. биол. наук. МГУ, М. 1988.

8. Рязанова Г.Л. Действие солей магния на термоинактивацию некоторых вирусов. Дисс. канд. М., 1967.

9. Тарасишин Л.А., Хилько С.Н., Дяченко Н.С. и др. Олигопептидный анализ гексонов аденовирусов человека типов 1, 2, 6 и аденовирусов обезьян SA7. Вопр. Вирусологии. 1981,26(5), с.574-580.

10. Тарасишин Л.А. Белки аденовирусов: первичная и антигенная структура. Успехи соврем, биологии. 1982, 94(5), с. 203-212.

11. Цетлин Е.М. Онкогенность аденовирусов обезьян. Дисс. канд. М., 1970.

12. Akusjarvi G. Anatomy of region LI from adenovirus type 2. J. Virol. 1985, 56(3), p.879-886.

13. Akusjarvi G., Persson H. Controls of RNA splicing and termination in the major late adenovirus transcription unit. Nature. 1981, 292(5822), p.420-426.

14. Altstein A.D., Dodonova N.N. Interaction between human and simian adenoviruses in simian cells: complementation, phenotypic mixing and formation of monkey cell "adapted" virions. Virology. 1968, 35, p.248.

15. Altstein A.D., Dodonova N.N., Vassilyeva N.N., Tsetlin E.M. Hybrid of monkey and human adenoviruses. J.Virol. 1968, 2(5), p. 488-493.

16. Ariga H., Klein H., LevineA. J. et. al. A cleavage product of the adenovirus DNA binding protein is active in DNA replication in vitro. Ibid. 1980, 101(1), p.307-310.

17. Armentano D.,Zabner J., Sacks C., Sookdeo C.C., Smith M.P., St. George J.A., Wadsworth S.C., Smith A.E., Gregory R.J. Effect of the E4 region on the persistence of transgene expression from adenovirus vectors. J. Virol. 1997, 71, p.2408-2416.

18. Arrand Y.R., Keller W., Roberts R.T. Extent of terminal repetition in adenovirus 2 DNA// Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1974, 39, p.401-407.

19. Atchison R.W., Casto B.C., McD.Hammon W. Adenoviruseassociated defective virus particles. Science. 1965, 149(3685), p.754.

20. Axelrod N. Phosphoproteins of adenovirus type 2. Virology. 1978, 87(2), p.366-383.

21. Bachenheimer S., Darnell J.E. Adenovirus-2 mRNA is transcribed as part of a high-molecular-weight precursor RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975, 72, p.4445-4449.

22. Baum S.G., Reich P., Huebner C.J., Rowe W., Weissman Sh.M. Biophysical evidence for linkage of adenovirus and SV40 DNA's in adenovirus 7-SV40 hybrid particles. Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1966, 56(5), p.1509.

23. Baum S.G., Horwitz M.S., Maizel J.V. Studies oo the mechanism of enhancement of human adenovirus infection in monkey cells by SV40. J.Virol. 1972, 10, p.211-219.

24. Beltz G.A., Flint S.J. Inhibition of HeLa cell protein synthesis during adenovirus infection: Restriction of cellular messenger RNA sequences to the nucleus. J. Mol. Biol. 1979, 131, p.353-373.

25. Benihoud K., Yeh P., Perricaudet M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 1999, 10, p.440-447.

26. Bergelson J.M., Cunningham J.A., Droguett G. et. al. Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and 5. Science. 1997, 275(5304), p.1320-1323.

27. Bergelson J.M., Krithivas A., Celi L. et. al. The murine CAR homolog is a receptor for coxsackie B viruses and adenoviruses. J. Virol. 1998, 72 (1), p. 415-419.

28. Berk AJ, Lee F, Harrison T, et al. Pre-early adenovirus 5 gene product regulates synthesis of early viral messenger RNAs. Cell. 1979, 17, p.935-944.

29. Black P.H., Lewis A., Blacklow N., Austin J.B., Rowe W.P. The presence of adenovirus-specific antigens in hamster cell rendered neoplastic by adenovirus 1-SV40 and adenovirus 2-SV40 hybrid viruses. Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1967, 57(5), p. 1324.

30. Boeye A., Melnick J.L., Rapp F. SV40 adenovirus hybrids; presence of two genotypes and the requirement of their complementation for viral replication. Virology. 1966, 28, p.56.

31. Bridge E., Medghalchi S., Ubol S, et al. Adenovirus early region 4 and viral DNA synthesis. Virology. 1993, 193, p.794-801.

32. Butel J.S. Characterisation of the strain of adenovirus type 7 carrying the defective monkey cell-adapting component. J. Virol. 1967, 1(5), p.876.

33. Butel J.S., Rapp F., Melnick J.L., Rubin B.A. Replication of adenovirus type 7 in monkey cells: a new determinant and its transfer to adenovirus type 2. Science. 1966, 154, p.671.

34. Butel J.S., Rapp F. Complementation between a defective monkey cell-adapting component and human adenoviruses in simian cells. Virology. 1967, 31, p.573.

35. Butel J.S., Rapp F. Replication of defective simian virus 40 and a monkey cell-adapting component in human kidney cells. J. Virol. 1968, 2(5), p.541.

36. Casto B.C., Atchison R.W., Hammon W.McD. Studies on the ralationship between adeno-associated virus type I (AAV-I) and adenoviruses. I. Replication AAV-I in certain cells cultures and its effect on helper adenoviruses. Virology. 1967, 32, p.52.

37. Cepko C.L., Sharp P.A. Assembly of adenovirus major capsid protein is mediated by a nonvirion protein. Cell. 1982, 31(2), p.407-415.

38. Challberg M.D., Desiderio S.V., Kelly TJ Jr. Adenovirus DNA replication in vitro: Characterization of a protein covalently linked to nascent DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980, 77, p.5105-5109.

39. Chatterjee P.K., Vayda M.E., Flint S.J. Interactions among the three adenovirus core proteins. Ibid. 1985, 55(2), p.379-386.

40. Chow L.T., Lewis J.B., Broker T.R. RNA transcription and splicing at early and intermediate times after adenovirus-2 infection. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1980, 44(1), p. 401414.

41. Cress W.D., Nevins J.R. Use of the E2F transcription factor by DNA tumor virus regulatory proteins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996, 208, p.63-78.

42. Davison A.J., Telford E.A., Watson M.S., McBride K., Mautner V. The DNA sequence of adenovirus type 40. J. Mol. Biol. 1993, 234, p.1308-1316.

43. Dix I., Leppard K.N. Regulated splicing of adenovirus type 5 E4 transcripts and regulated cytoplasmic accumulation of E4 mRNA. J.Virol. 1993, 67, p.3226-3231.

44. Dix I., Leppard K.N. Expression of adenovirus type 5 E4 Orf2 protein during lytic infection. J. Gen. Virol. 1995, 76, p.1051-1055.

45. Dobner T., Kzhyshkowska J. Nuclear export of adenovirus RNA. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2001, 259, p.25-54.

46. Fanning E., Shneider J., Arthur A., Hoss A., Moarefi I., Modrow S. Structure and function of SV40 large T antigen. Currr. Top. Microbiol. Immunol. 1989, 144, p.9-19.

47. Farber M.S., Baum S.G. Transcription of adenovirus RNA in permissive and nonpermissive infections. J. Virol. 1978, 27, p.136-148.

48. Fey G., Lewis J.B., Grodzicker T., Bothwell A. Characterization of a fused protein specified by the adenovirus type 2-simian virus 40 hybrid Ad2+ND1 dp2. J. Virol. 1979, 30, p.201-217.

49. Fields Virology. Ed. by Knipe D.M., Howley P.M. Lippincott Williams&Wilkins, USA, 2001.

50. Fox R.I., Baum S.G. Synthesis of viral RNA during restricted adenovirus infection. J. Virol. 1972, 10, p.220-227.

51. Fredman J.N., Engler J.A. Adenovirus precursor to terminal protein interacts with the nuclear matrix in vivo and in vitro. J. Virol. 1993, 67, p.3384—3395.

52. Friedman M.P., Lyons M.J., Ginsberg H.S. Biochemical consequences of type 2 adenovirus and SV40 double infections of African green monkey cells. J.Virol. 1970, 5, p.586-597.

53. Friefeld B.R., Lichy J.H., Field J. et. al. The in vitro replication of adenovirus DNA. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1984, 110, p.221-255.

54. Gambke C., Deppert W. Specific complex of the late non-structural 100 000-dalton protein with newly synthesized hexon in adenovirus type 2-infected cells. Virology. 1983, 124(1), p.1-12.

55. Gao G.-P., Yang Y., Wilson J.M. Biology of adenovirus vectors with El and E4 deletions for liver-directed gene therapy. J. Virol. 1996, 70, p.8934-8943.

56. Goding C., Jalinet P., Zajchowski D. et. al. Sequence-specific trans-activation of the adenovirus Ella early promoter by the viral EIV transcription unit. EMBO J. 1985, 4(6), p.523-1528.

57. Goodrum F.D., Ornelles D.A. Roles for the E4 orf6, orf3 and E1B 55-kilodalton proteins in cell cycle-independent adenovirus replication. J. Virol. 1999, 73, p.7474-7488.

58. Grable M, Hearing P. eis And trans requirements for the selective packaging of adenovirus type 5 DNA. J. Virol. 1992, 66, p.723-731.

59. Graham F.L., Abrahams P.J., Mulder C. et. al. Studies on in vitro transformatiom by DNA and DNA fragments of human adenoviruses and SV40. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1974, 39, p.637-650.

60. Graham F.L., Smiley J., Russel W.C., Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human sdenovirus type 5. J. Gen. Virol. 1977, 36, p. 59-72.

61. Green M. Biochemical studies on adenovirus multiplication. I. Kinetics of nucleic acid and protein synthesis in suspension cultures. Virology. 1961, 13, p. 169-176.

62. Green M., Pina M., Kimes R., Wensink P.C., MacHattie L.A., Thomas C.A. Adenovirus DNA. ¡.Molecular weight and conformation Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967, 57, p. 1302-1309.

63. Green N.M., Wrigley N.G., Russel W.C. et al. Evidence for a repeating cross-p sheet structure in the adenovirus fiber. EMBO J. 1983, 2(5), p.1357-1365.

64. Gruber W.C., Russell D.J., Tibbetts C. Fiber gene and genomic origin of human adenovirus type 4. Virology. 1993, 196, p.603-611.

65. Gustin K.E., Imperiale M.J. Encapsidation of viral DNA requires the adenovirus LI 52/55-kilodalton protein. J. Virol. 1998, 72, p.7860-7870.

66. Halbert D.N., Cutt J.R., Shenk T. Adenovirus early region 4 encodes functions required for efficient DNA replication, late gene expression and host cell shutoff. J. Virol. 1985, 56, p.250-257.

67. Hammarskjold ML, Winberg G. Encapsidation of adenovirus 16 DNA is directed by a small DNA sequence at the left end of the genome. Cell. 1980, 20, p.787-795.

68. Handa H., Kingston R.E., Sharp P.A. Inhibition of adenovirus early region IV transcription in vitro by a purified viral DNA binding protein. Nature 1983, 302(5908), p.545-547.

69. Hartley J.W., Huebner R.J., Rowe W.P. Serial propagation of adenoviruses (APC) in monkey kidney tissue cultures. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 1956, 92, p.667.

70. Hasson T.B., Ornelles D.A., Shenk T. Adenovirus LI 52- and 55-kilodalton proteins are present within assembling virions and colocalize with nuclear structures distinct from replication centers. J. Virol. 1992, 66, p.6133-6142.

71. Hay R.T. Origin of adenovirus DNA replication: Role of the nuclear factor I binding site in vivo. J. Mol. Biol. 1985, 186(1), p.129-137.

72. Hierholzer J. C., Wigand R., Anderson L.J., et al. Adenoviruses from p atients with AIDS: A plethora of serotypes and a description of five new serotypes of subgenus D (types 43-47). J Infect Dis. 1988, 158, p.804-813.

73. Hilleman M.R., Werner J.H. Recovery of new agents from patients with acute respiratory illness. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954, 85, p.183-188.

74. Hoggan M.D. Presence of small virus-like particles in various adenovirus type 2, 5, 7 and 12 preparations. Fed. Proc. 1965, 24 (2) pt.l, p.248.

75. Hoggan M.D., Blacklow N.R., Rowe W.P. Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations: physical, biological and immunological characteristics. Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1966, 55(6), p.1467.

76. Hong JS, Mullis KG, Engler JA. Characterization of the Early region 3 and fiber genes of Ad7. Virology 1988, 167, p. 545-553.

77. Horwitz M.S., Scharff M.D., Maizel J.V. Synthesis and assembly of adenovirus 2. I. Polypeptide synthesis, assembly of capsomers and morphogenesis of the virion. Virology. 1969, 39, p.682.

78. Horwitz M. Adenoviruses and their replication. In: Fields Virology. Raven Press, N.Y., 1985.

79. Hosakawa K, Sung MT. Isolation and characterization of an extremely basic protein from adenovirus type 5. J. Virol. 1976, 17, p.924-934.

80. Huebner R.J., Casey M.J., Chanock R.M., Shell K. Tumors induced in hamsters by a strain of adenovirus type 3. Sharing of tumor antigens and "neoantigens" with those produced by adenovirus type 7 tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1965, 54, p.381-388.

81. Huebner R.J., Chanock R.M., Rubin B.A., Casey M.J. Induction by adenovirus type 7 of tumors in hamsters having the antigenic characteristics of SV40 virus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1964, 52, p.1333.

82. Hull R.N., Johnson I.S., Culbertson C.G., Reimer C.B., Wright H.F. Oncogenicity of the simian adenoviruses. Science. 1965, 150, 3699, p.1044-1046.

83. Ishibashi M., Maizel J.V., Jr. The polypeptides of adenovirus. Virology. 1974, 58, p.409-424; Virology. 1974, 58, p.345-361.

84. Javier R.T. Adenovirus type 9 E4 open reading frame 1 encodes a transforming protein required for the production of mammary tumors in rats. J. Virol. 1994, 68, p.3917-3924.

85. Johnston J.M., Anderson K.P., Klessig D.F. Partial block to transcription of human adenovirus type 2 late genes in abortively infected monkey cells. J. Virol. 1985, 56, p.378-385.

86. Jones N., Shenk T. An adenovirus type 5 early gene function regulates expression of other early viral genes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979, 76(9), p.3665-3669.

87. Jornvall H., Akusjarvi G., Alestrom P. et. al. The adenovirus hexon protein. The primary structure of the polypeptide and its correlation with the hexon gene. J. Biol. Chem. 1981, 256(12), p.6181-6186.

88. Juttermann R., Weyer U., Doerfler W. Defect of adenovirus type 12 replication in hamster cells: absence of transcription of viral virus-associated and LI RNAs. J. Virol. 1989, 63, p.3535-3540.

89. Kanopka A., Muhlemann O., Petersen-Mahrt S., Estmer C., Ohrmalm C., Akusjarvi G. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 1998, 393, p.185-187.

90. Kaufman R.J. Identification of the components necessary for adenovirus translational control and their utilization in cDNA expression vectors. Proc. Nat. Aced. Sci. USA. 1985, 82(3), p.689-693.

91. Kel A.E., Kel-Margoulis O.V., Farnham P.J., Bartley S.M., Wingender E., Zhang M.Q. Computer-assisted identification of cell cycle-regulated genes: new targets for E2F transcription factors. J. Mol. Biol. 2001, 309, p.99-120.

92. Kelly T.J. Jr., Lewis A.M. Use of non-defective adenovirus-simian virus 40 hybrids for mapping the simian virus 40 genome. J. Virol. 1973, 12, p.643-652.

93. Kitchingman G.R. Sequence of the DNA-binding protein of a human subgroup E adenovirus (type 4): Comparisons with subgroup A (type 12), subgroup B (type 7), and subgroup C (type 5). Virology. 1985, 146, p.90-101.

94. Kleinberger T., Shenk T. Adenovirus E4orf4 protein binds to protein phosphatase 2A, and the complex down regulates ElA-enhanced junB transkription. J.Virol. 1993, 67, p.7556-7560.

95. Kleinberger T. Induction of apoptosis by adenovirus E4orf4 protein. Apoptosis. 2000, 5, p.211-215.

96. Klessig D.F., Anderson C.W. Block to multiplication of adenovirus serotype 2 in monkey cells. J. Virol. 1975, 16, p.1650-1668.

97. Klimkait T., Doerfler W. Adenovirus types 2 and 5 functions elicit replication and late expression of adenovirus type 12 DNA in hamster cells. J. Virol. 1985, 55, p.466-474.

98. Krougliak V., Graham F.L. Development of cell lines capable of complementing El, E4 and protein IX defective adenovirus type 5 mutants. Human Gene Therapy. 1995, 6, p.1575-1586.

99. Kvist S., Ostberg L., Persson H., Philipson L., Peterson P.A. Molecular association between transplantation antigens and cell surface antigen in adenovirus-transformed cell line. Proc Natl Acad Sci USA. 1978, 75, p.5674-5678.

100. Leppard K.N. E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adeno-associated virus infections. J. Gen. Virol. 1997, 78, p.2131-2138.

101. Leppard K.N., Everett R.D. The adenovirus type 5 E1B 55K and E4 Orf3 proteins associate in infected cells and affect ND10 components. J. Gen. Virol. 1999, 80, p.997-1008.

102. Lewis A.M., Levine A.S., Crumpacker C.S., Levin M.J., Samaha R.J., Henry P.H. Studies of nondefective adenovirus 2-SV40 specific biological properties. J. Virol. 1973, 11, p,655-664.

103. Logan J.S., Shenk T. Transcriptional and translational control of adenovirus gene expression. Microbiol. Rev. 1982, 46(4), p.377-383

104. Logan J, S henk T. A denovirus t ripartite 1 eader sequence enhances t ranslation o f m RNAs late after infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984, 81, p.3655-3659.

105. Lucas J.J., Ginsberg H.S. Transcription and transport of virus-specific RNAs in African green monkey cells abortively infected with type 2 adenovirus. J.Virol. 1972, 10, p. 1109-1117.

106. Lucher L.A. Adenovirus type 12 tumor antigen synthesis differs during infection of permissive and non-permissive cells. J. Gen. Virol. 1990, 71, p.579-583.

107. Lucher L.A., Khuntirat B., Zhao J., Angeletti P.C. Altered expression of adenovirus 12 DNA-binding protein but not DNA polymerase during abortive infection of hamster cells. Virology. 1992, 189, p.l 87-195.

108. Lucher L.A. Abortive adenovirus infection and host range determinants. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995, 199(1), p.119-152.

109. Mackey J.K., Rigden P.M., Green M. Do highly oncogenic group A human adenoviruses cause human cancer? Analysis of human tumors for adenovirus 12 transforming DNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976, 73, p.4657^1661.

110. Maizel J.V.Jr., White D.O., Scharff M.D. The polypeptides of adenovirus. Virology. 1968, 36, p.l 15-125.

111. Malherbe H., Harwin R. Seven viruses isolated from the vervet monkey. Brit. J. Exp. Path. 1957,38 (5), p.539-541.

112. Marcellus R.C., Lavoie J.N., Boivin D., Shore G.C., Ketner G„ Branton P.E. The early region E4 orf4 protein of human adenovirus type 5 induces p53-independent cell death by apoptosis. J. Virol. 1998, 72, p.7144-7153.

113. Marcellus R.C., Chan H., Paquette D., Thirlwell S.W., Boivin D., Branton P.E. Induction of p53-independent apoptosis by the adenovirus E4orf4 protein requires binding to the Balpha subunit of protein phosphatase 2A. J. Virol. 2000, 74, p.7869-7877.

114. Mathias P., Wickham T., Moore M. et. al. Multiple adenovirus serotypes use alpha v integrins for infection. J Virol. 1994, 68(10), p.6811- 6814.

115. Mautner V., MacKay N., Steinthorsdottir V. Complementation of enteric adenovirus type 40 for lytic growth in tissue culture by Elb 55K function of adenovirus types 5 and 12. Virology. 1989, 171, p.619-622.

116. Mautner V., MacKay N., Morris K. Enteric adenovirus type 40: expression of E1B mRNA and proteins in permissive and non-permissive cells. Virology. 1990, 179, p.129-138.

117. Medghalchi S., Padmanabhan R., Ketner G. Early region 4 modulates adenovirus DNA replication by two genetically separable mechanisms. Virology. 1997, 236, p.8-17.

118. Mirza MA, Weber J. Structure of adenovirus chromatin. Biochem Biophys Acta 1982, 696, p.76-86.

119. Moore M., Horikoshi N., Shenk T. Oncogenic potential of the adenovirus E4orf6 protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, 93, p. 11295-11301.

120. Morgan C., Rosenkranz H.S., Mednis B. Structure and development of viruses observed in the electron microscope. J.Virol. 1969, 4, p.777-796.

121. Naegele R.F., Rapp F. Enhancement of the replication of human adenoviruses in simian cells by simian adenovirus SV15. J.Virol. 1967, 1(4), p.838.

122. Nemerow G.R., Stewart P.L. Role of alpha(v) integrins in adenovirus cell entry and gene delivery. Microbiol Mol Biol Rev. 1999, 63(3), p.725-734.

123. Nevels M., Täuber B., Kremmer E., Spruss T., Wolf H., Dobner T. Transforming potential of the adenovirus type 5 E4orf3 protein. J. Virol. 1999, 73, p.1591-1600.

124. Nevins J.R., Winkler J.J. Regulation of early adenovirus transcription: A protein product of early region 2 specifically represses region 4 transcription. Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1980, 77(11), p. 1893-1897.

125. Nevins J.R. Mechanism of activation of early viral transcription by the adenovirus El A gene product. Cell. 1981, 26(2), p.213-220.

126. Newcomb W.W., Boring J.W., Brown J.C. Ion etching of the human adenovirus 2: structure of the core. J. Virol. 1984, 51(2), p.52-56.

127. Norrby E. The structural and functional diversity of adenovirus capsid components. J. Gen. Virol., 1969, 5, p. 221-236.

128. Norrby E., Wadell G. Immunological relationships between hexons of certain human adenoviruses. J. Virol. 1969, 4(5), p.663-670.

129. Norrby E., Marusyk R.G., Wadell G. Immunological relationships between capsid components of adenoviruses of different host cell species origin. Can. J. Microbiol. 1971, 17(9), p.1227-1237.

130. Norrby E., Bartha A., Boulanger P. Adenoiridae. Intervirology. 1976, 7, p.117-125.

131. Obert S., O'Connor R.J., Schmid S., Hearing P. The adenovirus E4-6/7 protein transactivates the E2 promoter by inducing dimerization of a heteromeric E2F complex. Mol. Cell. Biol. 1994, 14, p.1333-1346.

132. O'Connor G.T., Rabson A.S., Berezesky I., Paul F.J. Mixed infection with simian virus 40 and adenovirus 12. J. Natl. Cane. Inst. 1965, 31(4), p. 903.

133. O'Connor R.J., Hearing P. The E4-6/7 protein functionally compensates for the loss of El A expression in adenovirus infection. J. Virol. 2000, 74, p.5819-5824.

134. Oosterom-Dragon E.A., Ginsberg H.S. Characterization of two temperature-sensitive mutants of type 5 adenovirus with mutations in the 100,000-dalton protein gene. J. Virol. 1981, 40(2), p.491-500.

135. Pettersson U., Roberts R.J. Adenovirus gene expression and replication: A historical review. Cancer-Cells. 1986, 4, p.37-57.

136. Philipson L., Lonberg-Holm K., Pettersson U. Virus-receptor interaction in an adenovirus system. J. Virol. 1968, 2, p.1064-1075.

137. Philipson L., Petersson U., Lindberg U. Molecular biology of adenovirus. Virol. Monogr. 1975, 14, p.1-115.

138. Philipson L. Structure and assembly of adenoviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1983, 109, p.1-52.

139. Pieniazek D., Pieniazek N., Macejak D., Coward J., Rayfield M., Luftig R.B. Differential growth of human enteric adenovirus 41 (TAK) in continuous cell lines. Virology. 1990a, 174, p.239-249.

140. Pieniazek D., Pieniazek N.J., Macejak D., Luftig R. Enteric adenovirus 41 (Tak) requires low serum for growth in human primary cells. Virology. 1990b, 178, p.72-80.

141. Pilder S., Moore M., Logan J., Shenk T. The adenovirus E1B-55K transforming polypeptide modulates transport or cytoplasmic stabilization of viral and host cell mRNAs. Mol. Cell. Biol. 1986, 6, p.470-476.

142. Rabson A.S., O'Connor G.T., Berezesky I.K., Paul F.J. Enhancement of adenovirus growth in African green monkey kidney cell cultures by SV40. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1964, 116, 187-190.

143. Rapp F., Butel J., Melnick J. SV40-adenovirus "hybrid" populations: transfer of SV40 determinants from one type of adenovirus to another. Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1965, 54(3), p.717.

144. Rapp F., Jerkofsky M., Vanderslice D. Characterization of defectiveness of human adenoviruses in green monkey kidney cells. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1967, 126(3), p. 782.

145. Rapp F., Melnick J.L., Butel J.S., Kitahara T. The incorporation of SV40 genetic material into adenovirus 7 as measured by intranuclear synthesis of SV40 tumor antigen. Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1964, 52, p. 1348.

146. Reich P.R., Baum S.G., Rose J.A., Rowe W.P., Weissman S.M. Nucleic acid homology studies on adenovirus type 7-SV40 interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1966, 55, p.336-341.

147. Ricciardi R.P., Jones R.L., Cepko C.L. et. al. Expression of early adenovirus genes requires a viral encoded acidic polypeptide. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981, 78(10), p.6121-6125.

148. Richardson W.D., Westphal H. A cascade of adenovirus early functions is required for expression of adeno-associated virus. Cell. 1981, 27(1), p. 133-141.

149. Rijnders A.W.M., Van Bergen B.G.M., Van der Vlient P.C. et. al. Specific binding of the adenovirus terminal protein precursor-DNA polymerase complex to the origin of DNA replication. Nucl. Acids Res. 1983, 11(24), p. 8777-8789.

150. Robinson A.J., Younghusband H.B., Bellett A.J.D. A circular DNA protein complex from adenoviruses. Virology, 1973, 56, p. 54-69.

151. Rosen L.A. A hemagglutination ingibition technique for typing adenoviruses. Am. J. Hyg. 1960,71(1), p.120-128.

152. Rowe W.P. Studies of adenovirus-SV40 hybrid viruses. III. Transfer of SV40 gene between adenovirus types. Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1965, 54(3), p.711.

153. Rowe W.P., Baum S.G. Evidence for a possible genetic hybrid between adenovirus type 7 and SV40 viruses. Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1964, 52, p.1340.

154. Rowe W.P., Huebner R.J., Gilmore L.K., Parrott R.H., Ward T.G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1953, 84, p.570-573.

155. Ruigrok R.W., Barge A., Albiges-Rizo C., Dayan S. Structure of adenovirus fibre. II. Morphology of single fibres. J. Mol. Biol. 1990, 215, p.589-596.

156. Russel W.C., Mcintosh K., Skenel J.J. The preparation and properties of adenovirus cores. J. Gen. Virol., 1971, ll,p.35.

157. Russel W.C., Precious B. Nucleic acid-binding properties of adenovirus structural polypeptides. Ibid. 1982, 63(1), p.69-79.

158. Schneider R.J., Safer B., Munemitsu S.M., et al. Adenovirus VAI RNA prevents phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2 alpha subunit subsequent to infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985, 82, p.4321^1325.

159. Seiberg M., Aloni Y., Levine A.J. Comparison of human and monkey cells for the ability to attenuate transcripts that begin at the adenovirus major late promoter. J. Virol. 1989, 63, p.4093-4096.

160. Schaley J., O'Connor R.J., Taylor L.J., Bar-Sagi D., Hearing P. Induction of the cellular E2F-1 promoter by the adenovirus E4-6/7 protein. J. Virol. 2000, 74, p.2084-2093.

161. Sharp P.A., Moore C., Haverty J.L. The infectivity of adenovirus 5 DNA-protein complex. Virology. 1976, 75, p.442-456.

162. Shaw A.R., Ziff E.B. Transcripts from the adenovirus 2 major late promoter yield a single family of 3'-coterminal mRNAs during early infection and five families at late times. Cell. 1980, 22(5), p.905-916.

163. Shenk T. Adenoviridae: the viruses and their replication. In: Fields Virology, Lippincott Williams&Wilkins, USA, 2001.

164. Shenk T., Flint J. Transcriptional and transforming activities of the adenovirus E1A proteins. Adv. Cancer Res. 1991, 57, p.47-85.

165. Signas C., Akusjarvi G., Petterson U. Adenovirus 3 fiber polypeptide gene: implications for the structure of the fiber protein. J. Virol., 1985, 53(2), p.672-678.

166. Silver L. Anderson C.W. Interaction of human adenovirus serotype 2 with human lymphoid cells. Virology. 1988, 165, p.377-387.

167. Silverman L., Klessig D.L. Characterization of the translational defect to fiber synthesis in monkey cells abortively infected with human adenovirus: role of ancillary leaders. J. Virol. 1989, 63, p.4376-4385.

168. Smith K.O., Gehle W.D., Thiel J.F. Some properties of a small virus associated with adenovirus type 4 (AAV). Fed. Proc. 1966, 25(2) pt.l, p.249.

169. Smith K.O., Gehle W.D. Replication of an adeno-associated virus in canine and human cells with infectious canine hepatitis virus as a "helper". J. Virol. 1967a, 1(3), p.648.

170. Smith K.O., Thiel J.F. Adeno-associated virus studies employing a fluorescent focus assay technique. Proc. Soc. Exp. B. M. 1967b, 125(3), p.887.

171. Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J.Mol.Biol. 1975, 98, p.503.

172. Srinivasan A., Peden K.W., Pipas J.M. The large tumor antigen of simian virus 40 encodes at least two distinct transforming functions. J Virol. 1989, 63, p.5459-5463.

173. Stillman B., Lewis J., Chow L. et. al. Identification of the gene and mRNA for the adenovirus terminal protein precursor. Cell. 1981, 23(2), p.497-508

174. Stillman B.W. The replication of adenovirus DNA with purified proteins. Cell, 1983, 35(1), p.7-9.

175. Subramanian T., Tarodi B., Chinnadurai G. p53-independent apoptotic and necrotic cell deaths induced by adenovirus infection: suppression by E1B 19K and Bcl-2 Proteins. Cell. Growth Differ. 1995, 6, p.131-137.

176. Sundquist B., Everitt E., Philipson L., Hoglund S. Assembly of adenoviruses. J. Virol. 1973, 11(3), p.449-459.

177. Sussenbach J.S., Van der Vliet P.C. The mechanism of adenovirus DNA replication and the characterization of replication proteins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1983, 109, p.53-74.

178. Svensson C., Akusjärvi G. Adenovirus 2 early region 1A stimulates expression of both viral and cellular genes. EMBO J. 1984, 3(4), p.789-794.

179. Svensson C., Akusjärvi G. Adenovirus VA RNA. mediates a translational stimulation which is not restricted to the viral mRNAs. Ibid. 1985, 4(4), p. 957-964.

180. Svensson U., Persson R. Entry of adenovirus 2 into HeLa cells. J. Virol. 1984, 51(3), p.687-694.

181. Tamanoi F., Stillman B.W. Function of adenovirus terminal protein in the initiation of DNA replication. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1982, 79, p.2221-2225.

182. Tamanoi F., Stillman B.W. The origin of adenovirus DNA replication. Curr. Top. Microbiol, and Immunol. 1983, 109, p.73-87.

183. Täuber B., Dobner T. Molecular regulation and biological function of adenovirus early genes: the E4 ORFs. Gene. 2001, 278, p. 1-23.

184. Thomas D.L., Schaack J., Vogel H., Javier R.T. Several E4 region functions influence mammary tumorigenesis by human adenovirus type 9. J. Virol. 2001, 75, p.557-568.

185. Tigges M.A., Raskas H.J. Splice junctions in adenovirus 2 early region 4 mRNAs: multiple splice sites produce 18 to 24 RNAs. J.Virol. 1984, 50, p.106-117.

186. Tihanyi K., Bourbonniere M., Houde A. et al. Isolation and properties of adenovirus type 2 proteinase. J. Biol. Chem. 1993, 268, p.1780-1785.

187. Tomko R.P., Xu R., Philipson L. HCAR and MCAR: the human and mouse cellular receptors for subgroup C adenoviruses and group B coxsackieviruses. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997, 94(7), p. 3352-3356.

188. Trentin J.J., Yabe Y., Taylor G. The quest for human cancer viruses. Science. 1962, 137, p.835-849.

189. Trentin J.J., Van Hoosier G.L.J., Samper L. The oncogenicity of human adenoviruses in hamsters. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1968,127(3), p.683.

190. Tsuzuki J., Luftig R.B. Evidence for the ubiquitous presence of a protein kinase in human adenoviruses capable of preferentially phosphorylating capsid protein Ilia. Intervirology. 1985, 23(2), p.90-96.

191. Van der Eb A.J., Houweling A. Transformation with specific fragments of adenovirus DNAs. II. Analysis of the viral DNA sequences present in cells transformed with a 7% fragment of adenovirus 5 DNA. Gene. 1977, 2(3-4), p.133-146.

192. Van der Vliet P.C., Zandberg J., Jansz H.S. Evidence for a function of the adenovirus DNA-binding protein in initiation of DNA synthesis as well as in elongation of nascent DNA chains. Virology. 1977, 80(1), p.98-110.

193. Van Oostrum J., Burnett R.M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. J. Virol. 1985, 56(2), p.439-448.

194. Van Ormondt H., Galibert F. Nucleotide sequences of adenovirus DNAs. Curr Top Microbiol Immunol. 1984, 110, p.73-142.

195. Vayda M.E., Rogers A.E., Flint S.J. The structure of nucleoprotein cores released from adenovirions. Nucl. Acids Res. 1983, 11(4), p.441-460.

196. Virus Taxonomy. Academic press, USA, 2000.

197. Virtanen A., PetterssonU. O rganization o f e arly r egion 1B of human adenovirus type 2: identification of four differentially spliced mRNAs. J.Virol. 1985, 54(2), p.383-391.

198. Wang K., Pearson G.D. Adenovirus sequences required for replication in vivo. Nucl. Acids Res. 1985, 13(14), p.5173-5187.

199. Weber J., Blonchard J.M., Ginsberg H. et. al. Polyadenylic acid addition and splicing events in early adenovirus mRNA formation. J. Virol. 1980, 33(1), p.286-291.

200. Weber J.M., Dery C.V., Mirza M.A., Horvath J. Adenovirus DNA synthesis is coupled to virus assembly. Virology. 1985, 140, p.351-359.

201. Weber J., Jelinek W., Darnell J.E. Jr. The definition of a large viral transcription unit late in Ad2 infection of HeLa cells: Mapping of nascent RNAmolecules labeled in isolated nuclei. Cell. 1977, 10, p.611-616.

202. Weiss R.S., Javier R.T. A carboxy-terminal region required by the adenovirus type 9 E4 ORF1 oncoprotein for transformation mediates direct binding to cellular polypeptides. J. Virol. 1997, 71,p.7873-7880.

203. White D.O., ScharffM .D., Maizel J. V. The polypeptides o f adenovirus. III. S ynthesis in infected cells. Virology. 1969, 38, p.395.

204. Wickham T.J., Mathias P., Cheresh D.A. et. al. Integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. Cell. 1993, 73(2), p.309-319.

205. Williams J, Grodzicker T, Sharp P, Sambrook J. Adenovirus recombination: Physical mapping of crossover events. Cell. 1975, 4, p. 113-119.

206. Young C.S., Cachianes G., Munz P., Silverstein S. Replication and recombination in adenovirus-infected cells are temporally and functionally related. J. Virol. 1984, 51, p.571-577.

207. Younghusband B. An association between replicating adenovirus DNA and the nuclear matrix of infected HeLa cells. Can. J. Biochem and Biol. 1985, 63(6), p.654-660.

208. Zhang Y., Schneider R. Adenovirus inhibition of cellular protein synthesis and the specific translation of late viral mRNAs. Semin. Virol. 1993, 4, p.229-236.

209. Zock C., Iselt A., Doerfler W. A unique mitigator sequence determines the species specificity of the major late promoter in adenovirus type 12 DNA. J. Virol. 1993, 67, p.682-693.