Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

АБЕРРАЦИИ ХРОМОСОМ У ЛОШАДИ ПРИ НАРУШЕНИЯХ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "АБЕРРАЦИИ ХРОМОСОМ У ЛОШАДИ ПРИ НАРУШЕНИЯХ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ"

На правах рукописи

ШАРАСЬКИНЛ Ольга Геннадьевна

АБЕРРАЦИИ ХРОМОСОМ У ЛОШАДИ ПРИ НАРУШЕНИЯХ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ

Специальность 06.02.01. - «Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт - Петербург 2006

Работа выполнена в проблемкой лаборатории кафедры ветеринарной генетики и животноводства Санкт-Петербургской Государственной академии ветеринарной медицины.

Научный руководитель: Жигачев А.И.

доктор биологических наук, (СПГАВМ)

профессор, заслуженный деятель РФ

Официальные оппоненты: Доктор сельскохозяйственных наук,

профессор, заслуженный деятель науки РФ Завертяев Б.П.

(ГНУ ВНИИГРЖ)

кандидат биологических наук, доцент Митотько В,И.

(СПГАУ)

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт коневодства (ВНИИК)

Защита диссертации состоится Ла&аАишобг. в // часов

на заседании диссертационного совета Д. 006.012.01. по защите докторских диссертаций в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных (ГНУ ВНИИГРЖ) Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 196601, Санкт-Петербург, Г.Пушкин, Московское шоссе, 55-а. Факс: 465-99-85

С диссертацией можно ознакомиться л библиотеке ГНУ ВНИИГРЖ. Автореферат разослан 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

/Г.Н .Сердюк/

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Еще не прошло и половины столетия как Levan А.& Tjio J. (1956) на человеке, Moorhed et al. (I960) на животных успешно апробировали методику культивирования лимфоцитов периферической крови для получения препаратов хромосом. Однако за эти годы на многих видах млекопитающих выполнены сотки исследований, позволившие на новом уровне познать закономерности функционирования наследственности и изменчивости. По сути дела только с бОх годов XX века было установлено истинное число и морфология хромосом, их репродукция у большинства продуктивных (Гольдман И.Л. и др., 1969, Яковлев А.Ф., I9S5) и домашних видов животных, а в последующем выявлены геномные и структурные аберрации в кариотипах.

К сожалению, цитогенетических исследований на лошади крайне мало как в нашей стране, так и за рубежом (Пименова Т.И., 1987, Жигачев А.И., 1996, Bowling, 1997, Kuiper HJ.,2001). В тех же немногих работах, которые были выполнены на лошади показано, что цито генетические методы могут найти применение, прежде всего для выяснения причины нарушения воспроизводительной способности животных (Hainan С, 1982, Жигачев А,И., Богачева Т.В., 1993, Bowling А.Т., 1997, Kuiper Ю„2001), Безусловно, это имеет особую практическую ценность в племенном коневодстве, если еще иметь в виду биологическое малоплодие и значительный интервал между поколениями у этого вида.

По расчетам ВНИИ Коневодства (Калашников В. В., 2003) научно обоснованная потребность в лошадях в стране превышает фактическую численность белее чем втрое и составляет 6,2 млн. голов. В связи с этим значение пито генетических исследований в коневодстве трудно переоценить.

Научная работа выполнена в рамках отраслевой программы СХ: 042, раздел 01.01.6 по теме «Изучение роли наследственности и факторов внешней среды в этиологии врожденных аномалий, нарушений жизнеспособности и плодовитости, животных для разработки методов профилактики отдельных форм патологии и повышения потенциала продуктивности» (Кг гос. регистрации 01ШН 25237).

Цель и задачи исследований

Целью работы является изучение кариогипа, частоты и спектра аберраций у лошадей с нарушениями половых циклов, с фенотипическими отклонениями от нормы, с аномальным потомством для обоснования и разработки принципов цитогенетн чес ко го мониторинга в коневодстве.

Задачи исследований;

- провести морфометрический анализ хромосом лошадей без феноти-пических и физиологических отклонений;

ЦНВ МСХА

фонд N9 —

изучить кариотип лошадей с нарушениями половых циклов, с фенотип ическ и ми отклонениями от нормы, с аномальным потомством;

- определить показатели генетической нестабильности у лошадей с фенотипическими н физиологическими нарушениями;

- выявить животных с дисбалансом половых хромосом

- выявить взаимосвязь изменений кариотипа с фенотипическими и физиологическими отклонениями от нормы.

Научная новизна

Получены данные по показателям хромосомной нестабильности у лошадей с нарушениями половых циклов, с феноти пи ческими отклонениями от нормы, с аномальным потомством.

Приоритетными являются данные о том, что частота хромосомных аберраций у лошадей с физиологическими и фенотип и ческими отклонениями от нормы значительно выше, чем у лошадей без нарушений.

В результате отбора по фенотипу и физиологическим изменениям, выявлены и описаны животные с дисбалансом половых хромосом: 64,ХХ/63,ХО - мозаика Тернера и 64,ХУ/65,ХХУ - мозаика Кляйнфельтера.

Научная и практическая значимость работы

В результате исследований получены новые данные по частной генетике лошади и ветеринарной аитогекетнке.

Полученные данные могут быть использованы: для выявления причин фенотипических отклонений от нормы, нарушений физиологических функций; для цитогенетической диагностики жеребцов и кобыл перед началом племенного использования.

Апробация работы

Основные результаты исследований рассмотрены и обсуждены на отчетах кафедры ветеринарной генетики и животноводства СПбГАВМ в 2002 -2005гг., на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов СПбГАВМ в 2002 - 2005гг., на Всероссийской научно-практической конференции «Искусственное осеменение в коневодстве — истоки биотехнологии в животноводстве» (ВНИИКоневодства РАСХН, 2004).

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 103 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования н обсуждения, выводов, предложений и библиографического указателя (154 названий). Работа иллюстрирована 13 таблицами и 9 рисунками.

Основные полу«еВИяг выносимые на защиту:

- повышенная частота хромосомных аберраций у лошадей с физиологическими и фенотипическими отклонениями от нормы;

- мозаика Тернера 64,ХХ/63,ХО) ее связь с фенотипическими проявлениями.

1 - мозаика Кляйнфельгера 64,ХУ/65,ХХУ, ее связь с фенотип и чески мн проявлениями.

- цитогенетическиЙ мониторинг в племенном коневодстве.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Цитогенетическо му исследованию подверглись животные, принадлежащие частным владельцам и находящиеся в различных конюшнях Ленинградской области, с нарушениями половых циклов, отставанием в росте, крипторхизмом и аномальным потомством. Так же цитогенетнческн й анализ был проведен у двух фенотипически нормальных животных (жеребца и кобылы), от которых получали здоровое потомство. Согласно клиническим анализам все животные были здоровы, на протяжении б последних месяцев, до взятия крови, не болели вирусной инфекцией.

Кобыла Греция была выбрана для исследования, в связи с тем, что у нее отмечались нерегулярные половые циклы. Кобыла не приходила в охоту по 3 - 6 месяцев. Отмечались случаи, когда, придя охоту, она оставалась в состоянии полового возбуждения по 25 - 30 дней, а затем снова следовал длительный перерыв.

Кобыла Валенсия выбрана для исследования в связи с тем, что, по заявлению владельца, впервые в охоту она пришла в возрасте 8 месяцев, половые циклы нерегулярные, отмечается отставание в росте при нормальных условиях кормления и содержания.

Кобыла Хелсора выбрана для исследования, так как у нее наблюдались нерегулярные половые циклы. Кобыла небольшого роста (143 см в холке), при этом у нее удлиненное тело на непропорционально коротких ногах.

Исследование кобылы Трапеза решено было провести в связи с тем, что дважды от нее получали жеребят с признаками атаксии.

Объектом исследования кобыла Форма стала в связи с тем, что все полученные от нее жеребята имели различные аномалии (атаксия, аноф-тальмня и др.)

Цитогенетическое исследование жеребца Наблуса было решено провести в связи с тем, что его рост (140см в холке) гораздо ниже средних показателей по породе (154см).

Жеребец Ремингтон - правосторонний крнпторх. При ректальном исследовании было выявлено абдоминальное расположение крипторхирован-ного семенника.

Жеребец Аморс — правосторонний крипторх. Абдоминальный крип-торхнзм. За 8 лет использования в разведении от него получено 6 жеребят.

Препараты хромосом готовили из клеток периферической крови в проблемной лаборатории ветеринарной генетики Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

Препараты хромосом полуналн путем культивирования лимфоцитов переферической крови по общепринятой методике (Moorhead, Nowell, Mellman et al., 1960).

Анализ препаратов хромосом проводили под микроскопом МБИ — J 5 при увеличении х(ООО в иммерсионной системе и по микрофотографиям.

Микрофотосъемку производили из микросколе МБИ - 15 на пленш: Kodak Academy200 (рис. 1), Fuji SuperialOO и 200, Kodak Professional T400CN, Konica200. Для повышения коиграстности фотоотпечатков использовали зеленый светофильтр ЗС 10; ЗС 8; ЗС 1 (Федин, Барский, 1971). Проявка пленки и печать фотографий производилась в специализированной фотомастерской.

.Для изучения хромосомного набора и аберраций анализировали равномерно окрашенные метафазные пластинки, по 50 - 100 метафаз на каждое животное.

Измерение длины хромосом производили штангенциркулем по микрофотографиям. Вычисляли относительную длину, центромерный индекс хромосом и индекс спирализации. Классифицировали хромосомы согласно стандартной классификации (Levan A. et al., 1964, Графодатскнй А.С и др., 1988). При ка-риотмпической оценке животных руководствовались Методическими рекомендациями исследования хромосом сельскохозяйственных животных (1977).

При построении кариограммы, хромосомы которые нельзя достоверно идентифицировать при рутинной окраске располагались согласно убыванию их линейных размеров.

Полученный материал обработан статистическими методами по Г.ФЛакину (1980), с использованием микрокалькулятора CASIO.

Данные, полученные в ходе исследований, сравнивали с результатами анализа уровня естественного мутирования хромосом в соматических клетках лошадей, полученными Т.И.Пименовой (1987).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Мо рфометри ч ескнй анализ хромосомного набора лошади без физиологических и фенотипнческих отклонений от нормы

Для анализа хромосомного набора лошади исследовали препараты хромосом феиотипнчески нормальных животных, без отклонений воспроизводительной функции. Анализ хромосом производился при рутинном окрашивании. Проанализировано 11 метафаз жеребца и 13 метафаз кобылы. Для анализа использовались только метафазы с полным набором хромосом.

Результат.! представлены в таблице 1.

Согласно мо рфометри ческому анализу Х-хромосома в основном является второй по величине. Хотя в некоторых метафазах Х-хромосома имела почти такие же размеры, как и одна из пары метацентрнческих аутосом. В разных клетках у одной и той же особи относительные размеры

ХгХромосомы были различны. В среднем относительная дайна X-хромосомы составила 6,34% с колебаниями от 5,54% до 7,14%. Центромер-ный индекс Х-хромосомы составил в среднем 42,97% с колебаниями от 42,44% до 43,5%. Эти данные позволяют отнести ее к метацентрыкам.

■ tvI

.■»"J.«!

L • .4- . - • я

4 f,V * г

Щ

■5- • TAJ'- ч

Рисунок 1. Метафазные пластинки снятые на пленку Kodak Academy200.

Достоверная идентификация У-хромосомы при рутинном окрашивании невозможна. При построении кариограммы за У-хромосому принимали один из маленьких акроцентрнков, не имевших пару.

Таблица 1

Результаты морфометрического анализа хромосом лошади без физиологических и фенотипических отклонений

№ хромосомы Относительная длина Центромерный индекс

% <+/-) %

1 7,95 0,7 37,75 0.28

2 5,62 0,59 30,53 0,41

3 5,19 0,5« 28.01 0,34

4 4,89 0,32 33,37 0,4

5 4,45 0,13 36,05 0,51

6 3,97 0,18 38,29 0,42

7 3,68 0,12 46,52 0,43

8 3,6 0,12 39.15 0,5

9 3,44 0,15 41,22 0,44

10 3,17 0,17 43,17 0,44

11 2,57 0ЛЗ 41,38 0,35

12 2,06 0,12 40,44 0,42

13 1,87 0,14 40,28 0,42

14 4,78 0,32 - -

15 4,2 0,11 - -

16 3.62 0,25 - -

17 3.23 0,16 - -

18 2,96 0,12 - -

19 2,74 0,2 - -

20 2,66 0,12 -

21 2,48 0,29 - -

22 2,31 0,15 - -

23 2,06 0,28 - -

24 1,8 0,16 - -

25 1,46 0,24 -

26 1,29 0,17 - -

2 7 1.11 0,21 - -

28 0,99 0,46 - -

29 0,85 0,24 - -

30 0,76 0,35 - -

31 0.72 0,3 - -

X 6,34 0,8 42.97 0,53

У 1,2 0,3 -

i Анализ значений центромерного индекса показал,.что его среднее значение у первой пары аутосом составило 37,75% с колебаниями от 37,47% до 38,03%. В связи с тем, что в 66,6% случаях центромерный индекс превысил значение 37,5% - первую пару аутосом можно отнести к метацеи-трикам (Levan et. al, 1964), но часть хромосом (33,4%) имели субметацентр ическое строение.

Аутосомы с 4-й по 6-й пары имеют субметацеитрическое строение, согласно значениям центромерного индекса.

Аутосомы с 7-Й по 13 пары относятся к метаиентрикам, т.к. их центромерный индекс значительно превышает 37,5%.

3.2. Морфометрический анализ хромосомного набора лошадей имеющих физиологические и фенотип и чес кие отклонения от нормы

Морфометрический анализ хромосом производился для каждого исследуемого животного при рутинном окрашивании. Для этого анализировались метафазы, имеющие полный диплоидный набор хромосом. Вычисляли относительную длину хромосом и центромерный индекс и индекс спиралиэацни.

Исследование восьми лошадей с нарушениями половых циклов, отставанием в росте, крипторхиэмом и двух лошадей с нормальной воспроизводительной функцией и фенотипом, соответствующим породной принадлежности, выявило различие морфометрических показателей.

Анализ морфометрических показателей хромосом исследуемых животных не выявил значительных различий относительной длины хромосом. Выявлены некоторые различия в показателях центромерного индекса, определяющего тип строения хромосом. В основном это касается хромосом 8,12 и 13 пар. У некоторых лошадей с нарушениями, хромосомы восьмой пары, согласно центромерному индексу, имеют метаиентрическое строение, в отличие огг субметацентрического—у нормальных. А хромосомы 12 и 13 пары, в отличие от мепгацентрического строения - у нормальных животных, имеют субметацентрическое. Так же различия встречаются в 4,9,10 парах.

Не было выявлено отклонений в показателях центромерного индекса, определяющего тип строения хромосомы, у кобыл Хелсора и Трапеза, а так же у жеребца Аморс. Наибольшее количество различий в типе строения хромосом выявлено у жеребца Ремингтон (1—5 пары, 8,9 пары) достоверность различия составила Р>0,999, а так же у кобылы Греция - недостоверное различие по б паре, высокая степень достоверности (Р=0,99) по 8 паре, и по 9, 10 паре (Р>0,999).

У остальных животных встречались отклонения от нормы в двух — трех парах хромосом.

Вычисление индекса спирализации проводилось по двум формулам, одна из которых была предложена Т.И.Пименовой (1987). Существенные

различия в показателях наблюдались в тех случаях, когда самой длинной хромосомой оказывалась Х-хромосома, а не хромосома первой пары. Т.И.Пнменова предлагала использовать в вычислениях отношение суммы показателей относительной длины 11,12,13 к показателю длины хромосом первой пары. В этом случае, если хромосомы первой пары оказываются самыми крупными, показатели двух формул приблизительно одинаковы, а если наиболее крупной оказывается Х-хромосома, то разница в значениях формул оказывается существенной.

3.3. Структурные аберрации хромосом у лошадей с физиологическими и фе католически ми отклонениями

Для изучения структурных изменений хромосом-исследовали от 50 до 102 мегафаз для каждой лошади. Учитывали количество мегафаз с аберрациями, общее число аберраций, а так же провели учет хроматид-ных пробелов.

Изучение структурных изменений хромосом у исследуемых лошадей показало, что в большинстве случаев количество мегафаз с аберрациями и количество аберраций на 100 клеток у них выше, чем у животных, изученных Т.И.Пименовой (1987), у которых не наблюдалось каких-либо феноти-' пических и физиологических отклонений (табл. 2).

Таблица 2

Частота и спектр структурных изменений хромосом у лошадей с физиологическими и фенотипическими отклонениями.

лошадь кол-во мета-фаз мегафаз о аберрациями аберрации пробелы

всего на одиночные фраг. парные фрагменты кольцевые

л % п % п % п % п %

Греция 102 7 6,86 14 13,7 6 66,7 3 21,4 5 35,7 5 4,9

Валенсия 54 9 16,6 12 22,2 9 75 3 25 0 0 3 5,55

Хелсора 61 6 9,8 6 9,83 3 50 2 33,3 1 16,7 3 4,92

Форма 30 4 8 6 12 2 33,3 2 33,3 2 33,3 2 4

Трапеза 50 5 10 7 14 3 42,9 4 57,2 0 0 1 2

Ремингтон 58 3 5,2 5 8,62 1 20 2 40 2 40 4 6,89

Наблус 63 8 12,7 14 22,2 5 35,7 6 42,9 3 21,4 4 6,35

Аморс 55 4 7,3 6 10,9 3 50 3 50 0 0 3 5,43

: 9

При сравнении результатов частоты структурных изменений хромосом у коб. Греция, с данными, полученными Т.И.Пнменовой (1987) при анализе уровня естественного мутирования хромосом в сома+ических клетках лошадей, наблюдаются некоторые различия в показателях. Данные коб. Греция сравнивали с результатами анализа лошадей полукровных верховых пород и лошадей спортивной группы, т.к. коб. Греция является полукровной помесью и используется в спорте. Наблюдаются различия по показателю метафаз с аберрациями у коб. Греция (6,86%) и полукровными верховыми лошадьми (3,79%) с высокой степенью достоверности (Р>0,99); при сравнении этого же показателя коб. Греция с лошадьми спортивной группы (5,11%), разница не так велика.

- Разница в частоте аберраций на 100 клеток достоверна (Р>0,999) у коб. Греция (13,7) и полукровных лошадей (3,96), атак же у коб. Греция и лошадей спортивной группы (б,67).

зПри сравнении результатов коб.Валенсня и данных, полученных Т.И.Пнменовой (1987) использовали данные полукровных верховых и чистокровных верховых лошадей, т.к. кобыла является помесью латвийской и чистокровной верховой породы.

" Выявлены значительные различия в количестве метафаз у коб. Валенсия (16,6%) и лошадей полукровных пород (3,79%), и чистокровной верховой породы (4,75%). Разница в обоих случаях значительна и достоверна (РХ),999).

Достоверная разница (Р>0.999) отмечается и при сравнении показателей частоты аберраций на 100 клеток у коб. Валенсия (22,22) с данными полукровных (3,96) и чистокровных (5,75) лошадей.

: Различие так же наблюдается в частоте появления пробелов у коб. Валенсия (5,55%) и лошадей чистокровной верховой породы (7,25%), однако разница в данном случае имеет низкую достоверность (Р<0,9),

4 Так как коб. X ел сора является помесью ахалтекинской и тор и некой пород, сравнение результатов структурных изменений хромосом проводился сданными лошадей ахалтекинской породы и полукровных верховых.

- Имеется разница (Р>0,95) в частоте метафаз с аберрациями коб. Хел-сора (9,8%) и ахалтекинских лошадей (6,33%). При сравнении этого же показателя у коб. Хелсора и полукровных лошадей (3,79%), разница более значительна (Р>0,999).

При сравнении показателя частоты аберраций на 100 клеток коб. Хелсора (9,83) и полукровных лошадей (3,96) обнаруживается значительная разница (РХ),999).

- Результаты, полученные при исследовании частоты структурных аберраций, коб. Форма сравнивались с данными чистокровных верховых лошадей.

Частота метафаз с аберрациями у коб. Форма (8%) выше таковой у лошадей чистокровной верховой породы. Разница достоверна (Р>0,98).

Достоверное различие (Р>0,999) наблюдается в показателях частоты аберраций на 100 клеток у коб.Форма{12) и чистокровных лошадей (5,75).

Разница наблюдается в частоте появления пробелов у коб. Форма (4%) и лошадей чистокровной верховой пород (7,25%), с достоверностью Р>0,95.

Результаты кариотилирования коб. Трапеза сравнивали с данными орловских рысистых лошадей.

Достоверное различие (РХ),999) наблюдается в показателях частоты метафаз с аберрациями коб. Трапеза (10%) и орловских рысистых лошадей (3,82%). Такой же результат получен при сравнении показателей частоты аберраций на 100 клеток. У коб.Трапеза (14) этот показатель превышает таковой у орловских рысистых лошадей (4,39).

Разница в частоте пробелов у коб.Трапеза (2%) и орловских рысистых лошадей (3,09%) недостоверна (Р<0,9).

При сравнении показателей жер.Реминггон с данными полукровных верховых лошадей и лошадей спортивной группы, обнаружено: достоверное различие (Р>0,999) в частоте аберраций на 100 клеток жер.Ремииггон (8,62) и полукровных (3,96). Достоверная разница (Р>0,98) наблюдается при сравнении этого же показателя С данными лошадей спортивной группы (6,67).

Различие в показателях частоты метафаз с аберрациями жер. Ремингтон (5,2%) С данными полукровных лошадей (3,79%) недостоверно (Р<0,9). Этот показатель у Ремингтона очень близок к таковому у спортивных лошадей (5,11%).

Жер. Наблус относится к арабской чистокровной породе лошадей. В работе Т.И.Пименовой (1987) исследование арабских лошадей не проводилось, поэтому показатели частоты хромосомных аберраций жер.Наблус сравнивали с показателями чистокровных верховых, ахалтекинских и полукровных лошадей. Частота метафаз с аберрациями у жер. Наблус (12,7%) значительно превышает таковую у чистокровных верховых (4,75%), ахалтекинских (633%), полукровных лошадей (3,79%) с высокой степенью достоверности (Р>0,999).

Частота аберраций на 100 клеток так же оказалась значительно выше у жер. Наблус (22,22) чем у чистокровных верховых (5,75), ахалтекинских (11,39) И полукровных верховых (3,96) лошадей (Р>0,999).

Значительная разница в частоте пробелов (Р>0,9) наблюдалась у жер.Наблус (6,35%) и ахалтекинских лошадей (3,8%). С чистокровной верховой (7,25%) и полукровной (5,68%) разница незначительна и недостоверна (Р<0,9).

При сравнении результатов частоты и спектра аберраций жер. А морс, использовали данные полукровных верховых лошадей. Различие наблюда-

ется в показателях частоты метафаз с аберрациями и частоты аберраций на 100 клеток (Р>0,999), у жер. Аморс значение этих показателей выше, чем у полукровных лошадей.

При разделении исследованных лошадей по группам: крипторхи, кобылы с неполноценными половыми циклами, кобылы с аномальным (атаксия) потомством; обнаружена достоверная разница в частоте аберраций на 100 клеток между крипторхами и кобылами с неполноценными половыми циклами, у которых этот показатель значительно выше (табл. 3). В целом же, у крипторхов, самые низкие показатели структурных мутаций по сравнению с другими групппами изученных животных, за исключением частоты пробелов (6,17%).

Таблица 3

Частота структурных изменений хромосом у лошадей различных групп

группа животных кол-во метафаз метафаз с абер-рац. аберрации пробелы

л % Всего на 100 клеток п %

крипторхи 113 7 6,25*1,05 И 9,77*1,14 3,5 6,17*0,72

кобылы с нарушен. ПОЛОВЫХ цик'дов 217 22 10,1*2,88 32 15,25*3,66 3,6. .5,12*0,13

кобылы с аномалья. потомством 100 9 9,0 ±1,0 13 13,0±1,0 и 3,0± 1,0

разница крипторхи - коб.с нарушением половых циклов 3,9* 5,48** 1,05*

разница крипторхи - кобылы с аномальным потомством 2,75» 3,23* 3,17*

разница кобылы с нарушением половых циклов - коб. с аномальным потомством 1,15* 2,25* 2,12*

* - разница недостоверна

** - Р>0,93

При сравнении этих же показателей в группах «животные с нормальным ростом» и «животных с отставанием в росте», у последних метафаз с аберрациями оказалось достоверно больше (табл. 4). Таким образом, мож-

но предположить, что задержка в росте так -же может быть обусловлена повышенной частотой аберраций.

Таблица 4

Частота структурных изменений хромосом у лошадей с нормальным ростом и с отставанием в росте

группа животных кол-во метафаз метафаз с аберрациями аберрации пробелы

п % Всего на 100 клеток л %

лошади с отставай нем в росте 178 23 12,9 ±1,9 32 18,09 ±4,13 10 5.6 ±0,4

лошади с нормальным ростом 315 23 7,3 ±0,8 38 11,84 ±0,98 15 4,7 ±0,7

разница 5,6** 6Л5"* 0,9

**- Р>0,95

- Р=0 9

При анализе структурных аберраций в метафазах некоторых лошадей были обнаружены кольцевые хромосомы. Причем, у лошадей с дисбалансом половых хромосом, их частота составила 40% - у жер. Ремингтон, 35,71% - у коб. Греция от общего количества структурных аберраций. Это самые высокие показатели из всех полученных. Т.И.Пименова (1987) в своих исследованиях кольцевых хромосом не обнаружила.

Цитогенетический анализ хромосом кобыл, от которых неоднократно получали потомство с атаксией и другими аномалиями, выявил высокую частоту структурных аберраций по сравнению с уровнем спонтанного хромосомного мутирования у лошадей, приведенный Пнминовой Т.И. (1987). По остальным показателям эти лошади не имеют существенных различий.

3.4. Геномные мутации у лошадей с физиологическими и фенотип и чески ми нарушениями

Для определения анеуплоидии нами изучались клетки с числом хромосом 2п ± 2, т.е. с набором от 62 до 66 хромосом. Анализ геномных нарушений проводился для каждой лошади отдельно. Частота гипердиллоидных, г и полиплоидных и полиплоидных клеток представлены в таблице (табл. 5).

Для определения геномных нарушений у коб.Валенсыя исследовалось 49 диплоидных метафаз с 2п±2. Из них анеуплоидными оказались 4 (8,16%) клетки. Эти (слетки были представлены гиполиплоидами, 4,8% клеток с 2л-1 и 4,8% клеток с 2п-2.

Таблица 5

Частота геномных мутаций у лошадей

лошадь кол-во метафаз подробно просмотр. кол-во метафаз 2п=64 анеуплоидные

анеунлоид-ных метафаз 2(1-17-2 гаполиплоидных метафаз 2п-1 гипердиплоидных метафаз 2п+1

п % -п % п % п %

Греция 85 53 62,35 32 37,65 29 34,1 0 0

Валенсия 49 45 91,84 4 8,16 2 4,08 0 0

Хелсора 51 47 92,16 4 7,В4 3 5,88 1 1,96

Форма 43 42 97,68 1 2,32 1 2,32 0 0

Трапеза 40 39 97,5 1 2,5 I 2>5 0 0

Ремингтон 50 39 77 11 22 2 А 9 18

Наблус 52 49 94,23 3 5,77 1 1,92 2 3,84

А морс 48 46 95,84 2 4,16 2 4,16 0 0

При построении кариограмм из метафаз с 2п = 63, обнаружили, в одном случае отсутствие одного маленького акроцентрика, и в другом — отсутствие одного большого метацентрика, предположительно Х-хромосомы.

Гипердиплоидных клеток, как и полиплоидных у коб.Валенсия не обнаружено.

Из 51-й диплоидной метафазы коб, Хелсора 4 (7,84%) оказались с измененным набором. Из них в Зх клетках (5,83%) наблюдалось отсутствие одной хромосомы, т.е. диплоидный набор этих клеток составил 2п-1. Причем в двух клетках отсутствовали большие метацентрики, а в одной - маленький акроцектрик. Была так же обнаружена одна клетка (1,96%) с ги-лердиплонАиым набором 2п+1. Лишней оказалась хромосома средней величины, метацентри чес кого строения.

У коб.Форма анализировали 42 метафазы, с целью обнаружения анеу-плоидных клеток. Была обнаружена только одна клетка (2,32%) с числовым нарушением. В метафаэе с геномным нарушением отсутствовала одна ак-роцентрическая аутосома средней величины. Гнпердиплоидных клеток у коб. Форма обнаружено не было.

Из всех исследованных клеток коб. Трапеза только 40 оказались с набором хромосом 2п±2. Из которых, только одна клетка (2,5%) была анеуп-лоидной с недостающей одной хромосомой. При раскладке гиподиплоид-ной метафазы по парам гомологов обнаружено, что недостает одной субме-

та центрической хромосомы средней длины.> Гипердиплоидных и полиплоидных клеток у коб. Трапеза не обнаружено.

При исследовании пятидесяти двух метафаз жер .Наблус, было обнаружено 3 (5,77%) с анеуплоидным набором. Из которых, одна метафаза (1,92%) была гилодиплоидной, с отсутствующей акроцекгрической аутосомой среднего размера. Две клетки (3,84%) содержали лишние хромосомы 2п=б5. В одном случае лишней оказалась маленькая акроцентрическая хромосома, а в другом - тоже метаиентрик, но несколько большего размера.

У жер. Аморс было проанализировано 48 метафаз с набором 2п±2, Лнеуплондные метафазы составили 4,16%, Все они были представлены гипоплондами с хромосомным набором 2п-1, всего 2 клетки. При раскладке хромосом из гиподиплоидных метафаз по парам гомологов выявлено отсутствие маленьких акроцентриков в обоих случаях.

У двух исследованных лошадей были обнаружены существенные числовые изменения кариотнпа.

У коб.Греция было проанализировано 85 метафаз с набором 2п±2. Количество анеуплоидных метафаз составило 37,65%, из которых 90,6% пришлось на гнполиплоиды. Основное количество гиподиплоидных метафаз составили клетки с набором 2п-1, т.е. содержащие по 63 хромосомы. Таких клеток обнаружено 34,1% от общего числа исследованных метафаз.

Для построения кариограммы использовали равномерно окрашенные метафаэные пластинки с нормальным диплоидным набором (2п 1164) и метафазы с неполным набором (2п = 63). Кариограмму составляли, опираясь на морфомстрические показатели хромосом.

При построении кариограммы и раскладке хромосом по парам гомологов для коб.Греиия из метафаз с гнполиплоидным набором (2п = 63), была обнаружена только одна половая Х-хромосома (рис. 2). Второй крупный метаиентрик отсутствовал. В клетках с нормальным набором (2п = 64), обе Х-хромосомы присутствовали.

В нашем случае кобыла мозаика имела, в общем, нормальный фенотип, единственным, что выделяет ее из основной массы лошадей — достаточно высокий рост (172 см) в холке. Нерегулярность и неполноценность половых циклов у данной кобылы является характерной картиной для данного типа хромосомного дисбаланса. Не исключена возможность фершль-ности данной кобылы, но успешное использование в воспроизводстве однажды не гарантирует последующее плодотворное осеменение.

У жер. Ремингтон было исследовано 50 метафаз с набором 2п±2, Из них с числовыми нарушениями оказалось 11 клеток (22%). В двух метафа-зах (4%) наблюдалось отсутствие хромосом 2п-1. В обеих отсутствовали метацентрические хромосомы средней длины.

П ¡и Ь п и «1 яг

I* и

16 йЬ вй ^ 31 04 АД & Я * I ял ДА * *

44* * А «> *

Рисунок 2. Хромосомы коб. Греция, 63,ХО,

В девяти клетках (18%) хромосомный набор оказался гипердиплоидным (рис. 3). В каждой такой метафазе присутствовала одна лишняя хромосома. При построении кариограммы из гиперднллолдных метафаз, обнаружили присутствие лишней, достаточно крупной, метацентричсской хромосомы. Можно предположить, что это дополнительная половая X-хромосома. В случае с жер. Ремингтон можно говорить о мозаициэме 64,ХУ/65,ХХУ, так называемая мозаика Кляйнфельтера.

ВД 1» «Я *л »и. **

Л * АР К¥

СП Л» О о о* о ~ л*

Й">

а»

«X -

Рисунок 3. Хромосомы жер. Ремингтон, 65,ХХУ.

В литературе лошадей с таким кариотипом до сих пор описано не было. У людей мозанцизм с такой комбинацией половых хромосом встречается в 10% случаев синдрома Кляйнфельтера. Возможно, что такое состояние встречается чаще. Так, Paulsen и соавторы (1968) при обследовании шести индивидов 4б,ХУ/47,ХХУ, у которых был выявлен мозанцизм в тестику-лярной ткани, обнаружили, что только у трех из них мозанцизм выявлялся в лимфоцитах (Симпеон Дж., 1985).

Возможно, что у лошадей может наблюдаться такая же картина, и именно поэтому до сих пор не было обнаружено и описано случаев 64.ХУ/65.ХХУ.

В клинической картнне у 46,ХУ/47,ХХУ реже, чем у 47.ХХУ индивидов встречается гинекомастия, азооспермия, недоразвитие яичек. Уровень тестостерона выше у 4б,ХУ/47,ХХУ пациентов, а в биоптагте яичек обнаруживаются зрелые формы сперматозоидов (Симпеон Дж., 1985). Таким образом, недоразвитие одного из семенников у нашего жеребца, его нормальное половое поведение, вполне соответствует клинической картине, характерной для такой мозаики. При работе с данной лошадью хозяевами отмечалась некоторая «туповатость», неусидчивость, что так же может являться следствием хромосомного нарушения. У людей с синдром Кляйнфельтера отмечается умственная отсталость, низкий коэффициент интеллекта (Simpson, 1979).

Полиплоидных клеток у исследуемых животных обнаружено не было.

ВЫВОДЫ

1. В норме кар йот и п лошади содержит 64 хромосомы: 13 пар мета- и субметацентрических, IS пар акроиентрическнх, пара половых хромосом. Первая пара, как правило, самая крупная мета- или субметацентрического строения. Вторая и третья пара — крупные субметацеитрик и. Хромосомы 4 - 6 пары су бметаце нтрического строения. Хромосомы 7-13 пары - мета-центрического строения. Х-хромосома — крупный метацентрик второй или первый по величинне. У-хромосома — маленький акроцентрик.

2. При сплошном окрашивании достоверно можно определить первую (крупный метацентрик), вторую (крупный субметацентрик) пару хромосом, четырнадцатую пару (крупный акроцентрик) и половую Х-хромосому. Рутинное окрашивание дает возможность анализировать геномные и некоторые структурные нарушения.

3. У лошадей с физиологическими и фенотипическими отклонениями от нормы, хромосомная нестабильность оказалась значительно выше, чем у лошадей в норме. Частота клеток с аберрациями колебалась от 5,2% до 16,6%. Уровень аберраций на 100 клеток находился в пределах от 8,62 до 22,22. У некоторых животных обнаружены кольцевые хромосомы. Полиплоидных клеток не выявлено.

4. У кобыл с нарушениями половых циклов частота хромосомных аберраций оказалась самой высокой по сравнению с жеребцами-крипторхами (Р>0,95) н кобылами с аномальным потомством. Частота метафаз с аберрацииями составила 10,15+/-2,88%. Уровень аберраций на 100 клеток- 15,25+АЗ,66.

5. В группе лошадей с отставанием в росте частота хромосомных нарушений выше, чем у животных с нормальным ростом (Р>0,95). Частота клеток с аберрациями у лошадей с отставанием в росте составляет 12,9+/-1,9%, уровень аберраций на 100 клеток - 18,09+7-4,13.

6. Выявлена кобыла с дисбалансом половых хромосом, 2п" 64,ХХ/63,ХО. Соотношение клеток в кариотипе: 64,63% - содержат нормальный 64,ХХ набор, 35,37% - с отсутствием Х-хромосомы (63,ХО). Кобыла имела фенотипические отклонения от нормы в росте — высота в холке 172 см., претив 163 — 165 см. в среднем по породе и нарушения половых циклов,

7. Выявлен жеребец - с аномальным карнотипом, 2И* 64,ХУ/65,ХХУ. Клеток с нормальным мужским карнотипом - 81,25%, клеток с лишней X-хромосомой - 13,75%. Жеребец - абдоминальный крипторх, с нормальным половым рефлексом, плохо обучаемый в работе.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

К Лошадей, имеющих отклонения вроете и развитии, с нарушениями половых циклов, рекомендуется проверять на наличие хромосомных аберраций.

2. Осуществлять цитогенетическую аттестацию жеребцов, перед их использованием в воспроизводстве и кобыл перед зачислением в производящий состав.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Шараськина О.Г. Особенности кариотмпа лошади и использование цнтогенетического анализа в диагностике бесплодия //Мат. 53-й науч. конф. молодых ученых и студентов СПбГАВМ. - СПб. - 2004. - С. 81 - 82.

2. Жигачев А. И., Шараськина О.Г. Практическое значение цитогенетнческих исследований в коневодстве //Учен. зап. Витебской гос. академии вет, медицины. - Витебск. - 2004. - Т.40, ч.2. - С. 84 - 86.

3. Жигачев А.И., Богачева Т.В., Шараськина О.Г. Цитогенетический мониторинг при разведении племенных лошадей //Сборник докл. научн,-практич. конференции и координац. совещания, поев. ЮО-летию со дня рождения Скаткина П,Н. «Искусственное осеменение в коневодстве -истоки биотехнологии в животноводстве». - Дивово. — 2004. - С. 73 — 76.

Подписано в печать 06.12.2005 Формат 60 х 84 1/16. Бумага офсетная Объем I п.л. Тираж 100 жз. Заказ № 39 Издательство СПбГАВМ, Черниговская, 5.