Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка методов молекулярной оценки селекционного материала основных овощных культур (лук, морковь, капуста белокочанная) на основе RAPD технологии

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Лаптева, Марина Николаевна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

ЛАПТЕВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОЦЕНКИ СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ОСНОВНЫХ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР (ЛУК, МОРКОВЬ, КАПУСТА БЕЛОКОЧАННАЯ) НА ОСНОВЕ ЯАРБ ТЕХНОЛОГИИ

Специальность: 06.01.05 - СЕЛЕКЦИЯ И СЕМЕНОВОДСТВО

На правах рукописи

УДК 635.64:575.2:631.52

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научные руководители:

академик РАСХН, доктор сельскохозяйственных наук,

профессор В.Ф. Пивоваров;

кандидат биологических наук Д.Б. Дорохов.

Москва-1999

СОДЕРЖАНИЕ

12

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Использование морфологических и биохимических признаков в геномной идентификации растений. 8

1.2. Молекулярные маркеры на основе ДНК в геномной идентификации растений

1.2.1. RFLP технологии и их использование в геномной идентификации растений. 13

1.2.2. PCR технология и методы разработанные на ее основе

геномной идентификации растений. 15

1.2.3. RAPD метод. 18

1.2.4. Оценка различных методов молекулярного маркирования

в сравнении с RAPD методом. 22

1.2.5. Методы выделения ДНК из растительных тканей. 25

27

1.2.6. Оптимизация условий проведения PCR со случайными праймерами.

1.3. Области применения RAPD технологии. 31

1.3.1. Картирование признаков и генетические карты. 31

1.3.2. RAPD маркеры в оценке биоразнообразия зародышевой

плазмы. 32

1.3.3. RAPD маркеры в сортовой идентификации и

семенном контроле. 33

1.4. Таксономия рода Allium и изучение филогенетических связей между видами на основе морфологических и цитологических признаков. 36

1.5. Межвидовая гибридизация и ее значение в селекции лука. 40 2. Молекулярно-биологические исследования лука в анализе

филогенетических связей и прикладных аспектах селекции и семеноводства. 43

3. Андрогенез и гиногенез в создании исходного материала для гетерозисной селекции моркови и методы его оценки на выравненность. 47

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 53

2.1. Растительный материал. 53

2.2. 808-электрофорез запасных белков семян в полиакриламидном геле. 54

2.3. Выделение геномной ДНК. 56

2.4. Амплификация геномной ДНК. 5 6

2.5. Электрофорез в агарозном геле и визуализация продуктов амплификации. 57

2.6. Математическая обработка полученных данных. 58 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 59

3.1. Микрометод выделения геномной ДНК для КАРЭ анализа

и характеристика полученных препаратов. 59

3.2. ЯДРО технология: оптимизация и подбор условий

проведения ПЦР. 60

3.2.1. Обсуждение результатов. 64

3.3. Геномная идентификация в изучении культурного и

дикого ассортимента луков. 66

3.3.1. Подбор праймеров. 66

3.3.2. ЯАРО анализ в изучении межвидового и внутривидового полиморфизма луков. 69

3.3.3. ЫАРО анализ в сортовой идентификации. 74

3.3.4. Обсуждение результатов. 77

3.4. Биохимическая и молекулярная оценка коммерческих партий

семян. 83

3.4.1. Сравнительный анализ эффективности использования биохимических методов и ЯАРБ технологии в оценке коммерческих партий семян лука. 83

3.4.2. КАРБ технология в сортовой идентификации и оценке коммерческих партии семян капусты белокочанной. 91

3.4.3. Обсуждение результатов. 96

3.5. Анализ межвидовых гибридов лука. 97

3.5.1. Использование RAPD технологии в анализе межвидовых гибридов. 97

3.5.2. Обсуждение результатов. 98

3.6. Молекулярная оценка выравненности линейного материала моркови, полученного с использованием культуры in vitro. 104

3.6.1. Подбор праймеров. 105

3.6.2. Молекулярный анализ андрогенных растений моркови

RAPD методом. 108

3.6.3. Молекулярный анализ гиногенных растений моркови

RAPD методом. 116

3.6.4. Обсуждение результатов. 117 ВЫВОДЫ 120 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 121 ПРИЛОЖЕНИЕ 147

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одной из наиболее важных проблем в селекции и семеноводстве овощных культур является идентификация сортов и гибридов. Особенно это актуально для культур с перекрестным способом опыления, таких как: луки, морковь, капуста. Традиционно в качестве основных критериев оценки селекционного материала используются морфологические признаки. Однако различия между сортами по этим признакам не всегда достаточно четкие, оценка проводится, как правило, на взрослых растениях, получение которых требует немалых производственных затрат и времени. Поэтому, в последние годы, все чаще для решения практических задач используются методы молекулярно-генетических исследований растений (электрофорез запасных белков, изоферментов, методы анализа ДНК на основе М<ЪР- и КАРЭ-технологий). В связи с этим особый интерес представляет НАРБ-технология как эффективный метод анализа растительного генома. Она достаточно проста в исполнении, процесс автоматизирован, требует небольшого количества времени и растительного материала для анализа, вне зависимости от стадии развития самого растения. Стандартизация экспресс-методов выделения ДНК и условий проведения ИАРО анализа обеспечивают воспроизводимость и достоверность получаемых данных. Использование ЯАРБ технологии в геномной идентификации и паспортизации селекционного материала все чаще находит применение в оценке генетического разнообразия культурных растений и их диких сородичей, в реконструкции родословных, в подборе родительских пар и оценке гибридного потомства, в анализе новых форм, создаваемых с использованием биотехнологических приемов (соматический эмбриогенез и техники эмбриоспасения при отдаленной гибридизации, гино- и андрогенез), в совершенствовании методов семенного контроля. Данная технология впервые создала предпосылки для детального изучения природы хозяйственно ценных признаков, генетического картирования отдельных генов и для реализации программ, связанных с регистрацией новых селекционных достижений и защитой авторских прав селекционера.

Внедрение в практику молекулярно-генетических методов исследования растительного генома и ДНК «фингерпринтинга» призвано повысить эффективность селекционного процесса и сделать его более направленным.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы было разработать методы идентификации селекционного материала основных овощных культур (лук, морковь, капуста белокочанная) на основе RAPD технологии.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. создать коллекции геномной ДНК исследуемых культур

2. оптимизировать условия проведения полимеразной цепной реакции и системы праймирования для каждой из исследуемых культур в решении конкретных задач

3. провести молекулярный анализ геномной ДНК отдельных видов и сортопопуляций лука

4. исследовать уровень интрогресии геномов при отдаленной гибридизации луков

5. на основе RAPD технологии разработать методику оценки коммерческих партий семян лука репчатого и капусты белокочанной на сортовую принадлежность и сортовую чистоту

6. с помощью RAPD технологии провести молекулярный анализ гиногенных и андрогенных растений моркови, оценить степень их гомогенности и выравненности, а также рассмотреть зависимость этих показателей от происхождения растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников in vitro

Научная новизна результатов исследований. Оптимизированы условия проведения полимеразной цепной реакции и подобраны системы праймирования для каждой из исследуемых культур в решении конкретных задач. На основании данных RAPD анализа уточнена филогения отдельных видов рода Allium и показана эффективность данного метода в изучении популяций диких видов лука. Впервые дана молекулярная характеристика межвидовых гибридов лука в процессе беккроссирования и линейного материала моркови, полученного с использованием культуры in vitro.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработана быстрая технология RAPD анализа селекционного и семенного материала таких овощных культур как лук репчатый, чеснок посевной, капуста белокочанная, а также исходного материала для селекции лука и моркови. С помощью RAPD технологии проведены сортовая идентификация и оценка коммерческих партий семян лука репчатого и капусты белокочанной на сортовую принадлежность и сортовую чистоту. Молекулярные маркеры, полученные на основе ДНК амплификации, эффективны при

оценке коммерческих партий семян и должны служить средством правовой защиты селекционных достижений.

Опубликованы «Краткие методические указания по использованию RAPD маркеров для оценки генотипов луковых культур» в составе «Методических указаний по селекции луковых культур» (Москва: Издание РАСХН, 1997), которые предложены для использования в селекционной практике.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Актуальные проблемы растениеводства и животноводства», Москва, 1996; Международной конференции «Молекулярно-генетические маркеры растений», Ялта, 1996; Международной конференции «Агробиотехнология растений и животных», Киев, 1997; на Втором международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения», Пущино, 1997; Международном симпозиуме «Гетерозис у сельскохозяйственных растений», 1997; VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда», Москва, 1997; Научной сессии «Новые методы селекции и создание адаптивных сортов сельскохозяйственных культур: результаты и перспективы», Киров, 1998.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Долгое время процесс создания того или иного сорта или гибрида оставался длительным и трудоемким процессом, успех которого во многом определялся трудолюбием и интуицией селекционера. До сих пор основными характеристиками при описании селекционного материала остаются морфологические признаки и реакции на целый ряд патогенов и насекомых-вредителей. При этом не всегда удается объективно оценивать генетически обусловленные особенности генотипа, популяции, сорта, сравнивать их между собой, а также планировать подбор пар для скрещивания и контролировать направление селекционного процесса. Поэтому в последние годы ведется интенсивный поиск эффективных способов анализа и все шире для этих целей используются дополнительные, нетрадиционные методы анализа: физиолого-биохимические и, в особенности, молекулярные методы исследования растительного генома по ДНК (КРЬР, ЯАРО, 88К-РСЯ и др.), а также молекулярные маркеры, полученные на их основе. Использование принципов и методов маркирования в молекулярно-генетических исследованиях впервые создало предпосылки к маркированию важных селекционно-значимых признаков, изучению их генетической основы и наследуемости. Это позволяет сделать селекционный процесс более направленным при создании новых форм, обладающих рядом ценных признаков, открывая широкие перспективы для повышения эффективности селекционной работы и ускорения темпов селекционного производства.

Молекулярные методы анализа растительного генома, геномной идентификации имеют также важное биологическое значение, так как являются ценным источником информации о филогении, структуре популяций, видов и о процессах формообразования в них протекающих, а также для сохранения и рационального использования генетических ресурсов культурных растений.

1.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ В ГЕНОМНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАСТЕНИЙ.

Традиционно в селекционной практике в качестве генетических маркеров используются морфологические признаки, а также физиолого-биохимические (содержание и состав различного рода соединений). Однако число таких признаков ограничено и большинство из них, в зависимости от условий среды, может

варьировать в широких пределах. Случаи сцепленности морфологического признака с тем или иным хозяйственно-важным признаком крайне редки. Эти особенности морфологических и биохимических признаков снижают их информативную ценность при геномной идентификации и паспортизации селекционного материала.

Использование в качестве фенотипических признаков электрофоретических спектров белков существенно расширили рамки генетического маркирования. Белковый признак в меньшей степени подвержен фенотипическим изменениям, так как путь от гена до белкового признака значительно короче, чем до морфологического или обычного биохимического и, следовательно, является более надежным генетическим маркером. Совокупность таких белков-маркеров отражает структуру генома, специфику генотипа и широко используется для идентификации сортов, биотипов и видов растений (Конарев, 1983, 1993; Созинов, 1985). Выбор белка-маркера и метода его оценки зависит от конкретных целей и задач исследования. Для сортовой идентификации и решения ряда проблем селекции и семеноводства эффективными генетическими маркерами являются полиморфные запасные белки семян и изоферменты растений.

Анализ запасных белков наилучшие результаты показал при идентификации селекционного материала и в семенном контроле ряда зерновых и зернобобовых культур таких как: пшеница (Конарев, 1973, 1980, 1987), ячмень (Поморцев, 1982; Поморцев, Нецветаев, Созинов, 1985), рожь (Пенева, Мартыненко, 1987), горох (Тарлаковская, 1987; Калинина и др.,1988), фасоль (Lioi, 1989). Запасные белки овощных культур оказались менее эффективны в качестве маркеров и не получили такого широкого применения при оценке селекционного материала, так как с помощью электрофореза удается регистрировать преимущественно видовую и надвидовую изменчивость. На овощных культурах полиморфизм запасных белков использовался в систематике и филогении луков (Гаврилова, 1969; Maaß, 1992), при изучении сортов и гибридов лука в связи с гетерозисом (Брежнев и др., 1971), в видо-и сортоидентификации (лук, огурец, дыня) (Nakamura, Tahara, 1977), в сортовой идентификации и семенном контроле у представителей рода Cucurbita (Кононков и др., 1989; Методич. указания, 1990), идентификации сортопопуляций и инбредных линий моркови (Калинина и др., 1990).

Наряду с запасными белками, в качестве биохимических маркеров используются изоферменты растений, многие из которых представляют собой многокомпонентные, генетически полиморфные системы. Небольшие количества растительного материала для экстракции, значительное число растений анализируемых в день, несложная технология проведения анализа, кодоминантный характер наследования и информативность - достоинства, сделавшие этот метод исследования очень популярным среди генетиков, селекционеров и ботаников. Дополняя традиционные методы селекции, изоферменты расширили спектр генетически исследуемых признаков и оказали существенное влияние на проведение генетико-селекционных исследований таких как: таксономия, оценка генетического разнообразия селекционного материала, паспортизация, сортовая идентификация, анализ межвидовых и внутривидовых скрещиваний, оценка гибридности и семенной контроль (Nielsen, 1985; Левитес, 1986; Weeden, 1989).

Впервые использование изоферментных фенотипов было предложено более тридцати лет назад (Brewbaker, 1966) для сортовой идентификации и результаты работ, посвященных этой проблеме рассмотрены в обзорах Nielsen (1985) и Weeden (1989). Было установлено, что генетические различия между сортами могут регистрироваться в полиморфизмах аллозимных спектров, и изоферментные фенотипы могут быть использованы для идентификации и различения сортов, так, например, с помощью изоферментных фенотипов были идентифицированы сорта и линии редиса (Нарбут и др., 1974; Saharan et al., 1991). Большую практическую значимость изоферментный анализ имеет в оценке генетической чистоты коммерческих партий семян гетерозисных гибридов F] (Arus, 1983) и защите авторских прав (Bailey, 1983). Контроль за уровнем гомозиготности изоферментных локусов у исходных линий, полученных путем инбридинга или in vitro технологий андро- и гиногенеза является весьма эффективным для ускорения гетерозисной селекции (Orton, 1983; Cum, 1995; Campion et al., 1995; Bohanec et al., 1995). Тестирование исходных линий и гибридов F} успешно проводилось на разновидностях Brassica oleracea (Arus et al., 1982), тыкве (Ignart, Weeden, 1984), редисе (Kim, Park, 1984), китайской капусте (Xiaoying, Yan, 1994).

На овощных культурах изоферментный анализ различных ферментных систем использовался для оценки филогенетических связей видов рода Cucumis (Esquinas,

1981; Perl-Treves et al., 1985), видов рода Brassica (Coulhart, Denford, 1982), видов лука (Hadacova et al., 1983; Maaß, 1997), разновидностей сельдерея (Arus, Orton, 1984); для оценки биоразнообразия генетических коллекций чеснока (Pooler, Simon, 1993; Simon, 1994; Maaß, Klaas, 1995), лука репчатого (Rouamba et al., 1993), образцов капусты кочанной (Phippen et al., 1997).

Как генетические маркеры, изоферменты привлекались для маркирования моногенных признаков: устойчивости к нематоде у томата (Rick, Fobes, 1974), устойчивости гороха к вирусу желтой мозаики (Hunt, Barnes, 1982), а также при работах по созданию генетических карт салата латук (Landry et al., 1987), моркови (Westhai, Wrike, 1989, 1991; Shulz et al., 1994), огурца (Knerr, Staub, 1992; Kennard et al., 1994), дыни (Meglik et al., 1994).

Другим способом при�