Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЗАВИСИМОСТЬ СПОНТАННОГО И ИНДУЦИРОВАННОГО ОБЛУЧЕНИЕМ МУТАГЕНЕЗА У SACCHAROMYCES CEREVISIAE ОТ ФАЗЫ РОСТА И ФАЗЫ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "ЗАВИСИМОСТЬ СПОНТАННОГО И ИНДУЦИРОВАННОГО ОБЛУЧЕНИЕМ МУТАГЕНЕЗА У SACCHAROMYCES CEREVISIAE ОТ ФАЗЫ РОСТА И ФАЗЫ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА"

А'29033

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ ГОСАГРОПРОМА СССР

УДК 577.391 На правах рукописи 19-88-762

ЧЕПУРНОЙ Александр Иванович

ЗАВИСИМОСТЬ СПОНТАННОГО И ИНДУЦИРОВАННОГО ОБЛУЧЕНИЕМ МУТАГЕНЕЗА у ЗАССНАНОАГССЕв СЕВЕУ181АЕ ОТ ФАЗЫ РОСТА И ФАЗЫ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

Специальность: 03.00.01 - радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа внпышена в Объединенном институте ядервнх исследований.

Научннй. руководитель

доктор биодогичвскиг наук, профеосор В.И.Корогояш Официальные оппоненты:

доктор бяожогическкх наух« профессор И.А.Захаров кандидат биологически! наук Б.И.Саряиулкцав

Ведущая организация - Ленинградский государственный университет.

Зашла диосертапии состоится "У/ " ТЭб^года

ае эаседаниж специализированного Совета но радиобиологии Д 120.81.01 при Воесаюансм научно-исследовательском институте оедьс®охоа*1етвв»-ной реиодогпг Госагропроиа СССР (Нооква-Оантр. ул. Бвджнокого, д.4, ксин.ЭОО).

С даосертаднай можно оавокошться в библиотеке Воессюэного научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии. Отзнвн на автореферат просим направлять по адресу: 249060, Калуюкая обл., г.Обнинок, БШИСХР, спациалианрованный Совет.

йкс

Автореферат разослан __г.

Учений оехретарь адбщшяищравеяного Совета _ яавжв* биоломчеожит наук

Н .К. Сатарова

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность теш

Изучение механизмов мутационного процесса является одной из важнейших задач современной биологии, решение которой имеет огромное значение дня биологии вообще и для эволюционного учения в частности. Не менее важна эта проблема и для практики - особенно для сельского хозяйства, микробиологической промышленности а медицины.

Б связи с развитием методов исследования ДНК на молекулярном уровне после поразительных успехов молекулярного анализа мутационных изменений ДНК казалось, что мутационным исследованиям грозит опасность быть низведенными до небольшого раздела химии нуклеиновых кислот. Однако проблема мутагенезе, охватывающая во всей своей взаимосвязи такие фундаментальные внутриклеточные процессы, как репарация, репликация и рекомбинация ДНК, чрезвычайно сложна, чтобы быть решенной только о помощью молекулярных методов исследований. Мутагенез, сложный многокомпонентный клеточный процесс, необходимо изучать прежде всего на организменном и особенно клеточном уровнях, что обеспечит успешное исследование мутационного процесса и на уровне молекулярном '

Исследования, проведенные на дрожжах, наряду с работами на бактериях внесли значительный вклад в разработку проблем спонтанного и индуцированного мутационных процессов.

В вопросах мутагенеза у дрожжей к настоящему времени установилось представление, что основным процессом, ответственным за возникновение мутаций, является репарация ДНК ' '. Однако в последние годы появились публикации, в которых описываются случаи зависимости числа мутантов от количества повтавдений в ДНК, оставшихся неотрепарирован-ными к моменту репликации '' , а также отсутствие мутирования при блокировании репликации в темпера турочувствитель ном вггамме ЗаосЬаготусеэ сегет!я1ае '^ . Эти работы указывают на важную роль репликации в процессах образования мутаций. Однако исследований, посвященных оценке роли и вклада процессов репликации, репарации и рекомбинации в становление мутаций в клетке на дрожжах не проводилось. Результаты, полученные при изучении мутагенеза у дрожжей, еще недостаточны дан того, чтобы представить полную картину процессов, происходящих в клетке при образования мутаций.

№ Ш.Ауэрбах. Проблемы мутагенеза. Н.: Мир, 1978.

И. А. За г ар о в я др. Мутационный процесс у грибов. I. :Наутса,1980.

£{.Вага1е е* а1. - 1<382. Р-ЧЧ-

Цель и задача исследования

Цель настоящей работы состоит в разработке подходов к изучению роли я оценке вкладе репликации в мутагенез 7 Sac charomyс ев cerevisiae. Для выполнения работы были поставлены следующие основные задачи:

- Разработать адекватный метод количественной оценки содержания мутантов в культуре в любой требуемый момент при культивировании клеток дрожжей на средах самого разного состава.

- Исследовать образование спонтанных и индуцированных мутантов в разных фазах роста культуры.

- Исследовать образование спонтанных и индуцированных мутантов в разных фазах клеточного цикла дрсахей.

Результаты и выводы работы позволяют приблизиться к пониманию процессов становления мутаций в клетках низших аукариот.

Научная новизна и практическая ценность работы

- Разработана новая методике, позволяющая более корректно, чем традиционные метода, оценивать количественно содержание мутантов в культуре в любой требуемый момент при культивировании кяетоя на средах оамого разного состава*

- Показано, что образование спонтанных и гвша-индуцированных мутантов происходит в s-фазе клеточного цикла. В отсутствие репликации ДНК (в лаг-периоде, в стационарной фазе роста, в а^и й2-фезах клеточного цикла) мутанты не возникают.

- Обнаружено, что образование гаша-яндуцированных мутантов зависят от числа пострадиационных палений облученных клеток. Количество генераций, необходимое для полной реализации полученных при облучении премутационных повреждений, завиоит от того, в какой фазе клеточного цикла находились клетки в момент облучения.

- Экспериментально показано, что в с^-фазе клеточного цикла отсутствует накопление спонтанных первичных повреждений, являющихся субстратом дня образования спонтанных мутаций. Все события, связанные оо спонтанным мутированием, разыгрываются в s-фазе клеточного цикла дрожжей.

- Установлено, что частота образования спонтанных реверсов по гену 1еи2 у дрожжей Sacchaxomycea cerevialae зависит от содержания в среде лейцина. Ирг уменьшении содержания лейцина частота образования ревероов увеличивается.

- Обращается внимание на то, что у Seccharoogrces cerevisiae репарационные процессы, протекавшие в а^-ж о2-фазах клеточного цикла, в образовании спонтанных и гаша-индуцированннх мутантов учаотия не

Результаты проведенной работа шест важное значение для дальнейшего развития исследований по проблемам мутагенеза.

<?ЗТЬ9М ТйбОТИ

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов; изложена на 90 страницах машношоного текста) иллюстрируется 18 рисунками я 4 таблицами. Список литературы содержит 82 наименования) из них 23 работы на руооксм языке.

йгтдбятит

Материалы диссертации доложены на Биофизическом семинаре ОИШ (Дубна, 1987, 1988); семинаре лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ Лен .гос .университета (1988); семинаре сектора радиационной генетики ЛИЯФ АН СССР (Гатчина, 1988); Всесоюзных совещаниях "Молекулярная генетика дрожжей" (Петергоф, 1987), "Механизмы радиационного мутагенеза" (Пущино, 1988), "Молекулярные механизмы мутагенеза" (Новосибирск, 1988); Международном совещании "Генетическое дейотвне корпускулярных излучений" (Дубна, 1988).

Диссертационная работа апробирована на межлабореторной научной конференции БНИИСХР, состоявшейся 10 октября 1986 г.

На зашит? выносятся;

- Результаты опытов по разработке новой методики количественной оценки содержания мутантов в культуре.

- Результаты исследований опонтаиного мутирования клеток дрожжей на средах разного состава, в резных фазах роста культуры и в разных фазах клеточного цикла.

- Результаты исследований гаима-индуцированного мутирования клеток дрожжей на оредвх разного состава, в разных фазах роста культуры и в разных фазах клеточного цикла.

МАТШШИ II МЕТОда ИССЛЕДОВАНИЙ

Источники ионизирующих излучений

Облучение клеток производили на гаюда-установке "Свет" при мощности доза Р~35 Гр/мш. Клетки облучали как в оуспензии, из которой они потом рассоиалиаь в чашш Пэтри, так и пряно в чайках Петри, на твердой питательной среде. Различий в результатах при этих двух способах облучения не наблюдалось.

Штаты ДЕХШЮЙ Sac charomv с еэ cerevlalae

В работе использованы следующие штамма дрожжей Saceharomycea cerevisiae: ПАЗ-24 (a leu2-1 1ув1-1 RAD), ÏÏA3-36 (a ade2-l) И

S2SSC (<l) (предоставлен П.H Лобачевским, ОИЯИ, Дубна).

Штаты N¿3-24 2 ИАЗ-Зб били получена наш путем скрапивания вгташов ГЫ25-2В (л hiaD в Ï2104-4C С» gall mal his5-2 ade2-1 leu2-1 lye1-1 tyr) из коллекции Yeaet Genetic Stock Center, Беркли, США (предоставлена Н.А.Колтовой, ОИЯИ, Дубна) и отбора гаплоидных оегре-гантов.

Среда

Ростовая оведа. Культивирование дрожжей производили на питательной среде М3 ' ' о добавками необходимее аминокислот: лейцина (30 мг/д); лизина (30 мг/л); адалина (20 мг/л).

fîmtoiw^flff iîTffiTfl- Лля внявления мутантов использовали соответствующие селективные средн. Реверси по гену 1еи2 (штамм NA3-24) выявляли на среда М3 с лизином. Реверси по гену 1уа1 (отаым НАЗ-24) - на среде Мд с лейцинсм. Клетки штамма HA3-36 - на среда U3 с аденннсы. Мутанты по гену lys2 (штат S2S8C) - на среде с альфа-амииоажшшновой кислотой в качестве источника азота . Мутанты по гену САЛ1 (аташ 3283с) - на среда М3 с канава нинам (60 мг/л). Мутэнтн, устойчивые к нистатину (птамм згвзс),- на среде IL о нистатином (150 мг/л).

Полная арат. Полная среда П использовалась для определение числа жизнеспособных клеток путем посева на нее разведенной суспензии клеток.

А/

' ' И.А.Захаров и др. , Сборник методик по генетике дрожкей-сахаромицетов. Л.: Наука, 1Э84. В.В.Chattoo et al.- Genetics, 1979, T.93» P.51.

Методики

Суспензию дрожжей методом упорядоченного посева ^^ высевали на агаризованную ростовую питательную среда1, докрытую лавсановыми ядерными фильтрами (диаметр пор 0,2 mew, пористость 8-10$) '' . На одну чашку наносилось 220 инокулшов. Варьируя концентрацию клеток в суспензии, из которой производили раооев дрожкей, изменяли количество клеток в инокулятах в зависимости от задачи опыта от I до "10®.

йнокулированнне клетки в течение опытов выращивали при 30°С. В требуемое время несколько десятков колоний ресуспендировали в воде для определения общего количества клеток в одной колонии (путем мик-роскопирования суспензии в камере Горяева) и числа жизнеспособна* клеток (по количеству выросших колоний при посеве соответствующего разведения суспензии на богатую агаризованную среду П). В то же время необходимое для дальнейшей статистической обработки количество колоний шесте с фильтрами переносили для выявления мутантов на селективную среду. На селективной среде ежедневно производили учет мутантов, образующих видимые глазом колонии вторичного роста. Оценку количества мутантов в момент переноса клеток на селективную среду производили по тс числу в "первой волне" выявления

Синхронизацию клеток производили по методу Вильямсояа и Скоуп-са' -^Продолжительность клеточного цвкда у клеток штамма ыаз-24 сос-тавляет(2,0±р,2)часа. Облучение в g.,-фазе клеточного цикла производили через 30 мин после рассева синхронизированных клеток на чашки, а в g2 - спустя 30 мин с момента появления почек у 50£ клеток (середина s-фазы).

Особенности других приемов, использованных в работе, приведены в соответствующих главах диссертации.

Методы статистической обработки даяяшс

Частоту мутирования рассчитывали по стандартной формуле r « =l/n*la(H/He), где и - число клеток в одной колонии, н - число колоний, использованных дня оценки количества мутантов в культуре, Н0 - число колоний без мутантов из выборки К.

Ошибка рассчитывалась как ак = лп/пг*1п(н/и0) + i/n« *но/к0.

ftt H.H.Хромов-Борисов. - Тезисы докл. конф. по генетике промышленных

микроорганизмов. Цахкадзор. 1973, с.35. w Г.Н.Флеров. - Вестник АН СССР, 1984, * 4, с.35. fj' В.Л.Ильина, В.И.Корогодин. - Генетика, 1987, т.23, J6 4, с.630. /РуиИ.Чепурной, Н.Михова-Ценова. - PI9-87-563, Дубна, ОИЯИ, 1987. ^ 'D.Н.Hilliaraaon and A.W.Scopee. -Mature, 1962, V. 193, p.256.

Результаты повторных опытов не различались в пределах сшибки каждого опыта, поэтому объединялись путем расчета средневзвешенной оценки среднего и ее диопероин ^ '.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Разработка метода количественной сценки содержания мутантов в щгльтуре, основанного на использовании ядерных фильтров

На рис.1 схематически представлена кинетика выявления реверсов по гену 1еи2 после переноса колоний клеток штамма на3-24 на оелек-тивную среду.

Р49.1. Схема выявления реверсов при инкубировании дрожжей на селективной среде. I - выявление спонтанных реверсов; 2 - возрастание первой волны кривой в результате облучения исходной культуры за 24 часа до перенесения на селективную среду; 3 -возрастание второй волны кривой выявления в результате обогащения селективной среды лимитирую-иим метаболитом.

Ореяч РОСНО на ШЙапАиои r-p.lt. сунгки

Выявление реверсов происходит в вида двух хорошо выделенных волн. Облучение колоний клеток га сутки до переноса як на селективную среду проводит к образованию большого количества индуцированных ревероов. Кривая выявления ревероов в »том случае имеет большую, но сравнении с не облученными колониями, первую волну. Вторые волны практически совпадают. На основании этих данных и материалов, изложенных в диссертации, был сделан вывод, что существуйте в колониях на момент переноса реверсы выявляются на селективной среде в вида первой волны.

Если колонии необдученных клеток перенести на полус елективную среду, содержащую небольшое количество лейцина, кривая выявления в этом случае имеет болыцу® вторую волну. Первые волны выявления опон-таяных реверсов на селективной и полуселективной оредах совпадают.

Д*.Тейлор. Введение в те орав ооибок. К.: Мир, 1985.

Эти давние свидетельствуют о той, что реверсы иг второй волны образовались в результате мутирования клеток при остаточном росте на селективной среде.

В специальных экспериментах было показано, что остаточный рост и мутирование на селективной среда продолжаются в течение нескольких первых суток после переноса колоний, причем количество образующихся при атом реверсов совпадает с таковым во второй волне выявления мутантов.

Знание кинетики выявления мутантов на селективных средах позволяет определять количество не только обратных, но и прямых мутантов в культуре, если есть возможность использовать соответствующие селективные среды. Так нами было произведено количественное определение содержания среди клеток игтаииа ¡3288С прямых мутантов, устойчивых к канаванину, к нистатину, а также мутантов по гену ЬУБ2. Результаты, получаемые таким способом, характеризуются удивительным постоянством при повторении опытов.

В экспериментах со смешанной культурой клеток штаммов НАЗ-24 и НАЗ-Зб показано, что в первой волне происходит практически полное выявление мутантов, существовавших в колониях до их переноса на селективную среду, даже если такие мутанты находятся в колониях в единственном числе среди или под тощей в 2* 10е исходных клеток.

Использование кинетики выявления для количественной оценки содержания мутантов в культуре при работе с колониями может иметь одно ограничение, а именно: неполное выявление предсуществуодих мутантов в первой волне при больших размерах колоний. Это связано с тем, что из-за больших размеров колоний увеличивается время выявления просуществовавших мутантов. Выявление вторичных мутантов, образовавшихся уже на селективной среде ("вторая волна"), начинается раньше, чем успевают выявиться предсуществовавшие мутанты, это и приводит к неполноте выявления в первой волне существовавших до переноса мутантов. Однако данное ограничение не имеет всеобщего характера. Так, при определении частот прямых мутаций к канаванинустойчивости и мутаций в гене ыз2 у клеток штамма Б288С мы также наблюдали зависимость выявления от а, в то же время полнота выявления нистатннустойчивых мутантов не зависела от размеров колоний.

В экспериментах с колониями клеток штаммов наз-24 и згаас продемонстрировано, что выявление мутантов в первой волне достаточно полное, если используются колонии с при выявлении реверсов по гену 1ш2 в колониях клеток шташа наз-24 и п ^4-10® при выявлении мутантов по гену ызг в колониях клеток штамма 32ВВС.

Проведанные исследования позволяют заключить, что в выявлении мутантов на селективных средах есть закономерности, которые необходимо учитывать при количественной оценке содержания мутантов в культуре.

Предложенный способ оценки содержания цутантов в культуре в любой требуемый момент при культивировании клеток на средах любого состава наряду о его эстетическими достоинствами является веоьма корректным и может быть рекомендован для широкого применения при проведении исследований по мутагенезу.

2. Изучение спонтанного мутирования ЗаосЬагод.тсев cerevlalae

Изучение спонтанного мутирования Зас charomy с е э cereviaiae Н8 средах разного состава, в разных фазах роста культура и в разных фазах клеточного цикла производилось на примере образования реверсов по гену ieu2 среди клеток штата наз-24.

Для определения спектра мутаций все проявившиеся реверсы проверяли на способность расти на среде М3. Аллели 1еи2-1 и 1уа1-1 являются ochre-супревсибельнымн, поэтому если реверс проявлял способность расти на среде без лейцина и лизина, его относили к группе супрессор-ных (s), если же реверс был неспособен расти на Мд, то его отнооияи к группе локусных (ь) реверсий.

Данные, полученные при культивировании дрожжей на оредах с разным содержанием лейцина, свидетельствуют о существовании сильной зависимости частоты возникновения спонтанных реверсов по гену ieu2 от содержания в среде лейцина. При уменьшении концентрации лейцина от 30 до 0,3 мг/д частота ревертирования возрастает более чем в 20 раз. В большей степени зта зависимость выражена дня реверсов ь-типа, в меньшей - для $. При этом частота образования спонтанных реверсов ь-типа по гену 1уэ1 оставалась постоянной в исследованном диапазоне концентраций лейцина. Наличие этих зависимостей находится в соответствии в гипотезой о повышенном мутагенезе на участках ДИК, работающих более активно 'Л поскольку при уменьшении в среде лейшна действительно происходит активация гена на уровне транскрипции . Мутация же в локусе 1еи2-1 на регуляции гена не сказывается. В рамках этой гипотезы постоянство частоты образования реверсов L-тнпа по гену 1ув1 может быть объяснено независимостью активности 1уа1 гена от содержания в среде лейцина.

Даже если дальнейшие исследования покажут, что гипотеза повышенного мутагенеза активно работающих генов неверна, наличие зависимос-

^ В.И.Корогодин и др.. - PI9-88-35I, ОИЙН, Дубна, 1988. ' ' A.Andreadie et al. - J.Biol.Chem., 1984, У.25Э» P.B059.

тн частоты ревертирования гена 1еи2 от содержания в среда лейцина свидетельствует о том, что дисбаланс предшественников ДНК, который в нашем случае не создается, не является единственным и достаточным объяснением поваленного спонтанного мутирования генов у микроорганизмов, возможно, даже в случаях тинквового или аданинового голодания. Возможно наличие и других механизмов, поиск и проверка которых может открыть путь к решению проблемы спонтанного мутирования генов.

Эксперименты по спонтанному мутировании в разных фазах роста культуры показали, что в отсутствие деления клеток в лаг-фазе и стационарной фазе роста спонтанные мутанты не -образуется. В условиях, благоприятных для роста клеток, спонтанные реверсы по гену i«ua возникает с постоянной, не зависящей от фазы роста частотой r - (2,2 ± ±0,6)-10"® реверсов на клетку на деление.

В опытах о синхронизированной культурой показано, что образование спонтанных реверсов происходит в s-фазе клеточного цикла, то есть во время репликации ДНК.

Широко распространенное мнение об участии процессов репарации в образовании опонтанных мутаций основано на экспериментальном факте повышения частот спонтанного мутирования генов у дефектных по репарации штаммов и на двух гипотезах: гипотезе существования первичных спонтанных повреждений в ДНК и гипотезе каналированяя премутэци-онных повреждений в случае блокирования одного из путей репарации в другие.

С целы) проверки предположения о накоплении спонтанных премута-ционных повреждений во время G^-фазы были поставлены следующие эксперименты. Рост клеток на среде с пониженным до 3 иг/л содержанием лейцина характеризовался удлинением клеточного цикла до 10 часов на генерацию. Такое удлинение происходит за счет изменения длительности с1-фезы. Естественно предположить, что возрастание частоты мутирования на среде с пониженным содержанием лейцина происходит за счет накопления в удлиненной Gj-фазе большего количества премутационннх или "первичных спонтанных повреждений в ДНК" с последующей реализацией их в мутации во время репликации ДИК.

Часть колоний синхронизированных клеток со среды с 3 мг/л лейцина в разные моменты времени с^-фазы переносили на среду с нормальным содержанием лейцина,30 мг/л, где клетки делились через 2-3 часа после переноса. Соответственно, до и после деления определяли количество мутантов в расочитывали частоту мутирования на клетку аа генерацию. Вели премутационвые повреждения накапливается в клетке, то в

/Т5/

' ' T.Brychcy and R.C. von Boratel. - Hutat.Res.f1977, V.45» P.185.

культурах, перенесенных на среду с 30 иг/л лейцина позже, после деления клеток мы вправе ожидать большего количества реверсов. Результаты представлены на рис.2.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии накопления спонтанных премутационных поврежден!: .. Очень показателен последний перенос - клетки на среда с 3 мг/л лейцина уже практически достигли З-фаэы: перенесенные на сред? с 30 мг/л лейцина клетки и непэрене-сенные поделились одновременно, однако количество мутантов в них существенно различалось. Если бы в а1 происходило накопление премутационных повреждений, а в з-фазв они закреплялись в мутациях, тогда количество мутантов в обеих группах совпадали бы. Однако этого не наблюдается.

Рис.2. Проверка гипотезы о накоплении спонтанных премутационных повреждений ДНК во время в,-фазы клеточного цикла. А - количество клеток с почками в одной колонии на средах с пониженным (•) и после переноса их на среду с нормальным (о) содержанием лейцина. Б - количество колоний со спонтанными реверсами в выборках из Н = 1100.

о г ^ е е я «.чк

Полученные данные позволяют полагать, что нарушение нормального протекания репликации из-за плейотрсиного действия мутаций по репера- . ции мажет приводить к повышению частоты образования спонтанных мутаций вследствие возрастания ошибок репликации. Основанием для такого предположения является отсутствие накопления первичных спонтанных повреждений ДНК в клетках в й^фазе, связанное, скорее всего, о отсутствием их вообще.

Таким образом, если наш штамм не является исключением, следует заключить, что у дрожжей отсутствует накопление первичных спонтанных повреждений ДНК; все события, связанные со опонтайным мутированием,

разыгрываются в з-фазе клеточного цикла. Возникновение мутантов в з-фазе является, скорее всего, следствием ошибок репликации ДЕК. В отсутствие репликации ДНК спонтанные мутанты не образуются.

3. Изучение индуцированного мутирования зассЬагогоусев сегеу1а!ае

Изучение индуцированного мутирования За сс Ьш готусез сегеу1э!ае на разных оредах, в разных фазах роста культуры и в разных фазах клеточного цикла производилось на примере образования реверсов по гену 1еи2 среди клеток штамма ыаз-24 при облучении гамма-лучами в диапазоне доз от 7 до 2000 Гр.

Эксперименты с индуцированным мутагенезом в разных фазах роста культуры показали, что в отсутствие деления клеток с момента их облучения до переноса на селективную среду в культуре отсутствует образование индуцированных реверсов. Появление индуцированных реверсов регистрировалось' только тогда, когда клетки после облучения имели возможность размножаться. Причем количество индуцированных мутантов зависело от числа пострадиационных делений клеток.

Опыты с синхронизированными клетками полностью подтвердили эти наблюдения. Так, если после облучения клеток в экспоненциальной фаге роста образование индуцированных реверсов наблюдалось в течение 12-15 часов пострадиационного инкубирования (после чего частота мутирования падала до спонтанного уровня), то эксперименты с синхронной культурой показали, что после облучения клеток в в^фазе клеточного цикла образование индуцированных реверсов продолжалось в течение 6 часов, а после облучения в о2-фазе - основное количество индуцированных мутантов образовывалось на 10-15 ч пострадиационного инкубирования (рис.3). Такое растянутое пострадиационное мутагенное действие наблюдалось про всех дозах в диапазоне от 35 до 2000 Гр. Задержка начала образования индуцированных мутантов при облучении клеток в Б^-фазе до 10-го часа пострадиационного инкубирования, по нашему мнению, вызвана задержкой получивших повреждения клеток на а2-м стадии клеточного цикла. Задержка деления клеток после облучения наблюдается воегда, и максуна она как раз при облучении клеток в а2-фазе клеточного

ЦИК,ЦП „

По количеству индуцированных мутантов после длительного периода их образования были рассчитаны чаототы мутирования при облучении клеток в а^-фазах клеточного цикла и в период экспоненциального роста культур« в разных дозах. В исследованном диапазоне доз от 7 до 2000 Гр наблодался лжнейинй характер зависимости частоты мутирования

^^ З.Ьиске-НиШе е* а1. - Иа|11аг,Неа., 1979, У.79, Р.79.

Ряс.4. Зависимость частоты образования индуцированных ревврсов по гену 1еи2 от дозы гаила-излучения при облучении клеток штампа маз-24, находящихся в С1 (А ), G2 Í ■ ) фазах клеточного цикла и экспоненциальной фазе роста (•).

Рис.3. Накопление колоний с гамма-индуцированными реверсами по гену leu? в выборках из N>660 колоний клеток шташа ваэ-24 после облучения их в дозе 35 Гр в ( á ) и 02 (• ) фа-

зах клеточного цикяа. При облучении bg1 п~2Д.1Сг\ выживаемость 45± 10$; в g2 -n~5,5-IG4, выживаемость 74 ±105!.

от дозы гамма-излучения. Частоты образования индуцированных реверсов не зависели от физиологического состояния клеток и определялись лишь дозой облучения (рис.4).

Бели в случае спонтанного мутагенеза существование премутацион-нык повреждений ДНК находится под сомнением, то в случае индуцированного - существование премутационных повреждений сомнения не вызывает. Когда в этом случае происходит их реализация в мутации?

На рис,5 :1риведены результаты опытов по определению фазы клеточного цикла, в которой происходит возникновение гамяа-индударованных мутантов. Синхронизированные клетки высевали методом упорядоченного посева на чашки и помещали в термостат. Через каждые 30 мин инкубирования несколько чашек с колониями дрожжей облучали в дозе 35 Гр, По-

ловину из этих колоний сразу после облучения переносили на селективную среду для выявления реверсов по гену ieu2, другую половину перекосили на селективную среду через 30 мин пострадиационного инкубирования в термостате.

Рис.5. Определение фаза клеточного цикла, в которой происходит образование гаша-индуцированных мутантов. А - количество клеток в одной колонии синхронизированной культуры клеток штамма наз-24. £ - количество колоний с реверсами в необлученной (о) и облученных (•) куяыурах сразу после облучения и через 30 минут поотра диационн ого инкубирования в выборках из и = 1100.

Данные, полученные в этих опытах, однозначно указывают, что возникновение гаша-индуцированных мутантов происходит в Б-фазе клеточного щита независимо от того, когда клетки были облучены. Пострадиационное инкубирование приводило к образованию индуцированных реверсов в случае, если в течение этого инкубирования в культуре имела место репликацдя ДНК. До и после репликации мутанты не образовывались.

На рис.6 приведены данные о содержании индуцированных мутантов в облученной сразу после посева (в в1-фазе) синхронизированной культуре клеток штажа наз-24 в течение клеточных циклов первых четырех генераций после облучения.

Как ухе говорилось вше, образование индуцированных реверсов при облучении в с^-феэе не ограничивается первой пострадиационной репликацией, а наблвдаетоя в течение 6 часов пострадиационного инкубирования или в течение первых трех генераций облученных клеток. В данном случае (ряс,6В) мы имеем "тонкую структуру" пика, предотавленного ранее на рис.3 при облучении клеток в в^-фазе а переносе облученных клеток на селективную среду через каждые два чаоа. Как видно на рис.6, образование индуцированных мутантов не является монотонным в течение 6-часового инкубирования, что мокво было бы ожидать из-за дисперскк

задержки клеточного деления у получивших повреждения клеток, а привязано к трем последовательным фазам репликации ДНК.

Рис.6. Спонтанный и индуцированный мутагенез в клетках шташа наэ-24 в течение перка четырех генераций после облучения в дозе 35 А - число жизнеспособных клеток в одной колонии в необлу-ченной (о) и облученной (•) культурах. Б - количество колоний с реверсами по гену 1еи2 в выборках из и =880. В - прирост числа колоний с индуцированными реверсами за промежутки времени.

Образование индуцированных реверсов во второй и третьей после облучения фазах репликации, на наш взгляд, является следствием возможности сохранения в клетках премутационных повреждений без реализации их в мутации в течение нескольких делений. Про этом не исключено, что преиутациовные повреждения могут наследоваться дочерними клетками.

Приведенные данные, а также материалы, изложенные в диссертации, позволят1 заключить, что в сц-и Gg-фазах клеточного цикла образования

rama-индуцированных мутантов не происходит. Данное обстоятельство свидетельствует о том, что в образовании гаша-шдуцированяых мутантов репарационные процессы, протекащие в с,-и g2-фазах клеточного цикла, участия не принимают.

Как было показано, спонтанные и гамма-нндпщрованные мутанты образуются в s-фазе клеточного цикла. Однако это еще не означает, что механизмы спонтанного и индуцированного мутагенеза у дрожжей одинаковы. Представленные на рис.7 данные позволяют полагать, что они различаются.

Рио.7. Частоты спонтанного (о) и

Hi—f

гаина-индуцарованного {•) /при облучении клеток в дозе 35 Гр/

ревертирования гена ieu2 в клет-

ках шташа нАз-24 на средах с разным содержанием лейцина.

Ранее ухе была описана зависимость частоты спонтанного ревертирования гена leus от содержания в среде лейцина. При уменьшении содержания лейцина частота спонтанного ревертирования гена ieu2 резко возрастает. В случае одинаковых механизмов спонтанного и индуцированного мутагенеза ш вправе лр* уменыаенях содержания в среде лейцина ожидать аналогичной зависимости ж дм частоты индуцированного ревертирования. Однако частота гаша-ин дуцированного мутирования гена ieu2 после облучения в доге 35 Гр, рассчитанная с учетом зависимости образования индуцировании реверсов от числа последующих после облучения генераций я вычета спонтанных реверсов, оказалась одинаковой и не зависящей от содержания в среде лейцина.

1. разработанная новая методика количественной сценки содержания мутантов в культуре, основанная на использовании ядерных фильтров и знании кинетики выявления мутантов на селективных средах, позволяет корректно оценивать число мутантов в культуре в любой требуемый момент при культивировании клеток на средах оамого резного состава.

2. Частота образования спонтанных: реверсов по гену leu2 у дрожжей S&cch&romyces cer«vielae зависит от содержания в среде лейцина. При уменьшении содержания лейцина частота образования реверсов увеличивается.

3. Частота образования спонтанных мутантов (на примере образования реверсов по гену ieu£) не зависит от фазы роста культуры и являет-

выводи

ся величиной постоянной в расчете на исходную клетку на деление.

4. Спонтанные мутации у дрожжей образуются в з-фазе клеточного цикла, по-видамсму, в результате шибок репликации. В отсутствие репликации ДНК (в лаг-периоде, стационарной фазе роота, G1-$ase клеточного цикла) спонтанные мутанты не возникают.

5. В Gj-фазе клеточного цикла у дрожжей отсутствует накопление спонтанных премутационных повреждений ДНК.

в. Гамма-индуцироваиные мутанты образуются в з- фазе клеточного цикла, независимо от тоге, в какой фазе цикла клетки подвергались облучению. В и о2-фазах клеточного цикла образования мутантов не происходит.

7. Репарационные процессы, протекающие в (^-и в^-фазах клеточного цикла, в образовании спонтанных и гамма-шдупированных мутантов участия не принимают.

8, Образование гамма-ин Аудированных мутантов у дрожжей (на примере образования реверсов по гену ieu2) не является одномоментным, а растянуто во времени. Количество генераций, необходимое для полной реализации полученных при облучении премутационных повреждений, зависит от того, в какой фазе цикла клетки подвергались облучению. Реализация премутационных повреждений в индуцированные мутации происходит в течение нескольких пострадиационных репликаций.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

- Чепурной А.И., Михова-Ценова Н. Закономерности выявления мутантов на оелективных средах. - PI9-87-563, ОИЯИ, Дубна, 1287,

- Чепурной А.И., Михова-Ценова Н. Влияние содержания лейцина в питательной среде на частоту возникновения реверсов у гаплоидных дрожжей. PI9-88-333, ОЙЯИ, Дубна, 1988.

- Чепурной А.И., Михова-Ценова Н., Брунцкова X. Зависимость спонтанного мутирования гена 1еи2 У Saceharoatyeee cerevisiae ОТ фаза роста и фазы клеточного цикла. Р19-68-ЗЭ9, СИЯИ, Дгбна, 1988.

- Чепурной А.И., Михова-Ценова Н., Брунцкова X. Закономерности образования гамма-индуцированных мутантов Saccharomyces cereviaiae. PI9-88-340, ОИЯИ, Дубна, 1988.

- В.И.Корогодин, Н.О.Абетян, X.Брунцкова, НД.Джанполадян, В.Л.Коро-година, Н.Ыихова-Ценова, Н.В.Симонян, Ч.ФаЙси, А.И.ЧепурноЙ. Спонтанный цутагенез и условия культивирования клеток. PI9-88-35I, СИЯИ, Дубна, 1988.

Рукопись поступила в издательский отдел 21 октября 1988 года.

Редактор Т.Я.Жабнцкая. Макет Н.А.Киселевой.

Подписано в печать 11.11,88. Формат 60x90/16. Офсетная печать. Уч.-иэдлистов ] ^35. Тираж юо. Заказ ¿,1271. Издательский отдел Объединенного института ядерных исследований. Дубна Московской области.