Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь "химическая структура - биологический эффект" в оценке экологической опасности производных акриловой и метакриловой кислот

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь "химическая структура - биологический эффект" в оценке экологической опасности производных акриловой и метакриловой кислот"

Р Г Б ОД

На правах рукописи

ФЕФЕЛОВА Юлия Анатольевна

ВЗАИМОСВЯЗЬ «ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ" В ОЦЕНКЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ОПАСНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ АКРИЛОВОЙ И МЕТАКРИЛОВОЙ КИСЛОТ

03.00.16 - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КРАСНОЯРСК -1997

Работа выполнена в Красноярской государственной медицинской

Академии

Научный руководитель - доктор медицинских наук,

профессор В .В .Иванов

Научный консультант - доктор медиценских наук,

профессор Л.Г.Климацкая

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Л.Н. Меняйло

доктор биологических наук В.А. Кратасюк

Ведущая организация - Красноярский государственный

университет

Защита диссертации состоится "_"_1997 г.

в_часов на заседании специализированного совета Д. 120,45.01 при

Красноярском государственном аграрном университете по адресу: 660049, Красноярск - 49, проспект Мира, 88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Красноярского государственного университета.

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.с.- х.н., профессор

Р.М.Бабинцева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Преобразовательная деятельность человека в настоящее время приобрела невиданные масштабы. В этих условиях возрастает значимость экологических проблем. В соответствии с концепцией Всемирной организации здравоохранения "Здоровье для всех к 2000 году" , государства должны располагать надлежащими механизмами для мониторинга и борьбы с опасными для здоровья факторами окружающей среды, представляющими угрозу для здоровья населения (Кучма В.Р., 1993).

Среди веществ, оказывающих токсическое влияние на организм человека и животных, то есть представляющих серьезную экологическую опасность, значительное распостранение получили разнообразные эфиры акриловой и метакриловой кислот, которые находят широкое применение в производстве пластмасс, синтетических смол, лакокрасочных покрытий, эмульсий, органического стекла (Коржов Е.А., 1991). Продукция на акрилатной основе представлена предметами домашней обстановки, упаковочными материалами, одеждой, широко используется в стоматологии, машиностроении, авиационной, огттико-механической промышленности (Стркжов С. Г., 1987).

Важным направлением профилактики экологически вредного воздействия акрилатов является разработка и обоснование биологического мониторинга -принципиально нового направления, используемого в последнее время в экологии. Так, обосновано применение биологического мониторинга, например, для оценки загрязнения атмосферы на основе жизнедеятельности лишайников (Григорьев Ю.С., 1997), или выявление степени загрязненности водоемов по изменению поведенческих реакций рыб (Одум Ю.,1973), что является примером биомониторинга эффекта. Успешно это направление используется в настоящее время и в токсикологии (Айтио А., 1987 ). Одним из инструментов его разработки является вскрыше патогенеза токсичности. Одним из подходов служит исследование взаимосвязи " структура - эффект " в гомологичных рядах химических веществ (Браудв ЕВ. и др.,1993). Этот подход и использовался нами на модели токсических эффектов акрилатов. Накоплено достаточно сведений о

токсических проявлениях этих ксенобиотиков, также существуют исследования, прослеживающие связь между физико-химическими свойствами веществ : липофильностью, молекулярной рефракцией, молекулярным объемом , и их токсическими свойствами ( способностью вызывать гемолиз, коньюгировать с глутатионом и дозой, вызывающей 50 % гибель крыс и мышей ) (Tanii Н. et al., 1984). Ряд работ нашей лаборатории посвящен исследованию механизмов токсического действия акрилатов (Иванов В.В., 1988-1996; Климацкая Л.Г., 19941996; Котловский Ю.В., 1988-1990 и др. ) и непоредственно сравнению биологических эффектов групп акрилатов. Однако подход " структура -биологический эффект " не был целью этих исследований , поэтому достаточно полного сравнительного анализа токсичности ряда акриловых и метакриловых производных не проводилось.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

Исследовать сравнительную биологическую активность экологической опасности в гомологическом ряду эфиров акриловой и метакриловой кислот и дать патогенетическое обоснование разработки методов биомониторинга этих химических соединений.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Исследовать в динамике органное распределение и кумулятивный эффект в ряду акрилатов и их метаболитов.

2. Провести исследование ультраструктурных изменений клеток под воздействием представителей гомологичного ряда акрилатов и их метаболитов.

3. Дать сравнительную оценку тиолопривного эффекта акрилатов и их метаболитов.

4. Провести сравнительный анализ взаимодействия акрилатов и их метаболитов с микросомальной системой окисления и оценить ее роль в патогенезе экологической опасности акрилатов.

5. В системах in vitro и in vivo оценить роль различных систем детоксикации в метаболизме метилметакрилата.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Путем анализа распределения иС меченых акрилатов в различных органах выявлено наибольшее накопление этих экологически опасных ксенобиотиков в печени и почках.

2. Сравнительный анализ уровня содержания и скорости элиминации акрилатов и их метаболита, свидетельствует о более высокой скорости метаболизма бутилового спирта.

3. По степени выраженности ультраструктурных морфологических изменений гепатоцитов печени отравленных крыс образуется следующий ряд: БМА > ММА > МА > БА > MC > БС.

Обнаруживается взаимосвязь качественно однонаправленных параметров внутренней дозы ( наибольшая степень необратимого связывания с белками крови и максимальный кумулятивный эффект выявлен для БМА и минимальный -для БС) о параметрами биологического эффекта ( максимальный повреждающий эффект - для БМА и минимальный для БС по данным элекгронномикроскопических исследований) в ряду БМА, БА, БС.

4. Сравнительный анализ тиолопривного эффекта изучаемых акрилатов (МА, ММА, БА, БМА) и их метаболитов (MC, БС, АК, МАК) показывает, что эфиры метакриловой кислоты и весь ряд метаболитов не обладают прямым алкирующим эффектом; тогда как эфиры акриловой кислоты обладают высокой степенью прямого связывания, таким образом, получена сравнительная оценка биологической опасности данных соединений.

5. При анализе действия модификаторов активности микросомальной системы выявлено дублирующее действие двух систем биотрансформации ксенобиотиков: цитохрома Р-450 и КБЭ.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Впервые дан сравнительный анализ токсичности акрилатов и их метаболитов в зависимости от структурных особенностей их молекул, что может иметь значение для решения вопросов разработки производства экологически

безопасных продуктов. Вопреки появившимся в последнее время в литературе заключениям о малой роли цитохрома Р-450 для биотрансформации акрилатов (Мытников ВА, 1993), в данной работе подтверждена высокая значимость цитохрома Р-450 для их биотрансформации.

Полученные результаты о необратимом ковалентном связывании 1*С-БМА с белками плазмы крови дали патогенетическое обоснование разработки метода биомониторинга воздействия БМА по его внутренней дозе, что является более перспективным в сравнении с методами экологического мониторинга.

По результатам работы имеется 2 рационализаторских предложения и методические рекомендации.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения диссертации докладывались на итоговой научной конференции Красноярского медицинского института, 1990 г.; на научной конференции "Актуальные вопросы фармакологии и фармакотерапии", посвященной 10-летию со дня организации Института фармакологии ТНЦ РАМИ, 1994 г.; на 7-ом Всероссийском симпозиуме "Коррекция гомеостаэа°,1996 г, заседаниях Красноярского отделения Всероссийского общества патофизиологов в 1990-1997 гг.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ:

1. Наибольшая скорость метаболизма характерна для БС, тогда как БМА обладает максимальной степенью необратимого связывания с биомакромолекулами, наибольшим кумулятивным эффектом и самым низким периодом полувыведения.

2. По выраженности ультраструктурных изменеий гепатоцитов печени крыс образуется следующий ряд: БМА>ММА>МА>БА>МС>БС.

3. Сравнительный анализ тиолопривного эффекта изучаемых акрилатов и их метаболитов показывает, что прямой алкилирующей способностью обладают эфиры акриловой кислоты (МА, БА), в то время как эфиры метакриловой кислоты (ММА, БМА) и их метаболиты (МС, БС, АК, МАК) не обладают прямой

алкилирующей активностью, что имеет принципиальное значение для оценки экологической опасности изучаемых соединений .

4. Цитохром Р-450 участвует в метаболизме изучаемых акрилатов и их метаболитов.

5. В системах in vitro и in vivo при оценке экологического влияния ММА выявлено дублирующее действие различных систем биотрансформации в метаболизме этого соединения : цитохрома Р-450 и карбоксилэстеразы.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них -3 в центральной печати.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав и выводов. В тексте приведено 19 рисунков, 7 таблиц, 3 схемы. Библиографический указатель включает 183 литературных источника, из них 71 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа проводилась на 400 белых крысах обоего попа массой 200-250 г, линии "Вистар" и беспородных крысах-самцах массой 180 - 240 г.

Для всех исследуемых соединений (МА, ММА, МС, БА, БМА, БС) создавались модели острой интоксикации. Так как в подавляющем большинстве опытов использовались в качестве экспериментального материалы микросомы печени животных, то был выбран внутрибрюшинный путь введения акрилатов и спиртов, обеспечивающий максимальное поступление их в печень (Jonson Р., 1978), содержащую наибольшее количество КБЭ и цитохрома Р-450 (Арчаков А.И., 1975).

В качестве растворителя акрилатов использовалось подсолнечное масло. Режим введения: однократно внутрибрюшинно в следующих дозах: МА-325 мг/кг БА-550 мг/кг

ММА -1770 мг/ кг БМА - 2400 мг/ кг

МС - 7,4 -13 г/кг БС - 603 мг/мл

Через 12 часов после острого отравления ( вводимая доза равна 2/3 ЛДЯ ) забирались образцы тканей печени для исследования ультраструктуры гепатоцитов.

Количественное исследование динамики органного распределения и ковалентного связывания с белками плазмы крови проводились при внутрибрюшинном введении 14С - бутанола, [1 -14С - бутил] - акрилата, [1 - ,4С -бутил] - метакрилата (фирмы "Изотоп"). Исследуемые вещества вводили за 2, 12, 24, 48 часов до умерщвления животных из расчета 6, 7 ммоль на 1 кг массы, что составило 10 мБк/кг. У животных под тиопенталовым наркозом брали кровь гепаринизированным шприцем из сердца in situ. Отбирались образцы исследуемых органов. Регистрация радиоактивных импульсов проб производилась на счетчике Тамма-Г.

Эксперименты in vitro по изучению взаимодействия ММА с восстановленным глутатионом в инкубационной среде с микросомами печени крыс, предварительно получавших фенобарбитал, CoCL, и ММА проводились при следующих режимах

затравки:

1 - фенобарбитал, классический индуктор микросомальных ферментов печени крыс, растворялся в концентрации 1 г/л в питьевой воде, к которой животные имели свободный доступ. 1-ая группа крыс, таким образом, получала дозу фенобарбитала, расчетно равную 24 мг/кг ежедневно в течение 6 дней.

2 - ингибитор активности цитохрома Р-450 CoCI2 вводился один раз в сутки

в течение 3 дней, подкожно в дозе 23 мг/ кг.

3 - ММА вводился один раз в сутки в течение 3-х дней, внутрибрюшинно е дозе ЛДэо =1,12 г/кг.

Выделялась микросомальная фракция от затравленных животных (методике выделения описана далее ), вносилась в инкубационную смесь, которая имелг следующий состав: 0,2 М трис HCI буфер рН 7,4 ; 10 мМ Mg Cl2; 1 мМ TSH ; бело:

4 мг/мл; 3 мМ НАДФ- Н; 30 мМ ММА. Инкубация проводилась в течение 60 мину при 37°С при постоянном встряхивании в водяной бане. Пробы отбирались на 15

30, и 60 минуте инкубации. Общим контролем служила инкубационная смесь, содержащая микросомы печени, полученные от интактных животных. Контролем для каждой отдельной группы опытов ( №1, №2, №3 ) с различными режимами затравки служила инкубационная смесь, не содержащая НАДФ* Н.

Для опытов ¡n vivo по изучению влияния предварительно введенных модификаторов активности цитохрома Р-450 на изменение содержания небелковых тиолов при отравлении ММА исследовались гомогенаты следующих органов крыс: печень, почки, мозг; а также кровь.

Животные 1-ой группы получали дозу ММА равную 2/3 ЛД50

внутрибрюшинно, однократно, за 24 часа до забора органов и крови.

2-ая группа крыс в течение 6 дней получала фенобарбитал в питьевой воде (1 г/ л), к которой животные имели свободный доступ, расчетная доза равна 24 мл/кг ежедневно. На 7 день опять же вводилась доза ММА равная 2/3 ЛД50, внутрибрюшинно, однократно.

3-ая группа предварительно получала CoCI2 в течение 3-х дней по 1 разу в день, подкожно, в дозе 23 мг/кг. На 4 день - ММА - 2/3 ЛД50

внутрибрюшинно, однократно.

После введения 2/3 ЛД50 ММА животным из каждой группы, органы и

кровь забирались через 24 часа.

Контролем в данном эксперементе служила группа животных, получавшая подсолнечное масло в соответствующей дозе, внутрибрюшинно, однократно, за 24 часа до забора органов и крови.

Животные забивались декапитацией под гексенаповым наркозом (24,51). Печень перфузировалась; почки, сердце, мозг отмывались в физиологическом растворе при температуре 4°С. Кровь забиралась методом внутрисердечной пункции. Все органы гомогенизировались в 0,5 М трис HCI рН 7,4; 1 мМ ЭДТА; 0,5 М KCI; 0,25 М сахарозе при 0 - 4°С с помощью гомогенизатора стекло/ стекло.

Микросомальную фракцию получали путем препаративного центрифугирования (Карузина ИИ. и др., 1972) с использованием центрифуги РС-6 и вакуумной центрифуги ВАК 602 (Германия). В части опытов микросомы получали по методу низкоскоростного центрифугирования в присутствии ионов Са2', связывающихся с МК и утяжеляющими их (КатаИ! ЭЛ., 1971).

Белок определяли по методу Лоури в модификации Ониши и Барр (СЛт^Ы Э.Т., е.а., 1978), или биуретовым методом (Дэвини Т. и др., 1976) с помощью дезоксихолата натрия. В качестве стандарта использовался бычий сывороточный альбумин.

Оценку повреждающего действия исследуемых акрилатов и их метаболитов проводили исследуя алкилирующую активность этих соединений. Содержание глутатиона в инкубационной среде определяли с помощью реактива Эллмана на спектрофотометре марки СФ-26 при длине волны 412 нм (Веревкина И.В. и др., 1977).

Спектральный анализ акриловой кислоты проводился на двухлучевом спектрометре Эресогс! М40 (Германия). Определение спектральной константы диссоциации (Кб) и величины максимальной амплитуды спектральных изменений (АОП макс.) проводили в координатах Лайнуивера - Берка (Уэбб Л., 1966).

Среднесмертельную дозу (ЛДМ), вызывающую гибель половины подопытных

животных (□¡есИтеп \Л/.В.,е.а., 1943) определяли на фоне модификаторов микросомальной активности печени. Режим введения ФБ и СоС12 описан ранее.

Статистическая обработка результатов проводилась на персональном компьютере 1ВМ РС АТ 386 с помощью прикладного пакета программ "СТАТГРАФ". Достоверность результатов подсчитывали с использованием критериев Стьюдента и Бейли (Рокитский П.Ф., 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. Масштабы неблагоприятного экологического воздействия токсических продуктов современного производства в настоящее время достигли критических значений (Гичев Ю„ 1996).

Широкое распространение в промышленности и быту полимеров, получаемых на основе эфиров акриловой и метакриловой кислот, связано с производством большого количества эфиров этих кислот, обладающих токсическим воздействием на человека (Воронкова И.А., 1984). Кроме общетоксического действия данных ксенобиотиков, важно учитывать и отдаленные последствия контакта с этими соединениями, проявляющиеся в мутагенных (Федюкович Л.В. и др., 1991), тератогенных (Markle S.,1983) и канцерогенных (Chan P.C., 1988) эффектах.

Изучение связи строения химических веществ с их токсическим действием, как задачи промышленной токсикологии, является частью общебиологической проблемы связи строения веществ с их биологическим действием, которая решается не только в рамках токсикологии, а также фармакологии, биохимии, физиологии и других наук. Изучение этой связи дает возможность ориентироваться в степени и качестве ядовитости различных веществ, а также необходимо для предсказания характера и силы воздействия новых соединений, путем использования методов интерполяции и экстраполяции и важно для разработки патогенетически обоснованных методов профилактики.

Изучение патогенеза токсичности акрилатов играет важную роль для профилактики их повреждающего действия. В нашей работе для решения этой проблемы использовался сравнительный анализ биологических эффектов акрилатов в гомологичных рядах, то есть с учетом изменяющейся структуры их молекул. Это, в свою очередь, дало возможность патогенетического обоснования разработки новых методов биологического мониторинга -современного перспективного направления предупреждения токсического действия ксенобиотиков. Биологический мониторинг позволяет исключить принципиальный недостаток традиционного метода экологического мониторинга невозможность учета путей поступления яда в организм, распределения ксенобиотика в органах и тканях, особенностей повреждающего действия,

биотрансформации и последующего выведения ксенобиотика из организма (Хашимото К. и др., 1996; Иванов В.В. и др., 1996).

Биологический мониторинг связан со слежением за внутренней дозой (биомониторинг дозы) и биологическим эффектом (биомониторинг эффекта), которые тесно переплетаются между собой. С этих позиций до сих пор не были изучены такие акрилаты как: МА, БД ММА, БМА,

На первом этапе изучения сравнительной биологической активности в гомологичном ряду эфиров акриловой и метакриловой кислот исследовалось в динамике их распределение по органам и тканям крыс (Рис.1).

По полученным данным максимальное накопление [ "С - бутил] - акрилата, [ 14С - бутил] - метакрилата, 14С - бутилового спирта выявляется в печени. Для всех этих соединений в порядке увеличения периода полувыведения радиоактивной метки образуется следующий ряд: печень - почки - кровь - сердце - мозг. Показано, что либо сами изучаемые мономеры, либо их метаболиты, содержащие метку, способны необратимо связываться с функциональными группами белков плазмы крови. Причем для меченого бутилового эфира метакриловой кислоты выявляется значительно большая степень такого связывания с макромолекулами плазмы, чем для меченого бутилового эфира акриловой кислоты. Кроме того, [ МС - бутил] - метакрилат удерживается в органах (печень, почки, сердце, мозг) дольше, чем ( "С - бутил] - акрилат, на что указывает достоверная разница (Р < 0.01) периодов полувыведения этих соединений. Эти результаты являются следствием отличия данных акрилатов по химическому строению их молекул, а именно метилирования эфира акриловой кислоты, что проявляется резким увеличением его липофильных свойств ( коэффициент распределения масло -вода для БА равен 2500, тогда как для БМА - 55000 (Ломонова Г.В., 1984).

Одним из новейших направлений в молекулярной токсикологии является определение аддуктов ксенобиотиков с макромолекулами, что привело к формированию концепции "внутренней дозы" (Климацкая Л.Г., 1994-1996).

Внутренняя доза зависит от таких особенностей патогенеза как распределение ксенобиотиков в организме и способности их к необратимой связи (аддукции) с функциональными группами макромолекул. Необратимое связывание [м С-бутил]-метакрилата с молекулами мишенями в нашем эксперименте, в качестве которых выступают белки плазмы крови, является хорошим патогенетическим обоснованием использования этого показателя для биомониторинга БМА в качестве параметра внутренней дозы. Для других исследуемых ксенобиотиков: 14 С-(БА) - в гораздо меньшей степени образующим аддукты с молекулами - мишенями в нашем эксперименте и 14 С-(БС), обладающим в наименьшей степени способностью к необратимому ковалентному связыванию с белками плазмы крови (образование аддуктов с белками плазмы крови), не является столь перспективным для биомониторинга.

Акумулирование 14 С-(БМА) в исследуемых органах также указывает на необходимость рассматривать воздействие ксенобиотика на организм с позиций внутренней дозы, так как она позволяет учитывать как предыдущее, так и происходящее в данный момент воздействие.

Таким образом, сравнительный анализ распределения 14 С-меченых акрилатов БА, БМА и их метаболита БС в органах и тканях крыс при внутрибрюшинном введении показывает наибольшее их накопление в печени и почках. В порядке увеличения периода полувыведения радиоактивной метки для всех этих соединений образуется следующий ряд: печень - почки - кровь - сердце - мозг. Сравнение уровня содержания и элиминации акрилатов и их метаболита свидетельствует о более высокой скорости метаболизма БС.

Кроме того, 14 С-(БМА), как указывалось, дольше чем 14 С-(БА) удерживается в исследуемых органах и либо сам 14 С-(БМА), либо его метаболиты, содержащие метку, проявляют значительно большую

степень связывания с макромолекулами плазмы, чем 14 С-(БА) и 14 С-(БС).

Это является патогенетическим обоснованием использования данного показателя ( образование аддуктов с белками плазмы крови ) для проведения биомониторинга БМА.

При действии исследуемых акрилатов (МА, БА, ММА, БМА) и их метаболитов (МС, БС) наблюдаются ультраструктурные морфологические изменения различной степени выраженности. Анализ этих изменений выявляет следующую последовательность по убыли выраженности патологических признаков: БМА > ММА > МА > БА > МС > БС.

Важно отметить обнаруженный нами параллелизм между описываемыми явлениями, характеризующими внутреннюю дозу и биологическими эффектами в виде морфологической картины состояния субклеточных органелл гепатоцитов. Наибольший биологический эффект в виде повреждающего действия на ультраструкгурном уровне отмечался при введении БМА. Он характеризовался следующими значительными дегенеративными изменениями клеток .большинство из которых вообще полностью разрушено . Структурные элементы клетки выпадают в пространство синусоида: наблюдается явная гетерохромносгь и множественные некротические явления внутри ядра; кристы не контурируются, матрикс злектронноплотный, однородный; размеры митохондрий уменьшаются; разобщаются элементы аппарата Гольджи; значительно увеличивается количество лизосом и жировых включений.

Повреждения гепатоцитов слабее выражены при введении БА, по сравнению с Б^А. Ь|§цмэньшие повреждения - у животных, которым вводился бутиловый спирт. Как ранее указывалось, именно БМА обладает максимальной степенью необратимого связывания с макромолекулами плазмы и проявляет наибольшие кумулятивные свойства. Таким образом, при данных условиях затравки ( острое отравление, внутрибрюшинный путь поступления ) обнаруживается явный

параллелизм изменений параметров внутренней дозы с параметрами биологического эффекта.

Наибольший повреждающий эффект в гомологичном ряду акрилатов оказывает БМА, что может объясняться отличиями в строении его молекулы, связанными с метилированием и , следовательно, резким повышением липофильности. Следствие есть высокие кумулятивные свойства данного соединения и выраженный разрушающий эффект, оказываемый им на мембраны органелл клетки, где и акумулируются жирорастворимые соединения.

Высокая степень токсического действия эфиров акриловой кислоты (МА и БА) объясняется соотношением их гидрофильно-гидрофобных свойств, поскольку очень гидрофильные молекулы практически не проникают через липоидные барьеры и не достигают определенных рецепторов, контакт с которыми и обуславливает биологически выраженный эффект (Альберт А., 1989). Наоборот, молекулы, обладающие ярко выраженной липофильностью удерживаются при попадании в организм первыми липидными структурами на их пути, и также не оказывают специфического биологического действия (Филов В.А/, 1976). В этом смысле резкий повренодающий эффект БА, и в особенности МА, является характерным признакам того, что они достигают биологических рецепторов и способны оказывать максимально выраженный биологический эффект.

Исследование зависимости "концентрация - эффект" при взаимодействии акрилатов и их метаболитов с восстановленным глутатионом выявляет высокую активность МА и БА, начиная с 1 Мм и, практически, мгновенную скорость реакции при 30 мМ, тогда как все остальные соединения не проявляют реакционной способности в диапазоне изучаемых концентраций. В последней серии опытов концентрация акрилатов и их метаболитов в инкубационной среде многократно превышает физиологические значения глутатиона в клетке. Известно, что коньюгация с такими низкомолекулярными соединениями, как глутатион, происходит наиболее легко с гидрофильными ксенобиотиками. Однако,

возможна коньюгация и с гидрофобными молекулами, в особенности если концентрация их в клетке достаточно высока (Негттапк! К., 1984). Оказалось, что МА и БА - гидрофобные вещества - обладают высокой реактивностью и прямо связываются с восстановленным глутатионом, в отличие от метакриловых аналогов и ряда метаболитов (МС.БС.МАК), являющихся много более гидрофильными.

Образующиеся в результате коньюгации тиоловые эфиры, после серии реакций в организме превращаются в так называемые меркагггуровые кислоты (Акрилонитрил, 1987) и могут использоваться в целях биомониторинга эффекта воздействия (Кпимацкая Л.Г., 1994-1996). Проведенные исследования показывают принципиальную возможность образования меркаптуровых кислот для МА и БА и патогенетически обосновывают использование их для проведения биомониторинга этих ксенобиотиков.

Достоверное нарастание скорости убыли восстановленного глутатиона при сравнении неферментативного и ферментативного процессов при взаимодействи с акрилатами с участием микросом (Рис.2) дает основание думать, что метаболизм всех исследуемых соединений ( ММА, МС, МАК, БМА, БС ) протекает с участием ферментов микросомального окисления и образованием активных метаболитов, гораздо легче вступающих в реакции коньюгации с ГБН.

Доказательством взаимодействия акриловой кислоты с гемопротеидом микросомальной цепи, является возникновение 1-го типа спектральных изменений, объективно указывающего на протекание взаимодействия акриловой кислоты с активным центром цитохрома Р-450. Спектр характеризуется максимумом поглощения при 385 - 390 нм и минимумом при 420 - 425 нм. Константа диссоциации комплекса (Кб) равна 18 мМ, величина максимальной оптической плотности (Л ОП макс.) равна 0.095 единиц оптической плотности.

В серии опытов по влиянию микросом печени крыс, получавших модификаторы системы микросомальных оксидаз, на реакцию коньюгации ММА с ГЭН, обнаружен эффект снижения восстановленного глутатиона в системе, не

содержащей НАДФН. Действие цитохрома Р-450 в такой системе минимально. Следовательно полученный эффект может быть связан с активацией других ферментов.

В микросомах печени помимо цитохрома Р-450 содержится также карбоксилзстераза (1татига Т.,1984) и различные другие ферменты оксиления и гидролиза (Мэдди Э., 1979).

Известно, что фенобарбитал является хорошим индуктором не только цитохрома Р-450, но и карбоксилэстеразы (Большее В.Н., 1980).

Поэтому эффект уменьшения количества восстановленнного глутатиона в системе с индуцированными микросомами без НАДФ'Н может быть связан с активацией карбоксилэстеразы. Прямое взамодейсгвие продуктов гидролиза ММА (МАК и МС) с восстановленным глугатионом незначительно, но, возможно, идут дальнейшие превращений МАК и МС, и их метаболиты вступают в коньюгацию с ГБН (Рис.3).

Следовательно, можно считать, что результат достоверного тиолопонижающего эффекта в эксперименте с индуцированными микросомами без НАДФН объясняется активацией карбоксилэстеразы под действием неспецифического индуктора.

Кроме того, следует учитывать, что реакцию коньюгации глутатиона с ксенобиотиками катализирует группа низкоспецифичных ферментов - глутатион-Б-трансфераэ. Определенная доля этих ферментов (4 - 6 %) приходится на ЭПР ^акоЬу \Л/., 1978). Вполне возможно, что усиление эффекта снижения восстановленного глутатиона при добавлении к системе микросом, предварительно индуцированных фенобарбиталом, без НАДФН также объясняется активацией глутатион-Б-трансфераз.

Добавление НАДФ'Н к системе, содержащей индуцированные фенобарбиталом микросомы приводило к резкому снижению восстановленного глутатиона (Р < 0.001) в сравнении с контрольной средой, не содержащей НАДФ'Н. Скорость реакции при этом резко возрастала (более чем в два раза).

Поскольку фенобарбитал увеличивает удельное содержание цитохрома Р-450 (Котловский Ю.В., 1990) и этот фермент является НАДФ'Н зависимым, полученные результаты свидетельствуют об участии цитохрома Р-450 в метаболизме ММА.

То, что время 50 % убыли TSH в контроле и в опыте (СоС12) без инициирования НАДФ'Н изменяется практически в 2 раза, то есть уровень TSH резко снижается при сведенном к минимуму действию системы цитохрома Р-450, указывает на участие другого ферментативного процесса, метаболизма ММА до альдегида, содержащего элекгрофильный центр, который способен активно связываться с SH-группой глутатиона (Большее В.Н., 1980). Таким процессом может быть гидролиз ММА под действием карбоксилэстеразы (Мьпгников В.А., 1993). Продуктом окисления метилового спирта, образовавшегося при гидролизе, и будет формальдегид. Именно он снижает столь резко уровень восстановленного глутатиона в реакционной среде (Ku R.H.,1984; Мытников В.А.,1993).

Таким образом, можно считать, что в системе in vitro в метаболизме ММА принимает участие цитохром Р-450 и КБЭ. Фенобарбитал, являясь неспецифическим индуктором микросомальной системы, влияет как на цитохром Р-450, так и на карбоксилзстеразу (Большев В.Н., 1980). CoCI2 - специфический

ингибитор, и так как время 50-% убыли глутатиона резко уменьшалось без инициирования цитохрома Р-450, можно заключить, что метаболизм в этом случае осуществляется лишь под действием карбоксилэстеразы.

3-х дневное предварительное введение животным ММА, по-видимому, тормозит активность системы микросомальных ферментов, действуя как ингибитор не только на цитохром Р-450, но и на карбоксилзстеразу.

В экспериментах in vivo по изучению изменений содержания небелковых тиолов в различных оганах крыс при отравлении ММА, влияние модификаторов системы микросомальных оксидаз ( фенобарбитал и хлорид кобальта) оказывало однотипное действие (Табл.1).

Уровень небелковых тиолов во всех органах достоверно снижался. Таким образом, сведение к минимальному участие цитохрома Р-450 его специфическим ингибитором (СоС12) не отменяло снижения небелковых тиолов в различных

органах крыс, как это можно было ожидать в случае, если бы метаболизм ММА осуществлялся только системой цитохрома Р-450. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что к метаболизму ММА при блокаде цитохрома Р-450 может подключаться другая ферментная система микросом, скорее всего карбоксилэстераза (Котловский Ю.В., 1990; Мытников В.А., 1993). Таким образом, результаты, полученные in vivo подтверждают данные, полученные in vitro.

Сравнительный анапиз содержания небелковых тиолов в различных органах крыс показывает, что наименьшее снижение содержания Г8Н под воздействием индуктора микросом (фенобарбитал), происходит в печени, тиолопонижающий эффект ярче выражен в почках, мозгу и крови. Это может бьпъ связано с тем, что продукты метаболизма ММА, которые обладают выраженным тиолопривным эффектом, продолжают активно метаболизироваться в печени до соединений, которые уже не связывают небелковые тиолы.

То, что влияние и индуктора и ингибитора цитохрома Р-450 не изменяло полулетальную дозу при отравлении метилметакрилатом, подтверждает, что главным эффектом действия акрилатов, в данном случае метилового эфира акриловой кислоты, является эффект воздействия на ЦНС. Именно поражения ЦНС в основном определяют клиническую картину отравления животных и смерть. Поэтому воздействия индуктора микросомальной системы и ингибитора цитохрома Р-450 не оказывало видимого эффекта.

Таким образом, в системе in vivo также как с системе in vitro, выявляется дублирующее действие различных систем биотрансформации в метаболизме ММА: цитохрома Р-450 и КБЭ.

Наши исследования не подтвердили появившиеся в последнее время заключения о малой значимости цитохрома Р-450 в метаболизме изучаемых

ксенобиотиков и свидетельствуют о важной роли гемопротеида в процессах детоксикации.

По-видимому, существование разных способов метаболизма ксенобиотиков свидетельствует о высокой степени надежности функциональной системы детоксикации, обеспечивающей иммунохимический гомеостаз даже в случав повреждения или блокады одного или нескольких путей детоксикации. Полученные выводы могут иметь значение для разработки правильной стратегии защиты организма человека от экологически неблагоприятного воздействия акриловых производных.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ распределения 14С - меченых акрилатов БА, БМА и их метаболита БС в органах и тканях при внугрибрюшинном введении крысам свидетельствует об их выраженной экологической опасности и наибольшем их накоплении в печени и почках. В порядке увеличения периода лолувыведения радиоактивной метки для всех этих соединений образуется следующий ряд : печень > почки > кровь > сердце > мозг. Сравнение уровня содержания и элиминации акрилатов и их метаболита свидетельствует о более высокой скорости метаболизма БС.

2. Степень ковалентного необратимого связывания "С-меченых акрилатов с белками крови выражается последовательностью : БМА > БС > БА, что имеет значение для оценки экологической опасности изучаемых соединений. Полученные данные позволяют рекомендовать в качестве метода биомониторинга воздействия акрилатов их определение в аддуктах с белками крови, в частности, с гемоглобином.

3. Иследование ультраструктурных морфологических изменений гепатоцитов печени крыс при остром отравлении акрилатами и их метаболитами показало, что максимальным повреждающим эффектом обладает БМА (резко выраженные изменения до полной деструкции элементов гепатоцита), наименьшими - БС. По

степени проявления этих изменений образуется следующий ряд: БМА > ММА > МА > БА > МС > БС.

4. Обнаружена взаимосвязь качественно однонаправленных параметров внутренней дозы (наибольшая степень необратимого связывания с белками крови и максимальный кумулятивный эффект - для БМА и минимальный - для БС) с параметрами биологического эффекта (максимальный повреждающий эффект -для БМА и минимальный - для БС по данным электронномикроскопических исследований).

5. Наибольшая активность прямого неферментативного связывания с восстановленным глугатионом прослеживается для МА и БА, в отличие от их метилированных производных и их метаболитов (МС, БС, АК, МАК). Полученные результаты работы также дают обоснование использования меркаптуровых кислот мочи для проведения биомониторинга экологически опасного воздействия метилового и бутилового эфиров акриловой кислоты.

6. В присутствии метаболической системы (микросомы + НАДФ-Н) резко активируется реакция коньютации восстановленного глутатиона с акрилатами и их метаболитами, что свидетельствует о принадлежности акрилатов и их метаболитов к субстратам цитохрома Р-450.

7. Акриловая кислота при взаимодействии с гемопротеидом микросом дает первый тип спектральных изменений ДОПмакс. = 0,095 ед.опт.пл.; Кв = 18 мм.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Распределение в организме и взаимодействие с белками плазмы крови крыс бутилового эфира акриловой и метакриловой кислот / совместно с А.В.Светлаковым, В.В.Ивановым, А.В.Голоулиным II Гигиена труда и профессиональных заболевания.- 1988.-№3.-С.51-52.

2. Акрилаты: их распределение в организме и повреждающий эффект/ . совместно с Ю.В.Котловским, Л.В.Федкжович, В.Н.Бравве, Г.М.Климиной// Механизмы патологических реакций: Сб.науч.тр,- Омск, 1988.-Т.6.-С.З-40.

3. Патогенез токсичности бугилакрилата/ совместно с Ю.В.Котловским, И.КХригорьевой, А.В.Светлаковым, С.Б.Большаковым, В.В.Ивановым// Механизмы патологических реакций: Сб.науч.тр.- Томск, 1988.- Т.5.-С.152-156.

4. Токсические эффекты ненасыщенной связи в эфирах акриловой и метакриловой кислот / совместно с АВ.Светлаковым, В.В.Ивановым, М.В.Ардашееой // Фундаментальные науки - медицине и здравоохранению: Сб. науч.тр.- Иркутск, 1989,- ч.2,- С.107-108.

5. Сравнительная характеристика токсичности производных акриловой и метакриловой кислот и альфаметилстиролаУ/ Некоторые вопросы медико-биологических проблем Севера: Сб.науч.тр.-Красноярск, 1990.-С.71-72.

6. The role microsomal metabolism in acrylate toxicity/ совместно с Е.ДГольдбергом, B.B. Ивановым, Ю.В.Котловским, ВАМьгтниковым,

A.В.Светлаковым, Е.Ф.Жирновым U 7-lnternational Conference biochemistry biophysies of cytochrome P-450, structure function biotexnology ecological aspects. Moscov, 1991 ,Jule28-August 2. 1991,Moscov-USSR.-P.107.

7. Значение метаболизма бутилакрилата в реализации его токсического эффекта I совместно с В.Е.Бекеревым, Ю.В.Котловским II Механизмы патологических реакций: Сб.науч.тр.- Новокузнецк, 1991.-С.199-201.

8. Механизмы распределения и тиолопонижающий эффект акрилатов I совместно с АВ.Светлаковым, В.В.Ивановым // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов: Сб.науч.тр,-Томск, 1994,- Т.7.- С. 100-101.

9. Биомониторинг - как новое направление в контроле опасности загрязнения атмосферы и поверхности вод Сибири и Дальнего Востока химическими веществами / совместно с В.В.Ивановым, Л.Г.Кпимацкой, Е.В.Нестеровой, В.В.Барсуковым, Г.В.Матросовым, К.Хашимото, КИномато, К.Каваи,К.Мизунума // Механизмы развития патологических процессов: Сб.науч.тр.- Кемерово, 1994.-С.42-43.

10. Биологический мониторинг воздействия алкипирующих ксенобиотиков путем их определения с помощью нового аналитического подхода в соединениях с гемоглобином, белками плазмы и меркапуровых кислотах мочи / совместно с

B.В.Ивановым, Л.Г.Кпимацкой, Т.Каваи, К.Мизунума И Вопросы медицинской химии. -1995,- №3,- С.22-25.

11. Сравнительный анализ параметров биологического эффекта и внутренней дозы бутиловых эфиров акриловой и метакриловой кислот / совместно с В.В.Ивановым // 4-ый Российско-Японский международный медицинский симпозиум: Тез.докл.- Иркутск, 1996.- С.410.

12. Влияние модификаторов активности цитохрома Р-450 на изменение содержания небелковых тиолов в органах крыс при отравлении метилметакрилатом / совместно с В. В. Ивановым II Первый Российский конгресс по патофизиологии: Тез.докл.- Москва, 1996/- С.207.

Т1/2(час) 30. 262218-

14

10

Л

ТИЧЙГ

в

сердце

орган

Т1/2(час) 28

N

кровь

плазма

ткани

белки плазмы крови

Рис. 1. Период полувыведения [иС-бутил] - акрилата, [мС-бутил] - метакрилата, [,4С-бутанола] из органов крыс при однократном, внутрибрюшинном введении, доза введения - ЮмБк/кг, В опытах использовано по каждой группе. Обозначения: 1-БА; 2-БМА; 3-БС

и тканей 6 крыс в

Т 1/2 (мин)

НАДФН - + - + -+ -+ - + ММА БМА БС МАК МС

Рис. 2. Период полуисчезновения восстановленного глутатиона при инкубации с акрилатами, либо их метаболитами в ферментативном процессе микросомального окисления

Инкубационная смесь объемом 2.5мл содержала 0.2М трис НС1 буфер, рН 7.4; ЮмМ МдС12; 1мМ ГвН; белок 4мг/мл; ЗмМ НАДФН; ЗОмМ акрилата, либо метаболита.

Обозначения: * - различие достоверно отличаются от опыта без НАДФН.

Т 1/2(мин)

90 -

80 -

70 ~

НАДФН - + - + - + - + контроль СоСЬ ММА ФБ

Рис. 3. Период полуисчезновения восстановленного глутатиона при инкубации с метилметакрилатом и микросомами печени крыс, предварительно получавших хлорид кобальта, метилметакрилаг, фенобарбитал

Инкубационная смесь объемом 2.5мл содержала: 0.2М трис-НС1 буфер, рН 7.4; ЮмМ МдС12; 1мМ ГЭН; белок 4мг/мл; ЗмМ НАДФ.Н; ЗОмМ ММА; Обозначения: СоС12 - крысы предварительно получали 23 мг/кг СоС12 в течение 3-х дней, раз в сутки, п/к; ФБ - крысы предварительно получали в течение 6-ти дней через свободный доступ к питьевой воде фенобарбитал в расчетной дозе 24 мг/кг; ММА - крысы предварительно получали в течение 3-х 1/2 ЛД5о ММА, в/б, раз в сутки;

Таблица 1

Влияние изменения активности цитохрома Р-450 на содержание небелковых тиолов в органах и крови крыс при отравлении метилметакрилатом

Орган Контроль ММА СоСЬ + ММА Фенобарбитал + ММА

Печень 1.04±0.16 0.91±0.07 *,а 0.29±0.02 0.21 ±0.02 ,3

Почки 3.03±0.20 0.74±0.12 0.10*0.01 ,а 0.02±0.0001 ,Э

Мозг 1.20±0.04 0.41±0.04* 0.07±0.003*'а 0.03±0.004*'Э

Кровь 0.88±0.04 0.50±0.02 0.13±0.006*'а 0.06±0.009

Примечание: результаты выражены в мкмоль/г(сырая ткань); Обозначения:

контроль - крысы получали подсолнечное масло в соответствующей дозе, в/б, однократно, за 24 часа до забора органов и крови; ММА - крысы получали 2/3 ЛД5о ММА, в/б, однократно, за 24 часа до забора органов и крови;

СоС1г + ММА - крысы предварительно получали 23 мг/кг СоС12 в течение 3-х дней, раз в сутки, п/к, на 4-й день - 2/3 ЛД5о ММА, в/б, однократно; ФБ + ММА - крысы предварительно получали в течение 6-ти дней через свободный доступ к питьевой воде фенобарбитал в расчетной дозе 24 мг/кг, на 7-й день проводилось введение 2/3 ЛД50 ММ А,в/б, однократно; В эксперименте было использовано по в крыс в каждой группе; * - различия достоверно отличаются от контроля ;

а - различия достоверно отличаются от данных серии с введением ММА;

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фефелова, Юлия Анатольевна, Красноярск

\

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КРАСНОЯРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

Юлия Анатольевна Фефелова

Взаимосвязь "химическая структура - биологический эффект" в оценке экологической опасности производных акриловой и метакриловой кислот

03.00.16 - экология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор В.В. Иванов

Научный консультант:

доктор медицинских наук профессор Л.Г.Климацкая

Красноярск, 1997

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. МА - метилакрилат

2. ММА - метилметакрилат

3. Б А - бутил акрилат

4. БМА - бутилметакрилат

5. МС - метиловый спирт

6. БС - бутиловый спирт

7. АК - акриловая кислота

8. МАК - метакриловая кислота

9. НАДФ • Н - никотинамидадениндинуклеотид фосфат

(восстановленный)

10. ПОЛ - перекисное окисление липидов

11.ЦНС - центральная нервная система

12. ЭПР - эндоплазматический ретикулум

13. ГБН - глутатион (восстановленный)

14. АДГ - алкогольдегидрогеназа

15. МЭОС - микросомальная этанолокисляющая система

16. в/б - внутрибрюшинное введение

17. п/к - подкожное введение

18. в/в - внутривенное введение

19.АОС - антиоксидантная система

20. МК - микросомы

21. ФБ - фенобарбитал

22. ГАГ - глутаровый альдегид

23. КБЭ - карбоксилэстераза

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список используемых сокращений..........................................................2

Введение...................................................................................................5

Глава I. Исследование связи «структура - биологическая активность» в рядах гомологичных ксенобиотиков в изучении механизма их токсичности и разработке патогенетически обоснованных методов профилактики (Литературный обзор)....................................................11

1.1. Связь «структура - токсичность» в гомологичных рядах нитрилов..................................;...............................................................11

1.2.Биологическая активность и биомониторинг акрилатов................24

Глава II. Материалы и методы исследования.................................43

2.1. Объект исследования.......................................................................43

2.2. Характеристика условий затравки животных и используемых аналитических материалов.....................................................................43

2.3. Методы исследования....................................................................47

2.4. Статистическая обработка результатов........................................49

Результаты собственных исследований......................................50

Глава III. Динамика распределения меченых по спиртовой группе

акрилатов и их метаболита по органам и тканям крыс......................50

Глава IV . Сравнительный анализ ультраструктурных

морфологических изменений гепатоцитов печени крыс при остром

отравлении акрилатами и их метаболитами......................................55

Глава V. Исследование взаимодействия акрилатов и их метаболитов с

восстановленным глутатионом...............................................................66

5.1. Сравнительный анализ тиолопривной активности эфиров акриловой и метакриловой кислот и их метаболитов в системе in vitro...........................................................................................................66

5.2. Спектральные характеристики взаимодействия акрилатов и их метаболитов с цитохромом Р-450 и роль микросомальной системы печени в патогенезе токсичности акрилатов и их метаболитов in vitro и in vivo и роль микросомальной системы печени в патогенезе

токсичности акрилатов..........................................................................71

5.3. Влияние изменений активности системы микросомальных оксид аз

на тиолопривный эффект метилметакрилата m vivo........................... 81

Глава VI. Общее обсуждение полученных результатов......................83

Выводы..................................................................................................100

Список литературы...............................................................................102

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Преобразовательная деятельность человека в настоящее время приобрела невиданные масштабы. В этих условиях возрастает значимость экологических проблем. В соответствии с концепцией Всемирной организации здравоохранения "Здоровье для всех к 2000 году" , государства должны располагать надлежащими механизмами для мониторинга и борьбы с опасными для здоровья факторами окружающей среды, представляющими угрозу доя здоровья населения (50).

Среди веществ, оказывающих токсическое влияние на организм человека и животных, то есть представляющих серьезную экологическую опасность, значительное распостранение получили разнообразные эфиры акриловой и метакриловой кислот, которые находят широкое применение в производстве пластмасс, синтетических смол, лакокрасочных покрытий, эмульсий, органического стекла (44). Продукция на акрилатной основе представлена предметами домашней обстановки, упаковочными материалами, одеждой, широко используется в стоматологии, машиностроении, авиационной, оптико-механической промышленности (85).

Важным направлением профилактики экологически вредного воздействия акрилатов является разработка и обоснование биологического мониторинга - принципиально нового направления, используемого в последнее время в экологии. Так, обосновано применение биологического мониторинга, например, для оценки загрязнения атмосферы на основе жизнедеятельности лишайников (29), или выявление степени загрязненности водоемов по изменению поведенческих реакций рыб (73),

что является примером биомониторинга эффекта. Успешно это направление используется в настоящее время и в токсикологии (2,43,145 ). Одним из инструментов его разработки является вскрытие патогенеза токсичности. Одним из подходов служит исследование взаимосвязи "структура - эффект" в гомологичных рядах химических веществ (11,94,149,165,166,171). Этот подход и использовался нами на модели токсических эффектов акрилатов. Накоплено достаточно сведений о токсических проявлениях этих ксенобиотиков, также существуют исследования, прослеживающие связь между физико-химическими свойствами веществ липофильностью, молекулярной рефракцией, молекулярным объемом , и их токсическими свойствами ( способностью вызывать гемолиз, коньюгировать с глутатионом и дозой, вызывающей 50 % гибель крыс и мышей) (177). Ряд работ нашей лаборатории посвящен исследованию механизмов токсического действия акрилатов (10,12,36,43,45,49,70) и непоредственно сравнению биологических эффектов групп акрилатов. Однако подход " структура - биологический эффект " не был целью этих исследований , поэтому достаточно полного сравнительного анализа токсичности ряда акриловых и метакриловых производных не проводилось.

Цель работы. Исследовать сравнительную биологическую активность экологической опасности в гомологическом ряду эфиров акриловой и метакриловой кислот и дать патогенетическое обоснование разработки методов биомониторинга этих химических соединений.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать в динамике органное распределение и кумулятивный эффект в ряду акрилатов и их метаболитов.

2. Провести исследование ультраструктурных изменений клеток под воздействием представителей гомологичного ряда акрилатов и их метаболитов.

3. Дать сравнительную оценку тиолопривного эффекта акрилатов и их метаболитов.

4. Провести сравнительный анализ взаимодействия акрилатов и их метаболитов с микросомальной системой окисления и оценить ее роль в патогенезе экологической опасности акрилатов.

5. В системах in vitro и in vivo оценить роль различных систем детоксикации в метаболизме метилметакрилата.

Научная новизна

1. Путем анализа распределения 14С меченых акрилатов в различных органах выявлено наибольшее накопление этих экологически опасных ксенобиотиков в печени и почках.

2. Сравнительный анализ уровня содержания и скорости элиминации акрилатов и их метаболита, свидетельствует о более высокой скорости метаболизма бутилового спирта.

3. По степени выраженности ультраструктурных морфологических изменений гепатоцитов печени отравленных крыс образуется следующий ряд: БМА > ММА > МА > БА > MC > БС.

Обнаруживается взаимосвязь качественно однонаправленных параметров внутренней дозы ( наибольшая степень необратимого связывания с белками крови и максимальный кумулятивный эффект выявлен для БМА и минимальный - для БС) с параметрами биологического эффекта ( максимальный повреждающий эффект - для БМА и минимальный для БС по данным электронномикроскопических исследований ) в ряду БМА, Б А, БС.

4. Сравнительный анализ тиолопривного эффекта изучаемых акрилатов (МА, ММА, БА, БМА) и их метаболитов (МС, БС, АК, МАК) показывает, что эфиры метакриловой кислоты и весь ряд метаболитов не обладают прямым алкирующим эффектом; тогда как эфиры акриловой кислоты обладают высокой степенью прямого связывания, таким образом, получена сравнительная оценка биологической опасности данных соединений.

5. При анализе действия модификаторов активности микросомальной системы выявлено дублирующее действие двух систем биотрансформации ксенобиотиков: цитохрома Р-450 и КБЭ.

Научно-практическая значимость работы.

Впервые дан сравнительный анализ токсичности акрилатов и их метаболитов в зависимости от структурных особенностей их молекул, что может иметь значение для решения вопросов разработки производства экологически безопасных продуктов. Вопреки появившимся в последнее время в литературе заключениям о малой роли цитохрома Р-450 для биотрансформации акрилатов (70), в данной работе подтверждена высокая значимость цитохрома Р-450 для их биотрансформации .

Полученные результаты о необратимом ковалентном связывании 14С-БМА с белками плазмы крови дали патогенетическое обоснование разработки метода биомониторинга воздействия БМА по его внутренней дозе, что является более перспективным в сравнении с методами экологического мониторинга.

По результатам работы имеется 2 рационализаторских предложения и методические рекомендации "Биомониторинг акриламида. Метод определения акриламида и его аддуктов с белками крови и меркаптуровых кислотах мочи".

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на итоговой научной конференции Красноярского медицинского института, 1990 г.; на научной конференции "Актуальные вопросы фармакологии и фармакотерапии", посвященной 10-летию со дня организации Института фармакологии ТНЦ РАМИ, 1994 г.; на 7-ом Всероссийском симпозиуме "Коррекция гомеостаза",1996 г, заседаниях Красноярского отделения Всероссийского научного общества патофизиологов в 1990 -1997 гг.

Положения выносимые на защиту:

1. Наибольшая скорость метаболизма характерна для БС, тогда как БМА обладает максимальной степенью необратимого связывания с биомакромолекулами, наибольшим кумулятивным эффектом и самым низким периодом полувыведения.

2. По выраженности ультраструктурных изменеий гепатоцитов печени крыс образуется следующий ряд: БМА>ММА>МА>БА>МОБС.

3. Сравнительный анализ тиолопривного эффекта изучаемых акрилатов и их метаболитов показывает, что прямой алкилирующей способностью обладают эфиры акриловой кислоты (МА, БА), в то время как эфиры метакриловой кислоты (ММА, БМА) и их метаболиты (МС, БС, АК, МАК) не обладают прямой алкилирующей активностью, что имеет принципиальное значение для оценки экологической опасности изучаемых соединений.

4. Цитохром Р-450 участвует в метаболизме изучаемых акрилатов и их метаболитов.

5. В системах in vitro и in vivo при оценке экологического влияния ММА выявлено дублирующее действие различных систем биотрансформации в метаболизме этого соединения : цитохрома Р-450 и карбоксилэстеразы.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них - 3 в центральной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав и выводов. В тексте приведено 19 рисунков, 7 таблиц, 3 схемы. Библиографический указатель включает 183 литературных источника, из них 71 иностранных.

ГЛАВА 1. ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗИ "СТРУКТУРА -БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ" В РЯДАХ ГОМОЛОГИЧНЫХ КСЕНОБИОТИКОВ В ИЗУЧЕНИИ МЕХАНИЗМА ИХ ТОКСИЧНОСТИ И РАЗРАБОТКЕ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИ ОБОСНОВАННЫХ МЕТОДОВ ПРОФИЛАКТИКИ

1.1. Связь структура - токсичность в гомологичном ряду нитрилов

Изучение связи строения химического вещества с его токсическим действием, как задачи промышленной токсикологии, является частью общебиологической проблемы связи строения веществ с их биологическим действием, которая решается не только в рамках токсикологии, а также

Схема 1. Связь физико - химических характеристик веществ с их биологической активностью

фармакологии, биохимии, физиологии и других наук. Связи, существующие между физическими и химическими характеристиками веществ и их биологическим действием , а также направленность этих связей, представлена на схеме 1 (103).

Изучение связи строения и токсического действия дает возможность ориентироваться в степени и качестве ядовитости различных веществ, необходимо для предсказания характера и силы воздействия новых соединений путем использования методов интерполяции и экстраполяции, а также важно для разработки патогенетически обоснованных методов профилактики.

Существует ряд закономерностей, вытекающих из связи между строением органических соединений и их токсичностью, которые имеют отношение к ряду изучаемых нами веществ.

Согласию правилу Ричардсона сила наркотического действия в различных гомологичных рядах нарастает с возрастанием молекулярной массы. Эта закономерность справедлива и в отношении иных токсических эффектов. Например, аналогичная зависимость выявлена для силы гемолитического и бактерицидного действия соединений, также во многих гомологичных рядах нарастает интенсивность раздражающего действия паров с увеличением числа углеродных атомов (103). Но существует ряд отклонений от правила Ричардсона. Сила наркотического действия нарастает лишь до определенного члена гомологичного ряда, а затем резко падает (103).

Другим отклонением является то, что часто первый член гомологичного ряда оказывается более токсичным и выпадает из закономерности постепенного нарастания токсичности (168). Метиловый спирт, муравьиная кислота, муравьиный альдегид и прочие производные метана для разных рядов - примеры таких соединений.

Другой закономерностью отражающей изменение токсичности с изменением строения молекул является введение в молекулу кратных связей. Ненасыщенность соединения, чаще всего, соответствует повышению химической активности (103).

Введение в молекулу гидроксильной группы обычно вызывает ослабление токсичности. Это связано с увеличением растворимости. Известно, что спирты менее токсичны чем соответствующие углеводороды (168).

Введение в молекулу нитро, нитрозо или аминогруппы очень сильно изменяет токсические свойства соединения. Наибольшей токсичностью обладают нитро- и аминопроизводные ароматических углеводородов ( нитробензол, динитробензол, анилин, толу и дины, ксилидины ). Наличие карбоксильной группы или ацетилирование уменьшает токсичность. Это объясняется тем, что введение полярной группы увеличивает гидрофильность молекулы, следовательно накопление вещества в клетке идет в меньшей степени (103).

Изучение связи между физическими и химическими характеристиками веществ и их биологическим действием, как указывалось, является задачей, прежде всего, фармакологии и токсикологии, поскольку последняя входит в число наук родственных фармакологии. Классик отечественной фармакологии Н.В. Кравков придавал особое значение именно изучению зависимости действия фармакологических препаратов от их химической структуры (14).

Важным следствием различий химической структуры в гомологичном ряду химических веществ являются различия в распределении лекарственных веществ в организме. Фармакокинетика этого процесса зависит от различий взаимодействия гомологов с разнообразными факторами (связь с транспортными белками, проницаемость для них плазматических мембран, ассоциации с вне- и внутриклеточными

рецепторами). Особенности этого распределения определяются прежде всего физико-химическими свойствами лекарственных веществ.

Примером изменения фармакологических свойств лекарственных препаратов в зависимости от их химической структуры могут служить самые разнообразные группы лекарственных средств. Противомикробные и противопаразитарные средства включают в себя большую группу химиотерапевтических препаратов, используемых при инфекционных заболеваниях и действующих путем разрушения вызвавших их паразитов или микроорганизмов без повреждения тканей организма хозяина (81,82). В свою очередь к химиотерапевтическим средствам относятся сульфаниламидные препараты. Эта группа соединений с общей формулой :

Атом водорода аминогруппы (в положении 4) может быть также замещен различными радикалами. Препараты оказывают бактериостатическое действие (нарушают течение об