Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внехромосомная наследственность Streptomyces globisporus 1912

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Внехромосомная наследственность Streptomyces globisporus 1912"

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ВІРУСОЛОГІЇ ім.Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

; Р; л я ' На правах рукопису

■ і'іі;

ПОЛІЩУК Людмила Василівна

П03АХР0М0С0МНА СПАДКОВІСТЬ ЭТЙЕРТОМУСЕЗ аОВ/БРОЯиЗ 1912

03.00.07. - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації иа здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук.

КИЇВ - 1995

Робота виконана у відділі генетики мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології ім.Д.«.Заболотного НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор член-кор. НАНУ Мацелюх Б.ГІ.

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, професор

Захист відбудеться 20 грудня 1995 року о 10 00 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 01.81.01 при Інституті мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України ( 252143, Київ 143, вул.Заболотного,154, Інститут мікробіології та вірусології НАН України, зал засідань)

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Інституту мікробіології та вірусології НАН України

Автореферат розіслано 995 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради

Менджул М.І.

доктор біологічних наук, професор Малюта С.С

Провідна організація - Київський Університет

ім. Т.Г.Шевченка, кафедра мікробіології.

кандидат біологічних наук

Гіуріш Л.М.

ВСТУП

Аістуальність теми , Плазміди стрептоміцетів - необов'язкові позахромосомні генетичні елементи клітини, які широко поширені у представників цієї родини мікроорганізмів. Вони виконують важливі біологічні функції, надаючи клітинам ряд фенотипоаих ознак. Плазміди сприяють обміну генетичною інформацією між штамами одного і різних видів роду і виживанню клітин стрептоміцетів в особливих умовах існування.

Стрептоміцети - це головні промислові продуценти антибіотиків. У зв'язку з участю плазмід стрептоміцетів в синтезі і регуляції утворення антибіотиків, ці носіі позахромосомної спадковості стали об'єктом глибокого і всебічного вивчення в багатьох лабораторіях світу.

Важливе теоретичне і практичне значення надається плазмідам стрептоміцетів в наш час як векторам в генноінженерних роботах, що відкривають широкі перспективи у вивченні структури та функцій генів хромосом стрептоміцетів та конструювання високо активних продуцентів цінних антибіотиків, ферментів, білків тощо.

Мета і завдання роботи . Метою даної роботи було виділення та вивчення фізично! організації плазміди рЗй1912 штаму БігерШтусез дІоЬізрогиз 1912; з'ясування біологічних функцій і фенотипових ознак, що детермінуються нею; вивчення хімічної природи, фізичних та біологічних властивостей речовин, синтез яких детермінується цим позахромосомним елементом.

Для виконання роботи необхідно було вирішити такі задачі:

1. дослідити наявність плазмідної ДНК у ЗО штамів стрептоміцетів і відібрати перспективний для подальшої роботи штам;

2. визначити біологічні функції і фенотипові ознаки, що детермінуються плазмідою рЗв1912 у штаму-хазяїна;

-43. побудувати рестрикційну карту плазміди pSG1912 і локалізувати на ній мініреплікон;

4. визначити фізичні властивості і спектр дії антибіотиків, синтез яких детермінується плазмідою pSGl912.

ОСНОВНІ ПОЛОЖЕННЯ, ЩО ВИНОСЯТЬСЯ НА 3AXVCT:

1. Штам S.globisporus 1912 є носієм плазміди PSG1912 (11,2 тпн), яка детермінує Цг+-фенотип та синтез речовин антрациклінової природи, стійкість до.них та антибіотика норсетрицина.

2. Побудована рестрикційна карта плазміди pSG1912 , визначено розмір мініреплікона та його локалізацію на рестрикційній карті плазміди.

3. Встановлено, що S.globisporus 1912 (pSG1912+) синтезує речовини антрациклінової природи, які мають здатність пригнічувати ріст грампозитивних мікроорганізмів та пухлин.

Наукова новизна. На даний час достовірно відомо, що синтез тільки метиленоміцину А та стійкість до нього детермінується плазмідами (SGP1

і pSV1) (Chater and Bruton, 1985; Kinash et ai„ 1987). У ряді публікацій повідомляється, що синтез антибіотиків пенталенолактона (S.arenae TU469) та ласолоціда- (S.lasaliensis) та стійкість до них детермінується позахромосомними елементами (Kinash et al., 1987; Braxerthaler and Poetsch, 1991).

Нами проведено вивчення детермінації синтезу антибіотиків антрациклінової природи у штама S.globisporus 1912 (pSG1912+) та

^^спжан0^етщдащііо~тїлазщцоо р5ШШ2 ЙГ+^фенотипу, синтезу антибіотичних речовин і стійкості до них та до антибіотика норсертицина;

- досліджений спектр дії метаболітів, що синтезується S.globisporus 1912 (pSG1912+) і виявлена пригнічувальна дія їх на грампозитивні мікроорганізми та пухлини.

Практичнв значення. Плазміда рЗС1912 має велику копійність, стабільно зберігається в культурі та детермінує ряд фенотипових властивостей. При побудові іі рестрикційної карти встановлено наявність унікальних сайтів впізнання для 4 рестриктаз. Все це робить можливим використання плазміди рЭС1912 для побудови на її основі векторів клонування для стрептоміцетів. Штам З.діоЬієрогиз 1912 (рЗС1912+) синтезує вторинні метаболіти, що належать до антрациклінових речовин. Багато речовин цього класу мають практичне застосування в медицині для терапії онкозахворювань. Речовини, синтезовані Б.дІоЬізрогиз 1912 (рБС1912+) здатні пригнічувати ріст пухлин. Після подальшого вивчення вони можливо знайдуть застосування в медицині.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідалися і обговорювалися на У1 з'їзді УТГіС (Полтава, 1992 ), на Першій генетичній конференції країн Балтики (Вільнюс, 1992), на І (Установчому) з'їзді УМО (Одеса, 1994), на 9 Міжнародному симпозіумі з біології актиноміцетів (Москва, 1994).

Публікація результатів роботи. Основні положення роботи викладені у 7 друкованих працях.

Структура та об’єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, результатів, їх обговодення, висновків та списку літератури, який включає 267 найменувань. Робота викладена на 143 сторінках машинописного тексту та містить 6 малюнків, 23 фотографій та 28 таблиць. '

ЗМІСТ РОБОТИ

Оглял літератури. Наведені сучасні дані з питань хромосомної та позахромосомної спадковості стрептоміцетів: взаємодії ллазмідної та хромосомної ДНК в різні фази розвитку міцелію, розповсюдженості позахромосомної спадковості у представніків цього роду мікроорганізмів та про будову плазмід стрептоміцетів і функції, які детермінуються ними.

Також наведені відомості про антрациклінові антибіотики: їх продуцентів, властивості та значення для хіміотерапії пухлин.

Експериментальна частина.

Матеріали і методи. В роботі досліджувались ЗО штамів стреп-томіцетів, що належать до глобіслоринової групи непігментованих культур Streptcmyces. Вони були виділені із зразків грунту співробітниками відділу загальної та грунтової мікробіології ІМВ НАНУ. Використовувались також штами стрептоміцетів, ентеробактерій, бацил, нокардій та дріжджів з колекції відділу генетики мікроорганізмів ІМВ НАНУ.

Середовища та умови культивування мікроорганізмів підбиралися відповідно до задач експерименту, враховуючи потреби мікроорганізмів (Маниатис и др., 1984, Okanishi etal., 1974; Hopwood et al., 1985).

. Виділення плазмідної та тотальної ДНК з клітин мікроорганізмів проводили за методами Бірнбойма і Долі та Кайзера (Birnboim and Doly, 1979; Kieser, 1984) , в які було внесено деякі модифікації. Електронна мікроскопія плазмідної ДНК та визначення контурної довжини молекул плазмідної ДНК проводили за допомогою метода, запропонованого Девісом (Devis et al., 1971). Стандартом довжини була плазміда pBR322, розміром 4,36 тпн (Sutcliffe, 1987).

Розділення плазмідної, тотальної ДНК та їх рестрикційних фрагментів, обробку ДНК ендонуклеазами рестрикції та лігування лігазою фага Т4 проводили як описано в керівництві Маніатіса (Маниатс-шо^ 1984). Реакцію нік-трансляції проводили по методиці, запропонованій Рігбі (Rigbi et al., 1977). Перенесення. ДНК з агарозного гелю на нітроцелюлозний мембранний фільтр (фірма "Schuell BA8S", 0,45) проводили за Саузерном (Southern, 1975). Для виявлення у стрептоміцетів плазмід, що детермінують и2+'фенотип, використовували

2 методи - метод відбитків плям та метод мікроколоній. Для виявлення здатності стрептоміцетів пригнічувати ріст мікроорганізмів

використовували метод підсіву тест-культур, метод накладання агарових блоків культур стрептоміцетів та оприскування окремих колоній суспензією спор тест-культури . Чутливість стрептоміцетів до антибіотиків досліджували методом накладання стандартних паперових дисків з антибіотиками (Егоров, 1986). Для одержання безплазмідних варіантів використовували як фактори елімінації підвищену температуру, протопласгуеання і регенерацію, спори також обробляли бромістим етидієм, додецилсульфатом натрію, ультрафіолетовими хвилями окремо і в комплексі з етидій бромідом (Okanishi et al., 1974; Hopwood et al,, 1985).

Отримували компетентні клітини Е.соїі та протопласти стрептоміцетів, проводили їх трансформацію і відбір трансформантів за відповідними методиками (Стенько и др., 1986; Okanishi et al.,1974; Dagert, 1979, Hopwood et al., 1985).

Дослідження речовин з антибіотичними властивостями проводили методами аналітичної та препаративної тонкошарової хроматографії (Шаршунова и др., 1980). Біоавтографію .отриманих тонкошарових хроматограм проводили за методом (Aszalos et al., 1968).

Вивчення протипухлинної дії метаболіту з Rf 0,33, що синтезується S.globisporus 1912 (pSG1912+), проводили на 10 безпородних щурах -самках з перевивною карциномою Герена на 6 добу після перевивки. Вихідні розміри пухлин на цей день становили 0,9 - 1,1 смЗ. Препарат вводили в дозі 0,8 мг/кг в добу на протязі 10 діб. Досліди по вивченню протипухлинної дії метаболіту проводили на базі Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАНУ.

1. Дослідження ряду штамів гпобіспоринової групи на наявність поззхромосомної спадковості .

Для даних досліджень були відібрані ЗО штамів, що належали до групи глобіспоринових стрептоміцетів. Такий вибір був пов'язаний з тим,

що всі представники цієї групи синтезують речовини з антибіотичними властивостями широкого спектру дії (Красильников,1970).

Встановлено, що екстрахромосомна ДНК у 15 штамів не виділяється жодним з використаних нами методів, у 14 штамів в аналогічних умовах - виділяється нестабільно і тільки з одного иітама (S.globisporus 1912) плазмідна ДНК виділялась стабільно.

За даними літератури 20-25 % штамів стрептоміцетів містять в собі плазмідну ДНК (Okanishi et al., 1980; Hopwood et al., 1981; Omyra et al., 1981), але є дослідження, які виявили більшу поширеність плазмідної ДНК серед стрептоміцетів (93%) (Ritchie et al., 1985).

Як відомо, одною з типових властивостей, які детермінуються плазмідами стрептоміцетів, є явище "летального зигозису" (Ltz+ -фенотип, "поки"). Було проведено вивчення штамів з досліджуваної групи, що містять плазмідну ДНК, на наявність иг+-фенотипу. Як встановлено, всі перевірені безплазмідні штами виявилися чутливими до Ltz+ -фенотипу штаму S.globisporus 1912 (pSG1912.+) (Рис.1), в той час як деякі інші (наприклад, S.globisporus 284) продемонстрували явище "летального зигозису" тільки на газонах деяких з використаних безплазмідних штамів. Штам S.sp 4326 не виявив феномену "летального зигозису" на жодному з використаних штаміз, що може свідчити про некон'югативність плазміди цього штаму .

'■ч

—о----------І—:--------

Рис.1 . Виявлення феномену

летального зигозису

'-І'' -' ...« . ;• 9 ("поки") штамом

Ф ■ - ‘ Л' ’ г „•

S.globisporus1912 (pSG1912+) на

безплазмідному штамові S.levoris 165 (газон).

Іншою важливою фенотиповою ознакою, що детермінується плазмідами мікроорганізмів, є визначення стійкості до дії антибіотичних речовин. Досліджувався спектр чутливості до антибіотиків штамів , що містили позахромосомну ДНК , так і безплазмідних штамів. Було встановлено, що переважна більшість досліджених штамів незалежно від наявності плазмідної ДНК виявилась стійкою до р-лактамних та макролідних антибіотиків, мітоміцину С та поліміксину М і чутливою до аміноглікозидних антибіотиків, тетрацикліну, ристоміцину та деяких інших. Деякі відмінності в стійкості до антибіотиків виявлено у S.sp 2070 і S.pluricolorescens 12.

Досліджені штами глобіспоринової групи виявили слабку здатність пригнічувати ріст окремих грампозитивних і грамнегативних

мікроорганізмів. При вивченні впливу метаболітів штамів глобіспоринової групи S.globisporus 1912 (pSG1912+), S.globisporus 284, S.sp 2070, S.pluricolorescens 12 і S.levoris 165 на деякі штами стрептоміцетів з колекції лабораторії і на представників досліджуваної групи встановлено, що всі досліджені штами (за винятком S.levoris 165) як плазмідні, так і безплазмідні здатні пригнічувати ріст інших стрептоміцетів (Рис. 2).

Рис. 2.

Пригнічення росту безплазмід-

ного штама S.globisporus 3934

(газон) навколо агарових блоків з культурами :

1-S.globisporus 1912 (pSG1912+),

2-S.globisporus 284, 3-S.sp 801,

4-S.pluricolorescens. 12,

5-S.sp 4326, 6-S.sp 2070.

- іоНа підставі отриманих данних про стабільне виділення плазмідної ДНК з штаму S.globisporus 1912 (pSG1912+) і наявність у нього властивостей, які можуть детермінуватися плазмідою (синтезу метаболітів з антибіотичними властивостями, стійкості до них та феномену "летального зигозису”), було вирішено, відібрати для детального дослідження цей штам і плазміду, яку він містить (pSG1912).

2.Функції та фенотипові ознаки, детерміновані плазмідою PSG1912. Для того, щоб виявити, які з властивостей штаму S.globisporus 1912 (pSG1912+) детермінуються плазмідою pSG1912, було вирішено отримати безплазмідні варіанти цього штаму. Як відомо, втрата якої небудь властивості штаму, що супроводжує втрату плазміди, є одним

з доказів детермінації цієї властивості плазмідними генами (Shrempf, 1982; Fishman and Hershberger, 1983; Hintermann et al., 1984),

В нашій роботі використовувалися як фактори елімінації плазмід хімічні речовини та фізичні фактори. 6530 колоній, які виросли із оброблених спор або міцелію, було перевірено на наявність позахромосомної ДНК. При цьому було знайдено тридцять один клон, у яких позахромосомної ДНК фізичними методами не було виявлено. Ці клони по фенотипу було розподілено на 2 групи: до першої групи віднесли 27 клонів (наприклад, Е27, Е45, Е46, Е47 та Е66) з фенотипом S.globisporus 1912 (pSG1912+) ; до другої - віднесли 4 клони (Е1, Е2, ЕЗ

та Е8) . вілмінні за фенотипом від вихідної культури .--—

Проведено порівняльний аналіз властивостей та фенотипових .ознак вихідної культури S.globisporus 1912 (pSG1912+) і похідних, віднесених до обох груп. В результаті цього виявилось, що похідні, віднесені до різних груп, мають відмінності в антибіотичній активності, стійкості до норсетрицину та Ltz-фенотипові. Похідні другої групи перестали пригнічувати ріст ряду штамів стрептоміцетів, які пригнічуються вихідним штамом S.globisporus 1912 (pSG1912+) та

похідними першої групи, були чутливі до антибіотичної речовини, що синтезується вихідним штамом З.діоЬізрогиз 1912 (р5С1912+) та похідними першої групи. Змін в спектрі стійкості до поширених антибіотиків • не знайдено, але дослідження виявили чутливість до норсетрицина тільки похідних другої групи . Похідні другої групи мали також іи'-фенотип та були чутливі до иг+-фенотипу як вихідного штаму, так і похідних першої групи.

На підставі отриманих результатів зроблено висновок, що плазміда рБС1912 у З.дІоЬіБрогиз 1912 (рБС1912+) приймає участь в кодуванні синтезу стрептоміцетом речовин з антибіотичними властивостями та стійкості до них, надає мікроорганізмові стійкість до норсетрицину та иг+-фенотип. Тільки чотири клони похідних, другої групи дійсно втратили позахромосомну ДНК. Цей висновок був підтверджений даними, отриманими після повторної обробки клонів Е45 та Е47 елімінуючими факторами (підвищеною температурою та етидієм бромідом (Рис. 3). Це <*- ^ Рис.З.

р--*-* _

V

Електрофоретичне розділення

препаратів тотальної ДНК: а- Э.дЬЬгёрогиз 1912 (рЭС1912+);

б- штам Е45 1 групи (після обробки елімі-нуючим фактором).

1-хромосомна ДНК,

2-4 - форми плазмідної ДНК:

2-відкрита кільцева, 3-лінійна,

4-ковалентно замкнена кільцева форма.

і

2

3

4

виявило можливість існування плазміди р8СІ912 як в автономному, так і в інтегрованому станах із збереженням експресії локалізованих на ній генів.

Для безпосереднього доказу детермінації плазмідою рБС1912 феномену "летального зигозису" і синтезу антибіотичних речовин та стійкості до них було проведено трансформацію як безплазмідного варіанту Є8 (Б дІоЬІБрогиз 1912-8 (рЭС1912")) та Б.ієуогіз 165 (обидва відносяться до глобіспоринової групи), так і штаму Б-дгізеив 68-31, який відноситься до групи сірих культур. Ці штами були відібрані для використання як реципієнти в зв'язку з тим, що вони, з одного боку, чутливі до дії антибіотичних речовин, детермінація синтезу яких пов'зується з плазмідою р5С1912, а з другого - вони мали Ш" -фенотип; що повинно дозволити виявити фенотипові ознаки, детерміновані плазмідою рБ01912.

В дослідах по трансформації плазмідною ДНК рБС1912 протопластів відібраних реципієнтів було отримано 725 клонів, які виявили фенотипову ознаку, що детермінується трансформуючим фактором (плазмідою рБС1912) - здатність пригнічувати ріст тестерного штаму Б.ієуогіз 165. З них 75 клонів трансформантів було досліджено на наявність плазмідної ДНК фізичними методами. У всіх перевірених трансформантів виявлена плазмідна ДНК, аналогічна по рухливості в агарозному гелі плазміді р5Сі912. Перевірені трансформанти всіх трьох використаних реципієнтів виявились здатними виявляти Ш+-фенотип на тих же штамах, що і вихідний шта^ГЗ.дІоЬізрогиз 1912 (р5С1912+).

Багато вивчених плазмід стрептоміцетів виявились кон'югативними. Для визначення здатності плазміди рБ01912 до кон'югативного переходу проводили схрещування З.дІоЬІБрогиз 1912 (р301912+) з штамом Б.ІмсІапз ТК 24. У п'яти виділених клонів (К1, К2, КЗ, К4, К6) було виявлено плазмідну ДНК, яка за даними рестрикційиого ■ аналізу

аналогїчна pSG1912. Клони мали властивості донорного штаму, яких не було у реципієнта S.lividans ТК 24 (Рис. 4).

Рис. 4.

Електрофореграма розділення рестрикційних фрагментів ДНК плазміди pSG1912 та позахро-мосомної ДНК, виділеної з кон'юганта К6:

1- тотальна ДНК S.lividans ТК 24;

2- ДНК X + Hindill ; 3-pSÜ1912 + BamHI; 4- ДНК К6 + BamHI;

5-pSG1912 +Pvull; 6- ДНК К6 + Pvull.

Таким чином, перенесення в клітини реципієнтів плазмідноі ДНК супроводжується появою нових фекотилових ознак у трансформантів, що вважається безперечним доказом детермінації плазмідою цих властивостей (Hutter and Eckhardt, 1988).

У зв'язку із здатністю плазміди pSG1912 здійснювати інтеграцію в хромосому і ексцизію із неї проведені дослідження по вивченню впливу цих процесів на молекулярну масу і структуру плазміди. За даними рестрикційного аналізу ці процеси проходять без делецій та транслохацій послідовностей ДНК плазміди та інсерцій хромосомної ДНК.

3.Побудова рестрикційної та фізичної карт плазміди PSG1912. Після виявлення нової плазміди pSG1912 поряд з визначенням ознак, що детермінує плазміда, вивчали молекулярну будову і визначали копійність і розмір молекули. Для побудови рестрикційної карти проводили аналіз за допомогою ендонуклеаз рестрикції (таблиця 1).

Нами була побудозана рестрикційна карта плазміди pSG1912 для S рестриктаз і встановлена наявність для рестриктаз Alul, BamHI,

1 2. З Ч 5 6

Таблиця 1.

Рестрикційний аналіз ДНК плазміди pSG1912.

І Рестриктази І Розміри фрагментів (тпн), що утворилися 1

І І в результаті обробки рестриктазами І

одинарні перевари .

BamHI 11,2

Pstl 11,2

Sacl 11,2

Bglll 5,1 ¡6,1

Pvull 4,8 і 6,4

Kpnl 0,9; 1,8; 8,6

подвійні перевари

BamHI + Pstl • 11,2

BamH' + Sacl 2,9; 8,3

Pstl + Sacl 2,9; 8,3

Bglll + BamHI 5,1; 6,1

Bglll + Pstl ‘ 5,1; 6,1

Bglll + Sacl 2,3; 2,9; 6,1

Pvull + BamHI 1,2; 4,8; 5,2

Pvull + Pstl 1,2; 4,8; 5,2

Pvull + Sacl 2,2; 4,2; 4,8

Pvull + Bglll 1,2; 4,8; 5,1

Kpnl + BamHI 0,9; 1.8; 3,3; 5,3

Kpnl + Pstl . 0,9; 1.8; 3,3; 5,3

Kpnl + Sacl 0,9; 1.8; 2,4; 6,2

РзН і Басі по одному сайту впізнання на молекулі, що робить плазміду придатною для побудови на іі основі векторів клонування (Рис. 5). Молекулярна маса плазміди рЗЄ1912 становить 11,2 тпн. Плазміда р501912 виявилась висококопійною - до 500 копій на одну

хромосому.

Оді II

Рис.5

Рестрикційн» карта плазміди

васі

[тМгерЯсоп рБС1912.

КрпІ

РуиЛ'

Після побудови рестрикційної карти отримані відомості були використані для визначення розміру і розташування фрагмента плазмїдної ДНК, що функціонує як мініреплікон. Було встановлено, що БаиЗА - фрагмент плазміди рБС1912 в 4,5 тпн достатній для

З.дІоЬіврогиз 1912-8 (р5С1912') гібридним плазмідам рЗСМІ-рБСб, що побудовані на базі колійної плазміди рІЮі9В6 (нездатної самостійно реплікуватися в стрептоміцетах) . Цей БаиЗА - фрагмент було локалізовано за допомогою рестрикційного аналізу на рестрикційній карті плазміди р5С1912 (Рис.5). •

4. Фізико-хїмічні та біологічні властивості метаболітів в.дІоЬїврогиз 1912. Як встановлено нами, З.дІоЬізрогив 1912 (р361912+) синтезує комплекс речовин з антибіотичними властивостями. Ці речовини мають антрациклінову природу.

Методами тонкошарової хроматографії було досліджено хлороформ - ацетоновий екстракт і встановлено, що комплекс метаболітів, синтезований Б.діоЬізрогиз 1912 (р5в1912+), складається з 7 речовин, які мають різну ступінь антибіотичної активності (Рис. 6).

Нами було проведено дослідження динаміки синтезу компонентів комплексу метаболітів з антибіотичними властивостями і встановлено, що

забезпечення здатності реплікуватись в клітинах стрептоміцета

найбільше (до 60%) синтезується речовини з 0,33, з якої утворюються речовини плям з РМ 0,65 та 0.95 і одночасно з цією речовиною проходить

В!

ЯІ

Рис.в.

Тонкошарова

хроматограма;

1 -Є.дІоЬіхрошгиз

1912-8(рЄб1912')і

2-Б.дІоЬІзрогиз

о.во

та оіоавтограма

1812(рБС1612+)

0,45 метаболітів о.зз В.дІоЬігрогш; 1912 0і30 (РБС1в12+)

(заштриховано).

О

О

ЙІ 0

і

2.

синтез речовини з Ри 0,2. Речовина з РЙ 0,2 не утворюється з речовини з Р«0,33. . .

Ми вивчали поглинання речовин окремих фракцій в ультрафіолетових та видимих промінях. Спектри кожної речовини мають по 2 добре виражених піки в ультрафіолетовій частині спектру і по одному пікові в інтервалі 446 - 500 нм (таблиця 2).

Встановлено, що метаболіти з ГМ 0,33; 0,65 та 0,95 розчиняються в ацетоні, етанолі, метанолі, хлороформі, етилацетаті, бензолі, ксилолі, бутанолі- 1. чотирьоххлористому вуглецю і не розчинні в есЬіоі. гексані та воді. Якщо підлужити воду МаОН до рН 8,5 - 9,0, то можна екстрагувати нею до 90% речовин, розчинених в органічних розчинниках. .

У безплазмідного варіанту З.діоЬізрогиБ 1912-8 (рБ01912*) в аналогічних умовах вирощування та екстракції методом тонкошарової хроматографії не виявлено метаболітів, які були б аналогічні метаболітам, знайденим у вихідного штама (Рис.6).

Таблиця 2.

Фізико-хімічні характеристики речовин,що синтезуються

S.globisporus 1912 ( pSG1912 +)

М плями : Молекулярна : Молекулярна : Максимуми поглинання формула* вага (в нм) і колір.

0,20 - ' - : 214; 260; 442

0,33 С37Н44О14 714,2 . : темно червоний : 218; 260; 446

0,65 С 37 Н 42° 14 710,2 : темно червоний : 213; 248; 456

0,95 С 37 Н 42 О13 696,0 : бузковий : 215; 264; 500 : фіолетовий

* - встановлено за допомогою FAB мас-спектроскопіі.

У двох трансформантів ( Т68-29 і Т68-34) , отриманих в дослідах по трансформації протопластів S.griseus 68-31, проведено вивчення антибіотичної речовини методами тонкошарової хроматографії і біоавто-графії. У них були виявлені речовини, які мали антибіотичну активність і значення Rf, аналогічні речовинам вихідного штаму S.globisporus 1912 (pSG1912 + ). Штам-реципієнт S.griseus 61-38 таких біологічно активних речовин не синтезував. .

Одержані дані підтверджують детермінацію плазмідою pSG1912 синтезу речовин з антибіотичними властивостями.

У зв'язку з тим, що антибіотики антрациклінової природи широко використовуються в хіміотерапії пухлин, було досліджено здатність метаболітів S.globisporus 1912 (pSG1912 + ) впливати на розвиток пухлин. В наших експериментах використовували в якості моделі пєревивну пухлину - карциному Герена.

Наші попередні дослідження встановили, що термін життя експериментальних тварин довший в 1,5 рази терміну життя контрольних щурів. Одержані результати також виявили здатність метаболітів Б.дІоЬізрогиз 1912 (рЗС1912+) значно пригнічувати розвиток експериментальної пухлини. Необхідно відмітити, що не спостерігалося гострої токсичної дії препарату на щурів.

Таким чином, отримані нами результати є важливими для вивчення позахромосомноі спадковості стрептоміцетів. Встановлено, що плазміда рЗС1912 детермінує синтез антибіотиків антрациклінової природи, стійкість до них, стійкість до антибіотика норсетрицина та є кон'ю-гативною. Проведення рестрикційного аналізу плазміди рЭС1912 дозволило виявити на ній унікальні сайти рестрикції для 4 ендонуклеаз, що відкриває можливість конструювання вектора для генноінженерних експериментів по клонуванню генів. З другого боку, антибіотичні речовини, що синтезуються в.дІоЬізрогиз 1912 (рБОІ91пригнічують розвиток пухлин і грампозитивних мікроорганізмів. Подальші дослідження метаболітів Б.дкзЫзрогиэ 1912 (рБЄ 1912+) необхідні для встановлення можливості застосування їх в медицині та ветеринарії.

. ВУСНОВКІ/.

1. Показано, що 50 % перевірених штамів стрептоміцетів

глобіспоринової групи містять плазмідну ДНК в автономній формі. Стабільно плазмідна ДНК виділялася тільки з одного штаму -Б.дІоЬізрогиз

1912._________________________________________________________________

2. Плазміда рБС1912 є висококопійною (500 копій на одну хромосому), кільцевою та має молекулярний розмір 11,2 тпн.

3. Побудована рестрикційна карта плазміди рБС1912 для 6 ендонуклеаз рестрикції. Виявлено наявність унікальних сайтів рестрикції для ферментів АІиі, ВатНІ, РбИ та Басі. Встановлено, що мініреплікон

плазміди рЗй1912 розташований на ЭаиЗА фрагменті розміром 4,5 тпн та визначено його локалізацію на рестрикційній карті плазміди.

4. Доказано, що плазміда р5С1912 є кон'югативною і детермінує синтез антибіотичних речовин і стійкість до них, а також стійкість до антибіотика норсетрицина.

5. Встановлено, що плазміда рЗС19!2 стабільно існує як у вихідному хазяїні З.дІоЬієрогив 1912 (рЗС1912+), так і в деяких інших споріднених штамах (З.ієуогіз 165 і в.дгіБеиз 68-31), в які вона була перенесена методами трансформації чи кон'югації. Плазміда здатна до інтеграції в хромосоми цих штамів та ексцизію з них без змін в молекулярному розмірі та структурі.

Генетичні детермінанти плазміди р5С1912 здатні експресуаатися як в автономному, так і в інтегрованому станах. ,

6. В З-Ітсіапв ТК24 плазміда рЗС1912 існує тільки в автономній формі, що свідчить про відсутність аКВ послідовності, в яку за рахунок сайтспецифічної рекомбінації могла б інтегрувати плазміда.

7. Штам З.дІоЬізрогиз 1912 (р301912+) синтезує комплекс споріднених антибіотичних речовин антрациклінової природи. Речовини пригнічують ріст грампозитивних мікроорганізмів (особливо інших стрептоміцетів) та виявляють протипухлинну дію на моделі перевивної пухлини карциноми Герена.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Полищук Л.В., Дехтяренко Т.Д., Стефанишин Е.Е., Мацелюх Б.П., Козырицкая В.Е. Плазмиды стрептомицегов глобиспориновой групы//Микробиол. ж,-1985.-47.-Ы 4.- с. 83 - 88.

2. Стефанишин Е.Е., Дехтяренко Т.Д., Полищук Л.В., Заверуха В.Б., Мацелюх Є.П. Рестрикционный анализ плазмиды р301Э12// Микробиол.

ж,- 1986.-48.- N2.-0. 79-80.

-20-

3. Стенько A.C., Мацелюх Б.Л., Дехтяренко Т.Д., Стефанишин Е.Е., Стефанов A.B., Безкоровайная H.K., Полищук Л.В., Машковский H.H. Трансформация протопластов Streptomyces griseus хромосомной и плазмидной ДНК, заключенной в липосомы// Биополимеры и клетка.-1986.-2.-N 5.-е. 270 - 274.

4. Полищук Л.В., Стефанишин Е Е., Дехтяренко Т.Д., Стенько A.C., Заверуха В.Б., Мацелюх Б.П. Трансформация протопластов Streptomyces sp. 1912-8 с помощью ДНК плазмиды р5С1912//Микробиол. ж,- 1987,-49.-N 1.- с. 24 -28.

5. Полищук Л,В., Полевода Б.В., Заверуха В.Б., Мацелюх Б.П. Изучение стабильности наследования плазмиды pSG1912 клетками Streptomyces globisporus 1912 и гетерологичных штаммов стрептомице-тов// Микробиол. Ж.-1992.-54.-Ы 3.-С.9-14.

6. Заверуха В.Б., Полевода Б.В., Полищук Л.В., Мацелюх Б.П.

Клонирование фрагментов стрептомицетной плазмиды pSG1912 в составе вектора рІІС19//Микробиол. ж,- 1992,- 54,- N 5.с. 30 -35. '

7. Поліщук Л.В. Особливості біосинтезу метаболітів з

антимікробними властивостями Streptomyces globisporus 1912 //

Матеріали І Установчого з'їзду УМТ,- Одеса .-1993.-Мікробіол. ж,-1994,-56.- N 2,- с.99.

Полищук Л.В. .

Внехромосомная наследственность S.globisporus 1912.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07. - микробиология, Институт микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного НАН Украины, Киев, 1995.

РЕЗЮМЕ

У ЗО штамов стрептомицетов, выделенных из образцов почв различных регионов было изучено наличие плазмид и фенотипических признаков, которые могут детерминироваться ими. Был отобран штам

S.globisporus’ 1912 (p5G1912+), имеющий кольцевую мультикопийную плазмиду pSG1912 стабильно выделяемую и детерминирующую Ltz+-фенотип, синтез веществ антрациклиновой природы с антибиотическими свойствами, устойчивость к ним и антибиотику норсетрицину. Была построена рестрикционная карта плазмиды pSG19!2 (11,2 тпн) и

локализован на ней минирепликон. Изучены некоторые физикохимические свойства антибитических веществ, синтезируемых

S.globisporus 1912 (pSG19l2+). Установлено, что спектр

антибиотического действия метаболитов S.globisporus 1912 (pSG19t2+) включает грамположительные микроорганизмы и они оказывают противоопухолевое действие. -

Ключові слова: стрептоміцети, плазміди, компетентні клітини, протопласти, трасформація, трансформанти, антибіотик, рестрикція, тонкошарова хроматографія, стійкість до антибіотиків, антибіотична дія, електрофорез, Ltz-фенотип, елімінація, мініреплікон.

Polishchuk L.

The Extrachromosome heredity of S.globisporus 1912.

The Candidate Thesis for a Phylosophy Degree, a Speciality 03.00.07 -Microbiology, Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukrainian , Kiev, 1995.

SUMMARY

Presence of plasmid DNAs and some plasmidborn phenotypic properties have been investigeted for 30 Streptomycetes strains, isolated from samples of soil. Strain S.globisporus 1912 (pSG1912+) has been picked out as one which containing stable circular multicopy plasmid pSG1912. It

was shown that PSG1912 determines Ltz+-phenotype, synthesis of anthracycline antibiotics, resistence to them and northetricene. Restriction map of plasmid pSG1912 (11,2 kb) had been constracted and minireplicon has been localized on it. Some physical and chemical properties of antibiotic substances producing by S.globisporus 1912 (pSG1912+) have been studied. It was established S.globisporus 1912 (pSG1912+) substances have antibiotic activity against grampositive microorganisms and a tumor.

30K. N>297 T.100 YBK HAY 1095 r.