Влияние воды на биологические структуры тканей человека, животных и на биологически активные вещества растительного происхождения

Николаева, Светлана Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние воды на биологические структуры тканей человека, животных и на биологически активные вещества растительного происхождения
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние воды на биологические структуры тканей человека, животных и на биологически активные вещества растительного происхождения"

- £

^ На правах рукописи

Николаева Светлана Сергеевна

Влияние воды на биологические структуры тканей человека, животных и на биологически активпые вещества растительного

происхождения

03.00.23 - биотехнология 16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степеии доктора биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском центре биологически? структур ВИЛАР

Научные консультанты: академик РАМН, доктор технических наук Быков Валерий Алексееви доктор биологических наук Ребров Леонид Борисович

Официальные оппоненты: доктор химических наук доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Браудо Евгений Евгеньевич Шишкин Сергей Сергеевич Грибанов Генадий Александров«

Ведущая организация: ОАО биотехнология

Зашита диссертации состоится -Л. " января 1998 года в часов 1 заседани диссертационного совета Д.053.34.13 в Российском химик-технологическом университете им. Д.М. Менделеева по адресу: 12504 Москва, Миусская пл., 9

С диссертацией можно ознакомиться в НИЦ РХТУ им. Д.М. Менделеева

Iя

Автореферат разослан " ¿¡у " декабря 1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.И. Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Проблема влагообмена, роль свободной и связанной воды в биологических структурах являются ключевыми вопросами, т.к. все прижизненные и посмертные процессы развиваются в биогетерогенных водных системах. Хотя последние десятилетия характеризуются интенсивным и разносторонним изучением роли воды в структурной организации биополимеров, лишь немногочисленные исследования посвящены изучению влияния характера связанной воды на структурную устойчивость белков и физико-химические свойства тканей человека и животных (Михайлов А.Н., 1980; Аксенов С.И., 1990; Есипова Н.Г.,. 1965-1995; Привалов П.Л., 1987; Kuntz J.D., 1971, 1974; Bull Н.В., 1979; Van Hal D.A., 1996; Bert T.L.,1995).

При изучении способности биологических тканей поглощать воду из жидкой и паровой фазы недостаточно уделялось внимание участию в этом процессе отдельных структурных компонентов и белков, количество и структурная конформация которых может меняться при различных заболеваниях, а также в процессе химических и физических воздействий.

Одной из недостаточно разработанных крупных проблем химии биологических систем, является также изучение состояния воды в биологически активных веществах растительного происхождения. До сих пор не существует четких представлений, позволяющих объяснить особые свойства воды в структуре БАВ. Что же касается данных о состоянии воды в различных флавоноидах, об энергии и природе ее связей, то в литературе они практически отсутствуют. Для оценки действия лекарственных веществ и решения некоторых практических вопросов биотехнологии их производства и хранения важна количественная оценка водно-солевого транспорта через клеточные мембраны. Несмотря на большое количество работ по изучению влажностных характеристик БАВ, этот вопрос остается актуальным до сих пор (Попков В.А., 1981-1985г.г.; Сироткина Г.Г., 1996г.; Botha S.A., 1986; Chen Т.,1995; Kerk J., 1995).

Существующие в литературе расхождения в оценках гидратации являются существенным препятствием для создания концепций механизма взаимодействия биологических структур с водой. Причины расхождения в значительной мере связаны с трудностью интерпретации данных, полученных разными методами.

В связи с этим актуальной проблемой является разработка научной основы и создание методологии исследования механизмов гидратации для получения данных о формах и энергии связи воды, поглощаемой из жидкой и паровой фазы биологическими структурами животного и растительного происхождения.

Такие данные необходимы при диагностике заболеваний, в судебной медицине, в трансплантологии, при консервации органов и тканей, в производстве кожи и меха, а также в фармацевтической промышленности

при разработке методик получения лекарственных средств, для научного обоснования регламента сушки, контроле за их качеством, сохранностью и ДР-

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение влияния воды на биологические структуры различных тканей человека и животных, на клеточные мембраны и БАВ растительного происхождения и углубленное исследование закономерностей гидратации и проницаемости различных биоструктур и их физико-химических характеристик при взаимодействии с водой. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• Разработать научные основы и создать методологию изучения состояния воды и ее влияния на физико-химические свойства биологических структур животного и растительного происхождения.

• Изучить закономерности гидратации и экспериментально обосновать наличие нескольких типов воды, связанной различной степенью прочности в тканях человека, животных, клеточных структурах и фитопрепаратах в условиях различной относительной влажности.

• Изучить топографические, возрастные, аутолитические особенности состояния воды в коже, ахилловых сухожилиях, хряще, мышце человека, животных и в их структурных компонентах.

• Исследовать влияние структурной модификации коллагена и степени дезорганизации углеводно-белковых комплексов на влагообменные процессы в соединительной ткани и ее физико-химические свойства.

• Оценить влияние фиксирующих и консервирующих растворов на сорбционные и физико-химические характеристики различных биологических тканей.

• Изучить механизм возникновения пергаментации биологических тканей и разработать метод их восстановления.

• Исследовать связь между сорбционными свойствами и химической структурой стандартов фитопрепаратов и лекарственных средств и определить влияние воды на их физико-химические свойства.

Научная новизна. Создана научная основа и методология изучения влияния воды на биологические структуры животного и растительного происхождения. Комплекс акваметрических и физико-химических методов исследования позволил дать развернутую объективную оценку состояния воды в различных биоструктурах на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях.

Проведенные исследования позволили впервые дать сравнительную количественную оценку различных форм связанной воды и выявить отличительные закономерности гидратации в разных тканях (кожа, мышцы, хрящ, сухожилия) и их структурных компонентах (дерма, эпидермис, коллаген, эластин, гликозаминогликаны) в норме, онтогенезе, при посмертном аутолизе, структурных нарушениях, связанных с денатурацией коллагена и дезорганизацией белково-полисахаридного

комплекса, при формальдегидной фиксации, обработке консервирующими веществами, в процессе сушки и регидратации.

Полученные в работе данные являются новой информацией для расшифровки механизмов развития патологических изменений органов и тканей человека и животных, связанных со старением организма, с дезорганизацией отдельных структурных компонентов биологических тканей и тканевых биополимеров, а также для обоснования различных медикаментозных обработок в процессе лечения.

Получены принципиально новые данные о взаимосвязи между структурной организацией биологических тканей человека и животных, их влажностными параметрами и физико-химическими свойствами (реология, структурная устойчивость и др.).

Впервые изучены закономерности гидратации биологически активных веществ растительного происхождения, как функции гидротермических параметров окружающей среды. В условиях повышенной относительной влажности окружающей среды в субстанциях выявлено существование фракций свободной воды, радикально влияющей на их свойства.

Научно-практическая значимость. В результате использования акваметрических и физико-химических методов исследования: титрование с реактивом Фишера, сорбционный метод, набухание в жидкой воде, высушивание до постоянного веса и термический анализ (дифференциально-сканирующая калориметрия и термогравиметрия), ядерный магнитный резонанс, рентгеноструктурный анализ, электронная микроскопия, гидротермическая устойчивость, а также биохимические методы исследования, разработаны научные основы и создана методология, позволяющая проводить объективную оценку влагообменных процессов в любых биологических структурах, объектах животного и растительного происхождения и контролировать их сохранность при различных воздействиях.

Результаты исследования по влиянию посмертного аутолиза на изменение характера связывания и содержания воды в различных тканях человека и животных, их биохимического состава и физико-химических свойств имеют важные выводы для теории и практики трансплантации органов и тканей, их консервации и в различных судебно-медицинских исследованиях. Полученные результаты, в частности, позволяют выбрать оптимальный режим влажносгных характеристик для длительного сохранения консервированных биологических структур.

Кроме того, выводы работы по изучению влагообменных процессов в тканях, фиксированных формальдегидом, и обработанных консервирующими растворами, могут быть использованы при разработке искусственных трансплантантов мягких тканей с заранее заданными свойствами.

: Определенную практическую значимость для решения проблем длительного сохранения и восстановления внешнего вида мумий и биообъектов, с точки зрения биотехнологических задач в археологии и палеонтологии, имеют результаты исследования механизма, возникновения пергаментации при сушке и разработка специального метода реставрации пергаментированных тканей посредством ее регидратации. Сведения о влиянии воды на свойства кожи, дермы и коллагена могут быть использованы в технологических процессах переработки кожи и меха.

Результаты исследования состояния воды и ее влияния на биологически активные вещества растительного происхождения позволили уточнить характеристики стандартных веществ: гигроскопичность, температурные интервалы удаления различных типов связанной воды и температуры плавления самих веществ, которые заложены в фармстатью на флавоноид-стандартный образец, в Т.У.-рутин-стандарт, Т.У.-кверцетин-стандартный образец и другую научно-техническую документацию. Результаты исследования использованы при разработке новых методик получения кверцетин-стандарта и флакозид-стандарта. Предложены рекомендации по работе с субстанциями и стандартами, учитывающие наличие и влияние выявленных фракций свободной и связанной воды на их свойства.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 40 работ.

Основные результаты доложены: на Научном совете по проблемам биологической физики АН СССР г.Тбилиси, 1973г.; на XI Всесоюзном симпозиуме по Реологии, г.Суздаль, 1980г.; на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы действия ионизирующего излучения на структуру и функцию белков", г.Львов, 1986г., АН СССР; на Всесоюзной научно-технической конференции "Реологии и оптимизация процессов переработки полимеров" г.Ижевск, 1989г.; на VIII Всесоюзной школе по биологии опорно-двигательного аппарата, г.Киев, 1990г.; на 15-ой Международной конференции "Ядерный магнитный резонанс в биологии и медицине", Израиль, 1993г.; на юбилейной научной сессии, посвященной 100-летию со дня рождения Н.А.Преображенского, Москва, 1996г.; на 2-ой международной конференции по химии природных соединений, Турция, г.Эскешихир, 1996г.

Вклад автора. Автору принадлежит основная роль в выборе направления исследования, обобщении и трактовке полученного экспериментального материала. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал на всех этапах исследования от постановки задачи и эксперимента, до обсуждения и оформления результатов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 302 страницах, содержит 33 таблицы и 64 рисунка. Работа состоит из введения, литературного обзора (3 главы), экспериментальной части (гл.4),

результатов исследования (гл.5-8), обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 512 источников (из них 210 на руссом языке и 302 на иностранных языках).

Содержание диссертации.

Материалы и методы исследования

Материалом исследования явились ткани человека: кожа живота, спины, бедра, а также эпидермис и дерма кожи, гиалиновый хрящ надколенника, трахеи и ребра, ахиллово сухожилие, скелетная мышца спины, живота и бедра, дерма кожи крупного рогатого скота, а также кожа и сухожилия хвостов белых крыс.

В работе исследовался белок коллаген, который выделяли из кожи животных и человека, а также коллаген и препарат эластин фирмы "Serva". При изучении роли гликозаминогликанов во влагообменных процессах соединительной ткани, проводили ферментативную дезорганизацию основного вещества сухожилия и гиалинового хряща. Кроме того, изучалась влагопоглощающая способность модельных систем: ß-желатина-гепарин, ß-желатина-гиалуроновая кислота, ß- желатина-хондромукоид.

При исследовании посмертных изменений, образцы тканей хранили в эксикаторе над водой при 22°С и 5°С в течение 1-120 часов. В качестве антисептика применяли тимол или раствор азида натрия.

При изучении влияния фиксации и консервации на влагообменные процессы в тканях, последние обрабатывали растворами формальдегида, концентрации 4%, 8% (pH 3,5; 7,0) и водными растворами глицерина, ацетата калия и спирта с постепенно увеличивающейся концентрацией ( от 5% до 30% каждый).

Материалом для изучения возникновения пергаментации служили образцы кожи с признаками естественной или искусственно вызванной пергаментации, для чего кожу специально подвергали следующим воздействиям: образцы высушивали над СаС12 при 37°С, в течение 24 часов или в комнатных условиях (120 часов) с периодическим облучением У.Ф. светом (лампа ПРК) для уменьшения развития гнилостных процессов.

Исследование проницаемости клеточных мембран для молекул воды проводилось на сухой биомассе женьшеня (Biomassa Ginsengisicca), полученная in vitro из калуссной ткани штамма БИО-2 от корня женьшеня Panaxqinsenq С. А. Меу семейства аралиевых - Araliaclase.

Для изучения количества и состояния воды в БАВ растительного происхождения были использованы следующие объекты: 1. Стандартные образцы из класса флавоноидов, пять из которых (рутин, кверцегин, лютеолин, лютеолин-7-глюкозид и флакозид) разработаны в НПО "ВИЛАР", а дигидрокверцетин в Московской Медицинской академии им.И.М.Сеченова.

2. Фитопрепараты флавоноидной природы: диквертин и салифозид.

3. Сухие экстракты: танацехол, хелепинБ и десмокан, основными компонентами которых являются флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты.

Для изучения количества и характера воды в образцах животного и растительного происхождения были использованы: термический анализ (дифференциальный сканирующий калориметр Ю8С-2 и термогравиметрический прибор ТО-7 фирма Регкт-Е1тег), ядерный магнитный резонанс (спектрометр СХР-300 фирма "Вгикег" и "Миниспек-РС-20"), титрование с реактивом К.Фишера, изучение процессов сорбции-десорбции при разных значениях упругости водяных паров, создаваемых растворами эталонных солей, определение степени набухания в жидкой воде.

Структура коллагена и тканей изучалась с помощью рентгеноструктурного анализа (установка УРС-55 А) и электронно-микроскопических исследований ("Стереоскан-4-10"). В работе использовались также методы, характеризующие зависимость реологических показателей тканей от природы и количества содержащейся в них воды, для чего был создан специальный прибор.

Расчет поперечных сшивок в коллагене проводили по методу Флори и Рейнера. Определение структурных превращений коллагена регистрировали по величине структурной вязкости и оптического вращения. Наряду с физико-химическими исследованиями проводился контроль содержания в тканях основных биохимических компонентов: гексозаминов, гексуроновых кислот и оксипролина.

Результаты и их обсуждение.

1. Разработка научных основ и методологии изучения взаимодействия воды с различными биологическими структурами животного и БАВ растительного происхождения.

Для создания научной основы и методологии изучения механизмов взаимодействия воды с различными биологическими структурами был использован комплекс акваметрических и физико-химических методов, перечисленных в разделе "Материалы и методы исследования".

Разработанная методология дает возможность оценить количество и прочность связи воды , содержащейся в различных образцах и установить характер ее влияния на физико-химические свойства биологических структур. Оценка производится по следующим параметрам:

• содержание фракций связанной и свободной воды и их физические свойства;

• количество мономолекулярно связанной воды и сорбционная емкость образцов в широком влажностном интервале;

• температурные интервалы и величина энтальпий фазовых переходов при испарении или плавлении воды, а также коэффициенты набухания образцов в жидкой воде;

• модуль упругости и температура гидротермического сокращения.

Применение электронной микроскопии, рентгеноструктурного анализа и биохимических методов исследования позволяют изучить взаимосвязь между структурной организацией, морфологическим строением, биохимическим составом и содержанием воды в биологических тканях и их структурных компонентах.

Исследования показали, что каждый из этих методов позволяет охарактеризовать лишь определенный влажностный параметр, который нуждается в подтверждении или расшифровке.

Проведение комплексного исследования дает возможность получить обобщенные сведения о состоянии и характере связывания воды.

Созданная научная основа и методология исследования позволили получить широкую информацию о механизме процессов, протекающих в биологических структурах животного и растительного происхождения при различной влажности и установить характер изменения при этом их физико-химических свойств.

2. Взаимодействие соединительной ткани и ее структурных компонентов с водой.

Исследования топографических особенностей кожного покрова человека показали, что по содержанию воды кожа изученных участков тела располагается по убывающей в следующем порядке: бедро=> животг^спина (табл.1).

Таблица 1.

Топографические особенности влагосодержания кожи человека и ахиллова

сухожилия.

Топограф, участок Содержание воды, гЩО/ЮОг ткани

К.Фшпер Калорнмет связанная сорбция

общая свободп. связанная а„

1. Бедро 65,77+2,18 28,70+2,48 35,97+2,40 36,3±2,0 10,35+0,40 34,4±1,1

2. Живот 63,56±1,7 27,89+2,35 35,66+0,94 36,7+1,9 10,28+0,30 32,7±1,2

3. Спина 62,40+1,60 26,90+1,80 35,46±0,87 36,9+1,5 10,50±0,40 34,8±1,3

4. Ахиллово сухожилие 68,1+2,1 21,6±2,1 46,5+1,4 44,5+1,2 14,5±1,2 45,9±1,2

Раздельное определение фракций свободной и связанной воды позволило установить, что количество связанной воды не зависит от топографии тела и составляет для кожи здорового человека ~36%. Установленные топографические особенности влагосодержания образцов

определяются фракцией свободной воды, которая в значительной мере зависит от суммарного объема межструктурных пространств ткани и согласуются с особенностями архитектоники вязи изученных участков кожи.

р! Р,

Рис.1. Изотерма сорбции (1) и десорбции (2) паров воды кожей человека в

координатах: а- р/р5 (А) и

гН20/100г

р! Р,

а{\~р/р,)

•Р'Р. (Б)

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,Г'0,В 0.9

Рис.2. Изотермы сорбции (->), десорбции (<-) паров воды коллагеном (о»), а-желатиной (л ), Р-желатиной (о ), эластином (к ) в координатах: а-р/р5-

Изотермы сорбции и десорбции паров воды кожей и ее структурными компонентами, приведенные на рис.1 и 2, свидетельствуют о многообразии форм связи воды и могут быть описаны уравнением БЭТ, что позволяет определить величины эффективной емкости монослоя (ат) и максимальной сорбции (атах) (табл.2).

Таблица 2.

Характеристика содержания воды, поглощаемой кожей и структурными компонентами га паровой фазы.

№ п/п Исследуемый объект Содержание Н20, г/100 г ткани

Связанная вода (Сорбция)

«га ^•так

1. Кожа 10,3±0,9 37,4±1,2

2. Дерма 10,4±0,7 37,9+1,4

3. Эпидермис 16,2±0,4 59,4+2,1

4. Эластин 6,84+0,37 20,5+1,0

5. Коллаген 12,42+0,35 35,9±1,4

6. ск -желатина 3,78+0,53 20,7±1,09

7. ¡5-желатина 7,36±0,52 30,62+1,72

Из приведенных данных следует, что количество воды, находящееся в непосредственном контакте с активными центрами белка, рассчитанное по кривым сорбции составляет 12,42 гН20 на 100 г коллагена, т.е. примерно 0,6 моля Н20 на один аминокислотный остаток, что согласуется с литературными данными сорбции паров воды коллагеном животного происхождения.

Учитывая, что при различных физических и химических воздействиях на ткани, конформация структурных белков может меняться, была исследована, в частности, зависимость сорбционной способности коллагена от конформации его макромолекул. Сравнение величины ат коллагена различных структурных модификаций желатины, позволяют сделать вывод о том, что количество активных центров, способных связываться с молекулами воды при сорбции у коллагена и (3-желатины больше, чем у -желатины. При этом сорбционная способность (атах) препарата коллагена и пленок желатины в спиральной р-конформации также больше, чем клубкообразной, о(-желатины.

Вместе с тем, исследования показали, что пленки желатины со спиральной конформацией способны медленнее поглощать жидкую воду, что очевидно связано с более плотной упаковкой молекул коллагена в р-конформации. Из данных приведенных на рис.3 и в табл.2 следует, что эпидермис связывает значительно большее количество воды по сравнению с кожей, дермой, коллагеном и эластином.

" 40

гН20/100г

10 + 0

Рис.3. Изотермы сорбции паров воды эпидермисом (в), целой кожей (о), дермой (* ) и кожей с удаленным роговым слоем (д) ■

Такое различие объясняется тем, что основной белок эпидермиса -кератин содержит серусодержащие аминокислоты, которые, как известно, способны связывать большое количество воды. Вместе с тем влагосодержание целой кожи и дермы, а также кожи с удаленным роговым слоем в равных влажностных условиях одинаково. Объяснение этого очевидно кроется в том, что вклад эпидермиса, занимающего всего 2% от объема кожи, в суммарную величину сорбционной емкости невелик. Однако эпидермис лимитирует скорость сорбции и десорбции паров воды кожей. Удаление эпидермиса или его рогового слоя способствует ускорению десорбции паров воды из кожного покрова. Впервые установлено, что сорбционное равновесие кожи, лишенной рогового слоя и дермы, устанавливается через 4 суток, а для целого кожного покрова через 7 суток. Не менее важным вопросом, чем природа связывания парообразной воды является поглощение воды из жидкой фазы. Такие исследования важны при различных медикаментозных обработках, пересадке, а также консервации кожи.

Показано, что при погружении в воду, соединительная ткань способна связывать и удерживать в 1,5-2 раза больше воды, чем при сорбции из атмосферы, максимально насыщенной парами воды. При этом скорость проникновения воды из жидкой фазы в -50 раз превышает таковую из паровой фазы. Исследования набухания кожи в воде показали, что основной процесс поглощения воды происходит за 30 сек. При этом поглощается 96% всей воды.

Для того, чтобы оценить характер взаимодействия воды с кожей при различном влагосодержании были проведены калориметрические исследования образцов кожи человека в температурном интервале (-20°0250°С). Результаты исследования приведены на рис.4.

р/р*

и-1-1-1-1-1

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Рис.4. ДСК - термограммы: 1,2 - кожа человека; 3 - коллаген.

Содержание воды в образцах (г/100 г ткани): 1 - 62; 2 - 2,5; 3-43

Термограмма кожного покрова человека в температурной области выше 0°С характеризуется несколькими эндотермическими эффектами (кривая 1). В температурной области +50°С+140°С обнаруживается 4 эндотермических пика (III-VI), обусловленных удалением воды, связанной различной степенью прочности с биополимерами структурных компонентов кожи.

Доказательством того, что эти пики обусловлены испарением воды может служить то, что после высушивания кожи над Р205 эти фазовые переходы исчезают (кривая 2). Для сравнения на этом рисунке дана термограмма коллагена, выделенного из кожи (кр.З), на которой обнаруживается в этой температурной области только один фазовый переход, обусловленный удалением воды. Фазовый переход (II), очевидно, связан с полиморфным превращением липидов, содержащихся в коже, т.к. после спирто-эфирной обработки кожи, он исчезает и при регидратации не восстанавливается.

Остающаяся после высушивания кожи вода в количестве 2+2,5 % является структурносвязанной и удаляется в процессе плавления коллагена при 220°С.

Показано, что после нагревания образцов кожи при этой температуре на рентгенограмме исчезают рефлексы, отвечающие за кристаллическую структуру и появляется аморфное гало.

На термограмме кожи в температурной области ниже 0°С прописывается энтальпийный пик, обусловленный плавлением вымораживаемой, т.е. свободной воды (рис.4, 5). Показано, что в образцах кожи, влагосодержание которых составляет меньше ~40 г! 120 на 100 г ткани, вся имеющаяся в системе вода находится в невымораживаемом состоянии (рис.5, кр.1, 2). Известно, что отсутствие на термограмме

фазового перехода воды в минусовой температурной области, свидетельствует о том, что вся вода находится в связанном состоянии. Очевидно, в этом случае ткани можно замораживать, не опасаясь повреждения белковых структур за счет кристаллизации воды.

При содержании воды > 40 гН20 на 100 г ткани на термограмме, в области температур (0)°С-г(-3)°С прописывается фазовый переход, обусловленный с плавлением замороженной свободной воды (рис.5, кр.З-

5).

-в -А -2 0 < 'С

Рис.5 Энтальпии плавления, вымораживаемой (свободной) воды в коже человека при влагосодержании (г/100г ткани): 1 -18; 2 - 36; 3 -43; 4 - 62;

5-73

Содержание незамерзающей воды, связанной с активными группами биополимеров кожи, рассчитанное по разности между общим влагосодержанием и количеством свободной воды, полученное из площади эндотерм плавления льда составило ~ 39 г на 100 г ткани. Эта величина практически близка к величине максимальной сорбции (атах) (табл.2) и фракции связанной воды, остающийся в коже после ее отжатая (табл.1).

Сравнительная оценка результатов количества связанной воды в коже, полученных разными методами показала, что три метода -титрование воды по К.Фишеру остающееся в ткани после ее отпрессовывания, калориметрия и сорбционный метод исследования (атах) обнаружили близкие между собой значения связанной воды, составляющие порядка ~36-К39 г Н2О/ЮО г ткани. Аналогичная сходимость результатов содержания воды была получена при исследовании дермы теленка и

ахиллового сухожилия.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что вся вода, сорбируемая соединительной тканью из паровой фазы является гидратносвязанной и обладает присущими этой фракции физическими свойствами.

Исследования возрастных особенностей влагосодержания кожи человека показали, что с возрастом влагосодержание кожи несколько увеличивается (табл.3). При этом наблюдается перераспределение количества фракций связанной и свободной воды, выражающееся в том, что количество связанной воды уменьшается, а свободной растет. Изменение содержания фракций воды сопровождается повышением температуры гидротермического сокращения и модуля упругости ткани, что является результатом образования дополнительных межструктурных поперечных сшивок, образование которых в коллагенсодержащих тканях в процессе онтогенеза известно из литературных данных.

Таблица 3

Влияние возраста на физико-химические свойства кожного покрова

человека.

№ п/п Возрасти. группа(лет) Содержание Н^О г/100 ткани Температура гидротерм, сокращения,°С Модуль упругости Е-104Па

общая связанная свободная

1. 17-25 63,76+0,98 37,10±0,88 26,70±1,39 1,39 60,5 1,5±0,1

2. 43-55 64,04+1,76 35,20±1,50 28,80+2,40 1,22 62,5 2,0+0,12

3. 70-84 65,88±1,48 34,66+0,82 31,22+1,81 1,11 64,5 2,5+0,13

Роль коллагена и протеогликанов в связывании и транспорте воды в соединительной ткани была изучена в результате сравнительного исследования влагосодержания различных типов гиалинового хряща, при разрушении в соединительной ткани углеводно-белковых комплексов основного вещества, а также в модельных экспериментах.

Таблица 4.

Содержание воды и биохимических компонентов в гиалиновом хряще

Наименование образца Содержание, г/100 г ткани

вода Коллаген Гексоза- М11НЫ

К.Фишер Сорбция

общая свобод. связан. а-т (•'пи X

Хрящ реберный 57,4+0,6 22,9+1,4 34,5±0,7 14,55 44,1+0,4 56,0+1,3 5,18±0,2

Хрящ трахеи 65,8±0,6 31,0±2,0 34,8+1,5 - - 33,7+3,2 5,06±0,4

Хрящ надколенника 71,1+0,7 19,3+1,2 51,8+1,2 - - 58,7+2,3 4,78±0,51

Изучение состояния воды в хряще позволило показать, что по содержанию воды различные типы гиалинового хряща располагаются по убывающей в следующем порядке: хрящ надколенника, хрящ трахеи, хрящ реберный. При этом большая часть содержащейся в хряще воды находится в связанном состоянии.

Несмотря на различное содержание воды, все три вида хряща характеризуются одинаковым количеством ГАГ.

При этом прослеживается роль коллагена в водопоглощающей способности тканей. Чем больше содержится коллагена, тем меньше свободной воды в тканях, а в случае хряща надколенника значительно больше связанной воды. Аналогичные данные были получены при сравнительной оценке влагосодержания кожи и ахиллова сухожилия (табл. 1) Ахиллово сухожилие, в котором большее количество коллагена по сравнению с кожей, содержит больше связанной и меньше свободной воды.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что коллаген, как основной структурный элемент соединительной ткани играет существенную, а иногда и определяющую роль в количестве и характере связанной воды.

Известно, что изменение качественного и количественного состава углеводно-белковых комплексов основного вещества может явиться одной из причин изменения механизмов связывания воды соединительной тканью. На примере ахиллова сухожилия и реберного хряща впервые показано, что дезорганизация основного вещества приводит к неоднозначному нарушению влагопоглощающей способности соединительной ткани, сопровождающееся изменением ее физико-химических характеристик (табл.5).

Таблица 5.

Влияние разрушения ГАГ на влагопоглощающую способность и

реологические свойства соединительной ткани.

Исследуемый объект Содержание воды, г/100 г ткани Гексоза-мины, г/100 г тканей Модуль упругости Е104Па Жест! ость У 103 н/м

К.Фишер Сорбция

общая связан. свобод ат (Хтах

1 .Ахиллово сухож. 62,3±1,1 46,1 ±0,7 16,2+0,2 14,5+0,2 40, Ш,2 0,55±0,02 1300,0 -

2.То же, обработанно ферментом 64,9+0,9 43,4±0,4 21,5±1,5 8,9+0,4 43,1±1,2 0,1±0,01 430,0 -

З.Хрящ реберный 57,4±0,6 34,5+0,7 22,9+1,4 14,55±0,5 44,1 ±0,4 5,18+0,2 - 19,4

4.То же, обработанно ферментом 61,0±1,1 29,2+1,2 31,8±1,7 12,75+0,4 51,3±0,2 3,90+0,19 - 14,5

В результате обработки тканей муколитическими ферментами значительно изменяется микроструктура коллагеновых волокон соединительной ткани. Электронномикроскопические исследования показали, что при этом разрушается межволоконная сетчатая структура, основу которой составляют протеогликаны. Это приводит к нарушению интегрирующе-буферной функции основного вещества. Наблюдается

разобщение коллагеновых волокон на отдельные фибриллы и образование фибриллярной сетевидной конструкции, что приводит к уменьшению плотности и модуля упругости тканей. Полученные данные подтвердили, что электростатическое взаимодействие анионных групп ГАГ с катионными группами коллагена является одним из факторов, обеспечивающих высокую плотность надмолекулярной упаковки коллагенового комплекса и присущие ему структурно-механические свойства. Дезорганизация основного вещества соединительной ткани сопровождается нарушением ее гидратации. На фоне незначительного повышения общего влагосодержания происходит снижение фракции связанной воды, что свидетельствует об уменьшении активных центров в соединительной ткани, способных взаимодействовать с водой.

Вместе с тем, структурные изменения коллагенового каркаса создают дополнительную возможность для проникновения в них воды из жидкой и максимально насыщенной парообразной фазы.

В результате общее влагосодержание тканей увеличивается за счет фракции свободной воды. Некоторое подтверждение этого объяснения было получено при проведении модельных опытов. При введении гиалуроновой кислоты, хондромукопротеида или гепарина в раствор р-желатины наибольшая влагопоглощающая способность углеводно-белковых комплексов наблюдалась при минимальном содержании ГАГ. Последующее снижение набухания коллагенсодержащих пленок при повышении содержания ГАГ, очевидно, объясняется взаимным экранированием активных групп биополимеров. И только при содержании ГАГ, значительно превышающих концентрацию коллагена происходит увеличение количества воды в образцах. В свете полученных данных становится объяснимыми, известные из литературы данные, об увеличении общего влагосодержания в дегенеративном суставном хряще.

5. Особенности состояния воды в мышце.

Сравнительные исследования содержания воды в различных тканях человека позволили установить, что по значению общего влагосодержания мышца близка к хрящу надколенника (табл.6 и 5)

Таблица 6.

Влагосодержание мышцы

Наименование объекта Содержание воды, г Н20/100 г ткани

К.Фишер Калориметрия Сорбция

Общая Связ. Свобод. Связан. аш ®таах

1 .Мышца бедра 76,3+2,5 23,2+0,8 52,6+2,4 11,6+1,9 7,7±0,05 33,2+2,1

2.Мышца живота 75,8+2,7 22,7+1,5 51,7+1,3 10,9+1,3 7,5+0,03 32,1+2,2

Однако при этом наблюдается существенные различия в характере этой воды. В мышечной ткани, в отличие от соединительной, большая часть воды находится в свободном состоянии. При этом обнаружена неоднородность свойств этой воды.

Если в соединительной ткани вся вода, сорбируемая из паровой фазы и остающаяся после отжатия не вымораживается при температуре ниже нуля, то есть является связанной, и проявляет себя как однородная фракция, то в мышце только 1/2 часть связанной воды не замерзает при понижении температуры.

Исследование состояния воды в мышце при различной относительной влажности с помощью ЯМР-спектров по специально разработанной методике показало наличие в мышце по крайней мере 2-х основных фракций связанной воды, обмен между которыми затруднен.

На рис.6 показаны "разностные" спектры образцов мышцы, которые содержат не одну, а как минимум, две четко различающиеся по ширине линии, свидетельствующие о наличии 2-х фракций воды.

Рис.6. Типичные "разностные" ЯМР-спектры связанной воды в мышце, выдержанной при различной влажности: 1 - 22%; 2 -16%, 3 -10,5%

Ширина линии "пьедестала" для исследованных образцов лежит в диапазоне 25-40 кГц и сравнима с шириной линии биополимерной матрицы, что говорит о сильной структурированности этой фракции воды. Ширина узкой линии "разностного" спектра мышцы сильно изменяется в зависимости от содержания воды в образце (от 0,25 до ЮкГц). Соответствующая ей фракция воды, таким образом, является неоднородной. В ней, по-видимому, представлено несколько состояний воды, между которыми происходит быстрый обменный процесс, так что усредненные параметры этой линии спектра, в том числе ее ширина, зависят от соотношения долей воды в этих состояниях. Очевидно, эта фракция содержит не только гидратные оболочки биополимерной

структуры, но и большое количество следующих за ними слоев воды, активно обменивающихся с гидратными слоями. Вследствие существенного различия в ширине узкой линии и "пьедестала", составляющих общую линию в "разностных" спектрах, имеется возможность разделить интегралы этих компонент и,; таким образом, определить содержание воды в образцах для двух фракций.

С помощью разработанного метода разделения воды, содержащейся в биологических тканях на фракции по степени прочности их связывания с биополимерами были впервые получены изотермы сорбции двух фракций воды, представленных на рис.7

Рис.7. Изотермы сорбции для двух фракций воды (соответствующих узкой линии и "пьедесталу"). Пунктир соответствует образцам, обработанным формальдегидом, сплошные линии - образцы без обработки. 1 - полный интеграл "разностного" спектра, 2- отдельно для узкой линии воды, 3 -отдельно для "пьедестала". - отношение количества протонов Н20 к количеству протонов ткани, а - содержание Н^О в ткани (на вставке начальная часть изотерм сорбции).

Одна из них относится к структурированной воде в саркоплазме, ассоциированной с основными сократительными белками, а вторая входит в состав миоплазмы.

4. Особенности взаимодействия воды с биологическими тканями в посмертном периоде.

Характер посмертных изменений количества фракций воды в коже и ахилловом сухожилии, находящихся в стерильных условиях при 22°С и р/р5=0,96 сводится к тому, что при неизменном влагосодержании тканей,

\Л/

«г/г

через 48 часов после смерти наблюдается перераспределение фракционного состава воды (табл.7, рис.8).

При этом количество связанной воды уменьшается, а свободной растет. В течение всего последующего наблюдения (96 час.) эта тенденция сохраняется. При понижении температуры хранения образцов до 5°С процесс изменения состояния воды в ткани резко замедляется. Калориметрические исследования позволили установить, что наряду с количественными, происходят качественные изменения фракции свободной воды (рис.9). Температура плавления замороженной, свободной, воды в ахилловом сухожилии с увеличением посмертного периода сдвигается в область более низких температур, что свидетельствует об изменении ее подвижности вследствие растворения в воде электролитов образующихся при аутолизе тканей.

о,*

о.з -о.г -

a a is по

-и-н-п-ю -в -6 -г о г ♦ «

Рис.8. Зависимость общего влагосо-держания (1), свободной (2) и связанной воды (3) в ахилловых сухожилиях человека от времени посмертного хранения.

Рис.9. Кривые плавления заморажива емой воды в ахилловых сухожилиях человека с разным посмертном периодом: 1-24 часа; 2- 48 часов; 3-96 часов; 4-120 часов.

Наряду с параметрами, характеризующими гидратацию тканей изучались их биохимический состав и физико-химические свойства (табл.7). Снижение ГАГ в коже в посмертном периоде объясняет до некоторой степени их дегидратацию. Неменяющиеся при этом содержание оксипролина подтвердило известный факт об устойчивости коллагена к аутолизу. Однако исследования физико-химических свойств кислоторастворимой фракции коллагена позволили выявить, что в условиях хранения соединительной ткани in vitro происходит деструкция макромолекул коллагена, а также денатурационные процессы по типу спираль=> клубок. Об этом свидетельствует: снижение величины структурной вязкости, оптического вращения и увеличение количества коллагена, переходящего в воду при 65°С (тест "Верцера") по сравнению с исходными образцами тканей. Вместе с тем, наряду с деструкцией молекул коллагена происходит образование дополнительных поперечных сшивок, аналогичных тем, которые развиваются в онтогенезе. Об этом

свидетельствует повышение температуры гидротермического сокращения и модуля упругости. Из литературных данных известно, что основная масса этих связей образуется на основании модифицированных остатков лизина, в результате последовательных ферментативных реакций. Подобные кооперативные процессы деполимеризации молекулярных цепей и возникновение новых поперечных сшивок по месту освободившихся активных групп, наблюдаются при старении ряда полимерных материалов.

Таблица 7.

Влияние посмертного аутолиза на влагосодержание и физико-химические свойства соединительной ткани

Параметры Кожа Хрящ реберный

Посмертный период, час

24 48 96 24 48 96

1. Вода (общая), г/100гтк. 63,6±1,7 63,6+1,9 63,4±2,2 55,0+1,4 55,0±0,5 53,8±0,4

2. Вода связанная, г/100гтк. 35,7+0,9 34,8±0,8 32,2+0,9 37,0+0,5 36,0+1,0 35,0+0,7

3. Вода свободная, г/100гтк. 27,9±1,8 28,8+0,9 31,2+2,2 18,3±1,3 18,8±0,8 17,8+0,6

4. Содержание гексозамина 0,41 0,36 0,33 5,10±0,20 5,25+0,48 5,24+0,21

5- Содержание оксипролина. 10,8 10,8 10,8 5,54±0,36 5,39±0,47 5,30±0,56

6. Характеристическая вязкость коллагена, выде-леного из кожи 14,0 12,1 10,5 - - -

7.Уд,оптич.вращ. коллагена, выделенного из кожи 1050 980 915 - - -

8. Температура гидротерм.сок-ращение ткани, Т°С 59,0 62,0 63,0 - - -

9. Модуль упругости, ЕЮ4Па 1,2 1,9 2,35

10. Жесткость, у-103 н/м - 19,4 19,8 19,6

Такие изменения сопровождаются снижением сорбционной способности кожного покрова, как за счет уменьшения в ~2 раза количества активных центров, способных связывать воду, так и за счет уменьшения количества микропустот. Можно предположить, что образование дополнительного количества поперечных сшивок является одним из факторов достаточно высокой устойчивости кожи к аутолизу.

В отличие от кожного покрова общее влагосодержание и фракции связанной и свободной воды в хрящевой ткани не меняются на протяжении 9-ти суток наблюдения (табл.7). При этом количество таких биохимических компонентов, как оксипролин, гексозамины и уроновые кислоты остается неизменным. Сорбционные характеристики за этот период также не претерпевают никаких изменений.

Исследования изменения состояния воды в мышечной ткани на разных сроках аутолиза показали, что в течение 48 часов после смерти наблюдается изменение содержания связанной и свободной воды, аналогичное изменениям, наблюдаемым для соединительной ткани: снижается фракция связанной воды и увеличивается фракция свободной воды (рис.10). Это согласуется с микроскопическими исследованиями, в которых отмечается набухание мышечных клеток в этот период аутолиза. Однако, в отличие от соединительной ткани не происходит изменения температуры фазового перехода замороженной, т.е. свободной воды в мышце.

Рис.10. Изменение общего влагосодержания: 1 - свободной воды ; 2 -связанной воды; 3 - в мышце в процессе посмертного хранения.

После разрешения трупного окоченения в течение последующего периода посмертного хранения (-48 час), процесс дегидратации заменяется на обратный процесс, в котором происходит увеличение гидратносвязанной воды и снижение содержания фракции свободной влаги.

Увеличение фракции связанной воды на поздних сроках посмертного периода является, вероятно, следствием деструкции биополимеров ткани и

освобождением в результате этого, части функциональных групп, по которым и присоединяется дополнительное количество воды.

5. Роль воды в процессе возникновения и устранения пергаментации

тканей.

При консервации кожи с помощью сушки при повышенной температуре, а также при хранении кожи и шкурок животных и писчих пергаментов в условиях обычной атмосферной влажности, происходит превращение их в роговидный, полупрозрачный материал, который обладает повышенной прочностью. Установлено, что общее влагосодержание и фракция связанной воды в пергаментированных образцах снижается в 10 и 5 раз, соответственно, по сравнению с контролем (табл.8). При этом фракция свободной воды в пергаментированной ткани практически отсутствует. Аналогичные изменения влажностных характеристик были получены при исследовании кожи и мышцы мумий, пролежавших более 2-х тысяч лет в атмосферных условиях. Таким образом, в основе процесса пергаментации тканей лежат процессы ее дегидратации. Пергаментированная кожа по сравнению с контролем отличается повышенной температурой гидротермического сокращения (на 20°С) при этом величина модуля упругости увеличивается на 2 порядка. Такие данные свидетельствуют о том, что в процессе пергаментации образуются дополнительные связи между функциональными группами биополимеров кожи, которые освобождаются при удалении воды из ткани. Гистологические исследования показали, что в процессе сушки капилляры коллагена сжимаются, а стенки их изгибаются. В результате происходит уменьшение суммарного объема ткани и сближение элементов структуры, что также способствует упрочнению водородных связей между ними. Возникновение дополнительных ковалентных связей обнаруживается и при калориметрических исследованиях. На термограмме появляется дополнительный пик плавления в высокотемпературной области, превышающей на 15°С температуру плавления фиксированного коллагена.

В табл.9 представлены изменения рентгеноструктурных характеристик различных коллагенсодержащих объектов до и после появления пергаментации.

Приведенные данные показывают, что после сушки при 37°С на рентгенограммах коллагенсодержащих образцов уменьшается количество рефлексов, их интенсивность, а в некоторых случаях происходит изменение величины межплоскостного расстояния. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в процессе удаления воды происходит нарушение квазикристалличности коллагена и возникновение аморфного состояния. Фиксация формальдегидом значительно тормозит

процессы изменения структуры коллагена под влиянием дегидратации и удаления воды.

Таблица 8.

Влияние пергаментации на елагосодержание и физико-химические

свойства кожи.

Содержание, г/1 ООг ткани Мо- Тем-

Объекты Вода Гексоз- дуль пер.

исследова- К.Фишер Сорбция амины упруг. сокр

ния общая связан. свобод. ага ССшах Е-ЮПа Т°С

1 .Кожа, 64,211,5 36,310,9 27,911,9 10,111,2 35,111,2 0,4110,02 1,3-104 62,5

контроль

2.Кожа, 6,5±0,1 6,010,09 0,510,01 4,010,1 16,511,0 0,27+0,01 2,6 107 84

пергамент

3. То же, 63,010,09 33,710,8 29,311,5 7,5+0,2 32,511,3 0,2710,01 4,6-104 75

восстановл.

Таблица 9.

Изменение межплоскостных расстояний на рентгенограмме коллагенсодержащих объектов под влиянием пергаментации

Наименование объекты 0 Межплоскостные расстояния, А

Контроль Пе ргамент

АА' ВВ' се ОБ' ЕЕ' АА' ВВ' се ББ' ЕЕ'

1. Кожа человека 12,4 6,2 4,34 3,2 - 11,5 5,61 4,4 3,1 -

2. То же, фиксированная 12,4 6,2 4,34 3,2 - 12,4 6,2 4,34 3,2 -

3. Дерма кожи теленка 12,7 6,2 4,07 зд 11,7 5,65 4,0 3,0 -

4. То же, фиксированная 12,7 6,2 4,07 ЗД 12,7 6,2 4,0 3,1 -

5. Сухожилия ■ крысиных хвостов 12,2 8,1 6,0 4,2 3,6 11,3 - 5,9 - 3,74

6. р-желатина 10,9 5,4 3,9 2,98 - 10,7 5,2 3,9 2,94 -

7. (Л -желатина 13,0 4,95 4,1 3,0 - 10,6 5,2 4,07 - -

Образование дополнительных сшивок и изменение структурной организации ткани приводит к возникновению усадочного или изометрического напряжения, составляющего 2,5 Мпа, под влиянием которого гликозаминогликановые слои, расположенные на поверхности волокон дермы, а также на более мелких структурных элементах коллагена могут механически разрушаться. Разрушенные ГАГ могут явиться

дополнительным фактором для склейки структурных элементов дермы. На основании полученных данных предложен механизм и разработана схема возникновения пергаментации тканей и ее исправления, представленные на рис. 11.

Рис. 11. Схема возникновения и устранения пергаментации. а - нативная дерма; б - пергаментированная дерма; в - восстановленная дерма. 1 - фибриллы коллагена; 2 - продукты взаимодействия ГАГ с коллагеном; 3 - кристаллы ВаБС^.

Основой принципа восстановления пергаментированных тканей является подбор условий, в которых происходит разобщение элементов волокнистого каркаса дермы, позволяющее осуществить регидратацию тканей. На первом этапе восстановления тканей производится обработка пергаментированной кожи 1% раствором детергента ОП-Ю (рН 1,5) и ферментом муколитического действия - целлюлазой. При этом происходит частичное вымывание гидролизованных мукополисахоридов повышается общее влагосодержание и увеличивается фракция связанной воды, что ослабляет межмолекулярные связи в коллагене. На втором этапе регидратации проводится внедрение в образовавшиеся межструктурные пространства, веществ, экранирующих структурные элементы кожи. Последовательное введение солей Ыа804 и ВаСЬ приводит к осаждению образующихся кристалликов Ва804 на структурных элементах коллагена, которые играют роль искусственных экранов, вместо разрушенных во время сушки ГАГ, и предотвращают последующее неограниченное их сближение при повторном высушивании ткани.

6. Влияние фиксации на влагообменные процессы биологических тканей и их физико-химические свойства

Исследования влагообменной способности различных видов соединительной ткани (кожа, ахиллово сухожилие, хрящ), обработанных растворами формальдегида (4% концентрация, рН 3,5), выявили незначительное снижение общего влагосодержания и фракции связанной

воды в пределах 3-4% при некотором повышении содержания фракции свободной воды (табл.10).

Таблица 10.

Влияние формалъдегидной фиксации на влагообменные процессы в биологических тканях и их физико-химические свойства.

Наименование параметра Кожа Хрящ реберный Мышца

норма. фиксир. норма. фиксир. норма. фиксир.

Вода общая, г/100 г ткани 64,2+2,1 61,6+2,1 57,4±0,6 54,9+0,9 76,3±0,3 67,5+4,6

Вода связанная, г/100 г ткани 36,3±1,7 32,0±0,9 34,5±0,7 30,5+1,4 23,4±2,6 23,4+2,6

Вода свободная, г/100 г ткани 27,9±1,4 29,6±1,9 22,9±1,4 24,4±1,8 52,9±2,4 44,1±3,4

Вода в монослое (ост) 10,35±0,21 9,5±0,3 14,55±0,4 12,5±0,3 7,7+0,05 5,9±0,21

Вода максимально сорбир. (с^тах) 37,4+1,2 34,3+1,5 48,1+0,3 41,1+0,2 33,7±2,1 26,7+1,9

Гексозамины г/100г ткани 0,41 ±0,02 0,32±0,01 5,18+0,19 4,2±0,1 - -

Температура гидротер.сок- ращ.,Т°С 62 85 - - 60 82

Модуль упругости Е,Па 1,3-104 6,7-104 - - 1,47-103 9,7-106

Коэф.набухан.в воде, К-10"4 5,0+0,4 7,15+0,1 2,3±0,3 3,5+0,3 4,8+0,3 6,5+0,2

Установлено также снижение сорбционной способности тканей, о чем свидетельствует уменьшение величины эффективной емкости монослоя ат и максимальной сорбции (атах). С помощью калориметрии и ЯМР было показано, что снижение влагосодержания фиксированных тканей происходит за счет наиболее прочно связанной воды. Незначительное изменение влагосодержания можно объяснить тем, что при обработке тканей формальдегидом образуется около 6-ти термостойких поперечных связей на 105 молекулярную массу коллагена. Очевидно блокировка незначительной части активных групп белка не может оказать существенное влияние на гидрофильность тканей. В отличии от соединительной ткани снижение влагосодержания мышцы происходит за счет фракции невымораживаемой воды, при этом фракция связанной воды остающаяся в ткани после прессования остается

неизменной. Было сделано предположение, что неотжимаемая вода находится внутри клетки, а фракция незамерзающей воды непосредственно контактирует с активными группами биополимеров мышцы.

Показано, что в процессе обработки тканей формальдегидом удаляется ~ 20% углеводов. При этом на электронных микрофотографиях было обнаружено увеличение межструктурных полостей в тканях. Удаление ГАГ при фиксации было показано и на изолированных препаратах протеогликанов.

Однако при снижении влагопоглощающей способности фиксированной ткани увеличивается скорость проникновения в ее межструктурные пространства жидкой воды, о чем свидетельствует увеличение коэффициентов скорости набухания (табл. 10).

Повышение проницаемости тканей для жидкой воды может быть результатом образования поперечных сшивок, которые придают жесткость коллагеновому каркасу, что обеспечивает большую доступность межструктурных пространств и пор, для проникновения в них жидкой воды. Удаление ГАГ при фиксации также может способствовать увеличению проницаемости тканей.

На фоне незначительного изменения влагосодержания обращает на себя внимание резкое увеличение термостойкости (на 25°С) соединительной и мышечной тканей, а также увеличение протеолитической устойчивости коллагена.

Кроме того, фиксация резко меняет реологические параметры биологических тканей. Основные изменения сводятся к тому, что прочность тканей увеличивается, а деформация при одноосном растяжении и тангенциальном сжатии уменьшается. При этом повышается упругость материала, о чем свидетельствует снижение величины остаточной деформации и времени релаксационных процессов. Ткань приобретает способность восстанавливать свои первоначальные размеры после снятия многократно прикладываемых нагрузок. Последнее особенно важно при тех или иных процедурах, проводимых на фиксированных материаллах, в процессе которых к образцам могут прикладываться различные растягивающие и тангенциальные нагрузки.

Таким образом, несмотря на определенные изменения влагосодержания, фиксированные ткани не теряют присущую им гидрофильность и при этом приобретают структурную устойчивость, прочность и упругость.

7. Влагообменные процессы в тканях, обработанных консервирующими

растворами.

Изучение изменения степени обводненности тканей от концентрации консервирующих растворов (K.P.) выявило весьма неоднозначную картину. При обработках растворами <10% концентрации, влагосодержание тканей

увеличивается. Вероятно, диффузия в ткань низкоконцентрированных растворов консерванта, в которых 90-95% общего объема занимает вода, вызывает обычное набухание тканей.

По мере повышения концентрации компонентов консервирующего раствора, содержание общей и фракций связанной и свободной воды в тканях уменьшается примерно в 2 раза по сравнению с контролем, независимо от типа ткани, ее возрастных, топографических и аутолитических особенностей. Такие данные свидетельствуют о дегидратирующем действии консервирующего раствора (табл.11). С помощью _ЯМР было установлено, что при обработке тканей консервирующим раствором происходит дополнительная, частичная блокировка активных центров компонентами консервирующего раствора. Однако часть этих центров остается доступной для молекул воды. Такой вывод согласуется с результатами, полученными при изучении изотерм сорбции и расчете величины ат. Значительное уменьшение влагосодержания тканей при их обработке консервирующими растворами должно было бы привести к дальнейшему увеличению модуля упругости фиксированного материала. Вместо этого происходит его снижение (табл.10 и 11).

Таблица 11.

Влияние обработки консервирующими растворами на влажностные и физико-химические характеристики биологических тканей.

Наименование образца Вода гН20/100г ткани по К.Фишеру Из изотерм сорбции связанная Модуль упругости Е-ЮПа Температура сокр. Т°С

общая связан. свобод. ат С^тах

1 .Кожа, (контроль) 64,2±2,1 36,3+1,7 27,9±3,4 10,35+0,21 37,4±1,2 1,3-104 62,0

2.Тоже, обработ. K.P. 30,0±1,2 23,0±0,9 7,0±0,6 7,1±0,б 38,1±1,3 4,3-1О4 83,0

3. Ахиллово сухожилие (контроль) 62,3±1,9 46,1±0,7 16,2+0,8 14,52+0,21 46,5+1,2 1300-Ю4 63

4.Тоже, обработ. K.P. 30,1+1,0 28,1+0,8 7,5±0,2 10,2±0,1 53,1+2,1 2500-104 84

5.Хрящ межреберный (контроль) 57,4±0,6 34,5±0,7 22,9±0,7 14,0+0,2 44,1 ±0,4 - -

б.Тоже, обработ. K.P. 30,2±0,5 23,7±0,7 7,2±0,6 11,24±0,1 52,0+2,1 - -

7.Мышца (контроль) 76,3+2,5 23,7+0,9 52,6+2,4 7,7±0,05 33,7+2,1 14-Ю5 60,0

8.Тоже, обработ. K.P. 34,6±0,2 21,2+0,5 12,9+1,9 5,6±0,3 42,7+2,4 9,7-106 82,0

Такие результаты свидетельствуют о пластифицирующем действии консервирующих растворов. Упругие свойства ткани, приобретенные в процессе фиксации, при этом сохраняются.

Очевидно, гидрофильные молекулы спирта, глицерина и ацетата калия, связанные с большим количеством воды, размещаются в межструктурных пространствах тканей, облегчая скольжение структурных элементов друг относительно друга в процессе деформации. Калориметрические исследования показали, что с повышением концентрации компонентов консервирующего раствора , количество свободной воды, кристаллизующейся при температуре ниже нуля, уменьшается. В окончательном растворе, который используется для консервации тканей, не обнаружено свободной воды, способной замораживаться. Вырождение фазового перехода воды при пониженной температуре подтверждает, что вода в К.Р. связана с ее компонентами. Установлено, что содержание общей и фракций связанной и свободной воды в тканях определяется количеством воды в консервирующем растворе. Однако, несмотря на значительную дегидратирующую способность консерванта, он не вызывает необратимых изменений водного баланса тканей. В результате длительного пребывания в воде консервированные ткани по своим влажностным параметрам приближаются к контрольным образцам.

(Т=20°С)

Рассматривая влияние консерванта на способность тканей, сорбировать парообразную воду, учитывалось, что консервированная ткань является 2-х компонентной системой: ткань-консервант. В связи с этим строились две изотермы сорбции: для ткани, пропитанной консервирующим раствором и отмытой от него (рис.12).

Исследования сорбционной способности каждого из компонентов гетерогенной системы: кожа-консервант, показали, что сорбционная способность консервированной кожи не соответствует расчетным аддитивным изотермам компонентов, а определяется консервирующим раствором, пропитывающим ткань. Такие наблюдения позволили сделать вывод, что влагообменные процессы в системе ткань-консервант при контакте с жидкой и парообразной водой, определяются высокими гидрофильными свойствами консерванта. На основании полученных изотерм сорбции можно рассчитать величину упругости пара окружающей среды, которую необходимо иметь для того, чтобы в консервирующем растворе и консервированных тканях поддерживалось заданное влагосодержание, необходимое при длительном сохранении консервированных органов и тканей.

Биологические ткани, консервированные по способу, разработанному в НИЦ БС можно рассматривать, как композитный материал, структурные элементы которого армированы метиленовыми мостиками, способными обеспечивать их структурную стабильность и упругие свойства. Межструктурные пространства ткани заполнены консервирующим раствором, который с одной стороны, обладая пластифицирующими свойствами, придает тканям эластичность, а с другой стороны, как гидрофильный наполнитель, является постоянным депо воды, обеспечивая неизменность влажностных характеристик и внешнего вида консервированных тканей в широком влажностном диапазоне.

Известно, что при создании синтетических материалов , обладающих высокой прочностью и эластичностью так же используются сшивающие и пластифицирующие вещества.

Совокупность физико-химических параметров, характеризующих консервированную ткань, может быть использована при разработке искусственных трансплантантов мягких тканей с заранее заданными свойствами.

8. Состояние воды и проницаемость клеточных мембран женьшеня.

Разработка методов контроля и оценки состояния воды в различных биоструктурах растительного происхождения и количественная оценка водно-солевого транспорта через клеточную мембрану особенно важны для разработки научно-обоснованной технологии сушки и хранения лекарственного сырья, оценки действия лекарственных веществ, проникающих через клеточные мембраны и для решения практических

вопросов биотехнологии производства лекарственных препаратов.

В настоящей работе методом протонного ЯМР исследовалась проницаемость клеточных мембран для молекул воды в суспензии женьшеня на основе измерения скоростей ЯМР-релаксации внутриклеточной и межклеточной жидкости. Сравнение данных по ЯМР-релаксации суспензии женьшеня проводилось с литературными данными по суспензии эритроцитов, выделенных из крови человека. Для измерения спин-спиновой релаксации Т2 внутриклеточной воды, в исходную суспензию женьшеня добавляли парамагнитный раствор МпС12.

Исследования показали, что время релаксации Т2 межклеточной воды меньше времени обмена (за счет добавки парамагнитных ионов Мп2+) и полностью определяется временем обмена через мембрану. Обнаруженное Т| межклеточной воды по сравнению с маточным раствором говорит о сильном связывании воды на внешних поверхностях клеток (клеточных мембранах). Конкретное значение Т1 межклеточной воды при этом зависит, как от концентрации клеток в объеме образца, так и от размера самих клеток. Сравнение данных по суспензии эритроцитов показали, что для клеток женьшеня сиин-спиновая релаксация (Т2) происходит в 3 раза быстрее, чем для клеток эритроцитов. В принципе, этот параметр может отражать не только состав веществ внутри клетки, но и ее размеры. В уменьшение величин Т] и Т2 наибольший вклад дает рост концентрации веществ с молекулярной массой в диапазоне 103-104 Па. К таким веществам относятся легкие белки, очень крупные полипептиды и полисахариды. Из данных по микроскопии известно, что в клетках женьшеня много крахмальных зерен. Следовательно, уменьшение времени релаксации Т! и Т2 внутриклеточной воды непосредственно связано с наличием в клетках женьшеня большого количества полисахаридов.

Тот факт, что для внутриклеточной воды женьшеня время релаксации Т] больше, чем Т2 в 2,5 раза, а для межклеточной воды - в 1,5 раза, свидетельствует о заторможенности диффузии молекул воды в пространстве внутри клетки по сравнению с межклеточным пространством. Заморозка образцов приводит к частичному разрушению клеточных мембран. Но и в этом случае релаксационная кривая содержит вклады от межклеточной и внутриклеточной воды. Принципиально другая картина между свежей и замороженной суспензией клеток женьшеня наблюдается при добавлении парамагнитных ионов Мп2+. Это приводит к тому, что для замороженного образца многокомпонентность релаксационной кривой, как для Т1 так и для Т2 исчезает и таким образом, вся вода в образце релаксирует с одинаковой скоростью. Это означает, что межклеточная вода, испытавшая релаксационное воздействие ионов Мл2* достаточно быстро проникает через повреждения клеточных мембран внутрь клетки, и в результате параметры всей воды усредняются. Для незамороженной суспензии женьшеня многокомпонентность релаксационной кривой сохраняется. При этом в отличие от эритроцитов,

изменяется не только Т2 внутриклеточной воды, но и Т1 и Т2, как внутриклеточной, так и межклеточной воды практически синхронно. При титровании суспензии женьшеня раствором МпС12 Т] и Т2 уменьшаются в 1,5-2 раза. При этом изменяются относительные доли каждой фракции воды. Соотношение межклеточная: внутриклеточная вода изменяется от 63:36 в исходной суспензии до 88:12 в конце титрования. Такое изменение соотношения межклеточной и внутриклеточной воды, вероятно, связано с тем, что мембраны клеток женьшеня либо частично проницаемы для ионов Мп2+, либо они менее устойчивы и большие концентрации парамагнитных ионов приводят к их повреждению.

Таким образом, на основании вышеприведенных результатов можно заключить, что для суспензии женьшеня скорость релаксации внутриклеточной воды может определяться не только строением клетки, но и составом веществ, входящих в нее. Большое количество крахмальных зерен, находящихся в клетке женьшеня может сильно уменьшать время релаксации внутриклеточной воды. Внеклеточная вода достаточно сильно связана на поверхности клеточных мембран. Диффузия воды через мембрану клетки женьшеня не меньше нескольких милисекунд.

9. Исследование состояния воды и ее влияние на физико-химические параметры стандартных образцов и фитопрепаратов

Изучено содержание и характер связывания воды в стандартных образцах флавоноидов:рутине, кверцетине, дигидрокверцетине, лютеолине, лютеолин - 7 - глюкозиде и флакозиде. Такие же исследования проводились на фитопрепаратах салифозиде и диквертине.

В результате проведенных исследований было показано, что все изученные биофлавоноиды являются кристаллогидратами (табл. 12).

Гигроскопичность стандартов и фитопрепаратов определялась по анализу изотерм сорбции. На рис.13 представлены изотермы сорбции этих веществ. Сравнительная оценка изотерм сорбции и динамики сорбции паров воды позволила установить интервалы относительной влажности, при которой каждый из исследованных кристаллогидратов устойчив. Результаты исследования динамики сорбции паров воды предварительно высушенными стандартами и фитопрепаратами представлены на рис.14. Показано, что в широком диапазоне влажности от 33 до 75 % кристаллогидраты кверцетина, дигидрокверцетина, лютеолин-7-глюкозида и флакозида устойчивы, о чем свидетельствуют сорбционные кривые. На участке р/р5 от 0,33 до 0,75 изотермы сорбции всех перечисленных выше веществ имеют практически горизонтальный участок. Кристаллогидраты рутина и лютеолина неустойчивы, так как оба непрерывно меняют свое влагосодержание в зависимости от гидротермических условий окружающей среды. Так как оба стандартных вещества обладают высокой

12 т

0 20 40 60 80 100

Относительная влажность, %

-Люгеолин-7-глкжозд □ Рутин -Лютеодин А Салифозод

16 -14

* 12

I ю

ш и

= 8

б ■

—квсрцетин ' "А днквертин

Относительная влажность, %

□ дигадрокверцегн

Рис. 13. Изотермы сорбции

гигроскопичностью, то при работе с ними необходимо постоянно контролировать содержание в них воды. При давлении водяных паров близком к упругости насыщенного пара, исследованные фитопрепараты связывают от 0,1 до 6 моль воды на 1 моль вещества. Обычно степень гидратации молекулы зависит от количества центров связывания воды на поверхности молекулы. Однако при этом следует учитывать неоднородность центров сорбции, недоступность некоторых активных групп для молекул воды, взаимодействие полярных групп между собой. Наиболее значительные изменения в содержании связанной воды имеют место при р/р5>0,75, т.е. в области полимолекулярной сорбции.

0,1 1 ю

Продолжительность сорбции, ч

—О—лютеолик -7 - глюкозид —А— пютеопин —В— салифоэид

X флакозид —I—рутин

10 100 Продолжительность сорбции, ч

—А—дигидрокверм&тин —Ж—диквертин 0 кверцетин

Рис.14 Динамика сорбции паров воды стандартными образцами и фитопрепаратами

Таблица 12

Содержание различных фракций воды в стандартных образцах и фитопрепаратах.

Содержание воды по данным термического анализа, %

Рутин Кверцетин Дигидро-кверцетин Диквертин Флакозид Лютеолин Цинарозид Салнфозид

Исходный

Общая 7,57 ± 0,05 1,09 ±0,06 0,54 ± 0,06 4,02 ± 0,05 2,81 +0,05 3,51 ±0,06 4,45 ± 0,05 5,49 ± 0,04

Сорбционная 3,66 ± 0,03 - - 0,91 ±0,03 3,51 ±0,07 3,92 + 0,06

Псевдокристал

логидратная Кристаллогид- - - - 2,86 ± 0,04 - 2,53 ± 0,04 - -

ратная 4,11+0,06 1,09 + 0,06 0,54 + 0,06 1,11 ±0,05 1,87 + 0,06 1,02 ±0,03 1,01 ±0,04 1,49 ±0,05

Высушенный Общая 1,60 ±0,05 0,35 + 0,05 0,12 ±0,04 1,04 ±0,03 0,42 + 0,08 1,41+0,06 1,06 ±0,05 1,53+0,04

Сорбционная Псевдокристал - - - - - - - - ■

логидратная Кристаллогид- ратная 1,60 ±0,05 0,35 ±0,05 0,12 ±0,04 0,85 ± 0,05 0,41 ±0,06 0,42 ± 0,08 0,51 ±0,03 0,95 ± 0,05 1,06 ± 0,05 1,53 + 0,04

Максимально

увлажненный Общая 11,21 ±0,06 15,03+0,05 9,89 ± 0,05 10,12+0,07 16,95 ±0,08 11,61 ±0,04 7,73 ± 0,03 9,22 ± 0,06

Сорбционная 3,11+0,03 - 2,15 ±0,04 3,35 ± 0,05 15,21 ±0,05 3,65 ± 0,05 6,17 ±0,04 7,71 ±0,06

Псевдокристал

логидратная Кристаллогидр - 14,17 ±0,05 7,85 ± 0,05 6,55 ± 0,04 - 6,92 ± 0,08 -

атная 8,09 ± 0,05 1,01+0,05 0,44 ±0,05 | 0,39 ± 0,03 1,73 ±0,05 1,05 ± 0,03 1,48 ±0,06 1,51 ±0,05

100 200 300 Т°с 50 100 150 200 Т°С

Рис. 15. ДСК - термограммы стандартных образцов: 1 - исходный, 2 - высушенный, 3 - максимально увлажненный

Термические исследования для трех стандартных веществ кверцетина, дигидрокверцетина и лютеолина показали, что при р/р3>0,75 происходит качественное изменение состояния воды (рис.15). Форма пика и величина его энтальпии свидетельствуют о том, что дополнительно сорбируемая вода занимает промежуточное положение между сорбционной и кристаллизационной, и может быть отнесена к "псевдокристаллогидратной". Для всех остальных стандартных веществ (рутин, лютеолин - 7 - глюкозид, флакозид) в области повышенной относительной влажности характерно увеличение сорбционной воды, которое не сопровождается структурным изменением вещества. Сорбционная вода при 98 % относительной влажности появляется также у лютеолина и у дигидрокверцетина. Было показано, что вся вода содержащаяся в биофлавоноидах является связанной. Расчет энтальпий фазовых переходов в сочетании с результатами термогравиметрии и изучением сорбционной емкости показали существование как минимум трех видов связанной воды в биофлавоноидах: слабо связанной, сорбированной на поверхности молекул, наиболее прочно связанной -кристаллизационной, и воды занимающей промежуточное положение -"псевдокристаллогидратной" (табл.13).

Таким образом каждый из исследованных биофлавоноидов в исходных гидротермических условиях содержит сорбционную воду от 1 до 4 %, кристаллогидратную от 0,5 до 4,1 % , псевдокристаллогидратную от 0 до 3 %. Такие данные свидетельствуют об энергитической неоднородности связанной воды, что объясняется наличием в флавоноидах различных типов активных центров на их поверхности, с которыми взаимодействуют молекулы воды.

Состояние связанной воды определяет специфику процессов структурообразования и массообмена биофлавоноидов. Функциональные группы БАВ, обеспечивающие реализацию водородных связей, являются первичными центрами сорбции молекул воды. По мере заполнения локальных центров сорбции, молекулы связанной воды вступают во взаимодействие с ранее связанными молекулами воды, образуя сетку водородных связей. На примере лютеолина и флакозида было показано, что существование полимолекулярных слоев воды вблизи гидрофильной поверхности приводит к появлению расклинивающего давления (табл.13). Известно, что полиморфизм и псевдополиморфизм кристаллогидратов связан с содержанием в них прочно связанной воды. Так для флакозида, обладающего полиморфизмом существуют две формы кристаллогидрата. Первая кристаллическая форма является кристаллогидратом с содержанием в нем воды 0,42 %, что соответствует 0,1 моль воды на 1 моль вещества, вторая - кристаллогидратом с содержанием воды 2,8 %, что соответствует моногидрату. Для кверцетина, дигидрокверцетина и лютеолина установлено, что эти вещества обладают псевдополиморфизмом.

Таблица 13

Температурные интервалы и величины энтальпий фазовых переходов стандартных образцов флавоноидов и фитопрепаратов

Температурные интервалы ДТ (°С) и величины энтальпий

фазовых переходов ДН (Дж/г)

Исходный Высушенный Максимально увлажненный

ДТ ДН ДТ ДН ДТ ДН

Рутин пик I 30-180 154 30 -100 48

пик II пик III 186 31 186 30 100-180 186 114 32

Кверцетин пик I 122-130 260

пик II 322 330 322 180 322 300

Дигидро-

кверцетин пик I пик II пик III 246 240 246 180 65 - 100 115-129 246 31 210 225-

Диквертин пик I 50-100 65

пик II 115-150 108 120-145 30 115 - 150 95

пик III 241 185 241 190 241 180

Лютеолин

пик I - - - - 45-85 40

пик II 105 -150 85 100 -145 25 95 -145 210

пик III 160-170 ДСР 160 - 170 ДСР 160 - 170 ДСР

пик IV 326 255 326 250 326 200

Цинарозид пик I 45 - 105 95 65-110 102

пик II 254 150 254 135 254 152

Салифози д 40- 100 73 40- 105 75

пик I 253 100 253 105 253 110

пик II

Флакозид пик I 35-85 6 35-140 61

пик II пик III пик IV 90 - 140 151 208 33 67 52 151 208 43 49 151 208 48 50

Они имеют две кристаллические формы, одна из которых является кристаллогидратом с содержанием воды 0,17 моль воды на 1 моль вещества для кверцетина, 0,1 моль воды на 1 моль вещества для дигидрокверцетина и

0.24.моль воды на 1 моль вещества для лютеолина. Вторая кристаллическая структура связана с появлением в этих веществах прочно связанной псевдокристаллогидратной воды.

Таким образом в этой части работы было изучено состояние воды в индивидуальных флавоноидных соединениях, таких как рутин, кверцетин, дигидрокверцетин, флакозид и др. и были показаны особенности их гидратации. Установленные особенности проявляются в многообразии форм связи и энергетической неоднородности адсорбированной воды. В каждом конкретном случае это связывалось со структурными особенностями или недоступностью для воды некоторых функциональных групп стандартов за счет их экранирования. Изучение динамики сорбции стандартных образцов и индивидуальных фитопрепаратов позволило выявить тот интервал относительной влажности, в пределах которого влагосодержание препаратов не будет меняться. Такие данные необходимы при работе с любым фитопрепаратом.

Выводы

1. Разработаны научные основы и создана методология изучения влияния воды на биологические структуры животного и растительного происхождения на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях.

2. Впервые дана сравнительная количественная оценка содержания различных форм тканевой воды и выявлены отличительные закономерности гидратации разных тканей (кожа, мышца, хрящ, сухожилие) и в их структурных компонентах в норме, онтогенезе, посмертном аутолизе, при фиксации, консервации и сушке.

3. Показано, что вся вода, поглощаемая из паровой фазы соединительной тканью, гидратно связана. Выявлено наличие в мышечной ткани двух основных фракций связанной воды. По-видимому, одна из них относится к структурированной воде в саркоплазме, ассоциированной с основными сократительными белками, а вторая фракция воды входит в состав миоплазмы.

4. Установлена взаимосвязь между содержанием различных фракций воды, структурной организацией и конформационным строением коллагена и физико-химическими свойствами соединительной ткани. Дезорганизация основного вещества соединительной ткани приводит к снижению ее сорбционной способности и уменьшению фракции связанной воды. Происходящее при этом превращение структуры коллагенового каркаса в сетевидную (ячеистую) конструкцию создает возможность для дополнительного проникновения в межструктурные пространства ткани свободной воды.

5. Установлено, что возрастные и аутолитические особенности влагообменных процессов в биологических тканях человека и животных взаимосвязаны с изменениями их биохимического состава и физико-химических свойств. В обоих случаях отмечается снижение сорбционной способности тканей и количественное перераспределение связанной и свободной воды в пользу последней.

6. Изучена роль воды в процессах возникновения пергаментации кожного покрова и его устранения. Установлены пороговые значения количества связанной и свободной воды, снижающиеся при высушивании, за пределами которых наступает частичная или полная потеря влагопоглощения. На основании этих исследований предложена оригинальная методика устранения пергаментации кожи.

7. Показано, что при обработке биологических тканей формальдегидом происходит их гидрофобизация за счет уменьшения количества центров прочно удерживающих воду. При последующей обработке биологических тканей консервирующими растворами (КР) происходит замещение в них воды на гидрофильный наполнитель, в результате чего в тканях остается, в основном, связанная вода. Наблюдаемое при этом вырождение фазового перехода воды при пониженной температуре показывает, что использованные КР являются криопротекторами. Влагообменные процессы в системе ткань-консервант при контакте с парообразной водой, определяются высокой сорбционной способностью КР, которая также выполняет роль пластификатора, обеспечивая эластичность тканей и предотвращая возникновение пергаментации в процессе подсыхания.

8. Впервые с помощью метода термического анализа изучена зависимость гидратации стандартных веществ флавоноидов и фитопрепаратов от их структуры в широком влажностном диапазоне и показано наличие трех фракций воды, различающихся по прочности связывания: слабосвязанной (сорбционной), кристаллогидратной и псевдокристаллогидратной. Показано, что стандарты фловоноидов являются кристаллогидратами и многие из них обладают полиморфизмом или псевдополиморфизмом. Установлены пределы гидротермических параметров, в которых кристаллогидраты устойчивы, что важно для фармацевтической практики.

9. Результаты исследований БАВ растительного происхождения вошли в фармокопейную статью на флокозид-стандартный образец, в ТУ на рутин-стандартный образец и в ТУ на кверцетин-стандартный образец. Разработаны рекомендации по работе с субстанциями и стандартами, учитывающие влияние выявленных фракций воды на их свойства.

Основное содержание диссертации отражают следующие публикации:

1. Пчелин В.А., Николаева С.С. О старении коллагена. // Высокомол. соед., 1966, 8(1), С.136-140.

2. Бычков С.М., Николаева С.С., Харламова В.Н. Зависимость плотности и структурно-механических свойств коллагенового комплекса сухожилия от кислых гликозаминогликанов. // ДАН, 1968, 182(6), С.1428-1430.

3. Бычков С.М., Николаева С.С., Харламова В.Н. Взаимодействие гибридного комплекса протеин-хондроитин-кератан сульфата с проколлагеном. // Бюлл. эксп. биол. и мед., 1971, 11, С.38-40.

4. Пчелин В.А., Николаева С.С. Конформация молекул и физико-химические свойства пленок желатины. // Успехи коллоидной химии, 1973, (спец выпуск), С.357-359.

5. Михайлов А.Н., Николаева С.С. Фибриллы коллагена, как многокомпонентная и многофазная система. // Тезисы докл. на Научном совете по проблемам биологической физики. АН СССР, г.Тбилиси, 1973.

6. Михайлов А.Н., Николаева С.С., Ромаков Ю.А. Взаимодействие глицеринового альдегида с коллагеном, как одна из элементарных реакций замшевого дубления. // Кожевенно-обувная пром., 1974, 16(9), С.38-43.

7. Николаева С.С., Михайлов А.Н. Влияние сваривания на структурно-механические свойства дермы и выделения из нее волокон. // Кожевенно-обувная пром., 1975,17(8), С.35-42.

8. Михайлов А.Н., Николаева С.С., Дубинская В.А. Определение влаги в кожевенном сырье, полуфабрикатах и кожи с помощью реактива Фишера. //Кожевенно-обувная пром., 1975, 17(10), С.39-41.

9. Михайлов А.Н., Николаева С.С., Шименович Б.С. Водно-мукополисахаридные слои на поверхности волокон коллагена. // Кожевенно-обувная пром., 1976, 18(3), С.47-49.

10. Бычков С.М., Николаева С.С., Харламова В.Н. Структурно-механические свойства и набухание белковых комплексов гиалуроната и протеин-хондроитин-4-сульфата. //Бюлл. эксп. биол. и мед., 1976, 32(10), С.1211-1213.

П.Николаева С.С., Михайлов А.Н. Влияние формальдегида на структурообразование желатины и водорастворимого коллагена. // Высокомол. соед, 1977, 19(4), С.297-301.

12. Николаева С.С., Пчелин В.А., Михайлов А.Н. Доступность ультраструктуры коллагена и желатины для жидкостей. // Высокомол. соед., 1978, 20(7), С.521-523.

13. Николаева С.С., Королева O.A., Михайлов А.Н. Упруго-эластические свойства кожного покрова человека. // Материалы XI Всесоюзн. симпозиума по реологии. 1980, г. Суздаль, вып. II, М.,1981, С.87-90.

14. Николаева С.С., Дубинская В.А., Михайлов А.Н., Королева O.A. Влияние аутолиза на физико-химические свойства кожного покрова млекопитающих. //Вопр. мед. химии, 1981, 3, С.362-365.

15. Николаева С.С., Хорошков Ю.А., Дубинская В.А. Структура и свойства коллагенового комплекса сухожилия при дезорганизации основного

вещества соединительной ткани. // Бюлл. эксп. биол. и мед., 1981, 8, С.98-100.

16. Николаева С.С., Дубинская В.А. Топографические и возрастные особенности влагосодержания и реологии кожного покрова человека. /У Вестник дерматологии и венерологии, 1982, 5, С.57-60.

17. Николаева С.С., Хорошков Ю.А., Дубинская В.А., Омельяненко Н.П. Реология соединительной ткани. // Тезисы докл. на XII Всесоюзном симп. по реологии., г. Юрмала,1982, С.15-16.

18. Николаева С.С., Хорошков Ю.А., Дубинская В.А., Омельяненко Н.П. Реологические особенности соединительной ткани. // Механика композит, матер., 1985, 6, С.525-528.

19. Николаева С.С., Кондакова Н.В., Хорошков Ю.А., Дубинская В.А., Королева O.A. Влияние ионизирующей радиации на структуру коллагеновых волокон сухожилий человека. // Тезисы докл. на Всесоюзном симп. "Механизмы действия ионизирующего излучения на структуру и функции белков.", г. Львов, 1986, С.25-27.

20. Николаева С.С., Кондакова Н.В., Хорошков Ю.А., Дубинская В.А., Королева O.A. Влияние ионизирующей радиации на структуру коллагеновых волокон сухожилий человека. // Радиобиол., 1988, 28(4), С.483-487.

21. Николаева С.С., Королева O.A., Дубинская В.А. Реология биологических тканей. // Тезисы докл. на II Всесоюзной научно-технич. конференции "Реология и оптимизация процессов переработки полимеров.", г. Ижевск, 1989, С.18.

22. Николаева С.С., Королева O.A., Хорошков Ю.А. Реологические свойства скелетной мышцы человека и особенности структурной организации ее соединительнотканного каркаса. // Тезисы докл. на Всесоюзном симп. "Структурно-энергетическое обеспечение механической работы мышц.", г. Москва, 1990.

23. Королева O.A., Николаева С.С. Реологические свойства скелетных мышц человека. // Тезисы докл. на VIII Всесоюзной школе по биологии опорно-двигательного аппарата., г. Киев, 1990.

24. Дубинская В.А., Николаева С.С., Хорошков Ю.А., Королева O.A. Структура и физико-химические свойства гиалинового хряща человека при дезорганизации углеводно-белковых комплексов основного вещества. // Бюлл. эксп. биол. и мед., 1991,111(3), С.267-269.

25. Николаева С.С., Петушкова Ю.П., Хорошков Ю.А., Одинцова H.A. Микроструктура поверхности и физико-химические свойства пергамента при воздействии детергента и ионизирующего излучения. // Биофизика, 1991,36(5), С.105-112.

26. Denisov V.P., Vyaznikova M.Yu., Nikolaeva S.S. NMR Studies of Water Absorption in Muscle. // 15-th International Conference on the NMR in Biology and Medicine, 1992, Israel, p.271.

27. Вязникова М.Ю., Денисов В.П., Николаева С.С., Петрусевич Ю.М. Спектры протонного магнитного резонанса связанной воды в мышце, h Биофизика, 1993, 38(2), С.492-499.

28. Вязникова М.Ю., Николаева С.С., Быков В.А. Изучение состояния воды в растительной клетке и проницаемости клеточных мембран методом ЯМР. // Биомедицинские технологии, 1995, вып.2, С.35-39.

29. Быков В.А., Вязникова М.Ю., Николаева С.С. Состояние связанной воды и ее влияние на некоторые характеристики флавоноидов. // Биомедицинские технологии, 1996, вып.З, С.9-30.

30. ФС - 42 - 3308 - 96. Флакозид - стандартный образец.

31. ТУ - 64 -4 - 127 - 96. Рутин - стандартный образец.

32. ТУ - 64 -4 - 128 - 96. Кверцетин - стандартный образец.

33. Быков В.А., Вязникова М.Ю., Николаева С.С., Ребров Л.Б., Смирнове Л.П., Тюкавкина H.A., Руленко И.А. Исследование состояния воды i биофлавоноидах. // Юбилейная научная сессия, посвященная 100-летик со дня рождения профессора H.A. Преображенского, Москва, 1996, Тез. С.43-44.

34. Bykov V.A., Vyaznikova M.Yu., Nikolaeva S.S., Rebrov L.B., Smirnova L.P. Pervykh L.N. Study of the Hydration of Rutin and Quercetin. // Seconc International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds, Turkey Eskisehir,1996, Abstracts, P42.

35. Вязникова М.Ю., Николаева C.C., Смирнова. Л.П., РебровЛ.Б., Быко! В.А. Исследование воды в Рутине-стандарте. // Хим. - фарм. журнал 1997,31(1), С.36-38.

36. Вязникова М.Ю., Николаева С.С., Смирнова Л.П., РебровЛ.Б., Быко! В.А. Изучение состояния воды в стандартном образце флакозида. // Хим - фарм. журнал, 1997, 31(1), С.39-41.

37. Вязникова М.Ю., Николаева С.С., Смирнова Л.П., Быков В.А Исследование связанной воды в кверцетине. // Хим. - фарм. журнал 1997, 31(2), С.39-41.

38. Вязникова М.Ю., Николаева С.С., Быков В.А., Яковлева Л.В., Руленкс И.А., Тюкавкина H.A., Колесник Ю.А. Исследование состояния воды i стандартном образце дигидрокверцетина и новом фитопрепарат« диквертине. // Хим. - фарм. журнал, 1997, 31(2), С.42-45.

39. Вязникова М.Ю., Быков В.А., Николаева С.С., Яковлева Л.В., Смирнов; Л.П. Гигроскопичность флавоноидсодержащих сухих экстрактов. / Биомедицинские технологии, 1997, сдана в печать.

40. Дубинская В.А., Васильева И.С., Николаева С.С., Пасешниченко В.А Антиоксидантные свойства стероидных гликозидов из культуры клеток // Биомедицинские технологии, 1997, сдана в печать.

Информация о работе

Николаева, Светлана Сергеевна
доктора биологических наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.23

Автореферат

Влияние воды на биологические структуры тканей человека, животных и на биологически активные вещества растительного происхождения - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы