Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на развитие посттравматических процессов в головном мозге крыс

Григорян, Анаит Суреновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на развитие посттравматических процессов в головном мозге крыс
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на развитие посттравматических процессов в головном мозге крыс"

004612022

На правах рукописи

Григорян Анаит Суреновна

ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МЕЗЕНХИМ ПЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК НА РАЗВИТИЕ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКНХ ПРОЦЕССОВ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2010

1 1 НО Я 7П10

004612022

Работа выполнена в Отделе общей и частной морфологии Учреждения РАМН Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН и ООО «Транс-Технологии»

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, Гилерович Елена Георгиевна Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Неворотин Алексей Иосифович Доктор биологических наук, Хожай Людмила Ивановна

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится « 09 » ноября 2010 г. в_11:00_часов на заседании

диссертационного совета Д.001.022.02 по защите кандидатских и докторских диссертаций при Учреждении РАМН Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН (Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения РАМН Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

Ученый секретарь совета по защите кандидатских и докторских диссертаций доктор медицинских наук

П. А. Дыбан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сегодня клеточная терапия с помощью стволовых клеток (CK) считается перспективным подходом для коррекции последствий ряда патологических процессов. Применение клеток принципиально отлично от традиционной медикаментозной терапии, для которой характерны симптоматический подход и кратковременность воздействия. Обычно лекарственный препарат оказывает свое действие лишь в тот период, пока присутствует в организме в терапевтической концентрации. Клетки же, в случае их успешной интеграции в ткань реципиента, могут оказывать положительные эффекты в течение многих месяцев и лет. Использование в качестве терапевтического агента клеток дает надежду на восстановление естественной структуры и, следовательно, функций того или иного органа, утраченных в результате травмы или патологического процесса.

Стволовые и прогениторные клетки, полученные из различных источников, активно изучают в экспериментальных исследованиях на моделях заболеваний самой разной этиологии, включая многочисленные иейродегенеративные расстройства и тяжелые повреждения центральной нервной системы, вызванные ишемическим инсультом головного мозга, черепно-мозговыми травмами и травмами спинного мозга. В настоящее время показано, что клеточная терапия способна оказывать выраженное положительное влияние на функциональное восстановление нервной системы при болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, ишемическом инсульте и других патологиях [Викторов И.В., Сухих Г.Т., 2002; Dezawa М. et al., 2005; Haas S. et al., 2002; Levy Y.S. et al., 2004].

Благодаря своей способности к практически неограниченной пролиферации и дифференцировке во все клеточные типы эмбриона и взрослого организма, за исключением клеток трофэктодермы, идеальным клеточным материалом для терапии могут показаться эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), однако процессы их деления и развития из них специализированных клеток после трансплантации в организм реципиента невозможно контролировать. ЭСК, трансплантированные во взрослый организм, в процессе разнонаправленной дифференцировки образуют тератомы и тератокарциномы -соответственно доброкачественные и злокачественные опухоли, состоящие из производных трех зародышевых листков (эктодермы, энтодермы и мезодермы) [Дыбан П.А., Дыбан А.П., 2002; Aleckovic М„ Simon С., 2008; Blum В., Benvenisty N., 2009]. Возможна также воспалительная реакция отторжения трансплантата. Это было показано в нескольких экспериментах по эктопической трансплантации ЭСК [Itskovitz-Eldor J., 2000; Nussbaum J. et al., 2007; Odorico J.S. et al., 2001; Wernig M. et al., 2004].

Феталыше стволовые клетки (ФСК), хотя и являются клетками-предшественницами более высокой степени дифференцировки, нежели ЭСК, и не представляют опасности

канцерогенеза, часто не могут быть получены в достаточном для трансплантации количестве. Более серьезное препятствие для их применения - невозможность, как и в случае ЭСК, аутологичной трансплантации, из-за чего возникает риск их иммунного отторжения. В этом смысле головной мозг не является исключением, особенно если говорить о его состоянии после травмы, поскольку при этом разрушается гематоэнцефалический барьер и происходит инфильтрация нервной ткани иммунокомпетентными клетками, приходящими через поврежденные сосуды. Однако и в случае трансплантации аллогенного материала в интактный головной мозг наблюдается активная микроглиальная реакция [Tambuyzer B.R. et al., 2009].

По этим причинам все большее внимание исследователей привлекают взрослые стволовые клетки, которые, как известно, обнаруживаются в ряде тканей, в частности, в жировой ткани [Moseley Т А. et al., 2006; Nakagami H. et al., 2006; Tholpady S.S. et al., 2006], коже [Watt F M. et al., 2006], почках [Humphreys B.D. et al., 2006; Morigi M. et al., 2006], периферической крови [Fruehauf S. et al., 2005], головном мозге [Sohur U.S. et al., 2006; Taupin P., 2006] и костном мозге [Bobis S. et al., 2006; Sottile V., 2007]. Большинство этих клеток способны давать начало только элементам той ткани, из которой происходят, однако количество таких регионарных СК весьма невелико, и в норме они служат скорее для физиологического обновления ткани, нежели для ее постгравматической регенерации.

Из всех взрослых стволовых клеток млекопитающих, в том числе и человека, наиболее доступны для получения, наращивания в культуре и последующего использования так называемые мезенхимные стволовые клетки (МСК), присутствующие в строме костного мозга. Методики работы с МСК, позволяющие получить клетки в достаточном для трансплантации количестве, хорошо отработаны [Малайцев В В. и соавт., 2002; Jaiswal R.K. et al., 2002; Woodbury D. et al., 2002]. Известно, что данные клетки in vitro в отсутствии искусственных воздействий способны давать начало остеоцитам, адипоцитам и хондроцитам [Pittenger MF. et al., 2004; Friedenstein A.J. et al., 1966; Friedenstein A.J. et al., 1970 Friendenstein A.J., 1995], a под действием специфических факторов дифференцировки -некоторым другим клеточным типам, в том числе клеткам нейроналыюго ряда [Kopen G.C. et al., 1999; Muraglia A. et al., 2000; Sanchez-Ramos J. et al., 2000; Woodbury D. et al., 2000]. В связи с этим активно исследуются возможности использования МСК в терапии нейродегенеративных заболеваний и повреждений нервной системы [Корочкин Л И. и соавт., 2005; Alexandrova М.А. et al., 2004; Li Y. et al., 2001; Lindvall O., Kokaia Z., 2005; Lindvall O., Kokaia Z., 2006; Lu D. et al., 2001; Mahmood A. et al., 2001; Podgornyi O.V. et al., 2004]. В нашем научном коллективе на модели ишемического инсульта головного мозга у крыс было показано, что МСК ускоряют течение реакции асептического воспаления, способствуют

выживанию нейронов в зоне ишемической полутени, улучшению васкуяяризации ишемизированной зоны и сохранению целостности сосудистого сплетения [Зинькова Н.Н. и соавт., 2007; Соколова И.Б. и соавт., 2004].

Травма головного мозга (ТГМ) является серьезной медицинской проблемой. По данным ВОЗ, ее частота составляет от 30 до 50% от общего травматизма. Примерно 20% пациентов, получивших травмы головного мозга различной степени тяжести, погибает в течение первых 30 дней. Около 10% пациентов остаются инвалидами в случае легкой травмы, 66% - в случае травмы средней степени тяжести, и 100% - при тяжелой травме. При этом отмечается, что частота черепно-мозговой травмы возрастает в среднем иа 2% в год [Карпов С.М. и соавт., 2004]. В отличие от различного рода заболеваний, травма затрагивает все возрастные категории людей, по большей части детей и подростков, ведущих подвижный образ жизни [Ьи И й а1., 2003]. Пациенты, выжившие после тяжелых травм, нуждаются в интенсивной комплексной терапии [ОоЬкт В Н. , 1993].

Обширная травма головного мозга, затрагивающая множество ядерных структур, стоит особняком среди прочих повреждений. Она крайне сложна для изучения, поскольку влечет за собой активацию целого комплекса патогенетических механизмов, которые можно охарактеризовать как нарушение нейродинамических процессов, расстройство тканевого дыхания и энергетического метаболизма, нарушение ликвородинамики и изменение мозгового кровообращения [Яруллин Х.Х.,1983]. В то же время она является фундаментальной проблемой медицины, ставя перед исследователями вопрос о границах компенсаторных и регенерационных возможностей мозга. Экспериментальных работ, в которых бы проводились трансплантации различных типов стволовых клеток на моделях обширной механической травмы головного мозга, крайне мало. Применение МСК после ТГМ - одно из самых молодых направлений в этой области. Большинство экспериментальных работ, в которых проводились попытки таких трансплантаций, относится к 2000-2009 годам, а число этих работ крайне невелико и, что более важно, практически все они выполнены одной группой исследователей под руководством Майкла Чоппа (М.СЬорр) [1д1 Б. « а1„ 2001а; Ьи Б. е! а1., 2001Ь; Ьи Э. Й а1., 2002; МаЬшоос1 А. е! а1., 2001; МаЬтоо(1 А. е! а1., 2002; МаЬтоос! А. е1 а1., 2004а; МаЬшооа А. е! а1., 2004Ь; МаЬтоос! А. е1 а!., 2005].

Данная научная группа установила, что трансплантация МСК крысам с черепно-мозговой травмой позволяет сохранить достоверно большее количество жизнеспособных нейронов в нервной ткани, прилежащей непосредственно к травматической полости, а также способствует более быстрому и полному восстановлению моторных и когнитивных навыков. Однако эти исследования не охватывают всего спектра проблем, связанных с тяжелым

повреждением головного мозга. Нужно заметить, что в перечисленных случаях МСК были трансплантированы животным тотчас после нанесения травмы, что ни в коей мере не отражает реальной ситуации, возникающей в клинике, когда терапия применяется лишь спустя по крайней мере несколько часов после травмы. Также нельзя забывать о том, что в течение первых и вторых суток после повреждения головного мозга в нем развиваются процессы острого некроза [Зинькова H.H. и соавт., 2007]. Введение клеток в это время при попадании в травматическую полость может закончиться их гибелью. По этим причинам необходимо изучить течение посттравматических процессов в мозге при отложенной трансплантации МСК, чего до настоящего времени никем не проводилось.

Работы, выполненные в данной области, остаются сугубо феноменологическими - в них идет речь о воздействии МСК на поврежденную нервную ткань, но не о причинах и механизмах этого воздействия. Остается неизвестным распределение МСК в головном мозге при различных способах трансплантации. Не выяснен вопрос о возможностях диффереццировки МСК в нейрональном и глиальном направлениях in vivo. Не изучена динамика процессов реорганизации нервной ткани на фоне действия трансплантированных МСК, а также неизвестно, насколько трансплантация МСК влияет на активацию эндогенных процессов репарации и регенерации в мозге. Кроме того, остается неясным, какой именно способ трансплантации оптимален для терапии. Для решения этих вопросов необходимо тщательное исследование морфологических изменений, происходящих в головном мозге после ТГМ и трансплантации мезенхимных стволовых клеток. Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение влияния различных методов трансплантации сингенных МСК на структуры головного мозга при его обширной механической травме.

Для достижения поставленной цели работы были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. В поврежденном головном мозге изучить локализацию донорских МСК при различных способах их трансплантации: системно в кровь, введении в пограничную зону травматической полости, а также при одновременном введении в мозг и внутривенно.

2. Определить экспрессию трансплантированными МСК маркеров дифференцировки ряда клеток (нейрональные ядра, глиальный фибриллярный кислый белок, фактор фон Виллебрандта).

3. Изучить динамику морфологических изменений в головном мозге крыс при обширной механической травме.

4. Изучить динамику морфологических изменений в головном мозге крыс при обширной механической травме на фоне трансплантации МСК.

5. Провести сравнение влияния различных методов трансплантации МСК на течение посттравматических процессов в головном мозге крыс. Научная новизна работы

Впервые получены данные о действии МСК на клетки головного мозга при обширной травме, затрагивающей неокортекс и ядерные структуры. Экспериментально показано, что МСК снижают выраженность последствий противоудара, возникающего в момент нанесения травмы, оказывая нейропротекторное действие на пириформную кору контралатерального полушария. Показано, что МСК стимулируют неоаигиогенез в зоне повреждения мозга, что, по всей видимости, способствует улучшению трофики ткани.

Экспериментально зарегистрирована различная локализация МСК при разных способах трансплантации: в краевой зоне травматической полости при внутривенном введении; в краевой зоне травматической полости, субвентрикулярной зоне обоих полушарий и области сосудистого сплетения при введении в мозг и сочетанием введении в мозг и в внутривенно.

Впервые экспериментально продемонстрирована экспрессия отдельными трансплантированными МСК маркера нейронов ЫеиК

Экспериментально продемонстрировано ускорение процессов очищения зоны повреждения от некротических масс и клеточного детрита после нанесения травмы и введения МСК внутривенно и в мозг животного.

Впервые продемонстрировано формирование в базальных структурах мозга аномальных клеточных скоплений, содержащих фибробластоподобные клетки и коллагеновые волокна, в течение недели после трансплантации МСК в мозг, и образование аномально расширенных капилляров в различных структурах мозга через 6 недель наблюдения.

При внутривенном введении МСК показано уменьшение количества вцутримозговых структур, разрушенных в результате формирования травматической полости.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты диссертационного исследования могут быть использованы для дальнейшего изучения процессов репарации при травматических повреждениях головного мозга, а также в исследованиях участия трансплантированных МСК в регенеративных процессах в мозге. С практической точки зрения, результаты работы могут быть использованы для разработки новых терапевтических подходов, основанных на принципах клеточной терапии, для лечения пациентов, пострадавших в результате черепно-мозговых травм.

Основные положения, выносимые на защиту

1. МСК, введенные внутривенно через 36 ч после травмы, способны проникать через поврежденный ГЭБ и имеют тропизм к зоне повреждения.

2. Отдельные трансплантированные МСК в мозге способны претерпевать слияние с нейронами реципиента.

3. Внутривенное введение и трансплантация МСК в мозг ускоряет процесс очищения зоны повреждения от некротических масс и клеточного детрита.

4. Трансплантация МСК в мозг и сочетанное введение МСК в мозг и в хвостовую вену приводят к формированию через 1 неделю аномальных клеточных скоплений, содержащих фибробластоподобные клетки и коллагеновые волокна, и образованию аномально расширенных капилляров через 6 недель наблюдения.

5. Внутривенное введение МСК приводит к уменьшению количества структур мозга, разрушенных вследствие формирования травматической полости; трансплантация МСК в мозг приводит к увеличению количества поврежденных структур и расширению рубца на границе травматической полости. Трансплантация МСК внутривенно и в мозг стимулирует ангиогенез в краевой зоне травматической полости.

6. Трансплантация МСК оказывает нейропротекторное воздействие па пириформную кору контралатерального полушария.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Основные положения работы доложены и обсуждены на международном симпозиуме «Актуальные вопросы донорского и персонального хранения стволовых клеток» (21 сентября 2009 г., Москва) и на «Всероссийской научной школе-конференции для молодежи» (21-26 сентября 2009 г., Москва). Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения полученных результатов, выводов и заключения. Работа изложена на 261 стр. машинописного текста, иллюстрирована 101 рисунком и 22 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Эксперименты были проведены на 120 крысах - самцах линии Вистар-Киото массой от 180 до 200 г, в возрасте от 4 до 5 месяцев. Животных содержали в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, свободный доступ к воде и пище, температура 23-25°С).

Выделение и культивирование МСК из стромы костного мозга крыс

Суспензию костного мозга выделяли из бедренных костей животных сразу после декапитации. В стерильных условиях удаляли эпифизы бедренных костей, диафизы промывали средой культивирования аМЕМ (Hyclone, Новая Зеландия), содержавшей 20% сыворотки крови эмбрионов коров (Gibco, США) и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (Gibco, США). Полученный смыв помещали на пластиковые чашки Петри (Sarstedt, Германия). Через 48 часов после эксплантации костного мозга проводили двукратную процедуру отмывки МСК от форменных элементов крови с помощью раствора ФСБ (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4; 0,1М NaCl). Клетки культивировали в монослое при 37°С в 5% СОг-инкубаторе в течение 6-7 суток после эксплантации. В дальнейшем проводили пассирование культуры через каждые семь суток с исходной плотностью 1,27x103 клеток/см2, используя раствор трипсина и ЭДТА (Hyclone, Новая Зеландия). Замену питательной среды проводили каждые трое суток. Иммунофенотипирование МСК крыс

Иммунофенотипирование мезенхимных стволовых клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии на проточном цитофлуориметре EPICS XL (Beckman Coulter, США). МСК окрашивали антителами против негативного маркера CD45 (Beckton Dickinson, США) и против позитивных маркеров CD90 и CD 106 (Beckton Dickinson, США) по протоколам фирмы-изготовителя. Окрашивание МСК крыс флуорохромом РКН26

Перед трансплантацией животным МСК в культуре окрашивали витальным липофилышм красителем РКН26 (Sigma, США) по протоколу фирмы-изготовителя. Моделирование ТГМ у крыс и трансплантация клеточного материала

Была смоделирована закрытая травма головного мозга крысы в области соматосенсорной коры левого полушария. Крыс наркотизировали золетилом в дозе 5мг/кг (Zoletil, Virbac Santé Animale, Франция). Во время операции и до выхода из наркоза температура тела животных поддерживалась на уровне 37°С. Голову животного фиксировали, после чего разрезали кожу на голове и вскрывали череп, не повреждая твердой мозговой оболочки, и наносили травму с помощью метода «weight-drop» [Flieri A.M. et al., 2009; Shapira Y. et al., 1997] падением округлой гири весом 1,3 г по направляющей трубочке с высоты 25 см. Импульс удара гири о твердую мозговую оболочку составлял 31,25 мН/с. Операционную рану ушивали. Для анализа было создано 5 групп экспериментальных животных (таблица 1);

Таблица 1. Группы животных, вошедшие в исследование.

Группа (п=24 для каждой группы) Экспериментальное воздействие Морфологический / иммуногистохимический анализ / флуоресцентная иммуногистохимия на сроках 1,3, 6 нед. Морфометрический анализ / анализ распределения меченых РКН26 МСК в мозге на сроках 1 и 6 нед.

Негативный контроль ТГМ; никакой последующей терапии не проводилось.

Введение в мозг культу ралыюй среды аМЕМ ТГМ; введение 20 мкл аМЕМ через 72 ч. после нанесения травмы (2 укола по 10 мкл в стенку травматической полости в сенсомоторной коре).

Транспл. МСК в мозг ТГМ, трансплантация 2x105 МСК, окрашенных флуорохромом РКН26, в 20 мкл ссМЕМ через 72 ч. после нанесения травмы (2 укола по 10 мкл в стенку травматической полости в сенсомоторной коре).

Внутривенное введ. МСК ТГМ; введение 5x106 МСК, окрашенных флуорохромом РКН26, в 100 мкл аМЕМ через 72 ч. после нанесения травмы в хвостовую вену.

Сочетанная транспл. МСК ТГМ; трансплантация МСК в мозг и внутривенное введение МСК через 72 ч. после нанесения травмы.

Фиксация головного мозга

Животные под стандартным золетиловым наркозом подвергались прижизненной фиксации посредством перфузии через левый желудочек сердца 4% раствором параформальдегида в ФСБ (рН 7,2). Раствор фиксатора подавали со скоростью 10 мл/мин, общий объем фиксатора на одно животное составлял 200 мл. После декапитации извлекали головной мозг и вырезали сегмент, включающий видимую зону повреждения и интактные краевые зоны. Половину полученного блока фиксировали по стандартной методике в параформальдегиде с последующей заливкой в парафин, другую использовали для определения флуоресцентно меченых МСК. Для этого образцы помещали в раствор криопротектора - 30% сахарозы в ФСБ на 2-3 суток при температуре 4°С до момента, когда кусочки ткани погрузятся на дно емкости с фиксатором. Затем кусочки ткани охлаждали в парах жидкого азота в течение 10 с, погружали в жидкий азот на 1 ч и помещали в холодильную камеру с температурой -70°С.

Выявление флуоресцентно меченых МСК в головном мозге

Детекцию флуоресцентно меченых МСК в срезах мозга проводили с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica, Германия) на гистологических криопрепаратах толщиной 7 мкм, изготовленных на криостатном микротоме Bright (Bright, Великобритания). Гистологическое окрашивание срезов головного мозга

Парафиновые срезы головного мозга толщиной 7 мкм изготавливали по общепринятой методике на ротационном микротоме RM2125RT (Leica, Швейцария). Срезы мозга для морфологического анализа окрашивали толуидиновым синим по методу Ниссля, а также по методу Ван-Гизона для оценки возможного синтеза коллагена трансплантированными клетками в мозге. Морфологический анализ срезов головного мозга

При морфологическом анализе определяли наличие воспалительного процесса и некроза в левом (травмированном) полушарии головного мозга, состояние граничащих с травматической полостью и удаленных от повреждения участков мозга. Оценивали состояние подкорковых и базальных структур мозга как в ипсилатеральном, так и в контралатеральном полушарии. Структуры мозга идентифицировали по атласу [Paxinos G., Watson Ch., 1998]. Оценивали максимальное количество поврежденных участков коры и подкорковых структур мозга в каждой группе. Иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга Стандартное иммуногистохимическое окрашивание

Парафиновые срезы головного мозга толщиной 7 мкм изготавливали по общепринятой методике на ротационном микротоме RM2125RT (Leica, Швейцария). Иммуногистохимическим методом выявляли ряд маркеров клеточных типов: NeuN (белок нейрональных ядер, маркер нейронов; антитела Chemicon, США), ГФКБ (глиапьный фибриллярный кислый белок; маркер астроглии; антитела DAKO, Дания), Ki67 (ядерный маркер пролиферирующих клеток; антитела BD Pharmingen, США), vWF (фактор фон Виллебрандта; маркер эндотелиоцитов сосудов; антитела DAKO, Дания), SynF (синаптофизин; маркер мембран синаптических пузырьков в аксоне; антитела DAKO, Дания). Выявление маркера NeuN проводили по модифицированной методике [Коржевский Д.Э. и соавт., 2005], выявление остальных маркеров проводили по протоколам фирмы-изготовителя.

Флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание

Криосрезы головного мозга толщиной 7 мкм изготавливали по общепринятой методике на криостатном микротоме Leica СМ 1510 (Leica, Германия). Методами флуоресцентной иммуногистохимии выявляли ряд маркеров клеточных типов. NeuN

(антитела, конъюгированные с флуорохромом FITC (DAKO, Дания)), ГФКБ (антитела, конъюгированные с флуорохромом FITC (DAKO, Дания)), VWF (антитела, конъюгированные с фикоэритрином (DAKO, Дания)). Во всех случаях окрашивание проводили по протоколам фирмы-производителя. Морфометрическое исследование срезов головного мозга

При морфометрическом анализе головного мозга животных из разных экспериментальных групп проводили сравнительную оценку количества сохранных морфологически неизмененных NeuN-позитивных нейронов в краевой зоне травматической полости в коре; количества сохранных NeuN-позитивных нейронов в ядрах миндалевидного тела как ипсилатерального, так и контралатерального полушария; количества сохранных NeuN-позитивных нейронов в пириформпой коре как ипсилатерального, так и контралатерального полушария; количества поврежденных гиперхромных нейронов в пириформной коре как ипсилатерального, так и контралатерального полушария; количества микрососудов в краевой зоне травматической полости; толщины астроглиального рубца, образовавшегося в краевой зоне травматической полости.

Подсчет морфологически неизмененных NeuN-позитивных нейронов проводили на срезах, окрашенных антителами против маркера NeuN, в пограничной с повреждением зоне и в ядрах миндалевидного тела ипсилатерального и контралатерального полушарий через 1 и 6 недель после ТГМ. Подсчет морфологически неизмененных нейронов в пириформной коре ипсилатерального и контралатерального полушарий проводили через 6 недель после нанесения травмы. Подсчет поврежденных гиперхромных нейронов проводили на срезах, окрашенных толуидиновым синим по методу Ниссля. В каждом из этих участков случайным образом выбирали несколько полей зрения (5 в краевой зоне травматической полости в коре, по 4 в ядрах миндалины каждого полушария, по 6 в пириформной коре каждого полушария) под микроскопом Leica (Leica, Германия) при увеличении 40х (встроенный окуляр микроскопа - 10х) и изготавливали фотографии при помощи цифровой камеры DFC 100 (Leica, Германия). Подсчет микрососудов в пограничной зоне травматической полости проводили на срезах, окрашенных антителами против фактора фон Виллебрандта, конъюгированными с флуоресцентным красителем FITC.

На фотографиях с помощью программы PhotoM подсчитывали количество интересующих элементов (микрососудов либо нейронов) в каждом поле зрения. Полученные количественные данные обрабатывали с помощью программы Statistica (Stat Soft Inc., США).

Оценку толщины астроглиального рубца, сформировавшегося в краевой зоне травматической полости, проводили на срезах, окрашенных против маркера ГФКБ. Случайным образом выбирали участок краевой зоны под микроскопом Leica (Leica,

Германия) при увеличении 40х (Ок. 10х) и изготавливали фотографии при помощи цифровой камеры DFC 100 (Leica, Германия). Оценку ширины рубца проводили в программе PhotoM. Полученные количественные данные были обработаны с помощью программы Statistica (Stat Soft Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика МСК крысы in vitro

В работе использованы МСК, имеющие фенотип CD457CD44|OW/CD106|OW/CD90+. Данный фенотип был ранее описан для МСК крысы [Carvalho A.B. et al., 2008]. Таким образом, наши данные соответствуют данным других авторов. Тем не менее, следует признать, что до настоящего времени исследователи не пришли к единому мнению относительно иммунофенотипа МСК. У этих клеток нет уникального маркера, из-за чего специалисты, работающие с МСК, вынуждены характеризовать их по наборам поверхностных маркеров. Не существует также и унифицированного набора таких маркеров, принятого в лабораториях всего мира. Обычно популяцию МСК характеризуют по отсутствию всех либо одного из уникальных гемопоэтических маркеров (CD34, CD45) и по наличию на их мембране молекулы CD90 - маркера фибробластической дифференцировки [Chamberlain G. et al., 2007; Dominici M. et al., 2006], из чего исходили и мы, оценивая поверхностный фенотип использованных в работе клеток.

Локализация меченых флуорохромом РКН26 МСК в мозге при различных методах трансплантации

Спустя неделю после трансплантации при анализе распределения меченых МСК в мозге животных было обнаружено, что распределение клеток находится в жесткой зависимости от метода их доставки в организм реципиента. При внутривенном способе введения мы не обнаружили меченых МСК нигде, кроме как в краевой зоне травматической полости, образовавшейся на месте первичного некроза нервной ткани - по-видимому, клетки мигрируют в данную область через разрушенный гематоэнцефалический барьер по градиенту фактора SDF-1, чья концентрация резко возрастает в зонах тканевого повреждения [Bhakta S. et al., 2006], а также по градиенту факторов воспаления, таких как IL-1, IL-6 (интерлейкины-1 и -6), и TNF (tumor necrosis factor) [Capone С. et al., 2007; Kitaori T. et al., 2009].

Ранее другими исследователями, в частности, научной группой Майкла Чоппа, было показано, что при внутривенной трансплантации МСК располагаются в пограничной зоне травматической полости, а также в коре ипсилатералыюго полушария, в белом веществе мозолистого тела и стриатуме, способствуя ускорению восстановления когнитивных и

поведенческих функций у экспериментальных животных [Lu D. et al., 2001; Sykova E., Jendelova P., 2007]. Существуют и полностью противоречащие этому данные - так, научной группой Чарльза Кокса в 2009 году было показано, что при внутривенной трансплантации после травмы головного мозга у крыс лишь 0,0005% трансплантированных МСК достигают краевой зоны повреждения на вторые сутки после трансплантации, а через 2 недели в мозге их уже не обнаруживается. При этом МСК не оказывают никакого положительного влияния на восстановление моторных и когнитивных функций [Harting М.Т. et al., 2009].

Таким образом, миграция МСК в краевую зону травматической полости при внутривенном введении свидетельствует о тропности трансплантированных клеток к зоне повреждения, что согласуется с данными других авторов о том, что после трансплантации МСК не разносятся пассивно с током крови, но осуществляют направленную миграцию в определенные зоны-мишени, включающие области тканевого повреждения [Gao J et al., 2001; Allers С. et al., 2004; ParkK.I et al., 2008; Chamberlain G. et al., 2007].

При введении непосредственно в мозг в краевую зону травматической полости трансплантированные МСК располагались в месте введения, субвентрикулярной зоне обоих полушарий и в области сосудистого сплетения. По-видимому, наблюдаемое нами распределение клеток - результат миграции МСК в мозге с током ликвора. Ассоциации трансплантированных клеток с капиллярами в мозге не наблюдалось. В большинстве случаев при нанесении травмы повреждалась желудочковая система мозга, из-за чего трансплантированный материал попадал в полости желудочков, а часть клеток, по-видимому, мигрировала через поврежденную эпендимную выстилку в окружающую нервную ткань и оказывалась в субэпендимной зоне, а также во внутренней капсуле, мигрируя вдоль волокон белого вещества [Englund U. et al., 2002].

Экспрессия трансплантированными МСК маркеров нейронов, астроглии и эидотелиоцитов сосудов в мозге

Была обнаружена колокализация флуоресцентной метки отдельных трансплантированных МСК в мозге с маркером нейронов NeuN («нейрональные ядра»). Мы также оценивали колокализацию флуоресцентной метки МСК с маркером астроглиальной дифференцировки ГФКБ (глиальный фибриллярный кислый белок) и маркером эндотелиальных клеток сосудов - фактором фон Виллебрандта, однако МСК, экспрессирующих данные маркеры, обнаружено не было. Следует сказать, что наши данные не согласуются с данными большинства исследователей. Считается, что при попадании в травмированную нервную МСК ткань осуществляют нейропротекцию благодаря своей способности к дифференцировке в клетки пейронального и глиалыюго ряда. Майклом Чоппом и его коллегами было показано, что в мозге трансплантированные МСК начинают

экспрессировать маркерные белки нейронов МАР-2 (microtubule-associated protein-2) и NeuN, а также маркерный белок астроцитарной глии ГФКБ [Lu D. et al., 2001]. Другими исследователями также было показано, что МСК экспрессируют ГФКБ и маркер олигодендроцитов белок S-100, благодаря чему активируют регенерацию поврежденной нервной ткани [Arnold S. et al., 2006; Tohill M. et al., 2004]. Полученные нами данные, однако, свидетельствуют в пользу того, что убедительных доказательств дифференцировки МСК в нейроны нет, и мы, по всей видимости, наблюдаем феномен слияния трансплантированных клеток с клетками реципиента (т.н. «fusion»).

Сравнительная характеристика головного мозга крыс из групп контроля и клеточной терапии

При внутривенном введении и местной трансплантации МСК способствовали более раннему завершению воспалительного процесса в поврежденном мозге. Клетки воспалительного инфильтрата усиливают повреждение нервной ткани, вырабатывая свободные радикалы кислорода и цитотоксические факторы [Emsley Н С. et al., 2007; Hopkins

5.J. et al., 2003]. Скорейшее завершение воспалительного процесса и поглощения продуктов распада ткани микроглиальными клетками и макрофагами, привнесенными с током крови, способствует созданию «плацдарма» для процессов репарации и образования астроглиально-соединительнотканного рубца на границе повреждения.

В обеих контрольных группах на шестой неделе наблюдения сохранялась макрофагальная инфильтрация поврежденных зон, в то время как в группах внутривенного и местного введения МСК к этому сроку полностью завершалось очищение травматической полости от клеточного детрита. В научной литературе существуют аналогичные данные относительно того, что трансплантация МСК оказывает положительный эффект на течение посттравматических процессов в мозге благодаря снижению интенсивности воспалительной реакции [Ohtaki H. et al., 2008].

Известно, что как аутологичные, так и аллогенные МСК способны снижать выраженность воспалительной реакции [Сергеев B.C., 2005]. По-видимому, это происходит благодаря секреции МСК ряда противовоспалительных факторов и цитокинов, таких как IL-

6, IL-8, PGE-2 (простагландин Е2), TGF-ß (трансформирующий фактор роста бета) [Majumdar M.K. et al., 1998; Deans R.J. et al., 2000; Mareshi К. et al., 2001; Chen J. et al., 2003; Le Blanc K. et al., 2003; Silva W.A. et al., 2003; Nemeth K. et al., 2009]. Также МСК способны при взаимодействии с клетками воспаления подавлять синтез провоспалительных цитокинов последними. Было показано, что при кокультивировании МСК с дендритными антигенпрезентирующими клетками и Т-лимфоцитами происходит снижение выработки иммунокомпетентными клетками факторов TNF и IFN-y, играющих роль в запуске и

поддержании воспалительной реакции [Aggarwal S., Pittenger M.F., 2005]. Данные факторы при повреждении нервной системы секретируются микроглиальными клетками и клетками астроглии, способствуя повышению проницаемости капилляров, из-за чего усиливается миграция макрофагов и других лейкоцитов в зону повреждения [Yilmaz G. et al., 2006].

Группа клеточной терапии, когда животные получали сочетанную трансплантацию МСК, составила исключение - в ней, напротив, происходило усиление лейкоцитарной инфильтрации травмированных областей мозга. Возможно, избыток биологически активных факторов, продуцируемых МСК, мог привести к данному эффекту, поскольку в случае сочетанного введения МСК в мозге животного могло оказываться избыточное количество трансплантированных клеток. В своем исследовании мы не ставили перед собой задачу определить максимальную дозу МСК, переносимую животными, однако, по всей видимости, в данном случае мы столкнулись именно с дозозависимым эффектом трансплантации, когда при повышении неких определенных пороговых значений вместо положительных эффектов наблюдаются отрицательные. В научной литературе на сегодняшний день нет данных, свидетельствующих о негативном эффекте высоких концентраций мезенхимных стволовых клеток на воспалительный процесс в поврежденном мозге - напротив, проведенный в 2010 году метаанализ всех исследований в данной области показал, что увеличение дозы трансплантируемых МСК приводит исключительно к положительным эффектам и усилению супрессии воспалительного процесса, происходящего при различных типах травматических повреждений мозга [Janowski М. et al., 2010].

На основании наших данных мы можем заключить, что внутривенное введение МСК или трансплантация МСК в мозг на третьи сутки после нанесения травмы ускоряет завершение воспалительного процесса и очищения зоны повреждения от продуктов распада ткани, а сочетанная трансплантация оказывает обратный эффект. По всей видимости, наблюдаемый результат связан не со способом трансплантации клеточного материала, но с количеством трансплантируемых клеток.

Местная трансплантация МСК в мозг и сочетанная трансплантация приводят к неожиданным эффектам. В нашей работе мы впервые показали, что местная трансплантация МСК приводит к формированию в мозге плотных клеточных скоплений, содержащих множество клеток веретеновидной фибробластоподобной формы, синтезирующих коллаген (по всей видимости, трансплантированных МСК), и большое количество мелких сосудов. Другими исследователями, проводившими аналогичные трансплантации, подобный феномен отмечен не был [Zhang С. Et al., 2005]. Обычно эти скопления лежали под эпендимной выстилкой латерального желудочка либо его фиссуры в базальных структурах мозга, что свидетельствует о распространении трансплантированного материала с током ликвора.

Клеточные скопления в мозге не содержали клеток глиального и нейронального ряда, однако в них присутствовала масса пролиферирующих клеток - видимо, как трансплантированных МСК, так и клеток лейкоцитарного инфильтрата. Установить, какие именно клетки главным образом пролиферировали в скоплении, мы не имели возможности, поскольку автофлуоресценция массы присутствовавших в клеточных скоплениях макрофагов не позволяла отдифференцировать в них МСК, меченые красителем РКН26, имеющим тот же диапазон флуоресценции.

Кажется странным, что в клеточных скоплениях, несомненно, содержащих МСК, присутствовало огромное количество инфильтрирующих макрофагов, в то время как диффузно расположенные МСК в различных областях мозга вызывают усиление макрофагалыю-лейкоцитарной инфильтрации только в случае сочетанной трансплантации, оказывая прямо противоположный эффект в случае местной трансплантации. Мы можем предположить, что несвойственные мозгу плотные скопления клеток механически сдавливали и повреждали нервную ткань, приводя к появлению в этих зонах массы клеточного детрита, который активно и фагоцитировали макрофаги, мигрировавшие из многочисленных капилляров, присутствовавших в составе скоплений. Тем не менее, гистологический анализ не выявил ни в самих скоплениях, ни вокруг них гибнущих нейронов и глиальных элементов. Таким образом, нам остается только заключить, что макрофаги фагоцитировали именно остатки клеток, входящих в состав скоплений.

Через три недели наблюдения аномальные клеточные скопления практически полностью резорбировались, а на их месте еще наблюдалось небольшое количество пигментированных макрофагов, завершающих процессы фагоцитоза клеточного детрита и остатков коллагеновых волокон.

Через шесть недель данные клеточные скопления подвергались окончательной деструкции, однако в мозге животных обнаруживалось большое количество резко расширенных капилляров. По-видимому, это связано с продукцией трансплантированными клетками избытка фактора VEGF, стимулирующего пролиферацию эндотелиоцитов и ангиогенез [Croll S D., 2004]. Этим объясняется и тот факт, что при сочетанной трансплантации, когда животные получали большую дозу МСК, количество таких сосудов было существенно больше, и присутствовали они у всех без исключения животных. Известно, что попадание в нервную ткань избытка фактора VEGF провоцирует вместо формирования нормальных капиллярных сетей образование аномальных расширенных сосудов с тонкой эндотелиальной выстилкой [Croll S.D., Wiegand S.J., 2001].

Связано ли появление аномальных капилляров со скоплениями фибробластоподобных клеток, обнаруженными на первой неделе наблюдения, сказать трудно, поскольку клеточные

скопления имели четкую локализацию в мозге, в то время как расширенные капилляры располагались беспорядочно во всех структурах мозга, и какой-либо закономерности в их локализации выявить не удалось. Мы можем лишь с уверенностью утверждать, что именно трансплантация МСК в мозг, но не их внутривенное введение, приводит к обнаруженным эффектам.

При внутривенном введении МСК на поздних сроках анализа наблюдается наименьшее количество структур мозга, разрушенных в результате формирования травматической полости, в сравнении с другими экспериментальными группами. Трансплантация МСК в мозг и сочетанная трансплантация, напротив, приводят к тому, что количество разрушенных структур мозга существенно увеличивается в сравнении с другими экспериментальными группами. Подобное увеличение количества поврежденных структур мозга мы наблюдали также при введении в мозг культуралыюй среды а-МЕМ. По всей видимости, данный эффект - не результат трансплантации собственно МСК, а следствие дополнительной травмы, наносимой при таком методе трансплантации. На это указывает и тот факт, что местная трансплантация МСК и их внутривенное введение приводят к достоверному увеличению количества микрососудов в краевой зоне травматической полости, что свидетельствует о трофическом эффекте МСК и синтезируемого ими ангиогенного фактора VEGF [Croll S.D., 2004].

При сочетанной трансплантации улучшения трофики ткани не наблюдается, и количество микрососудов в исследованной области в этом случае не отличается от количества микрососудов в краевой зоне травматической полости в группах контроля. Очевидно, мы также можем отнести этот факт к доказательствам дозозависимого эффекта клеточной терапии. Слишком высокая концентрация ангиогенного фактора в мозге не способствует образованию функциональных капиллярных сетей, приводя исключительно к развитию сосудистых мальформаций [Croll S.D., Wiegand S.J., 2001].

Важный эффект местной трансплантации МСК - достоверное расширение астроглиального рубца, образовавшегося на границе травматической полости. Это негативный эффект клеточной трансплантации, поскольку астроглиальный рубец препятствует регенерации аксонов, а клетки в его составе на начальных этапах активации продуцируют провоспалительные цитокины [Fawcett J.W., Asher RA., 1999]. Отмечая данный эффект, мы не можем связать его как с методом трансплантации, поскольку трансплантация культуралыюй среды в мозг не вызывала значимых изменений структуры рубца, так и с эффектами трансплантированных клеток, поскольку в группе сочетанной трансплантации ширина астроглиального компонента рубца не отличалась от таковой в

других экспериментальных группах. Также мы не можем найти объяснения обнаруженному феномену в работах других авторов.

Использованная нами модель тяжелой травмы головного мозга предполагает, что в момент нанесения травмы происходит резкое смещение органа и его удар о стенку черепа - в клинической терминологии так называемый противоудар. В результате этого возникает очаг повреждения, противоположный точке приложения силы при нанесении травмы. Это объясняет обнаруженную нами выраженную диффузную и кластерную гибель нейронов в пириформной коре, практически прилегающей к основанию черепа и отделенной от него только мозговыми оболочками.

Трансплантация МСК оказывает положительное влияние на выживание нейронов в поврежденном головном мозге. В пириформной коре контралатералыюго полушария вплоть до шестой недели наблюдения было зарегистрировано достоверно большее количество морфологически неизмененных нейронов во всех случаях трансплантации МСК в сравнении с группами контроля (таблица 2).

Таблица 2. Среднее количество морфологически неизмененных и погибших нейронов в пириформной коре ипсилатерального и контралатерального полушарий головного мозга в разных экспериментальных группах животных через 6 нед. после нанесения травмы (во всех случаях п = 8). Данные по подсчету погибших нейронов представлены в виде Ме ± доверительный интервал для медианы, где Ме - медиана. Р<0,05 (* - достоверное отличие от других экспериментальных групп на данном сроке).

группа группа группа группа группа

негативного введения трансплантации внутривенного сочетанной

контроля аМЕМ в мозг МСК в мозг введения МСК трансплантации

МСК

ИПСИ- контра- ипси- контра- ипси- контра- ипси- контра- ипси- контра-

морфологически 49,67 44,58 44,5 40,5 48,67 53,83 47,67 57,5 53,75 52,83

неизмененные ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

нейроны 4,5 13,5 3,75 5,25 0,5 4* 3,4 6,5 ♦ 5,7 5,35 *

погибшие 3,91 5 5,5 5,3 1,17 2 5,33 0,83 1 0,6

нейроны ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

4,05 11 2,7 3,4 0,75 1,05 * 3,45 0,7 * 0,75 0,3 »

Можно ли объяснить данный эффект нейропротекторными функциями мезенхимных стволовых клеток? Известно, что при культивировании в присутствии экстрактов травмированного мозга МСК активно продуцируют такие факторы, как VEGF (vascular endotelial growth factor), BDNF (brain-derived neurotrophic factor), NGF (nerve growth factor), и

bFGF (basic fibroblast growth factor), которые обладают нейротрофическим и нейропротекторным действием, предотвращая апоптоз нервных клеток [Chen X. et al., 2002; Li Y. et al., 2002; Chen J. et al., 2003; Ferguson K.L., Slack R S., 2003; Torres-Aleman I., 2000]. В проведенных совсем недавно работах именно способностью МСК к продукции BDNF, а также нейротрофических факторов NT-3 и NGF in vivo после трансплантации крысам с экспериментальной травмой головного мозга, объясняется более быстрое восстановление поврежденных моторных и когнитивных функций у животных из групп клеточной терапии [Kim H.J. et al., 2009; Heile A.M. et al., 2009].

Мы не обнаружили в пириформной коре трансплантированных клеток, следовательно, не можем утверждать, что сохранение нейронов происходит благодаря паракринной функции МСК, а именно синтеза ими нейротрофических и ростовых факторов. Возможно, МСК осуществляют нейропротекцию в базальных областях мозга благодаря снижению выраженности воспалительных реакций, которые, даже происходя локально, при высокой интенсивности оказывают органный и системный эффект. Нейропротекция при инъекции МСК, вызываемая снижением активации микроглии и синтеза провоспалителыюго фактора TNF во всем мозге, а не в отдельных его структурах, экспериментально доказана также на моделях болезни Паркинсона [Park H.J. et al., 2008; Kim Y.J. et al., 2009].

В других областях мозга эффекты МСК на выживание нейронов не столь однозначны. Так, мы показали, что независимо от способа трансплантации МСК способствуют достоверному снижению количества гибнущих нейронов в пограничной зоне травматической полости в 1,3 раза в сравнению с обеими группами негативного контроля, но лишь в течение первой недели после нанесения травмы. На позднем сроке анализа эта разница полностью нивелируется, и количество погибших нервных клеток в пограничной зоне травматической полости во всех экспериментальных группах уравнивается. По-видимому, это связано с характером патологических изменений, происходящих после травмы головного мозга. Травма провоцирует не только немедленную гибель нервных клеток, но также становится причиной отложенной, или вторичной гибели нейронов.

Нервная ткань уникальна тем, что в ней наблюдается наиболее тесная взаимосвязь клеточных элементов, осуществляемая через взаимодействие отростков нервных клеток -аксонов и дендритов. Гибель одной нервной клетки приводит к обрыву аксональных связей и в результате - к атрофии аксонов других, непосредственно не поврежденных нервных клеток. Атрофия же аксонов неизбежно ведет к нарушению метаболизма нейрона и его последующей гибели [Mazzeo A T. et al., 2009; Vorwerk C,K. et al., 2004]. При травме в течение первой недели происходит диффузная гибель нервных клеток во всех структурах мозга - соответственно, происходит и разрушение аксональных и дендритных связей, что

влечет за собой неизбежную гибель нейронов, в течение некоторого времени еще остающихся жизнеспособными. По-видимому, МСК за счет описанных паракринных функций (синтеза нейротрофических и ростовых факторов) способствуют продлению жизни таких нервных клеток, синтезируя нейротрофические и нейропротекторные факторы, однако это не приводит к их полному восстановлению и не предотвращает вторичной гибели.

Таким образом, мы можем заключить, что трансплантация МСК оказывает достоверный положительный эффект на выживание нейронов в пириформной коре контралатералыюго полушария, влияние же ее на другие области поврежденного мозга, судя по нашим данным, отсутствует. Последнее указывает на то, что при обширной травме, затрагивающей как кору, так и подкорковые образования, разрушение мозговых структур столь велико, а гибель нервных клеток столь интенсивна, что нейропротекторные и противовоспалительные эффекты мезеихимных клеток, отмеченные другими авторами на моделях менее значительного повреждения мозга, недостаточны для сколь-либо значимого восстановления структуры поврежденного мозга.

Эффекты трансплантации МСК при травме головного мозга зависят от способа трансплантации. Внутривенное введение клеток оказывает ограниченное положительное влияние на состояние мозговых структур, состоящее главным образом в защите нейронов пириформной коры контралатералыюго полушария от гибели и выраженных ангиогенном/трофическом эффектах, приводящих к сохранению некоторых структур, граничащих с травматической полостью. Трансплантация МСК непосредственно в мозг оказывает скорее негативное, чем положительное воздействие на данный орган, приводя к формированию в мозге аномальных клеточных скоплений, образованию сосудистых мальформаций и дополнительному разрушению структур в краевой зоне травматической полости. Следует сказать, что клеточная терапия с помощью МСК при травме головного мозга остается в настоящее время в области проблем фундаментальной медицины и очень далека от научно обоснованного внедрения в клиническую практику, поскольку целесообразность данного шага остается недоказанной.

выводы

1. МСК, введенные внутривенно через 72 часа после травмы, достигают головного мозга и располагаются в краевой зоне травматической полости, что свидетельствует об их тропности к зоне повреждения. При введении в краевую зону травматической полости трансплантированные клетки локализуются в области введения, субвентрикулярной зоне обоих полушарий и в полостях латеральных желудочков мозга вблизи сосудистого сплетения.

2. В отдельных трансплантированных МСК в мозге экспрессируется маркер нейронов КеиЫ, что свидетельствует о слиянии трансплантированных клеток с нейронами реципиента. Трансплантированные МСК в мозге не экспрессируют маркера астроглии ГФКБ и маркера эндотелиоцитов сосудов vWF.

3. Внутривенное введение МСК и трансплантация МСК в мозг через 72 часа после нанесения травмы приводят к ускорению процесса очищения зоны повреждения от некротических масс и клеточного детрита.

4. Введение МСК в мозг и сочетанная трансплантация МСК приводят к формированию через 1 неделю аномальных клеточных скоплений, содержащих фибробластоподобные клетки и коллагеновые волокна, и образованию аномально расширенных капилляров через 6 недель наблюдения.

5. Внутривенное введение МСК уменьшает количество структур мозга, разрушенных в результате формирования травматической полости; трансплантация МСК в поврежденный мозг приводит к увеличению количества разрушенных структур мозга, что является результатом дополнительной травмы, наносимой таким способом введения клеток. Внутривенное введение и трансплантация МСК в поврежденный мозг способствуют увеличению количества капилляров в краевой зоне травматической полости, что свидетельствует об ангиогенном и трофическом эффектах трансплантированных клеток.

6.Трансплантация МСК способствует достоверному повышению выживаемости нейронов в пириформной коре контралатерального полушария, нивелируя последствия противоудара, происходящего в момент нанесения травмы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Григорян A.C., Цупкина Н.В., Сергеев B.C., Деев Р.В., Пинаев Г.П. Характеристика свойств стромальных клеток костного мозга в реакции смешанной культуры лимфоцитов. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2007. - т.2, № 2 - с. 62-67.

Григорян A.C., Гилерович Е.Г., Павличенко H.H., Кругляков П.В., Соколова И.Б., Полынцев Д.Г. Влияние внутривенной трансплантации мультипотептных мезенхимальных стромальных клеток на посттравматические процессы в головном мозге крыс. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Ииженерия. - 2009 - т.4, №3 - с. 9-10.

Григорян A.C., Гилерович Е.Г., Павличенко H.H., Кругляков П.В., Соколова И.Б., Полынцев Д.Г. Влияние трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток па постгравматические процессы при экспериментальной травме головного мозга. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2009 - т.4, №3 - с. 58-67.

Григорян A.C., Гилерович Е.Г., Павличенко H.H., Кругляков П.В., Соколова И.Б., Полынцев Д.Г. Влияние различных методов трансплантации мезенхимных стволовых клеток костного мозга на постгравматические процессы в головном мозге крыс // Материалы Всероссийской научной школы-конференции для молодежи: 21-26 сентября 2009 г. - М.: МАКС Пресс, 2009.-с. 35.

Григорян A.C., Кругляков П.В. Клеточная терапия при травме головного мозга. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2009. - т.4, №1 - с. 35-43.

Григорян A.C., Кругляков П.В., Таминкина Ю.А., Ефимова O.A., Пендина A.A., Воскресенская A.B., Кузнецова ТВ., Полынцев Д.Г. Изменения цитологических и кариологических характеристик мезенхимных стволовых клеток человека при культивировании in vitro. // Клеточные Технологии в Биологии и Медицине. - 2010. - №3 - с. 141-147.

Подписано в печать 05.10.2010. Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,75 Тираж 100 экз. Заказ 426

Отпечатано в типографии ООО «Адмирал»

199048, Санкт-Петербург, В. О., 6-я линия, д. 59 корп. 1, оф. 40Н

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Григорян, Анаит Суреновна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Научная,новизна работы

Теоретическое и практическое значение работы

Апробация работы

Объем и структура диссертации

ГЛАВА' 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Травма головного мозга. Патогенез и последствия

1.2. Терапия пациентов с ТГМ

1.2.1. Медикаментозные методы терапии пациентов с ТГМ

1.2.2. Клеточная терапия пациентов с TTMs 17 1.2.2.1 .Нейротрансплантация 1.2.2.1.1. Трансплантация фетального мозга

1.2.2.1.2. Трансплантация нейральных стволовых клеток 1.2.2.1.3. Трансплантация 1МТ2-клеток 1.2.2.2.Совместная трансплантация различных типов клеток

1.2.2.3.Трансплантация мезенхимных стволовых клеток

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Эксперименты in vi tro

2.1.1. Выделение и культивирование МСК из стромы костного мозга крыс

2.1.2. Иммунофенотипирование МСК крыс

2.1.3. Окрашивание МСК крыс флуорохромом РКН

2.2. Эксперименты ш vivo 35 * 2.2.1. Моделирование ТГМ у крыс и трансплантация - ~ клеточного материала

I 2.2.2. Фиксация головного мозга 38* > 2.2.3. Выявление флуоресцентно меченых МСК в головном мозге

2.2.4. Гистологическое окрашивание срезов головного мозга

2.2.5. Морфологический анализ срезов головного мозга

2.2.6. Иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга

2.2.6.1. Стандартное иммуногистохимическое окрашивание 2.2.6.2. Флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание

2.2.7. Морфометрическое исследование срезов головного мозга

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Характеристики МСК крысы in viíro 3.1.1. Иммунофенотипирование МСК крысы 3.1.2. Окрашивание МСК крысы флуорохромом РКН26 45 ' 3.2. Локализация меченых флуорохромом РКН26 МСК в мозге при различных методах трансплантации 48'

3.3. Колокализация флуоресцентной метки МСК и маркеров других клеточных типов в мозге

3.4. Морфологическая характеристика головного мозга после экспериментальной ТГМ 52 t 3.4.1. Морфологическая характеристика, головного мозга животных из группы негативного контроля

3.4.2. Морфологическая характеристика головного мозга крысы при введении в пограничную зону травматической полости культуральной среды а-МЕМ

3.4.3. Морфологическая характеристика головного мозга крысы при трансплантации

МСК в пограничную зону травматической полости

3.4.4. Морфологическая характеристика головного мозга крысы при внутривенном введении МСК

3.4.5. Морфологическая характеристика головного мозга крысы при сочетанной трансплантации МСК

3.5. Морфометрическое исследование головного мозга экспериментальных животных

3.5.1. Сравнительная оценка количества морфологически неизмененных нейронов в пограничной зоне повреждения в соматосенсорной коре головного мозга у животных из разных экспериментальных групп

3.5.2. Сравнительная оценка количества морфологически неизмененных нейронов в миндалевидном теле у животных из разных экспериментальных групп

3.5.3. Сравнительная оценка количества морфологически неизмененных и поврежденных нейронов в пириформной коре у животных из разных экспериментальных групп

3.5.4. Сравнительная оценка ширины астроглиального рубца в пограничной зоне повреждения у животных из разных экспериментальных групп

3.5.5. Сравнительная оценка количества микрососудов в пограничной зоне повреждения у животных из разных экспериментальных групп

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на развитие посттравматических процессов в головном мозге крыс"

Актуальность проблемы

Сегодня клеточная терапия с помощью стволовых клеток (СК) считается перспективным подходом для коррекции последствий ряда патологических процессов. Применение клеток принципиально отлично от традиционной медикаментозной терапии, для которой характерны симптоматический подход и кратковременность воздействия. Обычно лекарственный препарат оказывает свое действие лишь в тот период, пока присутствует в организме в терапевтической концентрации. Клетки .-же, в случае их успешной интеграции в ткань реципиента, могут оказывать положительные эффекты в течение многих месяцев и лет. Использование в качестве терапевтического агента клеток дает надежду на восстановление естественной структуры и, следовательно, функций того или иного органа,.утраченных в результате травмы или-патологического процесса.

Стволовые и прогениторные клетки, полученные из различных источников, активно изучают в экспериментальных исследованиях на моделях заболеваний самой? разной этиологии, включая многочисленные нейродегенеративные расстройства и тяжелые повреждения центральной; нервной системы; вызванные ишемическим инсультом головного мозга;, черепно-мозговыми травмами и травмами спинного мозга. В настоящее: время! показано; что клеточная терапия способна оказывать выраженное положительное влияние на функциональное восстановление нервной* системы при болезни Шаркинсона, болезни Альцгеймера, ишемическом инсульте и других патологиях [2* 65, 84, 115].

Благодаря своей способности к практически; неограниченной пролиферации и дифференцировке во все клеточные типы эмбриона, и взрослого организма, за исключением клеток трофэктодермы, идеальным клеточным материалом для терапии могут показаться эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), однако процессы, их деления и развития из. них специализированных клеток после трансплантации в организм реципиента невозможно контролировать. ЭСК, трансплантированные; во взрослый* организм,, в процессе разнонаправленной дифференцировки образуют тератомы и тератокарциномы - соответственно доброкачественные и злокачественные опухоли, состоящие из производных трех зародышевых листков (эктодермы, энтодермы и мезодермы) [7, 24, 46]. Возможна также воспалительная реакция отторжения трансплантата. Это было показано в нескольких экспериментах по эктопической трансплантации ЭСК [93, 146, 147, 207].

Фетальные стволовые клетки (ФСК), хотя и являются- клетками-предшественницами более высокой степени дифференцировки, нежели ЭСК, и не представляют опасности канцерогенеза, часто не могут быть получены в достаточном для трансплантации количестве. Более серьезное препятствие для их применения — невозможность, как и в случае ЭСК, аутологичной трансплантации, из-за чего возникает риск их иммунного отторжения. В »этом смысле головной мозг не является исключением, особенно если говорить о его состоянии после травмы, поскольку при этом разрушается гематоэнцефалический барьер* и происходит. инфильтрация нервной, ткани иммунокомпетентными клетками, приходящими через поврежденные сосуды. Однако и в случае трансплантации аллогенного материала в интактный головной мозг наблюдается активная микроглиальная реакция [185].

По этим причинам все большее внимание исследователей привлекают взрослые стволовые клетки, которые, как известно, обнаруживаются* в. ряде тканей, в частности, в жировой ткани [136, 140, 187], коже [204], почках [91, 135], периферической крови [81], головном мозге [178, 186] и костном мозге [47, 179]. Большинство этих клеток способны давать начало только элементам той ткани, из которой происходят, однако количество таких регионарных СК весьма невелико, и в норме они служат скорее для физиологического обновления ткани, нежели для ее посттравматической регенерации.

Из, всех взрослых стволовых клеток млекопитающих, в том числе и человека, наиболее доступны для получения, наращивания в культуре и последующего использования так называемые мезенхимные стволовые клетки (МСК), присутствующие в строме костного мозга. Методики работы^ с МСК, позволяющие получить клетки в достаточном для трансплантации количестве, хорошо отработаны [13, 94, 208]. Известно, что данные клетки in vitro в отсутствии искусственных воздействий способны давать начало остеоцитам, адипоцитам и хондроцитам [78-80, 155], а под действием специфических факторов дифференцировки - некоторым другим клеточным типам, в том числе « клеткам нейронального ряда [109; 139, 169, 209]. В связи с этим активно исследуются возможности использования МСК в терапии нейродегенеративных заболеваний и повреждений нервной системы [12, 25, 117-119, 125, 156]. В нашем научном коллективе на модели ишемического инсульта головного мозга у крыс было показано, что МСК ускоряют течение реакции асептического воспаления, способствуют выживанию нейронов в зоне ишемической полутени, улучшению васкуляризации ишемизированной зоны и сохранению целостности сосудистого сплетения [9].

Травма головного мозга (TFM) является серьезной медицинской* проблемой. По данным ВОЗ, ее частота составляет от 30 до 50% от общего травматизма. Примерно 20% пациентов, получивших травмы, головного мозга различной степени тяжести, погибает в течение первых 30 дней. Около» 10% пациентов остаются инвалидами в случае легкой травмы, 66% — в случае травмы средней степени тяжести, и 100% — при тяжелой.травме. При нтом отмечается, что частота черепно-мозговой травмы возрастает в среднем на 2% в год [10]. В^ отличие от различного рода заболеваний,, травма затрагивает все возрастные категории людещ по большей части детей и подростков, ведущих подвижный образ жизни [120]. Пациенты, выжившие после тяжелых травм, нуждаются, в интенсивной комплексной терапии [66].

Обширная^ травма головного мозга, затрагивающая, множество ядерных структур, стоит особняком среди прочих повреждений. Она крайне сложна для изучения, поскольку влечет за собой активацию целого комплекса патогенетических механизмов, которые можно охарактеризовать как нарушение нейродинамических процессов, расстройство тканевого дыхания» и t энергетического метаболизма, нарушение ликвородинамики и изменение мозгового кровообращения [21]. В то же время она является фундаментальной проблемой медицины, ставя перед исследователями вопрос о границах компенсаторных и регенерационных возможностей мозга. Экспериментальных работ, в которых бы проводились трансплантации различных типов стволовых клеток на моделях обширной механической травмы головного мозга, крайне мало. Применение МСК после ТГМ — одно из самых молодых направлений в этой области. Большинство экспериментальных работ, в которых проводились попытки таких трансплантаций, относится к 2000-2009 годам, а число этих работ крайне невелико и, что более важно, практически все они выполнены одной группой исследователей под руководством Майкла Чоппа (М.СЬорр) [119-121, 125-129].

Данная научная группа установила, что трансплантация МСК крысам с черепно-мозговой травмой позволяет сохранить достоверно большее количество жизнеспособных нейронов, в нервной ткани, прилежащей непосредственно к травматической полости, а также способствует более быстрому и полному восстановлению моторных и когнитивных навыков. Однако эти исследования, не охватывают всего спектра проблем, связанных с тяжелым повреждением головного мозга. Нужно заметить, что в перечисленных случаях МСК были трансплантированы животным тотчас после нанесения травмы, что ни в коей мере не отражает реальной ситуации, возникающей- в клинике, когда терапия применяется лишь спустя по крайней мере несколько часов> после травмы. Также нельзя забывать о том, что в течение первых и вторых суток после повреждения головного мозга в нем развиваются процессы острого некроза [9]>. Введение клеток в это время при попадании в травматическую полость, может закончиться их гибелью. По этим причинам необходимо изучить течение посттравматических процессов в мозге при отложенной трансплантации МСК, чего до настоящего времени никем не проводилось.

Работы, выполненные в данной области, остаются^ сугубо феноменологическими — в. них идет речь о воздействии МСК на поврежденную нервную ткань, но не о причинах и механизмах этого воздействия. Остается неизвестным распределение МСК в головном мозге при различных способах трансплантации-. Не выяснен вопрос о возможностях дифференцировки МСК в нейрональном и глиальном направлениях т угуо. Не изучена динамика процессов реорганизации нервной ткани на фоне действия трансплантированных МСК, а также неизвестно, насколько трансплантация МСК влияет на активацию эндогенных процессов репарации и регенерации в мозге. Кроме того,, остается« неясным, какой именно способ' трансплантации оптимален* для терапии: Для-, решения; этих вопросов необходимо тщательное исследование морфологических изменений; происходящих в; головном мозге после ТГМ и трансплантации мезенхимных стволовых клеток.

Цели и задачи исследования

Целью данной* работы' являлось изучение' влияния различных методов трансплантации сингенных МСК на структуры головного мозга при его обширной механической травме:.

Для? достижения! поставленной цели работы были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. В поврежденном головном мозге; изучить локализацию донорских МСК при различных способах их трансплантации: системно - в кровь, введении в пограничную, зону травматическойполости, а также при одновременном введении в мозг и внутривенно.

2. Определить экспрессию; трансплантированными; МСК маркеров дифференцировки ряда' клеток (нейрональные: ядра, глиальный фибриллярный кислый белок, фактор фон Виллебрандта).

3. Изучить,динамику морфологических изменений в головном мозге крыс при обширной механической травме.

4; Изучить динамику морфологических изменений в головном мозге крыс: при обширной механической травме на фоне трансплантации МСК. 5. Провести; сравнение влияния различных методов трансплантации МСК на течение посттравматических процессов в головном мозге крыс.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Отдельные трансплантированные МСК в мозге способны претерпевать слияние с нейронами реципиента либо дифференцироваться в нейрональном направлении.

4. Трансплантация МСК в мозг и сочетанное введение МСК в мозг и. в хвостовую вену приводят к формированию через 1 неделю аномальных клеточных скоплений, содержащих фибробластоподобные клетки и коллагеновые волокна, и образованию аномально расширенных капилляров через 6 недель наблюдения.

5. Внутривенное введение МСК приводит к уменьшению количества мозговых структур, разрушенных вследствие формирования травматической полости; трансплантация МСК в мозг приводит к увеличению количества^ поврежденных мозговых структур и расширению рубца на границе травматической полости. Трансплантация МСК внутривенно и в мозг стимулирует ангиогенез в краевой зоне травматической полости.

6. Трансплантация- МСК оказывает нейропротекторное воздействие на пириформную кору контралатерального полушария.

Научная новизна работы^

Впервые получены данные-о действии МСК на клетки головного мозга при обширной травме, затрагивающей неокортекс и ядерные структуры. Экспериментально показано, что МСК снижают выраженность последствий противоудара, возникающего в момент нанесения травмы, оказывая нейропротекторное действие на пириформную кору контралатерального

Экспериментально зарегистрирована различная локализация МСК при разных способах трансплантации: в краевой зоне травматической полости при внутривенном введении; в краевой зоне травматической полости, субвентрикулярной зоне обоих полушарий и области сосудистого сплетения при введении в мозг и сочетанном введении в мозг и в внутривенно.

Впервые экспериментально продемонстрирована экспрессия отдельными трансплантированными МСК маркера нейронов №иК.

Впервые продемонстрировано формирование в базальных структурах мозга аномальных клеточных скоплений, содержащих фибробластоподобные клетки и коллагеновые волокна, в течение недели после трансплантации МСК в мозг, и образование аномально расширенных капилляров« в различных структурах мозга через 6 недель наблюдения.

При внутривенном введении; МСК показано уменьшение количества внутримозговых структур, разрушенных в- результате формирования травматической полости.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты диссертационного исследования могут быть использованы* для дальнейшего изучения процессов репарации при травматических повреждениях головного мозга, а также,в исследованиях участия трансплантированных МСК в регенеративных процессах в мозге. С практической точки зрения, результаты работы могут быть использованы для разработки новых терапевтических подходов, основанных на принципах клеточной терапии, для лечения пациентов, пострадавших в результате черепно-мозговых травм.

Апробация работы

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения полученных результатов, выводов и заключения. Работа изложена на 241 странице машинописного текста, иллюстрирована 101 рисунком и 22 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Григорян, Анаит Суреновна

ВЫВОДЫ:

2. В отдельных трансплантированных МСК в мозге экспрессируется маркер нейронов ЫеиК, что свидетельствует о слиянии трансплантированных клеток с нейронами реципиента. Трансплантированные МСК в мозге не экспрессируют маркера астроглии ГФКБ и маркера эндотелиоцитов сосудов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Григорян A.C., Цупкина Н.В., Сергеев B.C., Деев Р.В., Пинаев Г.П. Характеристика свойств стромальных клеток костного мозга в реакции смешанной культуры лимфоцитов. // Клеточная Трансплантология- и Тканевая Инженерия. — 2007. — т.2, № 2 — с. 62-67.

Григорян A.C., Гилерович Е.Г., Павличенко H.H., Кругляков П.В., Соколова И.Б., Полынцев Д.Г. Влияние внутривенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на посттравматические процессы в головном мозге крыс. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2009 - т.4, №3 - с. 9-10.

Григорян A.C., Гилерович Е.Г., Павличенко H.H., Кругляков П.В., Соколова И.Б., Полынцев Д.Г. Влияние трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на посттравматические процессы при экспериментальной травме головного мозга. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. - 2009 — т.4, №3 - с. 58-67.

Григорян A.C., Гилерович Е.Г., Павличенко H.H., Кругляков П.В., Соколова И.Б., Полынцев Д.Г. Влияние различных методов трансплантации мезенхимных стволовых клеток костного мозга на посттравматические процессы в головном мозге крыс // Материалы Всероссийской научной школы-конференции для молодежи: 21-26 сентября. 2009 г. — М.: МАКС Пресс, 2009.-с. 35.

Григорян A.C., Кругляков П.В. Клеточная терапия при травме головного мозга: // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. — 2009. — т.4, №1 — с: 35-43.

Григорян A.C., Кругляков П.В., Таминкина Ю.А., Ефимова O.A., Пендина A.A., Воскресенская A.B., Кузнецова Т.В., Полынцев Д.Г. Изменения цитологических и кариологических характеристик мезенхимных стволовых клеток человека при культивировании in vitro. II Клеточные Технологии в Биологии и Медицине. - 2010. - №3 - с. 141-147.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Григорян, Анаит Суреновна, Санкт-Петербург

1. Викторов И.В., Сухих Г.Т. Медико-биологические аспекты применения стволовых клеток. // Вестник РАМН. 2002. - т. 4, №24 - с.ЗО.

2. Викторов И.В. Стволовые клетки мозга млекопитающих: биология стволовых клеток in vivo и in vitro. II Известия Академии Наук. Серия Биологическая. 2001. - №6. - с. 646-655.

3. Виноградова О.С. Гиппокамп и память. // М.: Наука. — 1975. — 332 с.

4. Владимирская Е.Б., Майорова O.A., Румянцев С.А. и соавт. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками / // Москва: Медпрактика-М, 2005. с. 41-113.

5. Гайдар Б.В., Брюховецкий A.C., Шумаков В.И. Результаты и перспективы применения трансплантации клеток нервной ткани человека при боевой травме мозга. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1998. - т. 199, № 126 (Приложение 1) - с. 133134.

6. Гилерович Е.Г., Отеллин В.А. Трансплантация эмбриональной нервной ткани человека как модель изучения ранних этапов становления центральной нервной системы. // Успехи физиологических наук. — 2001. т.32, №1. - с. 34-47.

7. Дыбан А.П., Дыбан П.А. Стволовые клетки в экспериментальной и клинической медицине. // Медицинский академический журнал. 2002. -т.2,№3.-с. 3-25.

8. Жаботинский Ю.М. Нормальная и патологическая морфология нейрона. //- JL: Медицина, Ленингр. отд-ние. — 1965. — 323 с.

9. Корочкин Л.И., Ревищин A.B., Охотин В.Е. Нейральные стволовые клетки, их значение в восстановительных процессах в нервной системе. // Морфология. 2005. - т. 127, №3. - с. 7-16.

10. Малайцев В.В., Богданова И.М., Сухих Г.Т. Современные представления о биологии стволовой клетки. // Архив Патологии. — 2002. т.64, №4. — с. 7-11.

11. Н.Отеллин В.А., Гусихина В.И., Гилерович Е.Г. Пересадки эмбриональных закладок неокортекса человека в мозг крыс. // Архив Анатомии, Гистологии и Эмбриологии. 1985. - т. 89, №8. — с. 18-22.

12. Парлюк О.В., Селедцов В.И., Рабинович С.С. и соавт. Результаты клеточной терапии, примененной в системе интенсивного лечения травматических ком. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. 2008. -т.З, №3 - с. 51-56.

13. Полежаев Л.В., Александрова М.А., Витвицкий В.А. Трансплантация ткани мозга в биологии и медицине. // М.: Наука. — 1993. — 239 с.

14. П.Полежаев Л.В., Александрова М.А. Трансплантация ткани мозга в норме и патологии. // М.: Наука. 1986. - 152 с.

15. Семченко В.В., Еринеев С.И., Степанова С.С., Сергиенко Г.Г. Трансплантация незрелой нервной ткани в экспериментальной и клинической неврологии. // Омск: ГУИПП Омский дом печати. — 2000. 340 с.

16. Сергеев B.C. Иммунологические свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия. — 2005. — т.1, №2. — с. 39-42.

17. Яруллин Х.Х. Клиническая реоэнцефалография. // М.: Медицина. -1983.-270с.

18. Aggarwal S., Pittenger M.F. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. // Blood. — 2005. Vol. 105, №4. -pp.1815-1822.

19. Aimone J.B., Wiles J., Gage F.H. Computational influence of adult neurogenesis on memory encoding. // Neuron. — 2009. Vol. 61, №2. - pp. 187-202.

20. Aleckovic M., Simon C. Is teratoma formation in stem cell research a characterization tool or a window to developmental biology? // Reproductive Biomedicine Online. 2008. - Vol. 17, №2. - pp. 270-280.

21. Alter M. Ganglioside GM1 in acute ischemic stroke. // Stroke. 1995. -Vol. 25, №6. - pp. 1141-1148.

22. Alves O.L., Bullock R. in Clark R.S.B, Kochanek P. Excitotoxic damage in traumatic brain injuiy. // Brain Injury. Boston: Kluwer Academic Publishers. 2001. - p. 1. - ISBN 0-7923-7532-7.

23. Anderson L., Caldwell M.A. Human neural progenitor cell transplants into the subthalamic nucleus lead to functional recovery in a rat model of Parkinson's disease. // Neurobiology of Disease. 2007. - Vol. 27, №2. -pp. 133-140.

24. Andsberg G., Kokaia Z., Bjorklund A., Martinez-Serrano A. Amelioration of ischemia-induced neuronal death in the rat striatum by NGF-secreting neural stem cells. // European Journal of Neuroscience. 1998. - Vol. 10, №6. -pp. 2026-2036.

25. Auerbach J.M., Eiden M.V., McKay R.D.G. Transplanted CNS stem cells form functional synapses in vivo. I I European Journal of Neuroscience. -2000.-Vol. 12, №5.-pp. 1696-1704.

26. Azizi S.A., Stokes D., Augelli B.J., DiGirolamo C., Prockop D.J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implantedin the brains of albino rats similarities to astrocyte grafts. // PNAS. — 1998. -Vol. 95, №7.-pp. 3908-3913.

27. Bertani N., Malatesta P., Volpi G., Sonego P., Perris R. Neurogenic potential of human mesenchymal stem cells revisited: analysis by immunostaining, time-lapse video and microarray. // Journal of Cell Science. — 2005. — Vol. 118, Pt. 17.-pp. 3925-3936.

28. Bi L.X., Simmons D.J., Mainous E. Expression of BMP-2 by rat bone marrow stromal cells in culture. // Calcified Tissue International. 1999. -Vol. 64, №1. - pp. 63-68.

29. Bieback K. Basic biology of mesenchymal stem cells. // Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2008. - Vol. 35, №3. - pp. 151-152.

30. Bjorklund A., Stenevi U., Dunnett S.B., Iversen S.D. Functional reactivation of the deafferented neostriatum by nigral transplants. // Nature. 1981. — Vol. 289, №5797.-p.497.

31. Bjorklund A., Stenevi U. Reconstruction of the nigrostriatal dopamine pathway by intracerebral nigral transplants. // Brain Research. 1979. - Vol. 177, №3.-pp. 555-560.

32. Bjorklund A., Stenevi U. Regeneration of monoaminergic and cholinergic neurons in mammalian central nervous system. // Physiological Reviews. -1979.-Vol. 59, №1. — pp. 62-100.

33. Blum A., Benvenisty N. The tumorigenicity of diploid and aneuploid human pluripotent stem cells. // Cell Cycle. 2009. - Vol. 23, №8. - pp. 38223830.

34. Bobis S., Jarocha D., Majka M. Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications. // Folia Histochemica et Cytobiologica. — 2006. Vol. 44, №4.-pp. 215-230.

35. Bogousslavsky J. for European Ad Hoc Consensus Group. Neuroprotection as initial therapy in acute stroke. Third report of an Ad Hoc Consensus Group meeting. // Cerebrovascular Disease. 1998. - Vol. 8, №1. - pp. 5972.

36. Brundin P., Karlsson J., Emgard M., Schierle G.S., Hansson O., Petersen A., Castilho R.F. Improving the survival of grafted dopaminergic neurons: a review over current approaches. // Cell Transplantation. 2000. - Vol. 9, №2.-pp. 179-195.

37. Chamberlain G., Fox J., Ashton B., Middleton J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features and potential for homing. // Stem Cells. 2007. - Vol. 25, №11. - pp. 27392749.

38. Chen X., Katakowski M., Ki Y. Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts: growth factor production. // Journal of Neuroscience Research. 2002. - Vol. 69, №5. - pp. 687-691.

39. Choong P.F., Mok P.L., Cheong S.K., Leong C.F., Then K.Y. Generating neuron-like cells from BM-derived mesenchymal stromal cells in vitro. II Cytotherapy. 2007. - Vol. 9, №2. - pp. 170-183.

40. Chopp M., Li Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. // Lancet Neurology. 2002. - Vol. 1, №2. - pp. 92-100.

41. Covolan L., Ribeiro L.T., Longo B.M., Mello L.E. Cell damage and neurogenesis in the dentate granule cell layer of adult rats after pilocarpine-or kainate-induced status epilepticus. // Hippocampus. 2000. — Vol. 10, №2.-pp. 169-180.

42. Croll S.D., Goodman J.H., Scharfman H.E. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in seizures: a double-edged sword. // Advances in Experimental Medical Biology. 2004. - №548. - pp. 57-68.

43. Croll S.D., Wiegand S.J. Vascular growth factors in cerebral ischemia. // Molecular Neurobiology. 2001. - Vol. 23, №2-3. - pp. 121-135.

44. Darsalia V., Kallur T., Kokaia Z. Survival, migration and neuronal differentiation of human fetal striatal and cortical neural stem cells grafted in stroke-damaged rat striatum. // European Journal of neuroscience. — 2007. — Vol. 26, №3. pp. 605-614.

45. Das G., Altman J. Transplanted precursors of nerve cells: their fate in the cerebellums of young rats. // Science. 1971. - Vol. 173, №997. - pp. 637 -638.

46. Deans R.J., Moseley A.B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical use. // Experimental Hematology. 2000. - Vol. 28, №8. — pp. 875884.

47. Deng J., Petersen B.E., Steindler D.A., Jorgensen M.L., Laywell E.D. Mesenchymal stem cells spontaneously express neural proteins in culture and are neurogenic after transplantation. // Stem Cells. 2006. - Vol. 24, №4.-pp. 1054-1064.

48. Dezawa M., Hoshino M., Nabeshima Y. Marrow stromal cells: implications in health and disease in the nervous system. // Current Opinion in Molecular Medicine. 2005. - Vol. 5, №7. - pp.723-732.

49. Dobkin B.H. Neuroplasticity. key to recovery after central nervous system injuiy. // West Journal of Medicine. 1993. - Vol. 159, №1. - pp. 56-60.

50. Duan X., Kang E., Liu C.Y., Ming G., Song H. Development of neural stem cell in the adult brain. // Current Opinion in Neurobiology. 2008. - Vol. 18, №1. — pp. 108-115.

51. Dunnett S.B., Ryan C.N., Levin P.D., Reynolds M., Bunch S.T. Functional consequences of embryonic neocortex transplanted to rats with prefrontal cortex lesions. // Behavioral Neuroscience. 1987. - Vol. 101, №4. - pp. 489-503.

52. Englund U., Bjorklund A., Wictorin K., Lindvall O., Kokaia M. Grafted neural stem cells develop into functional pyramidal neurons and integrate into host cortical circuity. // PNAS. 2002. - Vol. 99, №6. - pp. 1708917094.

53. Eriksson P.S., Perfilieva E., Bjork-Eriksson T., Alborn A-M., Nordborg C., Peterson D.A., Gage F.H. Neurogenesis in the adult human hippocampus. // Nature Medicine. 1998. - Vol. 4, №11. - pp. 1313-1317.

54. Fawcett J.W., Asher R.A. The glial scar and central nervous system repair. // Brain Research Bulletin. 1999. - Vol. 49, №6. - pp. 377-391.

55. Ferguson K.L., Slack R.S. Growth factors: can they promote neurogenesis? // Trends in Neurosciences. 2003. - Vol. 26, №6. - pp. 283-285.

56. Flieri A.M., Stahel P.F., Beauchamp K.M., Morgan S.J., Smith W.R., Shohami E. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. // Nature Protocols. 2009. - Vol. 4, №9. - pp. 1328-1337.

57. Freed C.R., Greene P.E., Breeze R.E. Transplantation of embryonic dopamine neurons for severe Parkinson's disease. // The New England Journal of Medicine.- 2001. -Vol. 344, №10.-pp. 710-719.

58. Frey L.C. Epidemiology of posttraumatic epilepsy: A critical review. // Epilepsia. 2003. - №44. - Supplement 10. - pp. 11-17.

59. Friedenstein AJ. Marrow stromal fibroblasts. // Calcified Tissue International. 1995. - Vol. 56. - Supplement 1. - S17.

60. Friedenstein A.J., Piatetzky-Shapiro I.I., Petrakova K.V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. // Journal of Embryology and Experimental Morphology. 1966. - Vol. 16, №3. - pp. 381-390.

61. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. // Cell and Tissue Kinetics. 1970. - Vol. 3, №4. - pp. 393403.

62. Fruehauf S., Seeger T., Topaly J. Innovative strategies for PBPC mobilization. // Cytotherapy. 2005 - Vol. 7, №5. - pp. 438-446.

63. Gao J., Dennis J.E., Muzic R.F., Lundberga M., Caplana A.I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. // Cells Tissues Organs. 2001. - Vol. 169, №1. - pp. 12-20.

64. Greenwald B.D., Burnett D.M., Miller M.A. Congenital and acquired brain injury. 1. Brain injury: epidemiology and pathophysiology. // Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 2003. - Vol. 84, №3. - Supplement l.-pp. S3-7.

65. Haas S., Weidner N., Winker J. Adult stem cell therapy in stroke. // Current Opinion in Neurology. 2005. - Vol. 18, № 1. - pp. 59-64.

66. Haley E.C., Kassell N.F., Alves W.M., Weir B.K., Hansen C.A. Phase II trial of tirilizad in aneurismal subarachnoid hemorrhage. A report of the Cooperative Aneurysm Study. // Journal of Neurosurgery. 1995. - Vol. 82, №5.-pp. 786-790.

67. Harting M.T., Jimenez F., Xue H., Fischer U.M., Baumgartner J., Dash P.K., Cox C.S. Intravenous mesenchymal stem cell therapy for traumatic brain injury. // Journal of Neurosurgery. 2009. - Vol. 110, №6. - pp. 1189-1197.

68. Hartley R.S., Trojanowski J.Q., Lee V.M. Differential effects of spinal cord gray and white matter on process outgrowth from grafted human NTERA2 neurons (NT2N, hNT). // The Journal of Computational Neurology. 1999. -Vol. 415, №3. - pp. 404-418.

69. Hebb D.O. The Organization of behavior. //New-York: Wiley. 1949.

70. Hopkins S.J. The pathophysiological role of cytokines. // Legal medicine (Tokyo, Japan). 2003. - Vol. 5. - Supplement 1. - S45-57.

71. Humphreys B.D., Duffield J.D., Bonventre J.V. Renal stem cells in recovery from acute kidney injury. // Minerva Urologica et Nefrologica. 2006. -Vol. 58, №4.-pp. 13-21.

72. Imitola J., Raddassi K.,' Park K.I. Directed migration of neural stem cells to sites of CNS injury by the stromal cell-derived factor la/CZC chemokine receptor 4 pathway. // PNAS Journal. 2004. - Vol. 101, №52. - pp. 1811718122

73. Janowski A., Walczak P., Date I. Intravenous route of cell delivery for treatment of neurological disorders: A meta-analysis of preclinical results. // Stem Cells and Development. -2010. Vol. 19, №1. - pp. 5-16.

74. Kaddis F.G., Clarkson E.D., Bell K.P., Choi P.K., Freed C.R. Co-grafts of muscle cells and mesencephalic tissue into hemiparkinsonian rats: behavioral and histochemical results. // Brain Research Bulletin. — 2000. — Vol. 51, №3.-pp. 203-211.

75. Kassis I., Grigoriadis N., Gowda-Kurkalli B. et al. Neuroprotection and immunomodulation with mesenchymal stem cells in chronic experimental autoimmune enchephalomyelitis. // Archives of Neurology. — 2008. Vol. 65, №6.-pp. 753-761.

76. Keilhoff G., Goihl A., Langnase K., Fansa H., Wolf G. Transdifferentiation of mesenchymal stem cells into Schwann cell-like myelinating cells. // European Journal of Cell Biology. 2006. - Vol. 85, №1. - pp. 11-24.

77. Kempermann G., Praag H.V., Gage F.H. Activity-dependent regulation of neuronal plasticity and self repair. // Program of Brain Research. 2000. - №127. - pp. 35-48.

78. Kermer P., Klocker N., Bahr M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. II Cell Tissue Research. 1999. - Vol. 298, №3. - pp. 383-395.

79. Kim H.J., Lee J.H., Kim S.H. Therapeutic effects of human mesenchymal stem cells for traumatic brain injury in rats: secretion of neurotrophic factors and inhibition of apoptosis. // Journal of Neurotrauma. -2010.-Vol. 27, №1. — pp. 131-138.

80. Kim Y.J., Park H.J., Lee J., Bang O.Y., Ahn Y.H., Joe E., Kim H.O., Lee P.H. Neuroprotective effects of human mesenchymal stem cells on dopaminergic neurons through anti-inflammatory action. // Glia. 2009. -Vol. 57, №1. — pp. 13-23.

81. Kim Y.S., Park H.J., Hong M.H., Kang P.M., Morgan J.P., Jeong M.H., Cho J.G., Park J.C., Ahn Y. TNF-alpha enhances engraftment of mesenchymal stem cells into infracted myocardium. // Frontiers in Bioscience. 2009. - №14. - pp. 2845-2856.

82. Kochar A., Zivin J.A., Lyden P.D., Mazzarella V. Glutamate antagonist therapy reduces neurologic deficits produced by focal central nervous system ischemia. // Archives of Neurology. 1988. - Vol. 45, №2. -pp. 148-153.

83. Kondziolka D., Wechsler L., Goldstein S. Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke. // Neurology. — 2000. Vol. 55, №4.-pp. 565-569.

84. Kopen G.C., Prockop D.J., Phinney D.G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. // PNAS. — 1999. -Vol. 96, №19. pp.10711-10716.

85. Le Blanc K., Tammik C., Rosendahl K., Zetterberg E., Ringden O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. / // Experimental Hematology. -2003. Vol. 31, №10. - pp. 890-896.

86. Lepore A.C., Neuhuber B., Connors T.M., Han S.S., Liu Y., Daniels M.P., Rao M.S., Fischer I. Long-term fate of neural precursor cells following transplantation into developing and adult CNS. // Neuroscience. -2006.-Vol. 139, №2.-pp. 513-530.

87. Levy Y.S., Stroomza M., Melamed E., Offen D. Embryonic and adult stem cells as a source for cell therapy in Parkinson's disease. // Journal of Molecular Neuroscience. 2004. - Vol. 24, №3. - pp. 353-386.

88. Li Y., Chen J., Chen X.G., Gautam S.C., Xu Y.X., Katakowski M., Zhang L.J., Lu M., Janakiraman N., Chopp M. Human marrow stromal cell therapy for stroke in rat: neurotrophins and functional recovery. // Neurology. 2002. - Vol. 59, №4. - pp. 514-523.

89. Li Y., Chen J., Wang L., Lu M., Chopp M. Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal cells. // Neurology. -2001. Vol. 56, №12. - pp. 1666-1672.

90. Lindvall O., Kokaia Z. Stem cell therapy for human brain disorders. // Kidney International. 2005. - Vol. 68, №5. - pp.1937-1939.

91. Lu D., Mahmood A., Chopp M. -Biologic transplantation and neurotrophin-induced neuroplasticity after traumatic brain injury. // The Journal of Head Trauma Rehabilitation. — 2003. — Vol. 18, №4. pp. 357376.

92. Lu D., Li Y., Wang L., Chen J., Mahmood A., Chopp M. Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. // Journal of Neurotrauma. 2001. - Vol. 18, №8 - pp. 813-821.

93. Lu D., Li Y., Mahmood A., Wang L., Rafiq T., Chopp M. Neural and marrow-derived stromal cell sphere' transplantation in a rat model of traumatic brain injury. // Journal of Neurosurgery. 2002. - Vol. 97, №4. -pp. 935-940.

94. Lubitz D.K. von, Lin R.C., Melman N., Ji X.D., Carter M.F., Jacobson K.A. Chronic administration of selective adenosine A1 receptor agonist or antagonist in cerebral ischemia. // European Journal of Pharmacology. -1994. Vol.e 256, №2. - pp. 161-167.

95. Maas A.I., Stocchetti N., Bullock R. Moderate and severe traumatic brain injury in adults. // Lancet Neurology. 2008. - Vol. 7, №8. - pp. 728741.

96. Mahmood A., Lu D., Qu C., Goussev A., Chopp M. Human marrow stromal cell treatment provides long-lasting benefit after traumatic brain injury in rats. // Neurosurgery. 2005. - Vol. 57, №5. - pp. 1026-1031.

97. Mahmood A., Lu D., Chopp M. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury. // Journal of Neurotrauma. 2004. - Vol. 21, №1. - pp. 33-39.

98. Mahmood A., Lu D., Chopp M. Marrow stromal cell transplantation after traumatic brain injury promotes cellular proliferation within the brain. // Neurosurgery. 2004. - Vol. 55, №5. - pp. 1185-1193.

99. Mahmood A., Lu D., Wang L., Li Y., Lu M., Chopp M. Treatment of traumatic brain injury in female rats with intravenous administration of bone marrow stromal cells. // Neurosurgery. 2001. - Vol. 49, №5. - pp. 11961203; discussion 1203-1204.

100. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D., Moorman M., Gerson S.L. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells. // Journal of Cellular Physiology. 1998. - Vol. 176, №1. - pp. 57-66.

101. Mareschi K., Biasin E., Piacibello W., Aglietta M., Madon E., Fagioli F. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. // Haematologica. 2001. - Vol. 86, №10. - pp. 10991100.

102. Mazzeo A.T., Beat A., Singh A., Bullock M.R. The role of mitochondrial transition pore, and its modulation, in traumatic brain injury and delayed neurodegeneration after TBI. // Experimental Neurology. -2009. Vol. 218, №2. - pp. 363-370.

103. Miyazono M., Nowell P.C., Finan J.L., Lee V.M., Trojanowski J.Q. Long-term integration and neuronal differentiation of human embryonal carcinoma cells (NTera-2) transplanted into caudoputamen of nude mice. //

104. The Journal of Computational Neurology. 1996. - Vol. 376, №4. - pp. 111.

105. Morigi M., Benigni A., Remuzzi G. Imberti B. The regernerative potential of stem cells in acute renal failure. // Cell Transplantation. 2006. -№15.-Supplement 1. -pp.Slll-S117.

106. Moseley T.A., Zhu M., Hedrick M.H. Adipose-derived stem and progenitor cells as fillers in plastic and reconstructive surgery. // Plastic and Reconstructive Surgery. 2006. - №118. - Supplement 3. - pp. 121S-128S.

107. Mullen R.J., Buck C.R., Smith A.M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. // Development. 1992. — Vol. 116, №1. -pp.201-211.

108. Muraglia A., Cancedda R., Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. // Journal of Cell Science. 2000. - №113 (Pt. 7). - pp. 1161-1166.

109. Nakagami H., Morishita R., Maeda K., Kikuchi Y., Ogihara T., Kaneda Y. Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy. // Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. -2006. Vol. 13, №2. — pp.77-81.

110. Nelson P.T., Kondziolka D., Wechsler L. Clonal human (hNT) neuron grafts for stroke therapy: neuropathology in a patient 27 months after implantation. // American Journal of Pathology. 2002. - Vol. 160, №4. -pp. 1201-1206.

111. Nieto-Sampedro M., Lewis E.R., Cotman C.W. Brain injury causes a time-dependent increase in neurotrophic activity at the lesion site. // Science. 1982. - Vol. 217, №4562. - pp. 860-861.

112. Nieto-Sampedro M., Whittemore S.R., Needels D.L., Larson J., Cotman C.W. The survival of brain transplants is enhanced by extracts from injured brain. // PNAS. 1984. - Vol. 81, №19. - pp. 6252-6254.

113. Nieuwkoop P.D. The «organization centre»: Segregation and pattern formation in morphogenetic field. // Acta Biotheoretica. — 1967. Vol. 17, №4.-pp. 178-194.

114. Odorico J.S., Kaufman D.S., Thomson J.A. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines. // Stem Cells. 2001. -Vol. 19, №3. - pp. 193-204.

115. Park E., Bell J.D., Baker A.J. Traumatic brain injury: Can the consequences be stopped? // Canadian Medical Association Journal. 2008. -Vol. 178, №9.-pp. 1163-1170.

116. Park H.J., Lee P.H., Bang O.Y., Lee J., Ahn Y.H. Mesenchymal stem cells therapy exerts neuroprotection in a progressive animal model of

117. Parkinson's disease. // Journal-of Neurochemistry. 2008. — Vol. 107, №1. -pp. 141-151.

118. Paxinos G., Watson Ch. The rat brain in stereotaxic coordinates. // New York: Academic Press. 1998. - 474 p.

119. Perlow M.J., Freed W.J., Hoffer B.J., Seiger A., Olson L., Wyatt R.J. Brain grafts reduce motor abnormalities produced by destruction of nigrostriatal dopamine system. // Science. 1979. — Vol. 204, №4393. - pp. 643-647.

120. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. // Science. -2004. Vol. 284, №5411. - pp. 143-147.

121. Poltavtseva R.A., Marey M.V., Aleksandrova M.A., Revishchin A.V., Korochkin L.I., Sukhikh G.T. Evaluation of progenitor cell cultures from human embryos for neurotransplantation. // Developmental Brain Research. -2002.-Vol. 134, №1-2. -pp. 149-154.

122. Postmantur R., Kampfl A., Siman R., Liu J., Zhao X., Clifton G.L., Hayes R.L. A calpain inhibitor attenuates cortical cytoskeletal protein loss after experimental traumatic brain injury in the rat. // Neuroscience. 1997. - Vol. 77, №3. - pp. 875-878.

123. Raghupathi R. Cell death mechanisms following traumatic brain injury. // Brain Pathology. 2004. - Vol. 14, №2. - pp. 215-222.

124. Reier P.J., Stokes B.T., Thompson F.J., Anderson D.K. Fetal cell grafts into resection and contusion/compression injuries of the rat and cat spinal cord. // Experimental Neurology. — 1992. — Vol. 115, №1. pp. 177188.

125. Reier P.J., Anderson D.K., Thompson F.J., Stokes B.T. Neural tissue transplantation and CNS trauma: anatomical and functional repair of the injured spinal cord. // Journal of Neurotrauma. 1992. - №9. - Supplement l.-pp. S223-248.

126. Rodriguez R., Menendez P. Mesenchymal stem cells and their use as cell replacement therapy and disease modeling tool. // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2008. - №12(6B). - pp. 2552-2565.

127. Rolls A., Shechter R., Schwarz M. The bright side of the glial scar in CNS repair. //Neuroscience. 2009. - Vol. 10, №3. - pp. 235-241.

128. Ryder E.F., Snyder E.Y., Cepko C.L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. // Journal of Neurobiology. — 1990 Vol. 21, №2.-pp. 356-375.

129. Saatman K.E., Conteras P.C., Smith D.H. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) improves both neurological motor and cognitive outcome following experimental brain injury. // Experimental Neurology. — 1997. — Vol. 147, №2.-pp. 418-427.

130. Salomone J.P. Prehospital care / in Moore E.J., Feliciano D.V., Mattox K.L. Trauma // New Jork: McGraw-Hill, Medical Publications Division. 2004. - pp. 117-118. - ISBN 0-07-137069-2.

131. Scalea T.M. Does it matter how head injured patients are resuscitated? / in Valadka A.B., Andrews B.T. Neurotrauma: Evidence-based Answers to Common Questions // Thieme. pp. 3-4. - ISBN 3131307811.

132. Shin C.C., Fu L., Zhu L., Forman S.J., Shih C.C. Derivation of neuralstem cells from mesenchymal stem cells: evidence for a bipotential stem cellipopulation. // Stem Cells Development. 2008. - Vol. 17, №6. - pp. 11091121.

133. Silva W.A., Covas D.T., Panepucci R.A., Proto-Siqueira R., Siufi J.L., Zanette D.L., Santos A.R., Zago M.A. The profile of gene expression of human marrow mesenchymal stem cells. // Stem Cells. 2003. - Vol. 21, №6.-pp. 661-669.

134. Snyder E.Y. Immortalized neural stem cells: Insights into development Prospects for gene therapy and repair. // Proceedings of the Association of American Physicians. - 1995. - Vol. 107, №2. - pp. 195-204.

135. Snyder E.Y., Deitcher D.L., Walsh C., Arnold-Aldea S., Hartwieg E.A., Cepko C.L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. // Cell. 1992. - Vol. 68, №1. - pp. 3351.

136. Sottile V. Bone marrow as a source of stem cells and germ cells? Perspectives for transplantation. // Cell and Tissue Research. 2007. - Vol. 328, №1.-pp. 1-5.

137. Stein D.G., Hoffman S.W. Concepts of CNS plasticity in the context of brain damage and repair. // The Journal of Head Trauma Rehabilitation. -2003.-Vol. 18,№4.-pp. 317-341.

138. Suzuki D.E., Pereira M.C.L., Janjoppi L., Okamoto O.K. Stem and progenitor cells from the central nervous system: basic aspects and clinical relevance. // Einstein. 2008. - Vol. 6, №1. - pp. 93-96.

139. Sykova E., Jendelova P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. I I Program of Brain Research. 2007. — №161. - pp. 367383.

140. Sykova E., Jendelova P. Migration, fate and in vivo imaging of adult stem cells in the CNS. // Cell Death and Differentiation. 2007. - Vol. 14, №7.-pp. 1336-1342.

141. Taupin P., Gage F.H. Adult neurogenesis and neural stem cells of the central nervous system in mammals. // Journal of Neuroscience Research. -2002. Vol. 69, №6. - pp. 745-749.

142. Tholpady S.S., Llull R., Ogle R.C., Rubin J.P., Futrell J.W., Katz A.J. Adipose tissue: stem cells and beyond. // Clinical Plastic Surgery. 2006. — Vol. 33, №1.-pp. 55-62.

143. Thompson W.G. Successful brain grafting. // New York Medical Journal. 1890. -№51. - pp. 701-702.

144. Tohill M., Mantovani C., Wiberg M., Terenghi G. Rat bone marrowmesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerveregeneration. // Neuroscience Letters. — 2004. — Vol. 362, №3. — pp. 200203.

145. Tomchuck S.L., Zwezdaryk K.J., Coffelt S.B., Waterman R.S., Danka E.S., Scandurro A.B. Toll-like receptors on human mesenchymal stem cells drive their migration and immunomodulating responces. // Stem Cells. -2007. Vol. 26, №1. - pp. 99-107.

146. Tondreau T., Lagneaux L., Dejeneffe M., Massy M., Mortier C., Delforge A., Bron D. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins before any differentiation. // Differentiation. 2004. - Vol. 72, №7. - pp. 319-326.

147. Torres-Aleman I. Serum growth factors and neuroprotective surveillance: focus on IGF-1. // Molecular Neurobiology. 2000. - Vol. 21, №3. - pp. 153-160.

148. Tropel P., Platet N., Platel J.C., Noël D., Albrieux M., Benabid A.L., Berger F. Functional neuronal differentiation of bone marrow-derivedmesenchymal stem cells. // Stem Cells. 2006. - Vol. 24, №12. - pp. 28682876.

149. Trounson A. New perspectives in human stem cell therapeutic research. // BMC Medicine. 2009. - №7. - pp. 29-34.

150. Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells and cell-based tissue engineering. // Arthritis Research and Therapy. 2002. — Vol. 5, №1. — pp. 32-45.

151. Valadka A.B. Injury to the cranium / in Moore E.J., Feliciano D.V., Mattox K.L. Trauma // New Jork: McGraw-Hill, Medical Publications Division. 2004. - pp. 385-406. - ISBN 0-07-137069-2.

152. Varon S., Hagg T., Manthorpe M. Nerve growth factor in CNS repair and regeneration. // Advances in Experimental Medicine and Biology. -1991. -№296. pp. 267-276.

153. Vorwerk C.K., Zurakowski D., McDermott L.M., Mawrin C., Dreyer E.B. Effects of axonal injury on ganglion cell survival and glutamate homeostasis. // Brain Research Bulletin. 2004. - Vol. 62, №6. - pp. 485490.

154. Wahlgren N.G., MacMahon D.G., De Keyser J. Intravenous Nimodipine West European Stroke Trial (INWEST) of nimodipine in the treatment of acute stroke. // Cerebrovascular Diseases. 1994. - Vol. 4, №3. -pp. 204-210.

155. Watt F.M., Lo Celso C., Silva-Vargas V. Epidermal stem cells: an update. // Current Opinion in Genetic Development. 2006. - Vol. 16, №5. -pp. 518-524.

156. Weimann J.M., Charlton C.A., Brazelton T.R., Hackman R.C., Blau H.M. Contribution of transplanted bone marrow cells to Purkinje neurons in human adult brains. // PNAS. 2003. - Vol. 100, №4. - pp. 2088-2093.

157. Wernig M., Benninger F., Schmandt T., Rade M., Tucker K.L., Biissow H., Beck H., Briistle O. Functional integration of embryonic stem cell-derived neurons in vivo. II Journal of Neuroscience. — 2004. — Vol. 24, №22.-pp. 5258-5268.

158. Woodbury D., Reynolds K., Black I.B. Adult bone marrow stromal stem cells express germline, ectodermal, endodermal, and mesodermal genes prior to neurogenesis. // Journal of Neuroscience Research. — 2002. Vol. 69, №6.-pp.908-917.

159. Woodbury D., Schwarz E.J., Prockop D.J., Black I.B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. // Journal of Neuroscience Research. 2000. - Vol. 61, №4. - pp. 364-370.

160. Yilmaz G., Arumugam T.V., Stokes K.Y., Granger D.N. Role of T lymphocytes and interferon-gamma in ischemic stroke. // Circulation. -2006. Vol. 113, №17. - pp. 2105-2112.

161. Zhuravleva Z.N. The hippocampus and neurotransplantation. // Neuroscience and Behavioral Physiology. 2005. - Vol. 35, №4. - pp. 343354.

Информация о работе

Григорян, Анаит Суреновна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на развитие посттравматических процессов в головном мозге крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы