Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ СИНХРОНИЗАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ДЕЛЕНИИ И ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИИ ФОРМИРОВАНИЯ СЕМЯН НА РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И МУТАБИЛЬНОСТИ ЯЧМЕНЯ

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ СИНХРОНИЗАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ДЕЛЕНИИ И ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИИ ФОРМИРОВАНИЯ СЕМЯН НА РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И МУТАБИЛЬНОСТИ ЯЧМЕНЯ"



государственный агропромышленный комплекс ссср

всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии

На правах рукописи

АРТЕМЬЕВА Валентина Васильевна

удк 576.5; 575.1 [+547.854.1

ВЛИЯНИЕ СИНХРОНИЗАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ДЕЛЕНИИ И ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИИ ФОРМИРОВАНИЯ СЕМЯН НА РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И МУТАБИЛЬНОСТЬ ЯЧМЕНЯ

Специальность 03.00.01 — Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ленинград 1987

Работа выполнена в Агрофизическом научно-исследовательском институте г. Ленинграда,

Научный руководитель: кандидат биологических паук В. Н. Савин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук О. В. Малиновский; кандидат биологических наук Е. Я- Зяблнцкая.

Вслушее учреждение: Институт экологии растений и животных У О АН СССР.

Защита диссертации состоится « J » 1087 г,

в /i час, на заседании Специализированного совета (К J20.81.01) во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии ГОСАГРОПРОМ СССР (Москва. Центр, ул. Белинского, 4,

к- ^

W4OA0

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: г. Обнинск, Калужская обл., ВНИИСХР, Спецсовет,

Автореферат разослан * JtO> СЯЮЛ^ьЯ 1087 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

II. И. Санжарова

;1хтг{цьрость работц. Сельскохозяйственная радиология располагает, в настоящее время рядом приемов и технологий,,применение которых повышает производство сельскохозяйственной продук-щга к способствует решению Продовольственной программы СССР. К ним относится использование ионизирующих излучений при выведений новых високопродуктнвныг сортов.

Радиационный чутагендз - эффективный метод изменения наследственности и создания генофонда для целей селекции и иэуче- ' ния биологии растений (И.В.Черный, 1961; Б.И.Головченко, 1965; О.Б.Еляндур, В.Н.Лыспков, 1966; Б.С.Алексеева, 1968« 1965; В.К.Щербаков, 1973, 1963; И.В.Дрягина, 1974, 1986; В.Г.Володин, 1975;,В,В,Шргун, 1983 и др.)..По данным ЗАО МАГАТЭ методом ради ышонно го мутагенеза в мире получено более 500 сортов различных культур: пшеницы, ячменя, овса, гречихи,-фасоли, сои, лягана, табаха, плодовых, ягодных-и овощных культур (О.С. Куков,

B.К.Щербаков, 1962). ■

Выведение новых сортов путем мутагенеза является весьма

трудоемким процессом. Для увеличения вероятности возюишовения Полезной в сельском хозяйстве мутация одни исследователи ис-польэугт больше количество посевного материала - до 200 тыс. растений-( ¿/ЛУйЛ^ 1908), другие -

увеличивают набор мутагенов (Х^мгои-*, 1971; ,

1972), третьи - повншают дозу мутагенов (И.ВЛерный, 1968 ;

C.А.Валев^, 1965 и др.), В первом и втором случаях получение, ценны* мутаций связано с увеличением материальных затрат и не всегда приводит к желаемому результату, в третьем - наряду с полезными мутациями возникает много нежизнеспособных.* Именно поэтому повышение эффективности мутагенеза является весьма актуальной проблемой,' ■

.Одним из путей повшения-эффективности радиационного мутагенеза монет служить увеличение чувствительности облучаемого, материала. Однако вопрос о связи мевду радиочувствительностью ж мутабильностью остается недостаточно изученным. В'большей степени изучена связь между радиочувствительностью л возникновением структурных изменений хримэсом, и в меньшей степени - связь между радиочувствительностью и возникновением генных жизнеспособных мутаций (К.К.Сидорова и др., 1967; . С.А.Валева, 1969; Г.И.Орав, 1972; К.Ц.Гарина, 1935).

>..Клетки на разных фазах митотяческого цикла проявляют нео-

Цсптрепьагэ

■Еа«л«стека "'ТЛс: ".иЗ (.рд-па Д^ма

К. А. Ткпйкгззга

динаковую радиочувствительность (Ю.А.Митрофанов, 1369; В.Б.Ива-вон, 1Э74;И.Н.Гудков, Д.Ц.ГродзинскиЯ, 1976). Большинство,авторов считают наиболее радиочувствительной конец фазы" и... нетало фазы (Б.Н.Савин, 1972; Н,В,Лучыш£, 1976;

1Э62;, 1976). Поэтому синхронизируя клетка зародышевых меристем к фазе синтеза ДНК можно ожидать повыше- -пил их радиочувствительности г возможного увеличения еффвктив- ' но ста радиационного мутагенеза. . ^ .

Кроме того из работ Ш.И.Нувдин, 1964-Б8; Е.И.Преойрежея-ская,. 1965-71 в др.) известно, что условия формирования семян У. могут также изменять радиочувствительность, но не изввотно ; бы-' ло, меняется ля яри атом мутабяльность.

Целр) ^ заду^я исслнро^андд. Целью настоящей работы бшо ; повышение о<И>актив110сти радиационного ^тагенеза аа счет изменения радиочувствительности сеьйа ячменя методой синхронизации * клеток апикальной меристемы стебля и $ордированиен семян в контролируемы* температурите условиях.

Для достижения поставленной цеди необходимо бшто решить ": следующие задачи: - 1

- разработать метод сшосроотэации клеток в апихальной не- . рпстеме стебля проростков ячменя сорта Пвркка к фазе синтеза .

дик» " -

- оценить влияние синхронизации клеток ашт&пьной ыериста-иы стебля проростков на их радиочувствительность и «утабилыюсть^

- изучить возмошость увеличения радиочувствительности" и-ыутабилгности растений ячменя щи формировании исходных семян в различных температурных условиях;

- определить влияние температурных условий формирования: саман ячменя и швеницн на ше - радиочувствительность а устойчя- ".■:

' вость к казной температуре.-

ЙЗ-УШАЯ, ^рущи^. Экспериментально установлено, что в пределах одного сорта существует положительная зависимость между редиочувстБительпостьв смаян а их му табъльшетьп. -

Разработан иетод синхронизация клеточной популяции ели-уадьяой меристемы стебля проростков ячменя.к фазе синтеза ДЙК о соиощьп б-емикоурадала (5АУ) и последующего выдершванЕЯ их ори1 пониженной температуре (+2*3°С), вызывающий увеличение выхода -структурных.и генаых мутадай в £-3 раза при одновременном:: рао- , , ишренки спектра мутации. .■'..'.'..' *''-..'■

Показано, что использование разработанного метода синхронизации ,клеточных'популяций усиливает изменчивость количественных признаков растений. ■

Установлено, что облучение семян,' сформированных в. контролируемых условиях при +12°С, приводит к увеличению выхода • структурных и генных мутаций в 2-3 раза по сравнении с облучением семян, сформированных при +20°С.

Выявлена неспецифическая устойчивость семян к гамма-облу-ченаю к низкой температуре, возникающая про их формировании в температурных условиях +30°С, что указывает на возможность управления-устойчивостью семян.

• Лзрктр^оскре значение;, работа. Предложен метод синхронизации клеток.в апикальной мернсгеые стебля ячг-'еня к фаза, синтеза ДНК и метод формирования семян в контролируемых, температурите условиях, повшагацяе дефективность радиационного мутагенеза.

Выявлено модифицирующе в влияние температуриых услсшй формирования семян, которое необходимо учитывать при исследовании радиочувствительности и устойчивости семян к низким температурам.

С использованием метода скщсронизацаиклеток апикальной меристемы стебля ячменя выделен радиомутант сорта Пиркки, отличающиеся высокой продуктивностью к скороспелостью в сравнении со стандартом. Радаомутант передан в конкурсное сортоиспытание и используется в савексии ярового ячмеяя в Северо-Задад-ном НПО по селекции в растениеводству "Белогорка".

Адгабагжя гавоты. Результаты исследований дол оке нн на Всесоюзной конференции по использованию радкаиг.оняой техники в сельском хозяйстве (1\яиинев, 1972), Симпозиуме со - сельскохозяйственной радиобиологии (теоретические и практические аспекты использования ЕОниэируших излучений в сельском хозяйстве) (Кишинев, 1976), Всесоюзной конференции по клеточным циклам (Ленинград, 1978), Всесоюзном совещании по экспериментальному, мутагенезу (Канав, 1379), 1-й и 2-й Всесоюзных конференциях по .сельскохозяйственной радиологии (Облинск, 1979, 1ЭШ), Всесоюзном совещании "Иодис^икация радиочувствительности биологических, объектов и ее значение для практики" (Ереван, 1985), I-« , Всесоюзном координационном совещании "Радиационная генетика -селекции" (Москва, 1986) и др.

Дубликате^. По" томе диссертации опубликовано II работ.

Структддаа и ойьем работы. Диссертация состоят аз введения, Ойэора литература, описания материала и методов исследования, >«ло*«ния результатов, юс обсуждения, выаодов, спасла литературы иприложения.

Диссертация содержит 168 страниц машинописного текста, 19 рисунков, 21 таблицу,' 14 приложений.Спиоок лшературы включает . . 292 раОоты , в той числе 134 иностранных.

Материал и методика. При изучения влияния предваригельшв сиюфонизации клеток апикальной меристемы проростков а температурных условий форшфования сеиянна радоючувств иг едьноот ь е<5ь-екхом исследования Оыди сорта ярового ячменя Пиркха а Цяа»раЛ-онированные в Ленинградской одлаотд. Прл изучении мвиошостн ; радиочувствительности и морозостойкости от температурных уело- , ЕвЛ формщювамйя семян одьектом исследования служи сорт osmoi пшеницы Мироновская 800,

Методдаа синхронизации включала:

- замачивание семян в воде в течение 5 ч. при температуре t2í?C;

- обработку семян в течение б ч. в раствора 5АУ /концентрация 500 да/л / пра температуре +22°С j

- промывку , семян в воде в течение 2 ч. при температуре 22QG¡

- вадеркиваквв кс а воде в течение 12 ч. при темаермуре 2«3°а /вариант о синхронизацией/.

Таким образом. овшее время ocí работай семян составляло 24 ч. Оптимальная концентрация 5АУ ti экспозиция Ó или выбрани опитньм ; путем.Кокгролеи слушан семена, замоченные в воде в течение 24 : чао* при температуре 22°С /вариант des синхронизации/.

далее часть проростков контрольных н после синхронизации проращивались на чистых фильтрах, смоченных водой при температуре 22°С. Дм изучения митотическо* активности клеток пророст- *' кн фиксировались в ацеталкоголе/1;3/ через каждые 2 часа, начиная о 2S часа н до 61-го. Мистическую активность подочвгшаля на давленш препаратах, окрашенных аштокармивом. Накаждый чао фиксации просматривали препараты клеток меристем 10 проростков /4«-5 тыс.клеток/.

Для исследования апикальной меристемы Стебля использовали ; давление в глицерин- желатине временные препараты.* Препараты окрашивали ш Фельгену посла гидролиза i ВС в течение 8 мин, при 6СРС. Содержание ДНК-Фуксина в ядрах клеток намеряли о помощш .

" '■; ,' -7 -v' '*.;'■ " ' -'

цитофотометра, сконструированного в лаборатории биофизики в ре-диобиоло'пш Агрофизического НИИ СМ.В.Архипов, 1974), одноволно-■ вш методом при длине волны 545 им. В каждом варианте опыта ис--'пользовали 5-7 препаратов, в каждом препарате измерялось m 30 ' . клеток,-

Для оценю» радиочувствительности 24-часовыаконтрольяие и " синхронизированные проростки подвергали гег-ма-о блучению

60Со

; на установке 1УБЭ-1500 Агрофизического института в дозах 10 и 20 Гр и высевали в поле. .

* ч • *

■■'.. Приисследовакии зависимости радиочувствительности семян , от температуряых условий их формирования растения ячменя вир»-. . щивали при постоянной температуре +12°С и +20°С в фитотроне ВКШ, а растения пшеницы при температура+12°С и +30°С, Собранные . о этих растоний семена бшт подверЕекы гамма-ойлучеиию: ячмень -; в дозах 25-150 Гр, а оэшай пшеница - в дозах 100-400 Гр.

Морозостойкость оценивали методом прямого ступенчатого промораживания проростков: промораживали в холодильных камерах яр«.. . температурах -I5°C, -iaPc по 100 проростков в шести повторвос-тях (Методические указания. Л., 1983). . ■

Критериями радиочувствительности служили: митотическая ак-тавность клеток и распределение клеток до фазам штоза, частота . Y хромосомных аберраций в анафазах первых митозов, лабораторная я -палевая всхожесть семян, и выживаемость растений, рост, развитие и продуктивность растений, пестролистность, морфологическая из- , меичивость, стерильность растений. J, Растения Mg высевали по семьям, в каждом варианте опыта

. 200 семеб. Изменчивость в потомстве облученных растений изучали . по частоте возникновения хлорофильных мутаций (Ж^с/т, ' 1954 ^ . 1960). .

• ■ При изучении мутаций количественных признаков в каждом ва-'■■■■. рнанте опыта Ы^ анализировали 80-100 произвольно взятых семей '

. по морфологическим признакам: высоте растения, длине главного Y;, колоса, числу колосков и семян вколос^ числу иевдоузлий а дки-. не вегетационного периода. Методом 'дисперсионного анализа опре--v";- деляяи показатель наследуемости в строкой смисле i/fi/aúfá/ffs, • 1958). Расчеты проводили на ЭШ T3-I6. ' , ' .. .

'■иНа Ыд были высеяны.наиболее перспективные мутантыдтадаль-; 'г^-, 'нейшей селекционной оценки. Все данные обработаны статистически .существенность различий мездг средними значениями 'изучаемая па-

раме тjo в проводили по критерию Стыоцевта. Чавду некоторыми оо-' казатаяямя родао чув ствителыю сти и изменчивости в потомстве облученных растений был рассчитан коэффициент корреляции (Б.À.Доспехов, 1979}. Все выводы основана на данных., достоверных' не менее.чвм на уровне значимости.

Разработка методики синхронизация клеток в апикальной меристеме стейля ячмаш Изучено действие 6АУ на синхронизацию и митотическу» активность клеток апикаяьшй меристемы стейля (ышянде -экспозиции при проращивании семян в растворе 6АУ), эффект низкотемпературная; условий прораздтаник семян, а также комбинированного деяст- ■ вая 5АУ и пониженной температуры на синхронизацию в. митотическу» активность клеток.

Установлено, что 5АУ в концентрации 500 иг/л стимулирует мдтотическую активность клеток, а в концентрациях 1000 а 5000 мг/л подавляет ее. При использовании 5АУ в концентрации 500иг/л и экспозиции 5 ч в апексах стебля наблюдается аезкачитель r а я еикхронизацня клеточных делений на период 31-35 ч,суммарная ми-то гическ as активность увеличивается за этот период по сравнению с контролем примерно в два раза, Проращивание семян в. воде при кпэкоЗ положительной температуре +2*3°С в течение 12 ч подавляет вступление клеток апикальной мераютеиы стебля s мптоа. Однако после временной задержки вступления клеток в митоз за период анализа до 61 ч претерпевает деление в два раза большее количество клеток. Следовательно, в этой варианте наблюдается'незначительная синхронизация клеточных делений (рис,1).

В ходе эксперимента бшга предпринята попытка усилить синхронизации клеточных делении путем совместного использования 6АУ в пониженной темпер&турц. Этот вариант оказался наилучшим -из трех испытанных (pic.I). Воздействие на апексы стебля раст- *' вором 5АУ (концентрация 500 иг/я) В течение 5 Ч И послэдутацее выдерживание проростков в воде при температуре +2*3°С, несколько задертавая появление делящихся клеток, обусловило одновременное вступление в митоз большого количества клеток и на ЭЭ-й . ч китотичеекпй индекс (Ш) достигал значения 33,4$ (при значении 7t3% в контроле). ;

Данные цитофотометриче CKorq анализа апикальной' церистемц , стейля ячменя свидетельствуют о том, что в первые часы про рас- -танея после действия синхронизаторов (24 час от начала замачи-

ми %

л .

Л*«

£9

/Г

Л«г

'Л

А

. \ , А

-»г* я Л "

Время от начала эекачивания семян, ч

■ - Ркс.Х, Изменение штоткческоЯ активноотн в апикальной . . меристеме стебля ячменя после обработки 5АУ и пониженной тем- . пературой +2+3°0, Обозначения! I - контроль, 3 - низкая температура, 3 - 5АУ ж.нязкая температура ■■.

вания семян) основная масса клеток (63£) скоацентщрована в фаэе; в то время как в " % "-фазе пребывает 30$ клеток, ев" (/*-фазе В ко.геролетакой синхронизации ни в одной из фаз не на-йшвдаяось. (табл.1). . .;

■ ■ Табаива I

Влияние синхронизации Клеток

а структуру популяций интерфазных клеточного цикла .

Варианты опита

Кйлдчест- Время от Процент клеток, находя-во просмо- начала за- вдхся в фазах I интер-

т ренных мачивагсяя _Фазы '

клеток семян, ч Л' 5«.

бе»'синхронизация (контроль)

при синхронизации

5АУ + низкая „ ' ■ темпе ратуша+3+3ЧС •

150 24 33±3,84 35*3,89 32±3,8

' 1

1501 '24 30*3,74 63±3,94 7^2,08

' В дальнейших исследованиях по изучению возможностей повышения эффективности радиационного мутагенеза использовался комбинированный метод синхронизации клеток в апексах стебля ячменя с помощью 5АУ и пониженной температуры. ■ «.:

Таким образом, нами риз работай метод синхронизация клеток ахшкальной ыар!1СТе1ш'отебля проростков'к фазе,' (синтеза ДНК)» : позволяющий увеличить МА в узком временном интервале сочти в 5 -рва по сравнению с контролем,

* • Радиочувствительность я изменчивость растений ячменя при синхроназыши кпетон В апикальной меристеме, стебля проростков'

Изучено влияние синхронизации клеточных делений в апикальной меристеме проростков ячменя'на их радиочувствительность по • следующим показателям; всхожесть семян и вшкиваемость дастевий, "рост, развитие и продуктивность растений, появление растений о хлорофильвыми нарушениями и морфологическими изменениями, мутирование хромосом» По всем изученным признакам синхронизация клеточных делений в апекса стебля проростков ячменя приводила к шь -вдаеязю их радиочувствительности. В табл.2 предетаапеиы данные по частоте аберраций хромосом а хлорофильной пестроцветкости после облучения проростков- с предварительно проведенной сЕнхро^ кизацией клеточных делений в них а после облучения намоченных.; в воде проростков (контроль), -

Tatolea 2

Влияниэ синхронизации клеточных делении в апексах -стебля Проростков ячменя Да частоту аберраций . хромосом и хлорофмьную вестроцБетйость

Дозы Количество Количество Корреляция между Вариант гаьма- .' анафаз о хлораТвдъюа анафазам» с абер-опыта odiarte- аберрациями, химер, рациями и хлоро-„ Кия, Гр % ■ % фильными химерами

Без сия- 0 ■-■ 0,7*0,14 • О

XpOiffl- 10 . 1,9*0,24 0,3t0,06 0,50 1

вации 20 5,8±р,12 1,4*0,17 0,41

При син- О ' 1,4+0,04 0,7±0,08 • ■ 0,16

хрояи- 10 9,4±0,07. 3,6±р,и 0,39

аацва 20 16,4^0,14 3,9¿0,I4 0,62 **

х) - значение в опыте превосходит кщтическое значение £ - fia уровне вначкмости 0,0б( хх) - на уровне значимости 0,01..

Геыма-ойлучение вызывает увеличение количества клеток о Хромосомными нагутениями. Синхронизация вызвана резкое повыше-

me мутабшодюстн. хромосома/ при доза IQ Гр выход хромосомных аберраций увеличился в б раз, а при 20 Гр - в три раза.. При дозе 20 Гр яаблодалось наибольшее количество клеток о хромоеоины-ш нарушенная, Б контрольном варпгите с - сияхрокЕзацией у 0,7?í ' растений на листьях набЛвдалясь хдорофяллонедостаточные пятна, в контрольной варианте des синхронизации . таких пятен не Сило. Гамма-облучание в дозе 2Q Гр увеличивало количество растений с . хлорсфиьнши изменавхями go Ï.4Â. ь' Baïaarçïe о саахронааацией, пря той жа дозе г количество июрофилышх нарушений возрастало в три раза. Коэффициент корреляция между количеством- хромосомных аберраций и хлорофальных нарушений позволяет судить а некоторой связи данных признаков (jf » 0,39*0,62). •

; Оледовательно, синхронизация клеточных делений в' апнкаль- . нов меристег.о проростков повышает ах . радиочувствительность • и : тем семш увеличивает мутагенную ©ффективность - по отплету рнвд-мутецвды ь рва, . ~ v ■

Изменчивость э потомстве облученных раотений '

Гидаа-ойяучение вызывает появление хлорофяльннх мутантов (табл.З).В контрольной серии опытов (вариант без сикхровиза-цви) мутанты не обнадг&ены, в варианте о синхронизацией без облучения появляясь хлорофилыше мутанты типа я ¿¿«я.. Проростки о предварительной синхронизацией клеток оказались в два раза более мутабильнши по сравнению о контрольными, Максимальная . чаотота мутаций в атом варианте составила после облучения в дозе 20 Гр - 192 >семей о мутациями в мутантных растений.t ■ - Спектр хлорофильных мутантов бьш представлен следующими типамиг aíh'na, xûttye- ,*iïu(t£$ , Ы/хмЪпаю , ¿cyrtsia- t ¿taníAetb, jfvi'aM, После облучения проростков без.синхронизации наиболее часто появляются мутации типа ViuUij, реже - хан&А. Частота разных типов мутаций у проростков о синхронизацией кная:в этих вар! ант ах опыта наиболее часто появляются мутации типа atA^a, ( затем'мутации ЛйлЙй. П]»1мечательно, .что мутации/^****. наблюдались только пр! облучении проростков о предварительной ' синхронизацией. \ . •• . .

; Таким образом, "синхронизация клеток в апикальной меристеме .. проростков вызывает, как повышение частоты* мутаций, .,тан я изменяет их спектр.

.... Расчет эффективности мутагенеза на единиц? доз« убеждает, -что синхронизация клеток в апексах стебля проростков ячменя

Таблица 3

. Частота » спектр хлорофидьных мутантов г Hg

после облучения синхронизированных ' \ и явсинхрониэвровакннх проростков

ЭДК? ^BcemEEZTBceiA »?, в Гр

Без син-

хронв- 10, 163 6,0tI,88 6194 0,5±р,2 ващш 20 . 163 e,QfcI,75, Ш2 0,6±р,24

При сип- 0 161 2,5*1,23 6280 0,1±0,003 - . хропи- 10 163 12,3*2,58 5762 D,9*0,06 1,23 Э9ЦЕИ ■ 20 153 19,0*3,18 5450 ¡3,3*0,39 Q,95

оказала существенное влияние: мутагенная вффективаооть увеличи- , лась вдвое. О увеличением дОэн мутагенная еЗфектнвнооть во здо-рофильвым мутацаяи Не возрастает, видимо, эаечет роста количе-; ства деталей. -

ООаангженб увеличение му*абалъностн после предварительной синхронизации по морфологическим признакам и стерильности рео-теНлй. . -_: ■.

■■■' Примечательно, что значительную часть морфологически видимых мутадвй в варианте галма-ойлучения синхронизированных проростков в дозе 20 Тр представляли аректЬидкце форш, Которые на- ' Ьледовались в раде поколений и бага затем ввделены для участил -в конкурсном сортоиспытании, а также использовались в селекционной процессе.

Установлено, что по ряду изученных количественных Признаков: Длине сслсашяц длине колоса« числу меадоуалий, числу- колосков гсеыяв гаколосе^ длине вегетационного оервода-облучение невйзнвало аначггельных изменений средних величин, увеличивая вря»том размах, изменчивости; аеметные изменения про слеживались толысо в вариантах о ¿яяжрониеецвейпроростков (табл.4)»В »том случае уохлввалаоь как Генотипическая варианса, так к кйзф&щн-внтна^едуёйости;™»

"*"'Таким образом, для количественных признаков, так же как в двя качественных. оОнаруяена большая изменчивость растений

после предварительной саяхронизадияклеток апикальной мармсте-ми проростков. • *

^ - ТаДмца 4 '■■

Влияние синхронизации клеток апикальной меристемы Проростков на геноткпическуп изменчивость • .. и наследуемость количественных цразйадов . (число семян » колосе) у ячменя сортаПиркка Ц^

До эи Гпапим"" "Дисперсия Гено-" Ков^циеты*' Показа- -''

Вари- Ж" зКа ВДШг

чекпя, признаке ««« ^

•2!! ЗС2 ЖИ

Без 0 44,01±С(£е 20,62

10 «,03^4X7,133 7.13 эацяи 30 За,ОТ1йЮ 26,01 ?,Э5 При 0 '43,07^,20 19,38 7,93 той- 10 37,95*0,36 40,25 9,50 задан 2а 34,02£1£9 52,16 6,17 .-4,40

. . Следовательно, синхронизация клеток в апикальной меристеме прощотков ячменя ловшает их радиочувствительность и «ута- . Сальность, тем евдым увеличивав еффекгивдость отбора в пределах одного сорта, :

: При использовании метода синхронизация клеточных делений в. апикальной меристеме Проростков ячменя были обнаружены хозяЯст-венно-ценныв форыы,' которые отличались от стандарта длиной вегетационного периода (совревали на 5-7 дней быстрее), Повдаен-ной вьишваемостьа, плотной, . устойчивой к полеганив соломиной, плотгом колосом о количеством сечян, превосходящим коходнут» форму, яо по длине колоса уступающим стандарту., :

Один из ввделеняых мутантов бш яа 13 ш ин*е коятроля, отличался высокой продуктивной кустистостью и укороченным наII ш колйсом. Прн етом чийло семян," формирующихся в колосе, было значительно бовдшм (на вт.), а свии зерна крупнее (масса 1000 зерен у мутанта бияа равна 39,1 г. чтй на 5*5 г больше, чем у стандарта). Масса зерна о одного.растеши увеличилась в среднем до 2,9 г по сравнении о 2,0 у исходной ' формы, что ' ео~\

тествеоно отрекалось да продуктивноотй неноза о едияяпн ЯЯ.,Продуктивность цекоэа с I к2 у мутанта составляла; 420 г, что на 56 г вше исходная форш. Созревание Наступало на "7дней раньше, чем у стандарта, Радаомутантперодан в конкурсное соритов спатани 9 в используете* в.селекция ярового ячменя в Севером Западном НПО по селекция и растениеводству "Белогорка"»

* Влияние температурных условий формирования семяи ' . па их радиочувствительно ств и изменчивость потомства

В литература опиоаны исследования по изучение влияния экологических условий вщвщивагаи растений на радиочувствитал±ность семян ячменя и пшеницы {С,И,Янушкевич, 19611 В.И.НуиДОШ я др., 19641 1967, 1968( Б.И.Преобраяеяская, IS65, 1969,1971 ! Т,И40рав я др,, Х972г С.П.Оемецини к др., 1976i Г.Г.Шведов, 1979, ■ 1981; я др.). Высказано предположение, что большая редиоустойчиа ость-гашых репродукций связана о разной температурой выращивания ма-териаских растений, а так*вс. интенсивностью радиации, игравшей ватскуя роль в повышении .устойчивости растений к ионизирующему облучению (Е.И .Преображенская, 1965, 1971; НЛ^Нуждия, . В.А.Пастушенко-СтрелеЦ.. 1969), Однако авторы не учитывали такие факторы, как длина дня* ' влажность, почвенные условия я др. , которые , также'могли модифицировать устойчивость растений tt иони-зяитюцим излучениям,

В свяэя с атим необходимо било провести исследования * в контролируемых температурных условиях с выравниванием всех других Факторов. i.

На рис. S .представлены данные об изменении «итотической активности клеток апикальных меристем в - контроле и после гемма-облучения двух партий семян. Максимумы митотическоД активности' в проростках рз семян, сформированных при 20°С, приходились на 28-й и 40-Й ч и составляли 8,9 и 9,7? соответственно. Облучение снижало митотическую активность и пики митозов после облучения сдвигались на 4 ч. Количество делящихся клеток на 32-Й ч от качала заматившшя семян составляло &% - после облучения,в' дозе 100 Гр, - после облучения в дозе 125 Гр и 7,0£ - после об-лучевияв дозе 150 Гр. Матотическая активность ,на 44 ч от начала замачивания семян (второй пик митозов) состевляяа 9- после гшма-облучеяия в дозе 100 Гр, 7,2% - I2D Гр и C.9Í-I50I]pî В контроле на 48 ч начинался третйй пик мятозов,в семенах после гемма-облучения дозами 100, I2& и 150 Гр »а 46 ч завершалась

вторая волна митозов А

Huit il M к « •♦» t/t П 1» If U U )t »4**1

■' В|выя от начала заиачаванвд семян, ч

Рас. 2." Влияние темпер ячменя copia Ида на. дина Обоаяачеяяя} I - семена ж__х________

2 - семена сфо»вдшванЫ:при температуре +12°С, Контроль - А; облучение семян в доэег 100 Г р - Б, ; 123 Гр - ^ 150 Гр - Г

В семенах, сформированных яря перше митозн наблюда-

лись на 4 часа позже ю сравнений о <ммвнами,оформированяшя при 20°С, ¿ при облучении в дозах 125 и ISO Гр - ' ва 8 чаосв позже , - НитотичеСкая, активность самян,.'сформированных-при 12°0 была аначительно меньше посла облучения в одних, и тех *е дозах и максимумы штозов сдвинуты на!2часов по сравнению о 'семенами, сформированными при 20°С, V

'1шм образом, гета-облученяй в одних в тех ка дозахпря-ьодит к более существенной задержке ми-готической активности у семян, сформированных .при го сравнению с семенами, сфор-

мированными nja 20°0. На основании втого можно Заключить/ что радиочувствительность Нервах более Ьысока.ЧеМ вторых. ; • Результаты цитологического авали за показали, что в контрольном варианте имеется неболылоа количество хромосомных аберрация*' причем в семенах,' оформированных ирг +12&С их почти а два разе больше, чем / семян, сформированных пря +20°С, однако эти различия статистически недостоверны (табл.б).• ;

Таблица 5

.. Частота появления аббераций. хромосом а клетках

кончиков корешков семян ячменя сорта Ида, сформированных в различных температурных • условиях при действии гамма-облучаная

Условия' Количество проанализированных анафаз

&>плп№ дозы гамма- ■ ■ ....... ■ ■ .... „ , ■—■■■■■ _

1штя * облучения, Гр Ес0ГО из них о аберрациям»

. семян шт. ■: -

+20°С

+12°С

0 1550 16 ■ 1,0±0,26

облучения)

100 . 900 II

125 ' 700 ■ 43 6.0tQ,90

150 1200 118 9,%0,в5

0 iooo . 19 1,9*0,43

облучения)

100 1500 198 i3,j4o,ef7

125 1006 180 17,4*1,18

150 995 2Я7 • 22,^1,33

После облучения семян в дозе 100 Тр количество аберращй увеличивалось: в свмоЯах, сформированных ; при +20°С - незначительно | а при +12°С - почти в семь раз« 0 увеличением дозы " об--лучения до 125-Гр количество аберраций возросло до 6,0£ у семяц офорлированяшс при 20°С, и до Х7,4#-у офориирбваншос при 12°0.

Очевидно, что семена, сформированные при +12°С, сильнее поражаются при облучения одной я той же дозой гамма-облучения, следовательно, они являются белее радиочувствительном.

При исследовании влияния температурных условий формирования на такие признаки, как всхожесть семян л выживаемость растений, рост и продуктивность растений, была отмечена следующая закономерность: семена, сформированные ври,низкой температуре . +12°С, оказываются - более радиочувствительными . по сравнению с ■ ' семенами, сформированными при 20°С'(рис.З).

Таким образом, условия выредиваяия материнских растений и формирование семян при низкой температура (+12°С) оказквеют мо-^ . дифицирутацее влияние на радиочувствительность сеыян, увеличивая ее я приводя к возрастанию числа структурных мутаций.

Рис.З, Едия1ша гамца-издучеиия 60Со на всхожесть семян, сформированных в различных температурных условиях и выживаемость полученных яз дох растешв. Обозначения: А - всхожесть, . Б - выживаемость: I - семена сформировали лря +20°С, Z - семена сформированы при +12°С.

^ Изменчивость'в потомстве облученных растений

При облучении семян, сформированных при +20°С, количество семай с'хлоро^юльнши мутациями в Mg С увеличением дозы гамма-излучения растет незначительно. Иная картина наЛлвдалась в потомстве облученных семян, сформированных яра +12°С. В этом случае частота хдорофилышх мутацоЭ значительно возрастает с уве-.личением дозы. Ток, частота хлорофвльных мутадий была вдте вы-,ше после облучения дозой 25Гр у семян, сформированных , при +12°С, по сравнению с семенами, сформированными при +20°С, и в три раза выше - при облучении в дозе 50 Гр и 100 Гр. То есть семена,- (формированные при +12°С, проявляют большую мутабиль-ность. У этих семян мутагенная эффективность гаммакнучёй при расчете на единицу дозы возрастает в два-три раза по сравнению с семенами, скормированнши щи +20°С.

Нами установлено , что спектр мутаций у семян, сфор4ирован-ных при +12°С, значительно расширяется. &айщвдалосъ в типов зшорофидькых мутаций у растений, выросших из ' семян, сфоргаро-ванных при +12°С, в то время как у потомства семян, сформированных при +-20°С, - только 5.

Таким образом, формирование семян при низкой температуре -

+12°С приводит к уъелмче дат не только стцг*турщи , во я генных. мутаций. При незначительном снижении вшшваемостя после гамма-Облучения (менее 10$ частота хлоре фальных мутаций увеличивает-, сн в два-три раза. Все это свидетельствует' о наличии прямой связи между радиочувствительность» я их чугвбшьноетью.

■ Устойчивость растений к неблагоприятна,! факторам среда . в зависимости от температуря их условий формирования семян При и следовании влияния тешературных условий- формирования семян на их радиочувствительность часть опытов была проведена и на озигдай пшенице Мироновская SOS, ■ : ■ ... Семена, сформированные при температуре +Х2°С, имели боль-шую абсолютную массу зерна и были более выполненные, чем семе- . на, сформированные при температуре +30°С, однако радиоустойчивость первых (сформированных при +Х2°С) оказалась значительно ниже,чем у семян, сформированных пря 30°С. В наибольшей степени этот, эффект проявился при , гаша-облученшг семян в дозе 100 Гр - яа 14-е сутки длина проростков составляла в процентах. к контролю 19,69 (для +12°С) и 73,40 (для семян, сформированных при +30°С). Возникает вопрос: специфична ли эта модификация радиочувствительности, или такимпутед меняется .общая устойчивость.-растения я 'к другим неблагоприятным факторам?

Результат оценки тех ж» партий семян.озимой пшеницу сорта Мироновская 806, сформированных аря различных температурах (+12 и +30°С) и подвергнутых промораживании при -15°С, показал, что морозостойкость семян, сформированных при температуре +12°С, в два раза ниже морозостойкости семян, сформированных при +30°С: выживаемость после промораживания составляла 44,3$ я 8э,8^ со-^ ответственно. Из этого-следует, что условия формирования семян оказывают существенное 'влияние на устойчивость растений к низ. кой температуре и радиоустоЯчавость, т.е. свидетельствуют о * наличии у растений.неспецифической устойчивости s возможности -управления етой устойчивостью. • ', . >

. ' Заключение'. *- ' ".

Одним из важнейших прикладных вопросов радиобиологии явля-' ется разработка методов увеличения частотой расширения спектра-мутаций, т.е. повьаиение эффективности радиационного мутагенез» Для их решения необходим, чтобы мутагены были более э^фектив-'. йими.тл. вызывали больше цутацкй на единицу дозы мутагена;'бо-.'

лее избирательными, т.е. давали более высокую частоту точковых мутаций по сравнении с деталями и хромо сомнша аберрациями; и более специфичными - давали более высокую частоту мутаций определенных локусов (Л//<#7л ,1973). :

В современной. науке эти задачи'решаются различными метода- . ми. В нашей работе предпринята попытка повысить эффективность радиационного мутагенеза путем изменения радиочувстви тельяости ;. семян внутри одного сорта методом синхронизации клеток апекса стебля ячменд к наиболее чувствительной фазе синтеза ДНК и получения, высокорадою чувствительных семян методом формирования их при низкой положительной температуре. Экспершентально. доказано, что синхронизация клеток в апикальной меристеме стебля проростков приводит к повшиешш их радиочувствительности, при атом выход структурных и генных мутаций увеличивается. Важно, что в исследованном диапазоне доз. облучения увеличение дозы вызывает больший выход генных мутаций, нехели структурдах'.

В работах Коаэака в Найлона, Сиддыка и Сваминатана, Гаудя а Гичера я др. (¿Т.^Слчаи 1964;

Мл* . ,1968;, /Ти^т^^^гнп , ^¿Ым, 1972; и , др.) ^Эффективность мутагенов предложено выражать как. количество мутаций (£) на единицу дозы. Расчет этим методом, представленный в ,табл. 3, показал, что для доз 10 я 20 Гр синхронизация увеличила эффективность -мутагена в два раза, уменьшила или оставили на прежнем уровне эффективность мутагенеза.' Нужно отметить, что при этом общее количество мутантшх семей и чутантшх растений в каждой семье увеличилось в.два и.более раз. В нашей работе использован широко распространенный метод анализ а, количества семей'с мутациями от числа проанализированных семей ^ и количества ыутаятных растений от общего числа выживших расте-■ ний Пр» анализе этим методом видно, что синхронизация увеличивает общее количество семей о мутациями и расширяет спектр мутаций, увеличивает количество мутадтных растений', .тем.самым повышает эффективность радиационного мутагенеза в два-три раза,' Второй предложенный метод -формирование семян при низкой положительной температуре таюне повышает эффективность рещиаци-оалого мутагенеза: выход хлорофильних мутаций уваличивается в 23 раза по сравнении с формированием семян при температуре +ЗСРС, спектр мутаций в первом йлучае (+12°С) значительно мире.. Кроме того, выявлены редкие тквд мутаций.

Мы предполагаем, что полученное вами повышение радиочувствительности оемяя двумя методами - си нхронязацпей я формированием семян ni® пониженной температуре имеет общую основу: более лабильное состояние хроматина в клетках семян звродшмеЕ. Синхронизацию клеток апикальной меристемы стебля проростков мы проводили к фазе синтеза ДНК - фазе а увеличение лабильности хроматина в этой фазе подтверждается' работой О,В.Малиновского (О.В.МалдновскиЙ( 1966). Исследованиями В.Н.Савпяа, В.В.Артемьевой» Л.И,Никитиной я др. {В.Н.Савин, В.В.Артемьева, Л.И.Ннки-- тина я др,, 1983) было показано, что у семян, сформированных

ищ низкой положительной температуре (+12°С ), хроматин являет- ся менее кошактти я менее устойчивым к кислотному гидролизу и, вероятно, поэтому, как и в случае с синхронизацией клеточной популяции, более подвержен воздействию различных неблагоприятных факторов.

Выводы

1. Разработан метод синхронизации клеток апикальной меристемы проростков к фазе синтеза ДНК ячменя сорта Пиркка о помощь» 5АУ и последующего , выдеркйвания проростков при пониженной температуре +2-3^ в течение 24 часов,

2. Синхронизация клеток в апикальной меристеме стебле проростков ячменя повышает их радиочувствительность к гамма-облучению по следующим показателям: всхожести семня и выживаемости растений,' частоте хлорофильша: нарушений, частоте хромосомных аберраций, количеству растений о морфологическими изменениями, стерильности растений. Гамг^а-^обкучвяио проростков с предварительной синхронизацией повышает частоту и расширяет спектр хло-рофгльннх мутантов, усиливает изменчивость количественных признаков. ; . .

. 3. Экспериментально установлено, -что при выращивании растений при низкой температуре (+Ï2°C) форлир^тзтся семена с повышенной радиочувствительностью по сравнению о семенами, сформированными ,при высока') температуре+20°С,

4. Гемма-облучение семян, оформировенных при низкой, положительной температуре, приводит к увеличению выхода хромосомных я генных цуташШ. При этом значительно расширяется спектр xno-j родильных мутаций и повышается эффективность радиационного, мутагенеза.

5, Температурное условия Зюрмирования семян "приводят к /до-

дификахда яесшешфичес>со& устойчивости растений к иокиэируодей радиации а морозу..

Б. В результате применения метода синхронизации - -клеток апикальной меристемы стебля ячменя выделен радиомутапт сорта Пиркка,' отличающийся высокой продуктивности а скороспелостьи в сравнении со стандартом, Радиомутант передан в конкурсное сортоиспытание'и используется в селекции ярового ячменя в Северо-Западном НПО по селекции и растениеводству "Бедогорка*. .-

Основное содержание работы изложено в следужщнх^цуйвдшциш

1, Савин В,В., Артемьева В.В. Синхронизация клеточной популяции в апикальной меристеме стебля о помощью совместного действия 5-аминоурацила и пониженной температура/Цитология н. -генетика. 1973. Т.УП* Л 3. С.201-204.

2, Саган В.НЧ Архипов М.8., Артемьева В.В.. АОдуллаев В.'Т^ Кондрашова М,Д. Цитогенетцческое действие радиации на синтез ДНК и роль синхронизации со стеьа - клеточной популгйщи стеблевой 'меристема в радиочувствительности сешш//Радио<Зиология. 1974. '* 17. 0.114-115 (Ивформ.бюлл.).

3, Артемьева В.В. Исследования синхронизация клеточных циклов у ячменя с помощь!) 5-аминоурацнра и пониженных температур

• Билл.яаучяо-технач.инфор*.по агроном,фиэвка. Л. , /1974. ^ & 20. ' С.29-33.

■ ,' 4. Савин В.НЧ Артемьева В.В. Влияние синхронизации клеточ-

• ной популяции меристемы проростков ячменя на радиочувствительность'растений первою покйленвд//Редяобиология сельскохозяйственных растений,Л., 1976, й 40 СЛЭ9-206. (Сб.тр.по агроноЦгаике).

.5. Артемьева В.ВЧ Савин В.Н. Влияние синхронизации клеточной популящш на радиочувствительность и. мутагенез растенгй/Тези-сы докладов по садьскохозяйствеавой ра]шоби<мо1^.Бишинев.1976*-

6. Туликова Т.И., Баденжо А.Д^ Артемьева В.В., Архипов М.В. , ЦитофотометрическиЙ метод оценки радиационных изменений ДНК-фуксина в интерфазных ядрах корневой и стеблевой меристем ячменя на ранних этапах прорастания несинхронизированных в синхронизи-* рованных проростков/Аезисы УП Всесоюзного симпозиума по структуре и функциям .клеточного ядра. Харьков, 1980. С.92-93.

7. Савин В.Н., АртемБ^ва В.В., Архипов. Ы.В., Судаков В .Л.,, Коьанская Н.Е. ИспольэоЕаяие. светокультуры для формирования вы. соних урожайных качеств семян// Пройлемы культивирования растений в регулируемых условиях. Л.,. 19в4. С.65-77. (Сб.науч.тр.).'

- 2Z -

8. Савин B.H., Архивов М.В., Николевко ВЖ, Никитина Л.И., Артемьева В.В, Мблекуляряо-генегнчесзше основы продуктивных качеств семян, устойчивости растений и разработка биофизических методов- отборе//Физиолого-геаетические основы интенсификация селекционного процесса. Материалы Всесоюзной конференции. Саратов, 1984. С .38-39., . .. ' ; ■■ :

9. Савин В.Н., Артемьева В.В., Никитина Л.It., Соболева О.Юч Архипов М.В. Влияние температурных условий формирования семян на потенциальную продуктивность я устойчивость растений к не благоприятным, факторам сред«//Физиологические закономерности онтогенеза и продуктивности растений. Л., 1985. С.78-93. (Сб. науч. тр. по arpo ном, физике ).'

10. Савин В.Н;, Артемьева В.В.,Влияние синхронизация клеток апикальной меристемы проростков и температурных условий выращивания на радиочувствительность я мутабильность раотений// Радиационная генетика - селекции. Материалы I Всес.координационного совещания. М., 19Й6. С.81-83.

П. Савин В,Н., Артемьева В.В., Архипов М.В., Канаш Е.В^ Никол енко В.Ф., Никитина Л.И,, Кондрашова Ы.Д, Разработка биофизических методов определения фиэ иологического состояния растений, их потенциальной продуктивности я устойчивости к неблаго-приятшм факторам среди// Сб. тр. по arpo ном.физика. Л», I98S , (в печати). ..;.

Бесплатно

РТП. Тип, ВНР, Зак. 1346. Тир, 100. М-20072. 25,09.87.