Влияние регуляторного пептида семакса на H2O2-индуцированные повреждения клеточных мембран животных

Одгаева, Айса Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние регуляторного пептида семакса на H2O2-индуцированные повреждения клеточных мембран животных
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние регуляторного пептида семакса на H2O2-индуцированные повреждения клеточных мембран животных"

На правах рукописи

Одгаева Айса Владимировна

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРНОГО ПЕПТИДА СЕМАКСА НА Н202-ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ЖИВОТНЫХ

03.00.13 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Астрахань 2009

003462162

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Каменский Андрей Александрович

Научный консультант: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Туровецкий Валерий Борисович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Котелевцев Сергей Васильевич доктор биологических наук, доцент

Кондратенко Елена Игоревна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Защита состоится «(э» марта 2009 года в часов на заседании

диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, д.1, Инновационный Естественный институт.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Инновационного Естественного института Астраханского государственного университета.

Автореферат разослан « ^ » февраля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Ю.В. Нестеров

Введение

Актуальность проблемы. В настоящее время очевидна необходимость создания лекарственных препаратов, способных повышать эффективность умственного труда в сложных условиях, не обладающих негативными побочными воздействиями. В поисках таких средств исследователи обращаются к возможному использованию эндогенных регуляторов организма или соединений, являющихся близкими их аналогами. В первую очередь внимание специалистов привлекают к себе регуляторные пептиды, воздействующие практически на все физиологические функции организма (Ляпина Л.А., Пастророва В.Е., 2006).

Одним из перспективных направлений в этой области являются работы по созданию лекарственных средств на основе аналогов фрагмента адренокортикотропного гормона (АКТГ), в частности фрагмента 4-10 аминокислотной последовательности АКТГ(4^10). В современной клинической практике одним из самых известных клинически применяемых препаратов, созданных на основе фрагмента АКТГ в Институте молекулярной генетики РАН (Пономарева-Степная М.А. и др., 1984), является семакс. Семакс - первый российский ноотропный препарат из группы нейропептидов, имеющий ряд важных преимуществ перед известными аналогами: полное отсутствие токсических и побочных влияний, а также гормональной активности.

Имеющиеся в настоящее время в литературе данные (Сафарова Э.Р., 2003; Гривенников И.А., 2006; Сторожевых Т.В., 2007) указывают на то, что высокая фармакологическая эффективность регуляторного пептида семакса в значительной степени определяется его нейропротекторным действием, в частности, его способностью повышать устойчивость мембран клеток к действию повреждающих факторов. Среди последних существенную роль играют активные формы кислорода (АФК), повышение уровня которых сопровождает развитие целого ряда заболеваний, В число АФК входит и перекись водорода, которая в силу ряда особенностей претендует на ведущую роль в реализации их действия на клетки. Одной из важных мишеней повреждающего действия Н202 на клетку является ее плазматическая мембрана. При этом, как полагают (Гамалей И.А., 1997), Н202 индуцирует в клетке развитие процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводящих к /

нарушению целостности их плазматических мембран и, как следствие, повышению проницаемости, а в дальнейшем - клеточной гибели. Известно, что действие многих повреждающих агентов на клетки сопровождается изменением внутриклеточной концентрации ионов Н+ и свободного Са2+, что играет важную роль в формировании ответа клеток на эти воздействия и реализации их повреждающего эффекта (Литинская Л.Л. и др., 1987; Порядин Г.В., 1997). Таким образом, изучение роли рН и Са2+ в качестве модифицирующих агентов может привести нас к пониманию возможных механизмов защитного действия семакса.

В заключение следует подчеркнуть, что, несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы проблема механизмов реализации молекулярных и клеточных эффектов семакса еще далека от своего окончательного разрешения.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы было изучение влияния регуляторного пептида семакса на Н202- индуцированные повреждения мембран перитонеальных макрофагов и культивируемых нервных клеток. В задачи работы входило:

1.Изучение основных закономерностей повреждающего действия перекиси водорода на мембраны перитонеальных макрофагов мышей и культивируемых нервных клеток мозга крыс.

2.Изучение влияния семакса на Н202-индуцированное повреждение плазматических мембран иммунокомпетентных и нервных клеток.

3.Изучение влияния семакса на некоторые функционально-метаболические параметры клеток.

Научная новизна. Использован комплексный подход к изучению протекторного действия семакса при повреждающем действии Н202. Изучено влияние ионов водорода на защитный эффект семакса при окислительном стрессе (ОС). Выявлено влияние исследуемого регуляторного пептида на функционально-метаболическую активность фагоцитарных и нервных клеток.

Практическое значение. Исследование и внедрение в клиническую практику новых препаратов, созданных на основе регуляторных пептидов, является актуальной проблемой, обусловленной необходимостью лечения целого ряда заболеваний

человека. Использованный в работе комплексный подход к изучению защитного действия семакса при инициации клеточных повреждений может быть использован в медико-биологических, клинических и фармакологических исследованиях новых синтетических препаратов.

Апробация работы. Основные положения работы представлялись на 4-м Международном симпозиуме "4th International Workshop on Space Radiation Research and 17-th Annual NASA Space Radiation Health Investigators" (Москва - Санкт-Петербург, 2006); 20-й Международной конференции "Stress and Behavior" (Санкт-Петербург, 2007); 10-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007); 20-м Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова. (Москва, 2007); 13-й и 14-й Международной конференции «Ломоносов», (Москва, 2006; 2007); Конференции "Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга" (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 8 докладов в материалах российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками. Библиография содержит 203 названия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследований. Объектами исследований служили перитонеальные макрофаги беспородных белых мышей-самцов, а также клетки диссоциированных культур гиппокампа, септума и мозжечка головного мозга крыс. Культуры нервных клеток были любезно предоставлены сотрудником лаборатории «Структуры и функции митохондрий» НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ д.б.н. Исаевым Н.К., за что автор приносит ему искреннюю благодарность.

Для получения перитонеальных макрофагов мышей их забивали с помощью цервикальной дислокации, вводили в брюшную полость 2 мл раствора Хенкса, содержавшего 10 мМ HEPES (рН 7,2) и через несколько минут извлекали

перитонеальную жидкость, содержавшую макрофаги. Концентрацию полученной таким образом суспензии клеток доводили тем же раствором до величины 1,5х106 клеток в мл. Небольшие объемы суспензии (20 мкл) наносили на покровные стекла, инкубировали 45 мин во влажной камере для прикрепления клеток к субстрату, а затем промывали раствором Хенкса для удаления неприкрепившихся клеток (Туровецкий В.Б. и др., 1995).

Методы исследования

Определение внутриклеточного рН макрофагов проводили с использованием варианта микрофлуориметрического метода. Введение в клетки люминесцентного рН-индикатора флуоресцеина осуществляли путем их инкубации с флуоресцеиндиацетатом (ФДА) (5 мкг/мл) течение 15 мин. После отмывки от несвязавшегося красителя проводили регистрацию интенсивности флуоресценции (I) отдельных клеток в двух узких полосах спектра излучения флуоресцеина (с максимумами в области Х1=520 нм и Х2=570 нм). Для определения значения внутриклеточного рН пользовались калибровочной кривой, представляющей собой график зависимости коэффициента К, равного отношению I) к 12, от величины рН среды (Туровецкий В.Б., 1994).

Измерения проводили с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ ИЗ, оснащенного фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А с цифровым вольтметром Щ-4300. Возбуждение флуоресценции клеток осуществляли с использованием галогенной лампы накаливания КГМ9-70 и комбинации стеклянных светофильтров ФС1-4 и СЗС21-2.

Выявление клеток с поврежденной плазматической мембраной осуществляли с использованием одновременной окраски клеток флуорохромами ФДА (5мкг/мл) и бромистым этидием (ЭБ) (5мкг/мл) фапкЬе^ Р., Ре^яку М.Г)., 1976). В результате такой обработки уже через 15 мин инкубации клеток с флуорохромами в поле зрения люминесцентного микроскопа легко идентифицируются клетки с поврежденной и неповрежденной плазматической мембраной. Анализировали несколько полей зрения на каждом стекле (не менее 400 клеток) (Туровецкий В.Б. и др., 1995).

Оценку содержания активных форм кислорода в макрофагах проводили с использованием НСТ-теста, в основе которого лежит восстановление в цитоплазме

макрофагов красителя нитросииего тетразолия (HCT, 0,1%-ный раствор) до нерастворимого диформазана под влиянием супероксидного аниона, который образуется в больших концентрациях при активации клетки (Кондратьева И.А., Самуилов В.Д., 2001).

Оценку уровня клеточного метаболизма определяли с помощью МТТ-теста. Для оценки уровня МТТ-теста клетки инкубировали 30 мин с МТТ (0,5 мг/мл), лизировали ДМСО и определяли оптическую плотность при 1=570 им с помощью сканирующего ридера Microelisa autoreader MR 580 (Dynatech Product, Germany).

Экспериментальные клеточные модели

Окислительный стресс, индуцированный в клетках с помощью Н202.

ОС в перитонеальных макрофагах индуцировали при температуре 37°С в течение 15 мин с помощью Н202, введенной в необходимых концентрациях в забуференный HEPES (10 мМ) раствор Хенкса (pH 7,2). Далее покровные стекла помещали на 45 мин в раствор Хенкса без Н202. Семакс и его аналог, а также исследуемые агенты добавляли в соответствующих концентрациях к клеткам сразу после окончания их инкубации с Н202 и отмывки от нее.

ОС в культивируемых нервных клетках индуцировали в несколько иных условиях. В ходе экспериментов с культивируемыми клетками плейты с клетками содержались в С02-инкубаторе при температуре 37°С. Оценку влияния на клетки Н202 и семакса проводили с помощью МТТ-теста.

Ультрафиолетовое облучение клеток.

Объектом исследования служили перитонеальные макрофаги. В качестве источника ультрафиолетового облучения использовали лабораторный спектральный облучатель JIOC-2. Облучение клеток проводили в дозах 4, 5, 6 и 12 Дж/см2 при интенсивности света 10 мВт/см2 через светофильтр с максимумом пропускания при А.=306 нм в комбинации со стеклянным светофильтром УФС-5 (Пирутин С.К. и др., 2002). После окончания облучения клетки инкубировали дополнительно 15 и 60 мин как в отсутствие добавок, так и в присутствии семакса (100 мкг/мл) или его аналога (100 мкг/мл).

Статистическая обработка результатов экспериментов

Результаты, полученные не менее чем в 5 независимых экспериментах в каждой серии, обрабатывали с помощью программы 81а1зой Й1аиз1юа 6.0. Данные представлены в виде средних значений исследуемых параметров и их среднеквадратических ошибок. Достоверность различий между средними значениями определяли по критерию Стьюдента. Различия между средними значениями исследуемых параметров считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Повреждение плазматических мембран макрофагов при действии Н)СЬ

Клеточная мембрана является одной из чувствительных мишеней при действии

на клетку многих повреждающих факторов. Среди последних существенную роль играют АФК, повышение уровня которых сопровождает развитие целого ряда заболеваний (Капелько В.И., 2003). В число АФК входит и Н202, которая в силу ряда особенностей претендует на ведущую роль в реализации их действия на клетки.

Температура и время инкубации клеток с Н202в разных концентрациях

Данные, представленные на рисунке 1, показывают, что инкубация перитонеальных макрофагов с Н202 сопровождалась повышением относительного содержания в популяции клеток с поврежденной плазматической мембраной. Выраженность эффекта возрастала при повышении концентрации перекиси от 0,1 до 10 мМ. Эти результаты находятся в хорошем соответствии с литературными данными (Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., 1993; Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996) о том что, что при действии на клетки Н202 в концентрации 0,1-2,5 мМ происходит комплекс событий, приводящий, в конечном счете, к ее гибели.

Из рисунка 1 также видно, что существенное увеличение числа поврежденных клеток наблюдалось нами также при повышении температуры инкубации от 20° до 37°С, что, по-видимому, объясняется усилением ПОЛ с ростом температуры (Владимиров Ю.А., 2000). Анализ временной зависимости развития эффекта Н202 (1мМ) на макрофаги показывает, что возрастание времени воздействия приводило к постепенному повышению процентного содержания поврежденных клеток, достигавшего 90% к 60-ой мин инкубации. Существенно при этом отметить, что развитие повреждения продолжалось и после переноса клеток в среду без Н202. Так,

Рис. 1. Повреждение плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей при действии Н2О2. По оси абсцисс - концентрация Н2О2, мМ; по оси ординат - относительное содержание в популяции макрофагов клеток с поврежденной плазматической мембраной, %. Инкубацию клеток с Н202 проводили в течение 30 мин при температуре 20°С ® и 37°С (|). Здесь и далее: *-различия между средними значениями исследованного параметра считали достоверными при р <0,05.

после инкубации клеток с Н202 в течение 15 или 30 мин дополнительная их инкубация уже в отсутствие перекиси в течение 45 или 30 мин приводила к возрастанию содержания в популяции поврежденных клеток, примерно, в 4,5 и 1,7 раза, соответственно.

Все данные хорошо укладываются в рамки существующей на сегодняшний день теории, согласно которой ключевым моментом в процессе повреждения мембран во время ОС является ПОЛ мембран и, как следствие, нарушение целостности бислоя в результате формирования гидрофильных пор (Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К.. 1993; Гамалей И.А., Клюбин И.В.. 1996; Владимиров Ю.А., 2000).

Таким образом, полученные нами данные показали, что действие Н202 на перитонеальные макрофаги мышей in vitro сопровождается зависящим от температуры, времени инкубации и концентрации агента нарушением целостности их плазматических мембран.

Ионы Ca 2

Как видно из данных, представленных на рисунке 2, инкубация клеток в присутствии ионов Са2+ (2мМ) или Са+2-ионофора А23187 (0,5 нг/мл) в течение 60 мин приводила к небольшому повышению (около 20%) содержания в популяции макрофагов клеток с поврежденной мембраной. Добавление Са2+ или А23187 к клеткам, подвергнутым предварительному повреждающему воздействию Н202 также приводило лишь к небольшому дополнительному возрастанию повреждения клеток (на 20% и 10%, соответственно). Полученные данные указывают, по-видимому, на независимость механизмов повреждающего действия Н202 и вышеуказанных агентов.

Возможным объяснением увеличения степени повреждения клеток при 60 мин

инкубации клеток на фоне повышенной концентрации Са+2 может являться то, что

Рис.2. Влияние ионов Са+2 на способность семакса защищать макрофаги от повреждающего действия Н2О2. Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов через 45 мин после окислительного стресса, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н2О2 (1мМ). За 100% принята величина исследуемого параметра в отсутствие пептида (□, К). Семакс (10 мкг/мл), СаСЬ (2мМ) и А23187 (0,5 нг/мл) добавляли к клеткам сразу после их отмывки от Н2О2 либо по-отдельности (щ), либо в сочетаниях семакса с СаС12 или А23187 В ряде экспериментов инкубацию клеток с СаСЬ или А23187 осуществляли в течение 60 мин без предварительной инкубации с Н2О2 (0).

увеличение содержания ионов кальция внутри клетки вследствие их проникновения через мембрану из внеклеточной среды способствует снижению активности протеинкиназы С, фосфорилирующей многие белки, активации фосфолипаз и ферментов, инициирующие процессы ПОЛ (N¡011011$ Б.О., 2004). Кроме того, множество ферментов в клетке и в митохондриях являются кальций зависимыми. Аккумуляция ионов Са+2 в матриксе митохондрии приводит к падению их мембранного потенциала митохондрий (Майзоп М.Р. е! а!., 1993). Значительное падение мембранного потенциала приводит к реверсу АТФ-синтетазы и истощению запаса АТФ в клетках (Вгиз1оуе18ку N. й а1., 2000). Излишнее поступление ионов Са+2 в митохондрии приводит к образованию поры неспецифической проницаемости и набуханию, что стимулирует активность компонентов дыхательной цепи (ВеЬиБ А. е! а1., 2004), а это, в свою очередь, ведет к увеличению продукции АФК (Ва1апсИег С. й а1„ 2004; Вис1с1 Я.Ь. сЛ а1., 1996).

45-минутная инкубация клеток в присутствие кальциевого ионофора А23187 и СаС12 после ОС, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н202 (1мМ), приводит к незначительному увеличению содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов (рис.2). Можно предположить, что небольшое возрастание количества

поврежденных клеток в результате ОС на фоне повышенного содержания ионов Са2+ связано с тем. что Н202 -индуцированные процессы сами по себе инициируют ПОЛ, следствием которого является увеличение проницаемости мембран, в том числе и для ионов кальция. Добавление к среде инкубации СаС12 или А23187 после инкубации с Н202 уже не вызывает достоверных изменений величины повреждения.

Ионы Н*

Помимо того, что ионы Н+ играют важную роль в процессах внутриклеточной регуляции и реализации действия различных факторов (Литинская Л.Л., и др., 1987; Вша \V.B-, МисскеШ Я., 1984), изменение рН способствует также изменению физико-химических свойств мембран (Котык А., Яначек К., 1980; Пирутин С.К. и др., 2002). Дополнительным подтверждением этому служат и наши данные (рис.3), показывающие, что при изменении внеклеточного уровня рН и, как следствие -внутриклеточного. происходят выраженные изменения чувствительности перитонеальных макрофагов к повреждающему действию Н202. Было выявлено, что снижение рН инкубационной среды от величины 7,2 (в контроле) до величины 6,9 приводит к достоверному снижению повреждающего действия на макрофаги Н202 (около 20%). При этом повышение внеклеточного рН до величины 7,5 не сопровождается достоверным изменением Н202-индуцированного повреждения клеток. Следует отметить, что при снижении внеклеточного рН до 6,9 имело место постепенное уменьшение рН„ достигавшее к 25 мин инкубации величины около 0,3 ед. рН (рис.4). Подкисление внутриклеточного содержимого сопровождалось достоверным снижением повреждения, в то время как подщелачивание увеличивало его выраженность.

Рис.3. Влияние изменения внутри- и внеклеточного рН перитонеальных макрофагов на выраженность повреждающего действия на них Н202. Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов через 45 мин после ОС, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н202 (1мМ). За 100% принята величина исследуемого параметра в отсутствие агентов (I, К). Температура инкубации составляла 37°. Смену стандартной среды инкубации (рН 7,2) на среду с рН 6,9 (|) или 7,5 (|) осуществляли сразу после их отмывки от Н202.

Рис. 4. Влияние снижения рН среды инкубации на внутриклеточный рН макрофагов мышей

По оси абсцисс - время от момента смены стандартной среды инкубации (рН 7.2) на таковую с рН 6.9, мин; по оси ординат -изменение величины внутриклеточного рН макрофагов по сравнению с контролем (до смены среды) (ДрН|). Инкубацию клеток проводили при 22°С.

Судя по имеющимся в литературе данным (Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1993; РепйПа А., 1976), значительную роль в реализации этого явления может играть связанный со снижением рН переход структуры мембраны в состояние, более устойчивое к действию ПОЛ. Таким образом, внутриклеточный рН является важным фактором, несомненно, участвующим в реализации ответов клеток на действие различных агентов.

Лекарственный препарат мексидол

Добавление в среду инкубации клеток лекарственного препарата мексидола, приводит к снижению Н2С>2-индуцированного повреждения примерно на 10% (1 мкг/мл) и 40% (10 мкг/мл). Судя по полученным результатам, величина наблюдаемого эффекта зависит от концентрации препарата и достоверно отличается от контроля лишь при его концентрации не менее 10 мкг/мл.

Анализируя собственные данные и результаты других авторов (Дюмаев К.М. и др., 1995; Девяткина Т.А. и др., 1999), можно сделать предположение о том, что протекторное действие мексидола в условиях ОС может быть обусловлено его мембраностабилизирующим действием, являющимся результатом угнетения ПОЛ мембран, изменением их фосфолипидного состава и нормализацией функционирования мембраносвязанных ферментов.

Защитное действие семакса при Н^О^-индуцированном повреждении плазматических мембран клеток

Концентрация семакса

Представленные на рисунке 5 данные показывают, что семакс концентрационнозависимым образом способен снижать выраженность

■0.05 -0,1

-0.2

-0,25 ■0.3 -О.Э5

повреждающего действия Н202 на перитонеальные макрофаги мышей. Защитный

эффект пептида существенно возрастал при увеличении его концентрации от 0,1 до

10.0 мкг/мл, но уже не изменяется при переходе к концентрации 100 мкг/мл.

Существенно, что при использовании вместо семакса его аналога защитное действие

пептида практически исчезает. Это указывает на специфичность действия семакса.

возможно, обусловленную реализацией его действия через связывание с

соответствующим рецептором. Специфичность действия семакса была выявлена нами

и при изучении действия Н202 на клетки-зерна мозжечка крыс.

Рис.5. Влияние семакса и его аналога на выраженность повреждающего действия Н202 на перитонеальные макрофаги мышей. По оси абсцисс - концентрация семакса (|) и его аналога мкг/мл; по оси ординат -относительное содержание поврежденных клеток в популяции макрофагов через 45 мин после ОС, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н202 (1мМ). За 100% принята величина исследуемого параметра в отсутствие пептида (С,К). Пептид в соответствующих концентрациях добавляли к клеткам сразу после окончания их инкубации с Н202 и отмывки от нее.

Поскольку наличие рецептора к семаксу на мембране макрофага пока не доказано, модель нерецепторного взаимодействия с клеткой представляется нам также интересной. Возможно, что исследуемый гептапептид реализует свои протекторные свойства за счет изменения физико-химических свойств плазматической мембраны как это способны делать его аналоги, фрагменты АКТГ (Hershkowitz М. et al.. 1982; Verhallen P.F. et al., 1984; Van der Zee C.E. et al.. 1989: Roux M. et al., 1997). Известно, что аналогичным эффектом обладают и сдвиги pH. инициирующие трансформацию мембран за счет изменения физико-химического состояния липидов (Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1993). В этой связи мы можем сделать предположение о том, что защитный эффект семакса может реализоваться через снижение им внутриклеточного pH макрофагов, влияющее на конформацию плазматических мембран клеток, увеличивая при этом их устойчивость к процессам ПОЛ.

Иммуномодулирующий пептид тафцин

Как оказалось, регуляторный пептид тафцин, имеющий в отличие от семакса иммуномодулирующую направленность действия и соответствующие рецепторы на поверхности макрофагов (Lipton J.M., 1997; Getting S.J. et al., 1999) также обладал способностью защищать эти клетки от Н202 - индуцированного повреждения. При этом аналог пептида (2TO-LPA) не только не обладал подобным защитным действием, но даже вызывал возрастание числа поврежденных клеток в популяции. Принимая во внимание наличие специфических центров связывания тафцина на плазматических мембранах макрофагов мышей (Lipton J.M., 1997; Getting S.J. et al., 1999), можно предположить, что свои защитные свойства исследуемый имммуномодулятор реализует именно за счет связывания с собственными рецепторами.

Заслуживает внимание тот факт, что фрагмент Lys-Pro-Arg, трипептид, входящий в структуру тафцина, содержится также в таких высокоактивных нейропептицах, как субстанция Р, нейротензин, оказывающих разностороннее воздействие на регуляцию центральных функции (Gainer Ed.H., 1977). Гривенников и соавторы (1999) предполагают, что во взрослом организме тафцин способен выполнять функции нейротрофического фактора «общего» характера, например, при повреждении мозга и развитии компенсаторно-восстановительных процессов, так как иммуноглобулины G присутствуют не только в крови, но и в спинномозговой жидкости.

Полученные в данной работе результаты позволяют предполагать, что один из возможных механизмов протекторного действия тафцина в условиях ОС включает связывание с находящимися на поверхности перитонеальных макрофагов рецепторами.

Последовательность введения к клеткам Н202и семакса

Проведенные нами эксперименты показали что, 45-минутная инкубация

культивируемых клеток гиппокампа в растворе Хенкса после окончания 15-минутной

инкубации с Н202 (0,5 мМ) приводила к накоплению в культуре до 50%

поврежденных клеток. В аналогичных условиях в культуре клеток септума

накапливалось до 70% поврежденных клеток, указывая на большую чувствительность

последних к Н202 по сравнению с гиппокампальными культурами. Использование

Н202 в концентрации 1мМ приводило к повреждению до 90% клеток септума. Добавление еемакса (10 мкг/мл) к культурам гиппокампа и септума сразу после окончания инкубации с Н202 незначительно увеличивало жизнеспособность клеток.

Как оказалось однократное внесение семакса (10 мкг/мл) в среду

культивирования за 24 часа до ОС существенно снижало количество поврежденных

клеток, как в популяции культивированных клеток гиппокампа так и в популяции

культивированных клеток септума. Сопоставление данных представленных на рис. 6

Рис.6. Выраженность защитного действия семакса при различной последовательности введения пептида и Н202 к клеткам. Данные представлены в виде разницы между величиной МТТ-теста в клетках, подвергнутых действию Н202 в присутствии и отсутствии семакса (10 мкг/мл), (защитный эффект семакса, Д%). Семакс добавляли к культивируемым клеткам гиппокампа (Щ) и септума (|) либо на 45 мин после ОС, вызванного 15-минутной инкубацией с Н202, либо за 24 часа до ОС.

показывает, что защитное действие семакса от Н202-индуцированного повреждения мембран клеток гиппокампа и септума оказывается несколько более выраженным при его введении к клеткам за 24 часа до инициирования ОС. Можно предположить, что Н202-индуцированное повреждение клеток может быть опосредовано образованием N0, влекущее за собой усиление входа ионов Са+2 и последующую активацию NO-синтетаз, вызывающие деградацию клеток (Snyder et al., 1992). Взаимодействуя с супероксидом, NO образует пероксинитриты, разрушающие липиды клетки. В работе Шадриной М.И. (2001) показано, что семакс достоверно снижает уровень NO в коре мозга крысы при неполной глобальной ишемии. Данный факт может указывать на способность семакса влиять на ОС, опосредуемый NO.

Мы попытались также сопоставить выраженность защитного эффекта семакса от Н202-индуцированного повреждения на культивируемых клетках септума и гиппокампа. Как показали результаты, между ними не наблюдалось существенных различий в величине исследуемого параметра. При этом эффект защиты был достоверно более выражен (р<0.05) при предварительном (за 24 ч до ОС) введении пептида к культурам септума и гиппокампа (при введении Н202 0.5мМ 36 и 17,54%, соответственно).

Основываясь на данных Гривенникова И.А. и Долотова О.В. (2004) можно предположить, что наблюдавшийся нами защитный эффект семакса может быть обусловлен также увеличением уровня экспрессии таких нейротрофических факторов как NGF, BDNF имеющих выраженные нейропротекторные свойства. Возможно, что суточная инкубация семакса (10 мкг/мл) с культивируемыми клетками септума и гиппокампа способствует образованию более высокого уровня нейротрофинов, чем при 45 мин инкубации нервных культур с пептидом. Соответственно, защитный эффект при суточной инкубации с семаксом оказался более выраженным, чем при его 45 мин инкубации.

В работе Сторожевых Т.П. и соавторов (2007) было показано, что семакс увеличивает выживаемость культивируемых зернистых клеток мозжечка, замедляя при этом развитие кальциевой дизрегуляции и изменяя митохондриальный потенциал. Основываясь на приведенных данных, можно сделать еще одно предположение о нейропротекторном действии семакса. Вероятно, одно из возможных объяснений нейропротекторного действия семакса в может заключаться в способности гептапептида оказывать влияние на кальциевый гомеостаз и функциональное состояние митохондрий.

Ионы Сап

Внесение семакса после 15 мин инкубации с Н202 приводило к снижению уровня повреждения ~на 30% (рис.2). Несколько менее выраженное уменьшение повреждения наблюдалось при одновременном введении к клеткам А23187 и семакса (на 18%), тогда как не наблюдалось достоверного снижения повреждения при введении пептида в присутствии Са+2. Основываясь на этих данных, можно предположить, защитный эффект семакса от повреждающего действия Н202 может быть связан с переходом клеточной мембраны к более стабильному состоянию за счет снижения мембранного потенциала, в то время как ПОЛ способствует его росту (Пучкова Т.В. и др., 1983; Сторожевых Т.В., 2007). Снижение защитного эффекта семакса в присутствие Са2+ или ионофора А23187 может быть связано с нарушением механизмов, лежащих в основе формирования протекторного действия семакса, а именно с его способностью влиять на кальциевый гомеостаз, митохондриальный

потенциал клеток (Сторожевых Т.В., 2007) и на структуру плазматических мембран клеток.

Повреждение клеточных мембран, вызванное ультрафиолетовым

облучением

Данные, представленные на рис.7 (1) показывают, что через 15 мин после окончания УФ-облучения в популяции макрофагов наблюдалось дозозависимое возрастание относительного содержания клеток с поврежденной плазматической мембраной, достигавшего при 12 Дж/см2 величины 90%. Увеличение времени инкубации клеток после облучения в дозах 5 и 6 Дж/см2 от 15 до 60 мин приводило к значительному возрастанию (в 2-3 раза) числа поврежденных клеток (рис. 7, 2). Величина этого эффекта существенно снижалась при введении в среду инкубации клеток сразу после окончания облучения семакса в концентрации 100 мкг/мл (рис. 7, 3). В тоже время, его аналог в тех же условиях практически не снижал выраженности повреждающего действия (рис. 7, 4). Существенное возрастание числа поврежденных клеток в ходе 60-минутной инкубации макрофагов уже после окончания облучения в дозах 5 и 6 Дж/см2 обусловлено развитием в этих «темновых» условиях перекисных процессов, инициированных в период освещения. Отсутствие этого эффекта после облучения клеток в дозе 4 Дж/см2 связано, вероятно, с недостаточностью для развития процессов цепного перекисного окисления содержания липцдных перекисей и достаточно высокой активностью систем антиоксидантной защиты в макрофагах. Отсутствие развития повреждений после облучения клеток в дозе 12 Дж/см2 обусловлено тем, что в этих условиях уже через 15 мин после окончания облучения практически все клетки в препарате макрофагов оказываются поврежденными.

Отсутствие защитного эффекта семакса после облучения клеток в дозе 12 Дж/см2 позволяет предположить, что его протекторное действие в период после УФ-облучения в дозах 5 и 6 Дж/см2 связано со способностью пептида предотвращать развитие мембранных повреждений (но не восстанавливать уже поврежденные мембраны), наиболее вероятно, за счет снижения активности процессов ПОЛ. Не исключено также участие в этих событиях ферментных систем антиоксидантной защиты макрофагов, а также изменений в Са2+-обменных реакциях клеток-фагоцитов, обнаруженных при действии семакса (Асташкин Е.И. и др., 2000). Полученные нами

Рис. 7. Влияние регуляторного пептида семакса и его аналога на выраженность повреждающего действия УФ-излучения на перитонеальные макрофаги мышей. По оси абсцисс - дозы УФ-излучения (Дж/см2); по оси ординат - относительное содержание клеток с поврежденной плазматической мембраной (%). Подсчет числа поврежденных клеток в препаратах проводили через 15 мин после окончания их облучения (1), а также через 60 мин после окончания облучения как в отсутствие добавок (2), так и в присутствии семакса (3) или его аналога

Отданные показали также, что защитный эффект семакса был специфичен, поскольку он

не наблюдался при использовании в тех же условиях его аналога.

Реализация уф-излучения связана с процессами ПОЛ. Результаты наших экспериментов (рис.5, 7,) показали, что семакс способен влиять на развитие ПОЛ, снижая при этом количество поврежденных клеток в популяции. Основываясь на сведениях из литературных источников и собственных результатах, можно предположить, что протекторные эффекты семакса могут быть реализованы за счет нерецепторного взаимодействия с клеткой, а именно, за счет его способности напрямую влиять на химический состав мембран, изменяя при этом их физико-химические свойства.

Влияние семакса на некоторые функционально-метаболические параметры клеток.

Внутриклеточный рН

Как известно (Литинская Л.Л. и др., 1987; Вша \У.В., КиссКеШ Я., 1984) внутриклеточный рН играет существенную роль в регуляции клеточных функций и, следовательно, в формировании ответа клетки на действие биологически активных факторов внешней среды. При этом в литературе имеются указания на то, что увеличение концентрации ионов водорода может повышать устойчивость плазматических мембран к действию ряда повреждающих агентов (Пирутин С.К. и др., 2002). Важно отметить, что сдвиги рН инициируют трансформацию мембран за счет изменения физико-химического состояния липидов (Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1993). В этой связи мы рассмотрели предположение о том, что защитный эффект семакса может реализоваться через снижение им внутриклеточного рН

макрофагов. Действительно, инкубация перитонеальных макрофагов (рис.8) и нервных клеток с семаксом, в условиях, при которых наблюдается снижение им повреждающего действия Н202 на мембраны клеток, сопровождается снижением их внутриклеточного рН. Повышение устойчивости клеток к повреждающему действию ОС мы наблюдали также и при снижении рН в среде инкубации клеток, которое также приводило к снижению их внутриклеточного рН. При подщелачивании подобный эффект не наблюдался. Следует обратить внимание также и на отсутствие эффекта снижения рН, при инкубации обоих типов клеток с аналогом семакса, который не обладал также и защитным эффектом при Н202-индуцированном повреждении клеточных мембран. Это является дополнительным указанием на роль ионов Н+ в клеточных эффектах семакса.

Полученные нами данные позволяют предположить возможность участия ионов водорода в реализации защитного действия семакса на клетки. Кроме того, эффект снижения рН] при действии пептида является, по-видимому, общим для разных типов клеток (по крайней мере, для макрофагов, клеток септума и клеток-зерен мозжечка), а также специфичным, поскольку аналог пептида не вызывал внутриклеточного подкисления.

Как видно из данных представленных на рисунке 8, 20-минутная инкубация

перитонеальных макрофагов с семаксом приводит к подкислению их

внутриклеточного содержимого. При этом увеличение концентрации пептида от 0,1

Рис.8. Концентрационная зависимость влияния семакса и его аналога на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов мышей.

По оси абсцисс - концентрация семакса (Щ) и его аналога (Щ), мкг/мл; по оси ординат -изменение величины внутриклеточного рН макрофагов по сравнению с контролем (до введения пептида), ДрШ. Инкубацию клеток с агентом проводили при температуре 22 С в течение 20 мин.

до 100 мкг/мл приводит к существенному уменьшению рН^ Изменение рН; не наблюдалось при замене семакса на его аналог, что указывает на специфичность

наблюдаемого эффекта. Сходным образом действовали семакс и его аналог (10

мкг/мл) и на клетки септума и клетки-зерена мозжечка крыс (рис.9). 20-минутная

инкубация клеток с пептидом приводила к подкислению их внутриклеточного

содержимого. В то же время, аналог семакса либо не вызывал достоверных

изменений рН; (в случае клеток септума), либо даже увеличивал его (в случае клеток-

Рис.9. Влияние семакса и его неактивного аналога на внутриклеточный рН культивируемых клеток септума и клеток-зерен мозжечка.

Данные представлены в виде изменения величины внутриклеточного рН

культивируемых клеток-зерен мозжечка (П) и клеток септума (Щ) по сравнению с контролем (до введения пептида), (АрН^. Инкубацию с семаксом или его неактивным аналогом (10 мкг/мл) проводили при температуре 22°С в течение 20 мин.

зерен мозжечка) по сравнению с контролем. Базируясь на данных о наличии у семакса в концентрации 10 мкг/мл выраженной способности защищать макрофаги от повреждающего действия Н202, мы изучили временную зависимость изменения рН, перитонеальных макрофагов мышей при действии пептида в этой концентрации. Было выявлено, что уже через 5 мин инкубации клеток с пептидом наблюдается достаточно выраженное уменьшение величины внутриклеточного рН (на 0,13±0,01 ед.рН). Снижение рН, продолжается, достигая к 25-ой мин величины 0,18±0,01 ед.рН.

Таким образом, основываясь на вышеперечисленных фактах, мы можем сделать предположение, что протекторные свойства семакса могут реализовываться за счет снижения уровня внутриклеточного рН.

Образование в макрофагах активных форм кислорода

Полученные данные о влиянии семакса на образование активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах были сопоставлены с их реакцией на классический иммуномодулирующий регуляторный пептид тафцин, обладающим выраженным фагоцитстимулирующим действием. Было показано, что действие обоих пептидов приводит к возрастанию величины НСТ-теста, причем, ответ клеток на действие семакса оказывается несколько более выраженным. При этом эффективность совместного действия тафцина и семакса практически не отличается

от такового одного семакса, что, по-видимому, можно рассматривать как указание на то, что реализация наблюдаемого эффекта у обоих пептидов идет по сходному пути. Полученные результаты можно расценить как указание на повышение внутриклеточных метаболических процессов в клетках фагоцитах при действии исследованных регуляторных пептидов.

Дегидрогеназная активность митохондрий в клетке

В наших экспериментальных условиях МТТ-тест можно, по-видимому, рассматривать и как параметр, позволяющий оценить уровень дегидрогеназной активности клеток. Это связано с тем, что используемые в опытах культуры клеток септума и гиппокампа содержали очень небольшое количество глиальных клеток и находились в бессывороточной нейробазальной среде с добавкой В-27 в течение опытов, что исключало возможность индукции процессов пролиферации клеток. Известно также, что семакс не увеличивает пролиферацию нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы (Сафарова Э.Р. и др., 2003). В этом случае полученные результаты указывают на то, что действие семакса на клетки приводит к возрастанию их дегидрогеназной активности примерно в одинаковой степени для обоих типов клеток. Выявлено, что повышение дегидрогеназной активности при действии семакса оказывается более выраженным при его введении за 24 ч до ОС примерно на 18 и 36%, соответственно (рис.10).

Рис.10. Влияние семакса на уровень дегидрогеназной активности

культивируемых клеток гиппокампа и септума.

По оси абсцисс - время инкубации культивируемых клеток гиппокампа (и) и септума (щ) с семаксом (10 мкг/мл). По оси ординат - разница между величиной МТТ-теста в клетках, инкубировавшихся с семаксом и без него (Д%).

Судя по полученным нами результатам при 24 часовой инкубации обоих типов клеток с семаксом (10 мкг/мл) происходит достоверное возрастание дегидрогеназной активности клеток по сравнению с контролем, достоверно более выраженное для клеток септума. В то же время подобный эффект не наблюдался при 45 минутной инкубации клеток.

Полученные данные хорошо согласуются с результатами работы Долотова О.В., (2004), в которой семакс максимально увеличивал экспрессию нейротрофинов мРНК N0? и ВЭОТ в несколько раз через 40-60 мин в культивируемых клетках гиппокампа, базальных ядрах переднего мозга и в их глие. Увеличение на 40% по сравнению с контролем наблюдалось через сутки в гиппокампе. Возможно также, что семакс реализует свои протекторные свойства за счет влияния на кальциевый гомеостаз и митохондриальный потенциал (Сторожевых Т.В., 2007).

Анализ литературных данных, а также наши собственные результаты, позволяют с известной долей осторожности сделать вывод о том, что семакс может повышать энергетический уровень и функционально-метаболическую активность клеток, подвергнутых воздействию ОС.

Заключение

Полученные в данной работе результаты позволяют предполагать, что один из возможных механизмов реализации протекторного действия семакса может осуществляться за счет изменения физико-химических свойств плазматической мембраны через снижение им внутриклеточного рН перитонеальных макрофагов мышей, культивируемых клеток септума, гиппокампа, а также клеток-зерен мозжечка, влияющего на конформацию плазматических мембран клеток, увеличивая при этом их устойчивость к процессам ПОЛ. Кроме того, вероятно, что другое из возможных объяснений нейропротекторного действия семакса может заключаться в способности гептапептида оказывать влияние на кальциевый гомеостаз и функциональное состояние митохондрий. Наши собственные результаты, позволяют с известной долей осторожности сделать вывод о том, что семакс может повышать энергетический уровень и функционально-метаболическую активность клеток, а именно - увеличивать устойчивость митохондрий к окислительному и кальциевому стрессу.

В связи с этим мы считаем, что полученные в работе данные могут быть использованы для дальнейшего изучения протекторых свойств семакса.

Основные выводы:

1. Инкубация клеток с Н202 в концентрациях, превышающих 100 мкМ вызывает увеличение содержания в популяции макрофагов клеток с поврежденной плазматической мембраной.

2. Снижение рН инкубационной среды от величины 7,2 (в контроле) до величины 6,9 приводит к достоверному снижению выраженности повреждающего действия на макрофаги Н202

3. Семакс дозозависимым образом способен снижать выраженность повреждающего действия Н202 на перитонеальные макрофаги мышей и нервные клетки крыс (культивируемые клетки септума, гиппокампа и клеток-зерен мозжечка).

4. Семакс (в отличие от его аналога) способен защищать изолированные перитонеальные макрофаги мышей от развития повреждения в их плазматических мембанах в результате часовой инкубации клеток после УФ-облучения.

5. Инкубация семакса с перитонеальными макрофагами, культивируемыми клетками септума и клетками-зернами мозжечка крыс приводила к подкислению их внутриклеточного содержимого.

6. Семакс способен повышать уровень функционально-метаболической активности перитонеальных макрофагов и культивируемых нервных клеток.

Список публикаций:

1) Odgaeva A.V., Pirutin S.K., Turovetsky V.B., Kamensky A.A. Effect of semax peptide on survival of murine peritoneal macrophages during exposure to middle-wave ultraviolet radiation. // 4-th International Workshop on Space Radiation Research and 17-th Annual NASA Space Radiation Health Investigators' Workshop. Moscow - St. - Petersburg, 2006, P.90.

2) Odgaeva A.V., Pirutin S.K., Turovetsky V.B., Kamensky A.A. Effect of neuropeptide drug semax on intracellular pH of cultured cerebellar granule cells. // Workshop on 10-th Jubilee Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry "Stress and Behavior". St. Petersburg, Russia 2007, P.77-78.

3) Одгаева A.B. Повреждение плазматических мембран перитонеальных макрофагов при действии разных доз гептапептида семакс при окислительном стрессе. // Сб. тезисов X Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная и клиническая медицина». Санкт-Петербург, 2007, С.322

4) Одгаева A.B., Туровецкий В.Б., Каменский A.A. Влияние семакса на внутриклеточный pH перитонеальных макрофагов. II Сб. тезисов XX Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва, 2007, С.360.

5) Одгаева A.B., Туровецкий В.Б., Каменский A.A. Влияние тафцина на выживаемость перитонеальных макрофагов мышей при окислительном стрессе. // Сб. тезисов XX Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва, 2007, С.360.

6) Одгаева A.B. Влияние pH среды инкубации на внутриклеточный pH перитонеальных макрофагов мышей и их выживаемость при окислительном стрессе. // Сб. тезисов Международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2007». Москва, 2007, С. 188.

7) Одгаева A.B., Туровецкий В.Б., Каменский A.A. Повреждение плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей при действии Н2О2. // Вестник МГУ серия 16. биология. -2007, №4, С. 20-21.

8) Одгаева A.B. Влияние гептапептида семакс на выживаемость перитонеальных макрофагов мышей при окислительном стрессе. // Сб. тезисов Международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2006». Москва, 2006, С. 173.

9) Одгаева A.B., Исаев Н.К., Туровецкий В.Б., Каменский A.A. Нейропротекторное действие гептапептида семакс при НгОг-индуцированном повреждении клеток в культурах гиппокампа и септума крыс линии Вистар. // Сб. статей конференции "Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга". Москва, 2007, С. 458-462.

10) Пирутин С.К., Туровецкий В.Б., Одгаева A.B., Каменский A.A. Влияние пептида семакса на индуцированное уф-излучением повреждение плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей. // Вестник МГУ серия 16. биология. - 2007, №3, С. 3-7.

11) Одгаева A.B. Действие семакса и его аналога на культуру клеток-зерен мозжечка крыс линии Вистар при окислительном стрессе. // Сб. тезисов X Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная и клиническая медицина». Санкт-Петербург, 2007, С.324.

Подписано в печать «02» февраля 2009 г. Заказ №16. Тираж 100 экз. Отпечатано в цифровом печатном салоне «Профит» г. Элиста, ул.Республиканская, 39, тел. 4-03-62

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Одгаева, Айса Владимировна

1.ВВЕДЕНИЕ.

И.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Роль регуляторных пептидов в организме.

2.1.1. Общие сведения о регуляторных пептидах.

2.1.2. Регуляторный пептид семакс.

2.1.2.1. Физиологическое действие семакса.

2.1.2.2. Молекулярно-клеточные механизмы действия семакса.

2.2. Активные формы кислорода в организме.

2.2.1. Образование АФК в клетке.

2.2.2. Влияние АФК на структуру и функции клетки.

2.2.3. Антиоксидантная защита клетки.

2.3. Регуляция функциональной активности клетки.

2.3.1. Плазматическая мембрана клетки.

2.3.2. Вторичные мессенджеры.

2.4. Структура и функции перитонеальных макрофагов.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Объекты исследования и их выделение.

3.1.1. Перитонеальные макрофаги мышей.

3.1.2. Монослойные культуры мозжечка, септума и гиппокампа.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Микрофлуориметрический метод определения внутриклеточного

3.2.2.Микрофлуориметрический метод определения целостности плазматической мембраны клетки.

3.2.3. Оценка содержания активных форм кислорода в макрофагах.

3.2.4. Оценка уровня клеточного метаболизма.

3.2.5. Статистическая обработка результатов экспериментов.

3.3. Экспериментальные клеточные модели.

3.3.1. Окислительный стресс, индуцированный в клетках с помощью

Н202.

3.3.2. Ультрафиолетовое облучение клеток.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Повреждение плазматических мембран макрофагов при действии Н202.

4.1.1.Температура и время инкубации клеток с Н202 в разных концентрациях.

4.1.2. Ионы Са+2.

4.1.3. Ионы Н4".

4.1.4. Лекарственный препарат мексидол.

4.2. Защитное действие семакса при Н202-индуцированном повреждении плазматических мембран клеток.

4.2.1. Концентрация семакса.

4.2.2. Иммуномодулирующий пептид тафцин.

4.2.3. Последовательность введения к клеткам семакса и Н202.

4.2.4. Ионы Са+2.

4.2.5.Повреждение клеточных мембран, вызванное ультрафиолетовым облучением.

4.3. Влияние семакса на некоторые функционально-метаболические параметры клеток.

4.3.1. Внутриклеточный рН.

4.3.2. Образование в макрофагах активных форм кислорода.

4.3.3. Дегидрогеназная активность митохондрий в клетке.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние регуляторного пептида семакса на H2O2-индуцированные повреждения клеточных мембран животных"

Одним из перспективных направлений в этой области являются работы по созданию лекарственных средств на основе аналогов фрагмента адренокортикотропного гормона (АКТГ), в частности фрагмента 4-10 аминокислотной последовательности АКТГ(410). В современной клинической практике одним из самых известных клинически применяемых препаратов, созданных на основе фрагмента АКТГ в Институте молекулярной генетики РАН (Пономарева-Степная М.А. и др., 1984), является семакс. Семакс - первый российский ноотропный препарат неистощающего типа из группы нейропептидов, имеющий ряд важных преимуществ перед известными аналогами: полное отсутствие токсических и побочных влияний, а также гормональной активности.

С использованием ряда поведенческих моделей в доклинических исследованиях были получены данные об эффективности семакса как препарата, обладающего ноотропным и нейропротекторным действием (Ашмарин И.П., 1997; Сафарова Э.Р., 2003). Вместе с тем, механизм действия семакса на клеточном и молекулярном уровнях до конца не изучен.

Имеющиеся в настоящее время в литературе данные (Сафарова Э.Р., 2003; Гривенников И.А., 2006) указывают на то, что высокая фармакологическая эффективность регуляторного пептида семакса в значительной степени определяется его нейропротекторным действием, в частности, его способностью повышать устойчивость мембран клеток к действию повреждающих факторов. Среди последних существенную роль играют активные формы кислорода (АФК), повышение уровня которых сопровождает развитие целого ряда заболеваний. В число активных форм кислорода входит и перекись водорода, которая в силу ряда особенностей претендует на ведущую роль в реализации действия АФК на клетки. Одной из важных мишеней повреждающего действия Н202 на клетку является ее плазматическая мембрана. При этом, как полагают (Гамалей И.А., 1997), Н202 индуцирует в клетке развитие процессов перекисного окисления липидов, приводящих к нарушению целостности их плазматических мембран и, как следствие, повышению проницаемости, а в дальнейшем - клеточной гибели. Известно, что действие многих повреждающих агентов на клетки сопровождается изменением внутриклеточной концентрации ионов ьГ и свободного Са , что играет важную роль в формировании ответа клеток на эти воздействия и реализации их повреждающего эффекта (Литинская JI.JI. и др., 1987; Порядин Г.В., 1997). Таким образом, изучение роли рН и Са в качестве модифицирующих агентов может привести нас к пониманию возможных механизмов защитного действия семакса.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы было изучение влияния регуляторного пептида семакса на Н202-индуцированные повреждения мембран перитонеальных макрофагов и культивируемых нервных клеток. В задачи работы входило:

Изучение основных закономерностей повреждающего действия перекиси водорода на мембраны перитонеальных макрофагов мышей и культивируемых нервных клеток мозга крыс.

2. Изучение влияния семакса на Н202-индуцированное повреждение плазматических мембран иммунокомпетентных и нервных клеток.

3. Изучение влияния семакса на некоторые функционально-метаболические параметры клеток.

Актуальность, показано, что регуляторный пептид семакс может защищать плазматические мембраны клеток при с НгОг-индуцированном окислительном стрессе.

Научная новизна. Использован комплексный подход к изучению протекторного действия семакса при повреждающем действии Н202. Изучено влияние ионов водорода на защитный эффект семакса при окислительном стрессе. Выявлено влияние исследуемого регуляторного пептида на функционально-метаболическую активность фагоцитарных и нервных клеток.

П.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Одгаева, Айса Владимировна

VI. Основные выводы

2. Снижение рН инкубационной среды от величины 7,2 (в контроле) до величины 6,9 приводит к достоверному снижению выраженности повреждающего действия на макрофаги Н202.

4. Семакс (в отличие от его неактивного аналога) способен защищать изолированные перитонеальные макрофаги мышей от развития повреждения в их плазматических мембанах в результате часовой инкубации клеток после УФ-облучения.

6. Семакс способен повышать уровень функционально-метаболической активности перитонеальных макрофагов и культивированных нервных клеток.

VII. Список сокращений HEPES - М-2-гидроксиэтилпиперазин-М'-2-этанолсульфоновая кислота PBS- фосфатный буфер pHj - внутриклеточный рН

МТТ - 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил тетразолиум бромида

ДМСО-диметилсульфоксид (CH3)2SO

НСТ - нитросиний тетрозолий

ЭБ - этидиум бромид

ФДА - флуоресцеин диацетат

NO - оксид азота

NMDA - N-метил-О-аспартат

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АФК - активные формы кислорода

ПОЛ - перекисное окисление липидов

Са 2+ - ионы кальция

V. Заключение

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Одгаева, Айса Владимировна, Москва

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж., Молекулярная биология клетки. В 3-х т. 1994.

2. Аронов Д.М. Применение коэнзима Q10 в кардиологической практике. // РМЖ. 2004, Т 12, №15, С. 905 - 909.

3. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Грачев С.В., Мясоедов Н.Ф. // Докл АН. 2000, Т. 374, №3, С. 401-403.

4. Асташкин Е.И., Петров Е.А., Беспалова Ю.Б., Глезер М.Г., Гривенников И.А., Грачев С.В. // Докл АН. 2001, Т. 378, №1, С. 121-123.

5. Балан П.В., Маклакова А.С., Крушинская Я.В., Соколова Н.А., Кудашов Н.И. Отставленные эффекты острой гипобарической гипоксии в эксперименте: влияние гептапептида семакс (AKTr4-7-PGP) // Акушерство и генекология. 1999, № 1, С. 46-49.

6. Баранов B.C., Божова В.П. и др. Внешняя среда и развивающийся организм. М.: Наука. 1977. С.57

7. Божкова В.П. Роль клеточной поверхности в стимуляции размножения клеток. // Онтогенез. 1986, Т. 17, №5, С.453-469.

8. Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов. // Издательство Московского ун-та. 1985. 208 с.

9. Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Гамалей И.А., Каулин А.Б. Использование фотопротеина из гидроида Obelia longissima для измерения внутриклеточного Са в макрофагах. Перепринт № 137Б. Красноярск. 1990. 45 с.

10. Веренинов А.А., Марахова И.И. Транспорт ионов у клеток в культуре. Л.: Наука. 1986. 292 с.

11. Викторов И.В. Методика тотальной окраски монослойных культур ванадиевым гематоксилином. // Бюлл. Эксперим. Биол. Мед. 1990, Т. 109, №6, С. 612-613.

12. Викторов И.В., Шунгская В.Е. Методы культивирования. Руководство по культивированию нервной ткани. М.: Наука. 1988.

13. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. М.: Наука. 1972. 252 с.

14. Владимиров Ю.А, Потапенко А .Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Высшая школа. 1989. 199 с.

15. Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и незапрограммированная смерть клетки. // Соросовский образовательный журнал. 2000, Т. 6, №9, С. 2-9.

16. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах. // Соросовский образовательный журнал. 2000, Т. 6, №12, С. 13-19.

17. Воейков В.Л. Благотворная роль активных форм кислорода. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 2001, Т. 11, №4, С. 128-135.

18. Галкина С.И., Судьина Г.Ф., Марголис Л.Б. Влияние межклеточных взаимодействий на стимуляцию нейтрофилов и фибробластов. Роль внутриклеточного рН. // Биол. мембраны. 1993, Т. 10, №1, С. 20-29.

19. Галлеев Ф.С., Фахрутдинов P.P. Влияние общей анастезии и ее компонентов на перекисное окисление липидов in vitro и in vivo. // Анастезиол. и реаниматол. 1987, №4, С. 14-18.

20. Гамалей И.А., Клюбин И.В. Перекись водорода как сигнальная молекула. // Цитология. 1996, Т. 38, №12, С. 1233-1247.

21. Гривенников И.А. Молекулярно-генетические подходы к пептидной фармакотерапии нейродегенеративных заболеваний. Докт.дисс., М., 2006.

22. Гривенников И.А., Долотов О.В., Гольдина Ю.И. Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих. // Молекулярная биология. 1999, Т. 33, №1, С. 120-126.

23. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Мясоедов Н.Ф. и др. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 1997, №6, С. 26-34.

24. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Чуканова Е.И. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2005, № 2, С.35-40.

25. Девяткина Т.А., Луценко Р.В., Важничая Е.М., Смирнов Л.Д. Влияние мексидола и его структурных компонентов на содержание углеводов и перекисное окисление липидов при остром стрессе. // Вопросы медицинской химии. 1999, № 3, С. 12-15.

26. Долгих В.Т. Основы иммунопатологии. Нижний Новгород: НГМА. 1998. 202 с.

27. Долотов В.О., Середенина Т.С., Левицкая Н.Г., Каменский А.А. и др. // ДАН. 2003, Т. 391, №1, С. 131-134.

28. Долотов О.В. Механизмы действия пептида семакс на центральную нервную систему: роль нейротрофинов. Канд. дисс., М., 2004.

29. Долотов О.В., Золотарев Ю.А., Дорохова Л.А., Андреева JI.A., Алфеева Л.Ю., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф. // Биоорг.хим. 2004, Т. 30, №3, С. 241-246.

30. Донцов В.И. Иммунобиология постнатального развития. М.:Наука.1990

31. Дюмаев К.М., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. М., 1995.

32. Еремин К.О., Кудрин B.C., Андреева Л.А., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский К.С. Влияние семакса на содержание и обмен моноаминов в мозге мышей линии C57/BL // Нейрохимия. 2002, Т. 19, № 3, С. 202-205.

33. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Усп. совр.биол. 1993, Т. 113, №3, С. 286-296.

34. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация. Пущино, 2003.

35. Йегер Л. Клиническая иммунология и аллергология. В 3-х т. Пер. с нем. М.: Медицина. 1990.

36. Шевченко К. В., Нагаев И. Ю., Алфеева Л. Ю., Андреева Л. А., Каменский А. А., Левицкая Н. Г., Шевченко В.П., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф. // Биоорг. Химия. 2006, Т. 32, С. 64-70.

37. Капелько В.И. Активные формы кислорода, антиоксиданты и профилактика заболеваний сердца. // РМЖ. 2003, Т.11, № 21, С. 1185 -1188.

38. Каплан А .Я., Кошелев В.Б., Незавибатько В.Н., Ашмарин И.П. Повышение устойчивости организма к гипоксии с помощью нейропептидного лекарственного препарата семакс. // Физиология человека. 1992, Т. 18, №5, С. 104-107.

39. Коган А.Х. // Вестник РАМН. 1999, №2, С. 7.

40. Козлов Ю. П., Данилов В. С., Каган В. Е., Ситковский М. В. Свободнорадикальное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Изд-воМГУ. 1972. 118 с.

41. Кондратьева И.А., Самуилов В.Д.Практикум по иммунологии: Учеб. Пособие. М.: Изд-во МГУ. 2001. 224 с.

42. Конев С.В., Волотовский И.Д. Фотобиология: Учеб. Пособие для ВУЗов. Минск: Изд-во Белар. Ун-та. 1979. 383 с.

43. Кост Н.В., Соколов О.Ю., Габаева М.В., и др. // Биоорганич.хим. 2001, Т, 27, №3, С. 180-183.

44. Крутецкая 3. И., Лебедев О. Е., Пашина А. В. Роль протеинкиназы С в регуляции трансэпителиального транспорта Na+ в коже взрослых особей и головастиков лягушки Rana temporaria. // Цитология. 2003, Т. 45, №6, С. 590-595.

45. Кузник Б.И., Васильев Н.В., Цыбиков Н.Н. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма. М.: Медицина. 1989. 320 с.

46. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Антиоксиданты в комплексной терапии атеросклероза: pro et contra. // Кардиология. 2004, №2, С. 72 - 81.

47. Левицкая Н.Г., Каменский А.А. // Природа. 2003. (веб-журнал)

48. Лейкина М.И., Литинская Л.Л., Полякова И.А. // Вестник московского университета. 1996, Сер. 16, №1, С. 28-32.

49. Литинская Л.Л., Векслер A.M., Туровецкий В.Б. Пространственно-временная гетерогенность внутриклеточного рН как способ регуляции функционального состояния клетки. М., 1987. 29 е.- Деп. в ВИНИТИ 25.03.87, №2144-В87.

50. Лось Д. А. Восприятие сигналов биологическими мембранами: сенсорные белки и экспрессия генов. // Соросовский образовательный журнал. 2001, Т. 7, №9, С. 14-22.

51. Лось Д.А. Десатуразы жирных кислот: Адаптивная экспрессия и принципы регуляции. // Физиология растений. 1997, Т. 44, С. 528-540.

52. Лукьянова Л.Д., Атабаева Р.Е.,Шепелева С.Ю. // Бюл. экспер. биол. -1993, №115, С. 259-260.

53. Ляпина Л.А., Пастророва В.Е., Оберган Т.Ю. и др. // Изв. РАН. Сер. биол. -2006, №2, С. 193-203.

54. Маев И.В., Дышева Д.Т. // Эксп. клин, гастроэнтеролог. 2003, №2, С. 86-90.4.1

55. Максимов Ю.В. Механизмы перераспределения и транспорта Са при ритмическом возбуждении миелинового нерва. Докт.дисс., М., 1997.

56. Марголис Л.Б., Розовская И.А., Скулачев В.П. Нигерицин как фактор, снижающий внутриклеточный рН и подавляющий синтез ДНК в клетках асцитной карциномы Эрлиха. // Биол. мембраны. 1986, Т. 3, №11, С. 11481151.

57. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге Новосибирск, 1989.

58. Меликян Г. Б. Взаимодействие и слияние бислойных липидных мембран: Дисс. канд. биол. наук. М.: Инст. Пробл. Перед. Информ. АН СССР. 1983. 157с.

59. Мельниченко В.И. Антиоксиданты в ветеринарии: новые возможности. // Ветеринарная клиника. 2006, № 7, С. 22-26.

60. Мельничук Д.А. Метаболическая система кислотно-щелочного гомеостаза в организме человека и животных. // Укр. биохим. журн. 1989, Т. 65, №3, С. 3-21.

61. Мельничук Д.А. Механизмы образования и биологическое значение карбонатов белков. // Укр. биохим. журн. 1985, Т. 57, №3, С. 98-115.

62. Мельничук Д.А. О механизме изменений обмена веществ у человека и животных при нарушении кислотно-щелочного равновесия в организме. // Биохимия человека и животных. Киев: Наук. Думка. 1983, Вып.7, С. 17-23.

63. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К. Окислительный стресс при воспалении. // Успехи современной биологии. 1997, Т. 117, Вып.2, С. 155-171.

64. Мураневич И.М. Только ли через рецепторы осуществляется модулирующее действие нейропептидов. // Физ. журн. им. Сеченова. 1993, Т. 79, №4, С. 9-28.

65. Одгаева А.В., Туровецкий В.Б., Каменский А.А. Повреждение плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей при действии Н202. // Вестник МГУ. Серия 16. Биология. 2007, №4, С. 20-21.

66. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.В. // Успехи биол. химии. -1990, Т.31,С. 180-208.

67. Пеленицын А.Б., Рощупкин Д.И., Владимиров Ю.А. О механизме фотогемолиза эритроцитов. // Физико-химические основы функционирования надмолекулярных структур клеток. М.: Изд-во МГУ. -1974, 4.2, С. 59-61.

68. Петров Р.В., Атуллаханов Р.И. Клеточные мембраны и иммунитет. М.: Высш. Школа. 1991.144 с.

69. Пирутин С.К., Туровецкий В.Б., Кудряшов Ю.Б., Рубин А.Б. Модификация повреждающего действия ультрафиолетового излучения на мембраны перитонеальных макрофагов мышей. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2002, Т. 42, №2, С. 151-154.

70. Пирутин С.К., Туровецкий В.Б., Кудряшов Ю.Б., Рубин А.Б. Повреждение мембран макрофагов при действии средневолнового ультрафиолетового излучения. // Радиационная биология. Радиоэкология. -2002, Т. 42, №2, С. 147-150.

71. Платонов И.А., Яснецов В.В. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1996, Т. 122, №11, С.521-523.

72. Покровский В.И., Гордиенко С.П., Литвинова В.И. Иммунология инфекционного процесса. М., 1993. 306 с.

73. Пол У. Иммунология в 3-х т. Пер. с англ. М.: Мир.1987.

74. Пономарева-Степная М.А., Незавибатько В.Н., Антонова Л.В., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Потаман В.Н., Каменский А.А., Ашмарин И.П. // Хим.-фарм. журн. 1984, №7, С. 790-795.

75. Порядин Г. В. Молекулярные механизмы повреждения клеток. М.: РГМУ. 1997.

76. Потапова А.А., Казьмин А.И., Бодренко Л.А., Подвигин С.Н. // Кремлевская медицина. Клинический вестник. -2003, № 2. (веб-журнал)

77. Путвинский А. В., Попов С. А., Пучкова Т. В., Данилов Ю. А., Владимиров Ю. А. Электрический пробой мембран эритроцитов за счет диффузионной разности потенциалов. // Биофизика. 1983, Т. XXVIII, Вып. 3,С. 505-506.

78. Пучкова Т.В., Путвинский А.В., Владимиров Ю.А. Снижение электрической прочности как основной механизм нарушения барьерной функции мембран. // Докл. АН СССР. 1983, Т. 270, №6, С. 1489-1492.

79. Рощупкин Д.И., Аносов А.К., Мурина М.А., Лордкипанидзе А.Т. Фотопревращение мембранных липидов и его роль в изменении функций биомембраны под действием УФ-излучения. М.:Наука. 1988. 232 с.

80. Рощупкин Д.И., Мурина М.А. Фотобиологические процессы в биомембранах при действии ультрафиолетового излучения на клетки, ткани и органы животных. // Биофизика. 1993, Т. 38, Вып.6, С. 1053-1068.

81. Рыбальченко В.К. Окситоциновые каналы в биомолекулярной липидной мембране. // Сб. тезисов Всес. симп. "Физиология пептидов", Л, 1988, с. 169170.

82. Рыбальченко В.К., Островская Г.В. Взаимодействие окситоцина с плазматической мембраной гладкомышечной клетки и гепатоцита. // Сб. тезисов Всес. симп. "Физиология пептидов", Л, 1988, с. 171-172.

83. Сафарова Э.Р., Шрам С.И., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф. // Бюлл Эксп. Биол. и мед. -2003, Т. 135, №3, С. 309-313.

84. Свет-Молдавский Г.Я., Шхвацабая И.К, Зинзар С.Н. // Доклады АН СССР. 1974, Т. 218, №4, С.246.

85. Свирновский А.И., Зорин В.П. Зависимость от температуры изменения рН. // Тез. Докл. I БФС. М. 1982, Т.З, С.87.

86. Скворцова В.И., Стаховская Л.В., Ефремова Н.М., Платонова И.А., Шамалов Н.А. Применение препарата нейропептидной природы семакса в первые часы и дни острого церебрального инсульта. Методические рекомендации. Москва, 2003.

87. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло. // Соросовский образовательный журнал. 1996, №3, С. 4-10.

88. Струков А.И., Серова В.В., Саркисова Д.С. Общая патология человека. Рук. Для врачей. М.: Медицина. М.: Медицина, 1990. 448 с.

89. Тилекеева У.М., Воронина Т.А., Кузьмин В.И. и др. // Фармакол. и токсикол. 1987, №1, С. 74-77.

90. Туровецкий В.Б., Породина Н.Б., Ерин А.Н., Молнар Е.М., Сухих Г.Т. // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1995, №12, С. 626-630.

91. Умрюхин П.Е., Коплик Е.В., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Судаков К.В. // Журнал ВНД. 2001, Т. 51, №2, С. 220-227.

92. Форман Г.В. Физиология кислотно-щелочного состояния в норме и при патологии. М.: Медицина, 1986. 638 с.

93. Юб.Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988, 568 с.

94. Чейдо М.А. и др. // Экспер и клин фармакол. 1993. Т. 56. № 1. С. 51. 108.Чекнеев С.Б. // Вестник РАМН. 1999, №2, С. 10.

95. Чизмаджев Ю.А. // Соросовский образовательный журнал. 2000, Т. 6, № 3, С. 23-27.

96. Ю.Чиркова Т.В. Клеточные мембраны и устойчивость растений к стрессовым воздействиям. // Соросовский образовательный журнал. -1997, №9, С. 12-17.

97. Яснецов В.В., Правдивцев В.А., Крылова И.Н., Козлов С.Б., Проворнова Н.А. Влияние семакса и АКТГ(5-10) на импульсную активность центральных нейронов. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1998, Т. 125, №3, С. 304-306.

98. Alonso М., Vianna M.R., Izquierdo I., Medina J.H. Signaling mechanisms mediating BDNF modulation of memory formation in vivo in the hippocampus. // Cell Mol. Neurobiol. 2002, Dec; 22(5-6) P. 663-674.

99. Anisimov V.N., Mylnikov S.V., Khavinson V.Kh. // Mech. Ageing. Devel.-1998, V. 103, P. 123.

100. Arefyeva I.A., Alfeeva L.Yu., Ilyina G.S., Nezavibat'ko V.N., Myasoedov N.F., Grivennikov I.A. //Neurosci.Res.Commun. 1992, V.l 1, P.137-143.

101. Ashmarin I.P., Nezavibatko V.N., Levitskaya N.G., Koshelev V.B., Kamensky A. A. Design and investigation of an АСТЩ4-10) analogue lacking D-amino acids and hydrophobic radicals. // Neurosci. Res. Commun. 1995, V. 16, P. 105-112.

102. Azbel M.Ya. // Proc. Natl. Annu.N.Y. Acad.Sci. 1994, V.91, P. 1245312457.

103. Babior B.M. //Blood. 1999, V. 93, P. 1464-1476.

104. Bashkatova V.G., Koshelev V.B., Fadyukova O.E. et al. // Brain Res. 2001, V. 894, N1, P. 145-149.

105. Batandier C., Levere X., Fontain E. // The Journal of biological chemistry. -2004, №279, (17) P. 17197-17204.

106. Bellavite P. // Free Radic. Biol. Med. 1988, V.4, P. 225-261.

107. Belous A., Wakata A., Knox C.D., Nicoud I.B. // Journal of cellular biochemistry. 2004, № 92, P. 1062-1073.

108. Bhardwaj S.K., Sharma ML, Gulati G, Chhabra A, Kaushik R, Sharma P, Kaur G. // Mol Chem Neuropathol. 1998, Jun-Aug; 34(2-3) P. 157-68.

109. Bodenson J., Wijander J., Sundler R. Proton-induced membrane fision. Role of phospholipid compmisition and protein-mediated intermembrane contact. // Biochim. Biophys. Acta. 1984, V. 777, №1, P. 21-27.

110. Bokoch G., Reed P. //J. Biol. Chem. 1980, V. 255, P. 10233-10226.

111. Brewer G.J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. // J Neurosci Res. 1995, V. 42, P. 674-683.

112. Brustovetsky N., Dubinsky J.N. // Journal neurosci. 2000, №20 (1) P. 103143.

113. Budd S.L., Nicholls D.J. // Journal of neurochemistry. 1996, V. 67, N6, P. 2282-2291.

114. Busa W.B., Nuccitelli R. Metabolic regulation via intracellular pH. // Amer.J. Physiol. 1984, V. 246, №4, P.409-438.

115. Capuano P, Capasso G. The importance of intracellular pH in the regulation of cell function. // G. Ital. Nefrol. 2003, Mar-Apr; 20 (2) P. 139-150.

116. Chabrier P.E., Demerle-Pallardy C., Braquet P. Potential physiological and patho physiological roles of nitric oxide in the brain // Патол. физиология и эксперим. Терапия. 1992, №4, С.31-33.

117. Chen Q., Vazquez E.J., Moghaddast S. Production of reactive oxygen species by mitochondria. //The jornal of biological chemistry. 2003, V. 278, №38, P. 36027-36031.

118. Chesler M. Regulation and Modulation of pH in the Brain. // Physiol Rev -2003, V. 83, P. 1183-1221.

119. Condliffe A.M., Webb L.M., Ferguson G.J., Davidson K., Turner M., Vigorito E., Manifava M., Chilvers E.R., Stephens L.R., Hawkins P.T. RhoG regulates the neutrophil NADPH oxidase. // J Immunol. 2006, V. 176, P. 53145320.

120. Cutler R. //Annu. N.Y. Acad. Sci. 1991, V. 621, P. 1-28.

121. Dankberg F., Persidsky M.D. A test of granulocyte membrane integrity and phagocytic function. //Cryobiology. 1976, V. 13, P. 430-432.

122. Dawson T.M., Dawson V.L. Nitric oxide synthase: role as transmitter/ mediator in the brain and endocrice system. // Annu. Rev. Med. 1996, V. 47, P. 219-227.

123. Demaurex N., Monod A., Lew D.P. et al. // Biochem. Journal. 1994, V. 297, P. 595-601.

124. Ermak G., Davies K.J. Calcium and oxidative stress: from cell signaling to cell death. // Mol. Immunol. 2002, V. 38, P. 713-721.

125. Favaron M., Manev M., Rimland J. M., Candeo P., Beccaro M. and Manev H. NMDA-stimulated expression of BDNF mRNA in cultured cerebellar granule neurones. // NeuroRepot. 1993, V. 4, P. 1171-1174.

126. Florentin I., Bruley-Rosset M., Kiges W. et al. // Cancer Immunol Immunother. 1978, V.5, №3, P. 211-216.

127. Gaboury J.P., Anderson D.C., Kubes P. // Amer. J. Physiol. 1994, V. 266, P. 637-642.

128. Gainer Ed.H. Peptides in Neurobiology. New York, 1977

129. Geiszt T.M., et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000, V. 97, P. 8010-8014.

130. Getting S.J., Gibbs L., Clark A.J.L. et al. // J. Immunol. 1999, V. 162, P. 7446-7453.

131. Grinstein S., Cohen S., Goetz J.D., Rothstein A. // J. Cell. Biol. 1985, V. 101, №1, P. 269-176.

132. Grinstein S., Rotin D., Masen M.J. // Biochim. Biophys. Acta. 1989, V. 988, №1, P. 73-97.

133. Hallett MB, Davies EV, Campbell AK. Oxidase activation in individual1. О I•neutrophils is dependent on the onset and magnitude of the Ca signal. // Cell Calcium. 1990, V. 11, P. 655-663.

134. Harman D. // Proc. Natl. Annu.N.Y. Acad.Sci. 1991, V.88, P. 5360-5363.

135. Harman D. // Annu.N.Y. Acad.Sci. 1994, V.717, P. 1-15.

136. Hawrot E. Cultured sympathetic neurons: effects of cell-derived and synthetic substrata on survival and development. // Developm. Biol. 1980, V.77, P. 136151.

137. Hershkowitz M., Zwiers H., Gispen W.H. The effect of ACTH on rat brain synaptic plasma membrane lipid fluidity. // Biochim Biophys Acta. 1982, Nov 22, 692 (3) P. 495-497.

138. Hiriyama Т., Kato I. // FEBS Lett. 1983, V. 157, P. 46-50.

139. Ho Y.-S., Magnenat J.-L., Gargano M. etc. // Environ. Helth perspect. 1998, V.106, P. 1219-1228.

140. Holian A., Daniel R.P. Stimulation of oxygen consumption and superoxide anion production in pulmonary macrophages by N-formylmetionyl peptides. // FEBS lett. 1979, Y.108, P. 47-50.

141. Holian A., Stickle D.F. Calcium regulation of phosphatidyl inositol turnover in macrophages activation by formyl peptides. // J. Cell. Physiol. 1985, V. 123, P. 39-45.

142. Houle J.G., Wasserman W.J. Intracellular pH plays a role in regulating protein synthesis in xenopus oocytes. // Delelop. Biol. 1983, V.97, №2, P.302-312.

143. Jaffrey S.R., Snyder S.H. Nitric oxide: a neural messenger. // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1995, V.l 1, P. 417-440.

144. Kaplan A.Ya., Kochetova A.G., Nezavibatko V.N., Rjasina T.V., Ashmarin LP. Synthetic ACTH analogue semax displays nootropic-like activity in human // Neuroscience res. Comm. 1996, V. 19, N2, P. 115-123.

145. Kuroki M., Takeshige K., Minakanci S.// Biochim. Biophys. Acta. 1989, V.1082, P. 103-106.

146. Langsjoen P.H., Langsjoen A.M. Overview of the CoQIO in cardiovascular disease. // BioFactors. 1999, V.9, P. 273 - 284.

147. Lau S.H., Rivier J., Vale W. et al. Surface properties of amphiphilic peptide hormone and of its analog: corticotrophin-releasing factor and sauvagine. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, V. 80, N23, P. 7070-7074.

148. Lindsay RM. Neurotrophic growth factors and neurodegenerative diseases: therapeutic potential of the neurotrophins and ciliary neurotrophic factor. // Neurobiol Aging. 1994, Mar-Apr; 15(2) P. 249-251.

149. Linnik M.D., Zobrist R.H., Hatfield M.D. Evidence supporting a role for programmed cell death in focal cerebral ischemia in rats. // Stroke. 1993, Dec; V. 24, №12, P. 2002-2008.

150. Lipton J.M., Gatania A. // Immunol.Today. 1997, V.18, P. 140-144.

151. Liu Y., Fiscum G., Schubert D. Generation of generation of reactive oxygen species by mitochondrial electron transport chain. // Jomal of neurochemistry. -2002, V. 80, P. 780-787.

152. Mattson M.P., Zhang Y., Bose S. // Experimental neurology. 1993, №121, P. 1-13.

153. Minichiello L., Korte M., Wolfer D., Kuhn R., Unsicker K., Cestari V., Rossi-Arnaud C., Lipp H.P., Bonhoeffer Т., Klein R. Essential role for TrkB receptors in hippocampus-mediated learning. // Neuron. 1999, V.24, N2, P.401-414.

154. Morison W.L., Parrish J.A., Anderson R.R., Bloch K.J. Sensitivity mononuclear cells to UV radiation. // Photochem. Photobiol. 1979, V. 29, P. Ю45-1047.

155. Mossman T. // Journal of Immunological Metods. 1983, V.65, P. 55-63.

156. Muecke D. // Allergic und Immunol. 1984, V.30, №3, P. 127-138.

157. Najjar V.A. // Drugs Future. 1987, V.12, №2, P. 147-160.

158. Nicholls D.G. Mitochondrial dysfunction and glutamate excitotoxicity studied in primary neuronal cultures. // Current Molecular Medicine. 2004, V.4, P. 149-177.

159. Nichols J.W., Deamer D.W. Catecholamine uptake and concentration by liposomes maintaning pH gradients. // Biochim. Biophys. Acta. 1976, V.455, № 2, P. 296-271.

160. Nicotera P., Orrenius S. The role of calcium in apoptosis. // Cell calcium. -1998, Feb-Mar; V.23, (2-3) P. 173-180.

161. Nishioka K., Amoscato A.A., Babcoock Y.F. et al. // Cancer Invest. 1984, V.2, №1, P. 39-49.

162. Noh K.-M, Koh J.-Y. // Jornal of neuroscience. 2000, V.20, P. 1-5.

163. Nohl H., Gille 1., Staniek K.Intracellular generation of reactive oxygen species by mitochondria. // Biochemical pharmacology. -2005, V.69, P. 719-723.

164. Paroutis P., Touret N., Grinstein S. The pH of the Secretory Pathway: Measurement, Determinants, and Regulation. // Physiology. 2004, August Vol. 19, N4, P. 207-215.

165. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Levitskaya N.G., Nezavibatko V.N. N-terminal degradation of ACTH(4-10) and its synthetic analog semax by the rat blood enzymes. // BBRC. 1991, V. 176, N 2, P. 741-746.

166. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Nezavibatko V.N. Degradation of ACTH/MSH(4-10) and its synthetic analog Semax by rat serum enzymes: an inhibitor study. // Peptides. 1993, V.14, N.3, P. 491-495.

167. Putnam R. W., Filosa J.A., Ritucci N. A. Cellular mechanisms involved in CO2 and acid signaling in chemosensitive neurons. // Am J Physiol Cell Physiol. -2004, V. 287, P. 1493-1526.

168. Rogers N.T., Hobson E., Pickering S. et. al. Phospholipase Cz causes Ca21 oscillations and parthenogenetic activation of human oocytes. // Reproduction. -2004, V. 128, P. 697-702.

169. Romero F.J., Bosch-Morell F., Romero M.J. etc. // Environ. Helth perspect.-1998, V.106, P.1245-1253.

170. Rose C.R. at all. From modulator to mediator: rapid effects of BDNF on ion channels. // Bioessays. 2004, Nov; V. 26, №11, P. 1185-1194.

171. Roux M., Neumann J.-M., Toma F. ACTH binding to phospholipid bilayers: a H-NMR study of the 5-14, 1-14, and 1-24 derivatives. // Biopolimers. 1997, V.42, P. 731-744.

172. Sargent D.F., Bean J.W., Schwyzer R. Conformation and orientation of regulatory peptides on lipid membranes. Key to molecular mechanism of receptor selection. //Biophys. Chem. 1988, V.31, №1, P. 183-193.

173. Sargent D.F., Schwyzer R. Membrane lipid phase as catalyst for peptide -receptor interaction. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986, V. 83, N16, P. 57745778.

174. Scatton B. The NMDA receptor complex. // Fundam. Clin. Pharmacol. -1993, V.7, P.389-400.

175. Schwyzer R. Membrane-assisted molecular mechanism of neurokinin receptor subtype selection. // EMBO J. 1987, V. 6, №8, P. 2255-2259. 193.Shadrina M.I., Dolotov V.O., Grivennikov I.A. et al. // Neurosci. Lett. -2001, V. 308, №2, P. 115-118.

176. Singh P., Jain A., Kaur G. Impact of hypoglycemia and diabetes on CNS: correlation of mitochondrial oxidative stress with DNA damage. // Molecular and cellular biochemistry. 2004, V. 260, P. 153-154.

177. Snoeij N.J., Rooijen H.J., Penninks A.H., Seinen W. // Biochim. Biophys. Acta. Bioenergetics. 1986, V.852, №2, P. 244-253.

178. Snyder S.H. Nitric oxide: first in a new class of neurotransmitters. // Science. 1992, V.257, №5069, P.494-496.

179. Stachecki J.J., Armant D.R. Transient release of calcium from inositol 1,4,5trisphosphate-specific stores regulates mouse preimplantation development. //

180. Development. 1996, V. 122, P. 2485-2496.

181. Sundaresan M. et al. // Science. 1995, V. 149, P. 125-138.

182. Swietach P., Rossini A., Spitzer K.W., Vaughan-Jones R.D. H+ Ion

183. Activation and Inactivation of the Ventricular Gap Junction. A Basis for Spatial

184. Regulation of Intracellular pH. // Circ Res. 2007, Mar 15, №3, P. 112-115.

185. Ueno E., Tanigawa Т., Osaki M., Ito H. Apoptosis induced by ultraviolet В irradiation of leukemia cells and macrophages: Effects of anti-oxygen reagents and cell differentiation. // Oncology Reports. 1997, V.4, №5, P. 531-533.

186. Verhallen P.F., Demel R.A., Zwiers H., Gispen W.H. Adrenocorticotropic hormon (ACTH)-lipid interactions. // Biochim Biophys Acta. 1984, Aug 22; V.775, №2, P. 246-254.

187. Votyakova T.V., Reynolds J.J. ¥m-depend and -independent production of reactive oxygen species by rat brain mitochondria. // Jornal of neurochemistry. — 2001, V.79, P. 266-277.

Информация о работе

Одгаева, Айса Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Влияние регуляторного пептида семакса на H2O2-индуцированные повреждения клеточных мембран животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы