Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние пролонгированного стресса и экзогенных глюкокортикоидов на уровень тревожности и содержание молекулярных продуктов липопероксидации и карбонилированных белков в различных структурах головного

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние пролонгированного стресса и экзогенных глюкокортикоидов на уровень тревожности и содержание молекулярных продуктов липопероксидации и карбонилированных белков в различных структурах головного"

СТРЕЛЬНИКОВ Илья Владимирович

ВЛИЯНИЕ ПРОЛОНГИРОВАННОГО СТРЕССА И ЭКЗОГЕННЫХ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ НА УРОВЕНЬ ТРЕВОЖНОСТИ И СОДЕРЖАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРОДУКТОВ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ И КАРБОНИЛИРОВАННЫХ БЕЛКОВ В РАЗЛИЧНЫХ СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС 03.03.01 -физиология

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 г д с к 2013

Курган- 2013

005543718

005543718

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Южно-Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Цейликмян Ольга Борисовна

доктор медицинских наук Ценликмаи Вадим Эдуардович доктор биологических наук, профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Шаповалов Петр Яковлевич

доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской ' Федерации, заведующий кафедрой гигиены с основами экологии

Соловьев Владимир Сергеевич

профессор, доктор медицинских наук, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменский государственный университет», заведующая кафедрой физиологии и анатомии человека и животных

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Казань

Защита диссертации состоится «Д? г. в/^Гасов на заседании

диссертационного совета ДМ 208.079.01 прй" федеральном государственном бюджетном учреясдении «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.Л. Илизарова» Минздрава России (640005, г. Курган ул М. Ульяновой, 6)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНЦ «ВТО» им. академика Г А Илизарова по адресу. 640005 т Курган, ул. М? Ульяновой, 6. Автореферат разослан »¿С» 013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,/

доктор медицинских наук, профессор Солдатав Юрий Петрович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

Тревожность является признаком мобилизации защитных сил организма в угрожаемых ему условиях (Панин Л.Е., Усенко Г.А. «Тревожность, адаптация, донозологическая диспансеризация» Новосибирск, 2004г). Это наиболее отчетливо проявляется на ранних этапах стресса, которые были обозначены Н.8е1уе как «стадия тревоги». По мере утраты новизны со стороны стрессорного стресса постепенно происходит снижение тревожности до исходного уровня. Также возможна инверсия анксиогенных эффектов стресса в анксиолитические. Однако при интенсивном и продолжительном стрессорном воздействии повышенный уровень тревожности стабилизируется в течении длительного времени. Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о широкой

распространенности анксиогенных поведенческих расстройств. Нейрофизиологической основой устойчивого повышения тревожности является снижение пластичности нейронов. Безусловно, биохимические механизмы снижения пластичности нейронов связаны с изменением уровней медиаторов тревожности, среди которых в первую очередь можно отметить кортиколиберин. Однако изменения физико-химических свойств мембран нейронов, ионных каналов, также как и вступление их в апоптоз сопряжено с изменением процессов свободно-радикального окисления. В свою очередь стрессорные гормоны также как кортиколиберин и глюкокортикоиды вовлечены в регуляцию свободно-радикального окисления в ЦНС. Следует отметить, что вклад глюкокортикоидов в регуляцию свободно-радикального окисления может реализовываться за счет реализации поведенческих реакций затаивания, связанных с ограничением двигательной активности а значит потребления кислорода.

Для изучения механизмов стрессорной стабилизации симптомов тревожности целесообразно соотношение между уровнем тревожности и продолжительностью стресса. При этом стоит отдельно уделить внимание соотношению между продолжительностью стресса и нарушениями регуляции в оси гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников по механизму отрицательной обратной связи. Также целесообразно изучить соотношение между продолжительностью стресса и уровнем свободно-радикального окисления в различных структурах головного мозга. В качестве экспериментальной модели удобно использовать модель острого (продолжительность одни сутки) и пролонгированного (продолжительность трое суток гипокинетического стресса). Это связано с тем, что в первую декаду гипокинетического стресса отмечается устойчивое развитие поведенческих расстройств, сопровождающихся активацией гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы и свободно-радикального окисления.

Однако до сих пор не известно, в какой степени характерные для ранних этапов гипокинетического стресса поведенческие расстройства связаны с нарушениями гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, а также с изменениями свободно-радикального окисления в головном мозге. Также остается не известным как нарушения регуляции ГГАс по механизму отрицательной обратной связи отражаются на отдаленные последствия стресса и чувствительность к действию экзогенного глюкокортикоида?

Цель исследования: Для идентификации маркеров анксиогенного действия глюкокортикоидов среди показателей свободно-радикального окисления оценить уровень тревожности и соотношение между уровнем липопероксидации и карбонилирования белков в различных структурах головного мозга при введении экзогенного глюкокортикостероида в условиях пролонгирования острого гипокинетического стресса.

Задачи исследования.

1. Определить особенности изменений уровня тревожности, регуляции ГГАС по механизму отрицательной обратной связи, уровня свободно-радикального окисления в ЦНС при остром 1-дневном гипокинетическом стрессе.

2. Изучить влияние увеличения продолжительности гипокинетического стресса до трех дней на уровень тревожности, регуляции ГГАС по механизму отрицательной обратной связи и изменениями уровня свободно-радикального окисления в ЦНС

3. Сопоставить изменения уровня тревожности с изменениями уровня перекисного окисления липидов и содержания карбонилированных белков при введении экзогенного глюкокортикоида триамцинолона ацетонида.

4. Исследовать влияние продолжительности предварительного гипокинетического стресса на изменения уровня тревожности и свободно-радикального окисления в ЦНС при введении экзогенного глюкокортикоида триамцинолона ацетонида

5. Сопоставить изменения уровня тревожности с глюкокортикоид-зависимыми изменениями в иммунных органах при гипокинетическом стрессе и при введении экзогенного глюкокортикоида.

Положения, выносимые на защиту.

1. Нарушение регуляции функциональной активности гипоталамо-гипофизарно - адренокортикальной системы, вызванное гипокинетическим стрессом, сопровождается развитием анксиогенных расстройств, сопряжённых с изменением соотношения между липопероксидацией и карбонилированием белков в исследованных структурах головного мозга.

2. Анксиолитическое действие экзогенного глюкокортикоида и острого однодневного гипокинетического стресса, формируется на фоне снижения уровня ПОЛ в различных структурах головного мозга

3. Купирование анксиолитического действия экзогенного глюкокортикостероида, вызванное предварительным гипокинетическим стрессом, сопряжено с ограничением окислительной модификации белка в различных структурах головного мозга и повышением содержания изопропанол - растворимых продуктов ПОЛ в среднем, продолговатом мозге и мозжечке.

Новизна исследования.

Впервые установлено, что пролонгирование гипокинетического стресса до трех дней приводит к повышению тревожности, сопряженное со снижением содержания карбонилированных белков при одновременном повышении содержания молекулярных продуктов ПОЛ. Установлено, что пролонгирование гипокинетического стресса с 24 часов до трёх дней усугубляет нарушения регуляции ГГАС по механизму отрицательной обратной связи. Обнаружено, что через 120 часов после завершения односуточного гипокинетического стресса наблюдается инверсия первоначального анксиогенного эффекта в анксиолитический, что сопровождается снижением уровня окислительного стресса. Установлено, что пролонгирование гипокинетического стресса до трех суток купировало' развитие анксиолитической реакции через 120 часов после завершения воздействия. Установлено, что через 120 часов после завершения пролонгированного гипокинетического стресса в различных структурах головного мозга наблюдается повышение содержания изопропанол -растворимых продуктов ПОЛ.

Обнаружено, что при введении экзогенного глюкокортикоида пролонгированного действия, развивается анксиолитическая реакция, сопряженная со снижением уровня кортикостерона и уровня свободно-радикального окисления в структурах головного мозга. Показано, что анксиолитическое действие экзогенного глюкокортикоида купируется на фоне предварительного однодневного и трехдневного гипокинетического стресса. При этом, введение экзогенного глюкокортикоида как после однодневного, так и после трехдневного стресса сопровождалась однотипными изменениями свободно-радикального окисления в структурах головного мозга повышением содержания изопропанол растворимых продуктов ПОЛ при одновременном снижении содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ и уровня окислительной модификации белков.

Теоретическая и практическая значимость.

На основании полученных результатов установлена зависимость между продолжительностью гипокинетического стресса и ГКС - зависимыми изменениями процессов липопероксидации и карбонилирования белков в различных структурах головного мозга, а также поведенческих реакций, что позволяет детализировать современные представления о стрессорных механизмах развития поведенческих расстройств. Полученные результаты следует учитывать при использовании терапии, включающей в себя глюкокортикоидные препараты.

Внедрение результатов исследования.

Разработанная тема выполнялась в рамках комплексной темы НИР «Роль цитохром Р450- зависимых монооксигеназ и чувствительность их к глюкокортикоидам в регуляции аллостаза» (№ государственной регистрации 01201255868). Ее результаты вошли в отчеты по НИР.

Апробация работы и публикации результатов исследования.

Материалы диссертации были доложены на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения профессора Р.ИЛифшица (Челябинск, 2009); 10 съезде иммунологов Урала (Челябинск, 2011), на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск,2011), на VII Всероссийской Конференции с Международным Участием «Иммунологические чтения в Челябинске» (Челябинск, 2012).

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 5 - в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ (Омский научный вестник; Вестник Уральской медицинской академической науки; Российский иммунологический журнал, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Вестник Южно-Уральского государственного университета).

Личный вклад автора.

В диссертации представлены результаты исследований, выполненных лично автором на кафедре биохимии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, и медико-биологической подготовки государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский

государственный университет». Личный вклад автора в настоящую работу состоит в постановке целей и задач, проведении экспериментов, обработке, анализе и обобщении полученных результатов. Исследование выполнено в рамках реализации ГЗ на оказание услуг на 2012 и на плановый период 20132014 годов № 4.4022.2011 и медико-биологической подготовки государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный университет». Личный вклад автора в настоящую работу состоит в постановке целей и задач, проведении экспериментов, обработке, анализе и обобщении полученных результатов.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов.' Библиографический указатель включает 215 источников: 94 - на русском языке и 121 - иностранных. Работа содержит 18 таблиц, 14 рисунка.

Содержание работы Материалы и методы исследования.

Экспериментальный раздел работы выполнен на 117 беспородных лабораторных крысах обоего пола массой 240 - 280 г. Для моделирования изучаемых состояний применялась модель гипокинетического стресса, предусматривающая содержание животных в клетках-пеналах из органического стекла. Продолжительность воздействия составляла 24 часа (острый гипокинетический стресс) и 72 часа (пролононгирование воздействия до трех суток).

Для изучения регуляции функциональной активности ГГАС использовали дексаметазоновый тест, который проводился после завершения гипокинезии по схеме, учитывающей особенности циркадной ритмики ГГАС у лабораторных крыс (Рыбникова Е.А., Самойлов МО., Миронова В.И., и соавт. Журнал неврологии и психиатрии. - 2007. - №7). В качестве оценочного показателя функционирования механизмов обратной связи использовали изменения уровня кортикостерона в плазме крови до (исходный уровень) и через 6 часов после введения дексаметазона (KRKA, Словения; внутрибрюшинно в дозе 5 мкг / кг).

Поведенческие реакции животных изучались с использованием теста «приподнятый крестообразный лабиринт» (Beizung С., Griebel G. Behav. Brain. Res. - 2001.- 125(1-2)) и актографа «открытое поле», эти тесты

считаются одной из наиболее адекватных и чувствительных моделей для изучения тревожности у лабораторных грызунов (Rodgers R.J., Cole J.C. Physiol. Behav. -1993. - Oct;54(4)). В современной физиологии до сих пор отсутствует единый подход к определению уровня тревожности у животных. Это связано с тем, что использование различных подходов (тесты «открытое поле», «крестообразный приподнятый лабиринт» и тест Фогеля) дают расхождение результатов (Судаков С.К. и соавт.,2013). Недавно был предложен новый индекс, позволяющий определить уровень нейрогенной тревожности по совокупности показателей теста «крестообразный приподнятый лабиринт» (Cohen Н et al.,2012), учитывающий как время пребывания в открытых и закрытых рукавах, так и число заходов в них. Мы рассчитали величину индекса тревожности (ИТ) у интактных животных. При этом отмечены положительные корреляции между ИТ и временем пребывания в темных рукавах крестообразного лабиринта(Я8=0,97;р=0,028), а также между ИТ и количеством заходов в темные рукава крестообразного лабиринта (Rs=0,81;p=0,034). Следовательно, предложенный коэффициент представляется релевантным для интегральной оценки тревожности

Для оценки ГКС - зависимых изменений свободно-радикального окисления животным вводили глюкокортикостероидный препарат триамцинолона ацетонид (кеналог, Veb Berlin-Chemie, Германия, доза: 2 мг/кг, подкожно). Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых тканей (Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р.И. Вопросы медицинской химии. - 1989. - № 1). Определение содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов производилось методом Львовской Е.И. с соавт. (Львовская Е.И., Волчегорский И.А., Шемяков С.Е. и др. Вопр. мед. химии.-1991. - №37), Уровень спонтанной и металл - катализируемой окислительной модификации белков в исследуемых тканях оценивали по образованию динитрофенилгидразонов (Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А. и соавт. Вопр. мед. химии.- 1995.- №4). Гематологические следования выполнены совместно с Л.А.Стрельниковой.

Изучение периферической крови проводилось общепринятыми методами (Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., 1992) и заключалось в подсчете лейкоцитов в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу изучали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе (проводился подсчет не менее чем 200 клеток). Цитологический состав костного мозга и селезёнки определялся в мазках-отпечатках органов (проводился подсчёт не менее чем на 500 клеток). Мазки периферической крови, также как мазки-отпечатки костного мозга и селезёнки, перед окраской фиксировали метанолом.

Результаты обрабатывались общепринятыми методами дескриптивной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (т).Статистически значимые различия определяли с использованием критериев непараметрической статистики: Манна-Уитни (и).

1. Влияние острого однодневного гипокинетического стресса на уровень тревожности, регуляцию нейро-эндокринной оси гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников и свободно-радикальное окисление в структурах головного мозга.

В ходе исследования установлено, что непосредственно после завершения острого гипокинетического стресса у животных усиливалась тревожность, что проявлялось в сокращении времени пребывания в « светлых рукавах» крестообразного лабиринта и возрастанием величины индекса тревожности. Причиной стрессорного повышения уровня тревожности может быть нарушение регуляции «длинной петли» отрицательной обратной связи, что было установлено в дальнейших исследованиях при выполнении «дексаметазонового» теста.

Таблица 1

Влияние однодневной гипокинезии на поведенческую активность животных в «крестообразном лабиринте»

Показатель 1 Интактная группа (п=6) 2 Гипокинезия 1 сутки (п=9)

Количество заходов в светлые рукава 7,37±0,84 3,75±0,39

Количество заходов в темные рукава 8,75±1,43 10,83±3,47

Время в светлых рукавах 147,62±7,23 100,07±8,15

Время в темных рукавах 379,78±20,44 406,51±15,73

Количество свисаний 7,12±1,25 8,00±0,96

Индекс тревожности 0,81±0,078 0,91 ±0,021

Примечание: Здесь представлены данные, поведенческой активности непосредственно после завершения однодневного гипокинетического стресса

Следует отметить, что ГК1 характеризовался увеличением содержания кортикостерона крови. Прирост содержания кортикостерона на базальном уровне может быть связан с нарушением регуляции по механизму «длиной петли отрицательной обратной связи», которое проявляется в снижении чувствительности гипоталамических центров типа Р\Т< (паравентрикулярное ядро) к глюкокортикоид-зависимому торможению продукции кортиколиберина. Использование для оценки регуляции ГГАС дексаметазонового теста подтвердило это предположение.

Введение дексаметазона интактным животным привело к снижению уровня кортикостерона на 51% по сравнению с исходным уровнем, при ГК1 -только на 16%. Нарушение регуляции ГГАС сопровождалось изменениями в содержании ПОЛ и карбонилированных белков в различных структурах головного мозга. Так, в коре головного мозга, в гиппокампе и в гипоталамусе снижалось содержание карбонилированных белков при одновременном увеличении уровня гептан-растворимых диеновых конъюгатов.

Вох & РМ: груминг

контроль 1 сутки

□ Меап □ ±5Е Х±1.96'ЗЕ

Рисунок 2 Уровень груминга после завершения однодневной гипокинезии. Примечание: подсчет количества гигиенических актов самоочистки проводилось в манеже «открытое поле» в течение 5 минут.

Отдаленные последствия ГК1 на поведенческом уровне проявлялись в инверсии первоначального анксиогенного эффекта острого стресса в анксиолитический. Так, через 120 часов после завершения ГК1 наблюдалось снижение величины ИТ по сравнению с интактной группой. Анксиолитическое действие однодневной гипокинезии проявлялись в увеличении количества заходов в светлые рукава «крестообразного лабиринта». На этом фоне наблюдалось снижение содержания молекулярных продуктов ПОЛ и карбонилированных белков в коре головного мозга, среднем мозге и мозжечке. Кроме того в мозжечке снижалось содержание Fe+2/H202 индуцированного карбонилирования белков. В связи с этим уместно обратить внимание на отрицательную корреляционную зависимость между содержанием изо-пропанол растворимых Шиффовых оснований и временем пребывания в «светлых рукавах крестообразного лабиринта» (Rs=-0,89;p=0,04).

Полученные результаты можно обобщить следующим образом:

1. Острый однодневный гипокинетический стресс характеризуется увеличением индекса тревожности, ассоциированного со снижением количества заходов в светлые рукава крестообразного лабиринта. Наблюдаемая непосредственно после завершения однодневного гипокинетического стресса повышенная тревожность ассоциируется с усилением ПОЛ и снижением содержания карбонилированных белков в различных структурах головного мозга.

2. Отдаленные последствия гипокинетического стресса проявляются в инверсии анксиогенного эффекта стресса в анксиолитический. Сниженная тревожность ассоциирована со снижением содержания молекулярных продуктов ПОЛ в различных структурах головного мозга.

2. Влияние пролонгированного гипокинетического стресса на уровень тревожности, регуляцию иейро-эндокринной оси гнпоталамус-гипофиз-кора надпочечники и свободно-раднкальное окисление в структурах головного мозга.

Пролонгирование гипокинетического стресса до тех суток привело к усилению тревожности. Это проявлялось не только в снижении количества заходов в светлые рукава крестообразного лабиринта, но и в сокращении времени пребывания в них. Повышенный уровень тревожности здесь ассоциирован с увеличением уровня груминга. Одновременно наблюдалось нарушение регуляции по механизму длиной петли отрицательной обратной связи . При этом отмечается статистически значимое увеличение содержание кортикостерона в группе «ГКЗ+дексаметазон» по сравнению с группой

«ГК1+дексаметазон». При пролонгировании гипокинетического стресса в коре головного мозга, в гиппокампе и в гипоталамусе снижалось содержание карбонилированных белков. При этом в коре, гиппокампе, в гипоталамусе и в продолговатом мозге увеличивалось содержание гептан-растворимых кетодиенов и сопряженных триенов.

В отличие от группы животных с острым стрессом при пролонгировании гипокинетического стресса спустя 120 часов после завершения воздействия отсутствовала инверсия анксиогенных эффектов в анксиолитические. Коэффициент тревожности оставался повышенным, что сопровождалось снижением количества заходов в светлые рукава крестообразного лабиринта. При этом наблюдалось снижение количества выходов центр, что также может быть рассмотрено как проявление анксиогенного действия стресса. Одновременно наблюдалось увеличение количества фекальных болюсов, что свидетельствует об усилении вегетативной составляющей тревожности. Таким образом, по мере увеличения продолжительности гипокинетического стресса повышается уровень как нейрогенной так и вегетативной тревожности. При этом оставалось повышенным значение коэффициента тревожности.

В коре головного мозга, через 120 часов после завершения ГКЗ наблюдалось усиление ПОЛ. Это проявлялось в увеличении содержания гептан растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов по сравнению с контролем. При этом содержание карбонилированных белков не претерпело статистически значимых изменений. В гиппокампе через 120 часов после завершения ГКЗ отмечено снижение содержания карбонилированных белков, а также гептан-растворимых диеновых конъюгатов при одновременном повышении уровня изо-пропанол растворимых диеновых конъюгатов.

Через 120 часов после завершения ГКЗ в гипоталамусе наблюдалось снижение содержания карбонилированных белков . Заслуживает внимания характерная для группы ГКЗ отрицательная корреляция между содержанием базальных карбонилированных белков в гипоталамусе и временем пребывания в открытых рукавах крестообразного лабиринта (Яя=-0,89;Р=0,008). Для гипоталамуса характерно снижение содержания гептан-растворимых и повышение содержания изо-пропанол растворимых диеновых конъюгатов. В среднем мозге через 120 часов после завершения ГКЗ наблюдалось снижение содержания индуцированных карбонилированных белков. Кроме того, на фоне повышенного содержания изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов отмечено уменьшение содержания гептанофильных диеновых конъюгатов, а также кетодиенов и сопряжённых триенов.

Таблица 2

Содержание карбонилированных белков в различных структурах головного мозга при остром и пролонгированном гипокинетическом стрессе

Показатель 1 Интактные животные (п=6) 2 Гипокинезия 1 сутки (п=9) 3 Гипокинезия 3 суток (п=9)

Карбонилированные белки мкмоль/ г белка (гипоталамус) 3,99±0,67 1,83±0,37 P=0,033U 1,05±0,12 P=0,lIU

Карбонилированные белки (гиппокамп) мкмоль/ г белка 2,97±0,22 1, 43±0,25 Р=0,029U 0,84±0,07

Карбонилированные белки (средний мозг) мкмоль/ г белка 4,78±0,45 5,21±0,78 10,25±0,97

Карбонилированные белки (продолговатый мозг) мкмоль/ г белка 6,44±0,97 6,11 ±0,46 11,34±1,07

3. Влияние экзогенного глюкокортикоида триамцинолона ацетонида на уровень тревожности, и свободно-радикальное окисление в структурах головного мозга.

В предыдущих исследованиях отмечено, что поведенческие эффекты ТА имеют тревожно-депрессивную направленность и ассоциируются с усилением ПОЛ и снижением активности церебральной МАО-Б (Волчегорскй И.А. и соавт., 2003). Однако анксиогенный характер реакций в ответ на введение ТА воспроизводится не во всех исследованиях (Бояринова Н.В., 2010). В наших экспериментах мы столкнулись с одновременным снижением времени пребывания в светлых рукавах крестообразного лабиринта, что традиционно рассматривается как анксиогенный показатель, а также с увеличением времени пребывания в центре крестообразного лабиринта, что в свою очередь рассматривается как анксиолитический показатель. Кроме того при введении ТА нестрессированным животным увеличивается количество свисаний и число заходов в светлые рукава крестообразного лабиринта. Поэтому для оценки поведенческих эффектов ТА мы посчитали целесообразным исследовать не только абсолютные показатели теста «крестообразный лабиринт», но и рассчитанные на их основе относительные показатели. В итоге было установлено, что у животных получавших экзогенный глюкокортикоид пролонгированного действия снижалось значение ИТ. При этом отмечены отрицательные

корреляции между ИТ и количеством заходов в светлые рукава крестообразного лабиринта, времени нахождения в центре, времени нахождения в светлых рукавах, уровня груминга и уровня ориентировочной активности (количества стоек). ИТ положительно коррелировал только с такими показателями как времени нахождения в темных рукавах лабиринта (11з=0,934;р=0,025) и уровня анксиогенной дефекации(115=0,879;р=0,034). Также неоднозначны изменения свободно-радикального окисления в различных структурах головного мозга. Введение ТА нестрессированным животным не привело к статистически значимым изменениям показателей ПОЛ и окислительной деструкции белков в коре головного мозга. После введения экзогенного глюкокортикоида в гиппокампе наблюдалось снижение гептан-растворимых Шиффовых оснований. При этом отмечена положительная корреляция между ИТ и содержанием этой категории продуктов ПОЛ (1^=0,9;Р=0,037). В среднем мозге после введения ТА наблюдалось только снижение карбонилированных белков. При этом отмечена отрицательная корреляция между содержанием карбонилированных белков в среднем мозге и величиной ИТ (11з=-0,9;Р=0,037). По показателям липопероксидации в этой структуре головного мозга не обнаружено статистически значимых изменений с интактными животными. В этой экспериментальной группе обнаружена положительная корреляционная зависимость между уровнем Ре+2/Н202 - индуцированного карбонилирования и временем пребывания в светлых рукавах крестообразного лабиринта (1*5=0,9;Р:=0,037) и отрицательная зависимость с временем нахождения в «тёмных рукавах» (118=-0,9;Р=0,037).

Таблица 3

Поведенческая активность животных в «крестообразном лабиринте» через 120 часов после инъекции ТА

Показатель 1 Интактная группа (п=6) 2 ТА (п=9)

Количество заходов в светлые рукава 1,2±0,24 4,00±1,07 Р=0,025и

Количество заходов в темные рукава 2,0 Ш, 14 1,57±0,21

Время в светлых рукавах (сек) 140,8±20,4 160,32±18,7

Время в темных рукавах (сек) 421,8±15,2 351,32±10,4

Индекс тревожности 0,69±0,078 0,52±0,024 Р =0,025и

Примечание: Здесь представлены данные, поведенческой активности в крестообразном лабиринте в течение 600 сек.

Так как введение ТА приводит к дефициту эндогенных глюкокортикоидов и атрофии надпочечников в результате угнетения ГГАС. Поэтому имеются основания предполагать, что после введения ГГАС снижается продукция кортиколиберина. В свою очередь это создает благоприятные возможности для анксиолитических эффектов ГА.

Полученные результаты можно обобщить следующим образом:

1. Введение экзогенного глюкокортикоида анксиолитического действия характеризуется сниженным уровнем тревожности.

2. При введении экзогенного глюкокортикоида наблюдается снижение содержания молекулярных продуктов ПОЛ в различных структурах головного мозга.

4. Влияние острого гипокинетического стресса на

глюкокортикоид-зависимые изменения уровня тревожности и на свободно-радикальное окисление в структурах головного мозга.

На фоне гипокинетического стресса наблюдалось купирование анксиолитического действия ТА. Это проявлялось в отсутствии статистически значимых различий с интактными животными у всех показателей поведенческой активности в тесте «крестообразный лабиринт». Установлено, что в группе «ГК1+ТА» по сравнению с интактными животными снижено содержание карбонилированных белков в коре головного мозга. Там же отмечено снижение содержания изо-пропанол растворимых диеновых конъюгатов на фоне увеличения содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов. В продолговатом мозге снижение содержания карбонилированных белков сопровождалось повышением содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов. В мозжечке наблюдалось только снижение содержания карбонилированных белков, а содержание молекулярных продуктов ПОЛ не претерпело статистически значимых изменений. В среднем мозге на фоне снижения содержания карбонилированных белков наблюдалось повышение содержания изо-пропанол растворимых диеновых конъюгатов. Таким образом, данный режим гетеротипического стресса характеризовался специфичным изменением продуктов липопероксидации - в одних структурах их содержание повышалось, в других снижалось. Зато в отношении карбонилирования белков нигде не наблюдалось увеличение их содержания. Так, введение экзогенного глюкокортикоида на фоне острого гипокинетического стресса

сопровождалось снижением базального уровня карбонилированных белков в коре, гиппокампе и в продолговатом мозге, а также уровня Ре+2/Н202 индуцированного карбонилирования белков в мозжечке (сравнение между группами «ТА» и «ГК1+ТА»),

Если сравнивать между собой группы «ГК1+ТА» и «ТА» то прежде всего обращает на себя внимание возрастание коэффициента тревожности у животных получавших экзогенный глюкокортикоид на фоне гипокинетического стресса. При этом отмечено пятикратное снижение количества заходов в светлые рукава «крестообразного лабиринта» при дополнительном введении ТА после завершения ГК1.Также, наблюдалось достоверное снижение количества свисаний в группе «ГК1+ТА» по сравнению с группой «ТА». Но в то же время в группе «ГК1+ТА» по сравнению с группой «ТА» снижался уровень анксиогенной дефекации. Ограничение анксиолитического действия ГК1 и ТА в условиях гетеротипического стресса проявлялось в относительном снижении уровня карбонилрования белков в некоторых структурах головного мозга (сопоставление между группами «ГК1+ТА» и группы «ТА»), Дополнительное введение экзогенного глюкокортикоида после завершения ГК1 привело к повышению содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований в коре. Следует отметить наличие отрицательной корреляции между содержанием этой категории продуктов ПОЛ и временем пребывания в светлых рукавах крестообразного лабиринта (Яз=-0,9; Р=0,037) В гиппокампе в группе «ГК1+ТА» по сравнению с группой «ТА» также наблюдался повышенный уровень гептан-растворимых Шиффовых оснований. Отмечены отрицательные корреляционные зависимости между этой категорией продуктов ПОЛ и количеством выходов в центр 0,9;р=0,037).

Таким образом, полученные результаты можно обобщить следующим образом:

1.На фоне острого гипокинетического стресса купируется анксиолитическое действие экзогенного глюкокортикоида.

2. Купирование анксиолитического действия экзогенного глюкокортикоида ассоциируется с усилением ПОЛ в различных структурах головного мозга.

3. Для «ГК1+ТА» по сравнению с группой «ТА» характерно повышение уровня тревожности и увеличение содержания молекулярных продуктов ПОЛ в различных структурах головного мозга.

5. Влияние пролонгированного гипокинетического стресса на глюкокортикоид-зависимые изменения уровня тревожности и на свободно-радикальное окисление в структурах головного мозга.

Введение ТА на фоне пролонгированного стресса также сопровождалось отменой анксиолитического действия экзогенного глюкокортикоида. В группе «ГКЗ+ТА» по сравнению с интактной группой отсутствуют статистически значимые изменения показателей поведенческой активности в тесте «крестообразный лабиринт». Купирование анксиолитического действия экзогенного глюкокортикоида сопровождалось изменением соотношения между уровнем карбонилирования белков и перекисным окислением липидов в различных структурах головного мозга.

Так, этот вариант гетеротипического стресса также характеризовался снижением содержания карбонилированных белков в коре головного мозга по сравнению с интактной группой. Одновременно в коре повышался уровень гептан-растворимых диеновых конъюгатов. Помимо коры головного мозга также снижалось содержание карбонилированных белков в гиппокампе. Но в отличие от коры здесь еще и наблюдалось снижение содержания гептан - растворимых продуктов ПОЛ. В среднем мозге по сравнению с интактными животными не наблюдалось снижение содержания карбонилированных белков. Но при этом наблюдалось диспропорцорционирование в содержании молекулярных продуктов ПОЛ на фоне снижения содержания гептан-растворимых продуктов повысилось содержание изопропанол-растворимых продуктов ПОЛ. Подобные изменения могут быть связаны с глюкокортикоид-зависимым ингибированием активности фосфолипазы А2, обеспечивающей транслокацию ацильных радикалов из фосфолипидов клеточной мембраны в цитоплазму (Тепперман Дж, Тепперман Х.,1989).

В продолговатом мозге наблюдалось снижение содержания карбонилированных белков при одновременном повышении содержания молекулярных гептан-растворимых, а также изо-пропанол растворимых диеновых конъюгатов. Для мозжечка характерно снижение металл-индуцировного карбонилирования белков при одновременном приросте содержания изо-пропанол растворимых диеновых конъюгатов.

В гиппокампе у животных группы «ГКЗ+ТА» по сравнению с группой «ТА» наблюдалось статистически значимое снижение содержания карбонилированных белков. Кроме того отмечено снижение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов при одновременном увеличении содержания изопропанол-растворимых и гептан-растворимых Шиффовых оснований. В связи с этим необходимо отметить наличие положительной корреляции между содержанием изопропанол-растворимых Шиффовых

основании и временем пребывания в «тёмных рукавах» крестообразного лабиринта (1*5=0,81;Р=0,049), а также отрицательной корреляции между содержанием изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов и уровнем анксиогенной дефекации №=-0,94;Р=0,005). В гипоталамусе введение ТА после завершения ГКЗ сопровождалось снижением содержания карбонилированных белков в ответ на индукцию при одновременном увеличении содержания изопропанол-растворимых Шиффовых оснований При этом в группе «ГКЗ+ТА» отмечено наличие положительной корреляции между временем пребывания в тёмных рукавах крестообразного лабиринта и

(СЯ5=0!94;Р=0 037)"°"ПРОПаНОЛ РаСТВ°РИМЫХ ШиФФ°*ых оснований

У животных получавших экзогенный глюкокортикоид на фоне

пролонгированного стресса (группа «ГКЗ+ТА») отмечен более высокий

уровень индекса тревожности при одновременном снижении времени

пребывания в «светлых рукавах» крестообразного лабиринта по сравнению с

группой «ТА». Сопоставление групп «ТА» и «ГКЗ+ТА» показало что

введение экзогенного глюкокортикоида на фоне пролонгированного

гипокинетического стресса сопровождалось относительным снижением

уровня карбонилированных белков и изо-пропанол растворимых диеновых

конъюгатов при одновременном повышении содержания гептан -

растворимых диеновых конъюгатов в коре головного мозга. У животных

получавших экзогенный глюкокортикоид на фоне пролонгированного

стресса (группа «ГКЗ+ТА») отмечен более высокий уровень индекса

тревожности при одновременном снижении времени пребывания в «светлых

рукавах» крестообразного лабиринта по сравнению с группой «ТА»

Сопоставление групп «ТА» и «ГКЗ+ТА» показало, что введение экзогенного

глюкокортикоида на фоне пролонгированного гипокинетического стресса

сопровождалось относительным снижением уровня карбонилированных

оелков и изо-пропанол растворимых диеновых конъюгатов при

одновременном повышении содержания гептан -растворимых диеновых конъюгатов и к-ппр тгпоилт г

конъюгатов в коре головного мозга.

В группе «ГКЗ+ТА» анксиогенные изменения выражены в большей степени чем в группе «ГК1+ТА», что проявлялось в более высоком значении индекса тревожности и меньшим пребывании в «светлых рукавах» крестообразного лабиринта.

Таблица 4

Содержание продуктов липопероксидации в коре головного мозга при введении глнжокортикоидного препарата после завершения гипокинезии _

Показатель Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза) Диеновые конъюгаты (гептановая фаза)

1 Интактные животные (п=5) 0,329±0,008 0,469±0,024

2 ТА (п=6) 0,341±0,009 0,436±0,054

3 ГК1+ТА (п=6) 0,286±0,006 Р 4.5=0,004и 0,559±0,024

Примечание: Содержание продуктов ПОЛ выражено в условных единицах окисления (окислительный индекс), который рассчитывался как соотношение оптических плотностей липидных экстрактов Е232/Е220 для первичных продуктов (диеновые конъюгаты), Е278/Е220 для вторичных продуктов (КДиСТ), Е400Х2/Е220 для конечных продуктов (шиффовы основания). ТА - группа «триамцинолона ацетонид»., ГК1+ТА -введение ТА после гипокинетического стресса

Полученные результаты можно обобщить следующим образом:

1.На фоне пролонгирования гипокинетического стресса купируется анксиолитическое действие экзогенного глюкокортикоида.

2. Вызванное трехдневным гипокинетическим стрессом купирование анксиолитического действия экзогенного глюкокортикоида ассоциируется с усилением ПОЛ и снижением содержания карбонилированных белков в различных структурах головного мозга.

3. Для «ГКЗ+ТА» по сравнению с группами «ГК1+ТА» и «ТА» характерно повышение уровня тревожности и увеличение содержания молекулярных продуктов ПОЛ в различных структурах головного мозга.

б. Изменения в органах кроветворения и иммуногенеза ассоциированные с возрастанием тревожности в у™" ни гипокинетического стресса. уиювиях

Наблюдаемые изменения уровня тревожности на рассматриваемых этапах гипокинетического стресса ассоциируются с повышенным уровнем цитокинов (Сысаков Д.А.,2009). В частности однодневная и трехднев .ая гипокинезия сопряжены с повышенным уровнем 1Ь-1. Содержание провоспалительных цитокинов может быть повышено на фоне ТА-зависимой гипокортикостеронемии. Вместе с тем 1И может проникать в головной мозг и усиливать продукцию кортиколиберина в рамках имунно-нейро-эндокринных взаимодействий. Причем 1Ь-1 может сам по себе усиливать тревожность. Принимая во внимания функциональные взаимодействия между провоспалительными цитокинами и глюкокортикоидами мы сочли целесообразным изучить ассоциированные с повышенной тревожностью изменения клеточного состава и свободно-радикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза, так как это может быть отражением работы иммуно - неироэндокринной регуляционной метасистемы. Исследованные показатели липопероксидации и карбонилирования белков коррелируют с

ГмГпТоя ' ВаЖН° °™еТИТЬ' ЧТ° МСЖДУ ВеЛИЧИН0Й ИТ и количеством лимфоцитов в вилочковой железе обнаружена положительная

корреляционная зависимость (1*з=0,89;р=0.032). Также обнаружена

корреляционная зависимость между временем пребывания в темных рукавах

ЛабИрИНТа И К°ЛИЧеСТВа каРи^итов костного мозга (К5-0,93,р-0.034) и селезенки(Кз=-0,85;р=0.036). Эти корреляции представляют определенный интерес в связи с тем, что основный атрибутивным признаком действия этого экзогенного глюкокортикоида является гипоплазия органов иммуногенеза и кроветворения. Соответственно обнаруженные корреляции показателей тревожности с наиболее чувствительными маркерами гипоплазирующего действия ТА позволяют рассматривать показатели тревожности в качестве маркеров чувствительности к глюкокортикоидам на поведенческом уровне. С этими цитологическими показателями также коррелируют показатели свободно-радикального окисления в различных структурах головного мозга Так отмечены положительные корреляции между количеством кариоцитов костного мозга и количеством гептан-растворимых кетодиенов и сопряженных триенов (1^=0,93;р=0.034). Также положительные корреляции характерны для количества миелонуклеаров костного мозга и уровнем

ГзгеТ^^р^Г"08 В ГИПШЖаМПе ^=°,94;р=0.031)и в среднем

Соответственно те показатели свободно-радикального окисления в различных структурах головного мозга, которые в этой группе непосредственно коррелируют с уровнем кариоцитов тимуса, костного мозга и селезенки можно рассматривать в качестве биохимических маркеров чувствительности к глюкокортикоидам.

Скорее всего, увеличение тревожности непосредственно после завершения острого и пролонгированного гипокинетического стресса имеет кортиколиберин-зависимый характер. Причиной повышения уровня кортиколиберина может быть нарушение регуляции гипоталамо-гипофизарно - адреналовой системы по механизму длинной петли отрицательной обратной связи. Так, наши исследования показали, что при ГК1 и при ГКЗ повышается уровень кортикостерона в условиях «дексаметазонового теста». Аналогичные результаты получены при различных режимах повторных 1 часовых иммобилизаций (Цейликман В.Э. и соавт.,2013). Кроме того, причиной повышения уровня кортиколиберина может быть характерное для острого и пролонгированного гипокинетического стресса увеличение уровня 1Ь-1 (Сысаков Д.А.,2009). Как уже отмечалось, этот цитокин может непосредственно проникать через фенестрированные участки гемато-энцефалического барьера и усиливать продукцию гипоталамического кортиколиберина. Это приводит к дополнительному приросту содержания глюкокортикоидов. Поэтому, после завершения гипокинетического стресса в крови наблюдается одновременное увеличение концентрации глюкокортикоидов и провоспалительных цитокинов.

ВЫВОДЫ

1. Характерное для однодневного гипокинетического стресса повышение уровня тревожности, ассоциируется с нарушением регуляции в гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системе по механизму отрицательной обратной связи. При однодневном гипокинетическом стрессе повышение тревожности связано с повышением содержания молекулярных продуктов ПОЛ. Со снижением содержания молекулярных продуктов ПОЛ связана наблюдаемая через 120 часов после завершения однодневного гипокинетического стресса инверсия анксиогенных эффектов в анксиолитические.

2. Увеличение продолжительности гипокинетического стресса усугубляет проявления тревожности вследствие усугубления нарушений регуляции в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе по механизму отрицательной обратной связи и за счет усиления ПОЛ в различных структурах головного мозга. В результате устойчивого во времени повышения ПОЛ, через 120 часов после завершения гипокинетического

стресса купировалась инверсия анксиогенных эффектов стресса в анксиолитические.

3. Анксиолитическое действие экзогенного глюкокортикоида триамцинолона ацетонида связано со снижением уровня свободно-радикального окисления, проявлявшимся в одновременном снижении уровня ПОЛ и карбонилированных белков в различных структурах головного мозга.

4. Купирование анксиолитического действия экзогенного глюкокортикоида предаварительным гипокинетическим стрессом связано с увеличением содержания молекулярных продуктов ПОЛ в различных структурах головного мозга. Выраженность купирования анксиолитического действия глюкокортикоидов и усиления ПОЛ определяется продолжительностью гипокинетического стресса.

5. При гипокинетическом стрессе повышенная тревожность, также как и гипоплазия иммунных органов, имеет глюкокортикоид-зависимый характер. Рост тревожности и инволюция вилочковой железы и костного мозга ассоциированы с повышением содержания молекулярных продуктов ПОЛ в различных структурах головного мозга, а также в тимусе и в селезенке.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Стрельников, И.В. Влияние предварительной гипокинезии на глюкокортикоидзависимые изменения свободно-радикального окисления в среднем мозге и гийпокампе / И.В. Стрельников И Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии. Российская конференция, посвящённая 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. Челябинск - 2009 -С. 180-183

2. Козочкин, Д.А. Соотношение между липопероксидацней и окислением белков в крови и головном мозге в динамике тридцатисуточной гипокинезии / А.И.Синицкий, Д.А.Романов, Тимофеева Т.Г., Л.А. Стрельников И.В. Стрельникова Л.А., Филимонова Т.А., Цейликман В.Э. // Омский научный вестник. Серия. Ресурсы земли. Человек. 2011 №1(104).- С. 102 - 104.

3. Стрельникова, Л.А. Влияние однодневной гипокинезии на показатели дексаметазонового теста, уровень апоптоза, окислительного стресса и чувствительность вилочковой железы к гипоплазирующему действию глюкокортикоидов/ Л.А. Стрельникова, И.В. Стрельников, Н. Н., Курчатова, М. В. Осиков, Д. А. Козочкин, А. И. Синицкий, В. Э. Цейликман, О. Б. Цейликман // Российский иммунологический журнал.-2012.-т.6(14). - №3(1).-С.143-145

4. Стрельников И.В Влияние предварительной трехдневной гипокинезии на глюкокортикоид-зависимые показатели поведенческой активности и свободно-радикального окисления в различных структурах головного мозга /В.Э. Цейликман, Д.А.Козочкин, М.Е.Мишарнна, А.Л.Цытович, Л.Ф.Чарная, С.В.Попов// Вестник Уральской медицинской академической науки.-2012- №2 (39). - С. 112-113.

5. Цейликман В.Э. Влияние предварительного гипокинетического стресса на чувствительность костного мозга к гипоплазирующему действию экзогенного глюкокортикоида / М.В.Осиков,Л. А.Стрслышкова,Т. А.Филимонова,

И.В.Сгрельников,О.Б.Цейликман, Д.А Козочкин, А.И.Синицкий, Н.Е.Ианков, Н.А.Панкова /'/Бюллетень экспериментальной биологии и медицины .-2013 -Т.155, №5-С.547-551

6. Стрельников И.В. Влияние пролонгированного гипокинетического стресса на уровень тревожности и соотношение между липопероксидацней и карбонилированием белков в структурах мозга/ И.В. Стрельников, О.Б. Цейликман,В.Э.Цейликман,Е.Б. Манухина3, Ф. Дауни //Вестник Южно-Уральского государственного университета.- 2013- Т.13,№3- С.62-64.

Использованные сокращения

ПОЛ - перекисное окисление липидов ГК1 - односуточная гипокинезия ГКЗ - трех суточная гипокинезия И Г - индекс тревожности ТА - триамциналона ацитонид

ГГАС - гипоталамо-гипофизарно-адреналовоя система МАО-Б - моноаминоксидаза-Б ГКС - глюкокортикостероиды ЦНС - центральная нервная система

Подписано в печать 25.10.2013г. Тираж 100 экз. Заказ № 389. Отпечатано в типографии «Искра-Профи» 454080, г. Челябинск, ул. Сони Кривой, 42. Тел.: 230-57-70 '

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Стрельников, Илья Владимирович, Курган

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ЮЖНО-УРАЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

04201455873

СТРЕЛЬНИКОВ

Илья Владимирович

ВЛИЯНИЕ ПРОЛОНГИРОВАННОГО СТРЕССА И ЭКЗОГЕННЫХ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ НА УРОВЕНЬ ТРЕВОЖНОСТИ И СОДЕРЖАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРОДУКТОВ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ И КАРБОНИЛИРОВАННЫХ БЕЖОВ В РАЗЛИЧНЫХ СТРУКТУРАХ

ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС

03.03.01 -физиология

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Цейликман Ольга Борисовна

доктор биологических наук, профессор Цейликман Вадим Эдуардович

Челябинск - 2013

Содержание

Введение............................................................................................. 4

Глава 1.Механизмы развития тревожности и изменения свободно-радикального окисления при стрессовых воздействиях с ограниченной

двигательной активностью (обзор литературы)............................................... 12

Глава 2. Материалы и методы исследования............................................ 33

2.2. Общая характеристика экспериментальных моделей............................... 33

2.3.Методы анализа изучаемых явлений........................................................................................................................33

Нейроэтиологические методы....................................................................................................................................................................35

Разделение головного мозга на отделы........................................................................................................................................37

Биохимические методы............................................................................................................................................................................................37

Статистическая обработка результатов.........................................................................................................................40

Глава 3. Результаты исследования....................................................................................................................41

3.1. Влияние острого однодневного гипокинетического стресса на уровень тревожности, регуляцию нейроэндокринной оси гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников и уровень свободно-радикального окисления в структурах головного мозга........................................................................................................... 42

3.2. Влияние пролонгированного гипокинетического стресса на уровень тревожности, регуляцию нейроэндокринной оси гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников и уровень свободно-радикального окисления в структурах головного мозга........................................................................................................... 51

3.3. Влияние экзогенного глюкокортикоида триамцинолона ацетонида на уровень тревожности и уровень свободно-радикального окисления в

структурах головного мозга...................................................................................... 60

3.4 Влияние острого гипокинетического стресса на глюкокортикоид-зависимые изменения уровня тревожности и уровень свободно-радикального

окисления в структурах головного мозга................................................................. 64

З.ЗВлияние пролонгированного гипокинетического стресса на глюкокортикоид-зависимые изменения уровня тревожности и уровень

свободно-радикального окисления в структурах головного мозга........................ 73

3.6 Изменения в органах кроветворения и иммуногенеза ассоциированные с

возрастанием тревожности в условиях гипокинетического стресса................. 89

Обсуждение............................................................................................................ 94

Заключение..............................................................................................................................................................................108

Выводы..........................................................................................................................................................................................118

Список сокращений....................................................................................................................................................................................................120

Список литературы..............................................................................................................................................................121

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

В настоящее время стресс превратился в глобальную проблему современной цивилизации. С ним ассоциировано развитие психосоматической патологии, затрагивающей заболевания внутренних органов в результате нарушения психологического статуса. В свою очередь личностные расстройства в значительной степени связаны с устойчивой тревожностью. Тревожность является признаком мобилизации защитных сил организма в угрожаемых ему условиях (Панин Л.Е., Усенко Г.А. «Тревожность, адаптация, донозологическая диспансеризация» Новосибирск, 2004г). Это наиболее отчетливо проявляется на ранних этапах стресса, которые были обозначены Н.8е1уе как «стадия тревоги». По мере утраты новизны со стороны стрессорного раздражителя постепенно происходит снижение тревожности до исходного уровня. Также возможна инверсия анксиогенных эффектов стресса в анксиолитические. Однако при интенсивном и продолжительном стрессорном воздействии повышенный уровень тревожности стабилизируется в течение длительного времени. Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о широкой распространенности анксиогенных поведенческих расстройств. Нейрофизиологической основой устойчивого повышения тревожности является снижение пластичности нейронов. Безусловно, биохимические механизмами снижения пластичности нейронов связаны с изменением уровней медиаторов тревожности, среди которых в первую очередь можно отметить кортиколиберин. Однако изменения физико-химических свойств мембран нейронов, ионных каналов, также как и вступление их в апоптоз сопряжено с изменением процессов свободно-радикального окисления. В свою очередь стрессорные гормоны также как кортиколиберин и глюкокортикоиды вовлечены в регуляцию свободно-радикального окисления в ЦНС. Следует отметить, что вклад глюкокортикоидов в регуляцию

свободно-радикального окисления может реализовываться за счет реализации поведенческих реакций затаивания, связанных с ограничением двигательной активности, а значит потреблением кислорода.

Для изучения механизмов стрессорной стабилизации симптомов {ф тревожности целесообразно соотношение между уровнем тревожности и продолжительностью стресса. При этом стоит отдельно уделить внимание соотношению между продолжительностью стресса и нарушениями регуляции в оси гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников по механизму отрицательной обратной связи. Также целесообразно изучить соотношение между продолжительностью стресса и уровнем свободно-радикального окисления в различных структурах головного мозга. В качестве экспериментальной модели удобно использовать модель острого (продолжительность 1 сутки) и пролонгированного (продолжительность 3 суток гипокинетического стресса). Это связано с тем, что в первую декаду гипокинетического стресса отмечается устойчивое развитие поведенческих расстройств, сопровождающихся активацией гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы и свободно-радикального окисления. Однако до сих пор не известно, в какой степени характерные для ранних этапов гипокинетического стресса поведенческие расстройства связаны с нарушениями гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, а также с изменениями свободно-радикального окисления в головном мозге. Также остается не известным как нарушения регуляции ГГАс по механизму отрицательной обратной связи отражаются на отдаленные последствия стресса и чувствительность к действию экзогенного глюкокортикоида.

»

Цель исследования: Для идентификации маркеров анксиогенного действия глюкокортикоидов среди показателей свободно-радикального окисления оценить уровень тревожности и соотношение между уровнем липопероксидации и карбонилированием белков в различных структурах

головного мозга при введении экзогенного глюкокортикостероида в условиях пролонгирования острого гипокинетического стресса.

Задачи исследования

1. Сопоставить изменения уровня тревожности с особенностями регуляции ГТАС по механизму отрицательной обратной связи и изменениями уровня перекисного окисления липидов и содержания карбонилированных белков в ЦНС при остром 1-суточном гипокинетическом стрессе.

2. Сопоставить изменения уровня тревожности с особенностями регуляции ГГАС по механизму отрицательной обратной связи и изменениями уровня перекисного окисления липидов и содержания карбонилированных белков в ЦНС при пролонгированном до 3 суток гипокинетическом стрессе.

3. Сопоставить изменения уровня тревожности с изменениями уровня перекисного окисления липидов и содержания карбонилированных белков при введении экзогенного глюкокортикоида триамцинолона ацетонида.

4. Сопоставить изменения уровня тревожности с изменениями уровня перекисного окисления липидов и содержания карбонилированных белков в ЦНС при введении экзогенного глюкокортикоида триамцинолона ацетонида на фоне предшествующего однодневного гипокинетического стресса.

5. Сопоставить изменения уровня тревожности с изменениями уровня перекисного окисления липидов и содержания карбонилированных белков в ЦНС при введении экзогенного глюкокортикоида триамцинолона ацетонида на фоне предшествующего пролонгированного до трех дней гипокинетического стресса.

Методология и методы исследования

Экспериментальный раздел работы выполнен на 117 беспородных лабораторных крысах обоего пола массой 240 — 280 г. Для моделирования изучаемых состояний применялась модель гипокинетического стресса, предусматривающая содержание животных в клетках-пеналах из органического стекла. Продолжительность воздействия составляла 24 часа (острый гипокинетический стресс) и 72 часа (пролононгирование воздействия до трех суток).

Для изучения регуляции функциональной активности ГГАС использовали дексаметазоновый тест, который проводился после завершения гипокинезии по схеме, учитывающей особенности циркадной ритмики ГГАС у лабораторных крыс (Рыбникова Е.А., Самойлов М.О., Миронова В.И., и соавт. Журнал неврологии и психиатрии. - 2007. - №7). В качестве оценочного показателя функционирования механизмов обратной связи использовали изменения уровня кортикостерона в плазме крови до (исходный уровень) и через 6 часов после введения дексаметазона (KRKA, Словения; внутрибрюшинно в дозе 5 мкг / кг).

Поведенческие реакции животных изучались с использованием теста «приподнятый крестообразный лабиринт» (BelzungC., GriebelG., 2001) и актографа «открытое поле», эти тесты считаются одной из наиболее адекватных и чувствительных моделей для изучения тревожности у лабораторных грызунов (RodgersRJ., ColeJ.C. ,1993).

Для оценки ГКС - зависимых изменений свободно-радикального окисления животным вводили глюкокортикостероидный препарат триамцинолона ацетонид (кеналог, Veb Berlin-Chemie, Германия, доза: 2 мг/кг, подкожно).

Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых

тканей (Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р.И. Вопросы медицинской химии. - 1989. - № 1). Определение содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов производилось методом Львовской Е.И. с соавт. (Львовская Е.И., Волчегорский И.А., % Шемяков С.Е. и др. Вопр. мед. химии.-1991. - №37), Уровень спонтанной и металл - катализируемой окислительной модификации белков в исследуемых тканях оценивали по образованию динитрофенилгидразонов (Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А. и соавт. Вопр. мед. химии.- 1995.- №4). Результаты обрабатывались общепринятыми методами дескриптивной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (ш). Статистически значимые различия определяли с использованием критериев непараметрической статистики: Манна-Уитни (U).

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

¿¿Ь Степень достоверности полученных результатов диссертации

подтверждается их теоретическим анализом, личным участием автора во всех экспериментах, проведенных с помощью современных методик, сертифицированного оборудования и реактивов; актами внедрения результатов работы в учебный процесс и проверки первичной документации; статистической обработкой полученных данных и публикацией материалов диссертации в статьях, докладах на научных конференциях. Материалы диссертации были доложены на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения профессора Р.И.Лифшица (Челябинск, 2009); 10 съезде иммунологов Урала (Челябинск, 2011), на Всероссийской научно-Щ практической конференции «Медицинская биохимия и клиническая

лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск,2011), на Российской конференции «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы», посвященная 80-

летию со дня рождения профессора Г.К.Попова (Челябинск,2012), на VII Всероссийской Конференции с Международным Участием «Иммунологические чтения в Челябинске» (Челябинск, 2012).

В диссертации представлены результаты исследований, выполненных лично автором на кафедре биохимии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и на кафедре адаптивной физической культуры и медико-биологической подготовки государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный университет». Личный вклад автора в настоящую работу состоит в постановке целей и задач, проведении экспериментов, обработке, анализе и обобщении полученных результатов.Исследование выполнено в рамках реализации ГЗ на оказание услуг на 2012 и на плановый период 2013-2014 годов №4.4022.2011.

Положения, выносимые на защиту

1. Нарушение регуляции функциональной активности гипоталамо-гипофизарно - адренокортикальной системы, вызванное гипокинетическим стрессом, сопровождается развитием анксиогенных расстройств, сопряжённых с изменением соотношения между липопероксидацией и карбонилированием белков в исследованных структурах головного мозга.

2. Анксиолитическое действие экзогенного глюкокортикоида и острого однодневного гипокинетического стресса, формируется на фоне снижения уровня ПОЛ в различных структурах головного мозга

3. Купирование анксиолитического действия экзогенного глюкокортикостероида, вызванное предварительным

гипокинетическим стрессом, сопряжено с ограничением окислительной модификации белка в различных структурах головного мозга и повышением содержания изопропанол -растворимых продуктов ПОЛ в среднем, продолговатом мозге и мозжечке.

Научная новизна

Впервые установлено, что пролонгирование гипокинетического стресса до трех дней приводит к повышению тревожности, сопряженное со снижением содержания карбонилированных белков при одновременном повышении содержания молекулярных продуктов ПОЛ. Установлено, что пролонгирование гипокинетического стресса с 24 часов до трёх суток усугубляет нарушения регуляции ГГАС по механизму отрицательной обратной связи. Обнаружено, что через 120 часов после завершения односуточного гипокинетического стресса наблюдается инверсия первоначального анксиогенного эффекта в анксиолитический, что сопровождается снижением уровня окислительного стресса. Установлено, что пролонгирование гипокинетического стресса до трех суток купировало развитие анксиолитической реакции через 120 часов после завершения воздействия. Установлено, что через 120 часов после завершения пролонгированного гипокинетического стресса в различных структурах головного мозга наблюдается повышение содержания изопропанол -растворимых продуктов ПОЛ.

Обнаружено, что при введении экзогенного глюкокортикоида пролонгированного действия, развивается анксиолитическая реакция, сопряженная со снижением уровня кортикостерона и уровня свободно-радикального окисления в структурах головного мозга. Показано, что анксиолитическое действие экзогенного глюкокортикоида купируется на фоне предварительного однодневного и трехдневного гипокинетического стресса. При этом, введение экзогенного глюкокортикоида как после

однодневного, так и после трехдневного стресса сопровождалась однотипными изменениями свободно-радикального окисления в структурах головного мозга повышением содержания изопропанол-растворимых продуктов ПОЛ при одновременном снижении содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ и уровня окислительной модификации белков.

Теоретическая и практическая значимость

На основании полученных результатов установлена зависимость между продолжительностью гипокинетического стресса и ГКС - зависимыми изменениями процессов липопероксидации и карбонилирования белков в различных структурах головного мозга, а также поведенческих р