Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние пролина на конформационную стабильность полипептидных цепей коллагенов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние пролина на конформационную стабильность полипептидных цепей коллагенов"

на правах рукописи УДК 577.322.9

РУБИН МАКСИМ АНДРЕЕВИЧ

Влияние пролина на конформационную стабильность полипептидных цепей коллагенов

03.00.02. - биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

0034ь шьо

Москва 2008

003461063

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Научные руководители: кандидат физико-математических наук, Есипова Наталия Георгиевна доктор биологических наук, академик Макаров Александр Александрович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Лобышев Валентин Иванович доктор физико-математических наук Нечипуренко Юрий Дмитриевич

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.

Защита состоится 19 февраля 2009 г, в ¿Г час. ЗО мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова, Москва (Россия 119991, Москва, Ленинские горы 1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

■/В

Автореферат разослан « ' » января 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор Кренделёва Т.Е.

Общая характеристика работы

Введение. Актуальность проблемы.

Коллаген считается самым распространенным белком. Его содержание в тканях животных превышает 60%. Долгое время полагали, что фибриллярный коллаген ответственен лишь за опорные и предохранительные функции. Однако, установление коллагеновых участков в Ся1-компоненте комплемента, в ацетилхолинэстеразе и, наконец, открытие различных типов коллагена показало, что для коллагенового семейства характерно большое функциональное разнообразие. Но что делает коллагены уникальными белковыми объектами, так это разнообразие тех уровней организации, на которых происходит реальное функционирование коллагеновых полипептидов.

Общепринято, что физико-химические свойства макромолекул определяются последовательностью их химических единиц. Понимание молекулярных основ функционирования макромолекул предполагает знание системы взаимодействий, приводящих к формированию различных уровней организации. А это, в свою очередь, предполагает детализацию роли каждого из элементов структуры в определении физических свойств макромолекул.

Вместе с тем в наших знаниях практически о любом из уровней

организации структуры имеются существенные пробелы. Например,

количественному изучению до сих пор поддаются лишь две из трех

регулярных вторичных структур: а-спираль и (3-структура.

Важнейший, как ясно сегодня, третий тип структуры - левая спираль

типа поли-1-пролин II - а это основа структурообразования

коллагенов - до сих пор недостаточно охарактеризован

количественно, прежде всего, в смысле физических характеристик,

3

где наибольшую неясность вносит боковой радикал пролина, ответственный за само название типа структуры. Действительно, гидрофобный боковой радикал пролина - пятичленное пирролидиновое кольцо - не снижает высокую растворимость как пролина, так и пептидов с пролином и поли-1-пролина. Растворимость указанных пептидов значительно выше, чем это ожидалось в соответствии с индексом гидрофобности бокового радикала. Эти свойства пролиновых пептидов, несомненно, определили необычные явления, наблюдаемые при денатурации (плавлении) фибриллярных макромолекул коллагенов. С ростом содержания иминокислот растет энтропия денатурационного перехода, что не соответствует ограничениям числа' конформационных состояний пролина -пятичленного кольца, замыкающегося СК-связью в основной цепи полипептида. Вместе с тем именно структуры коллагенового типа являются основой многих новых материалов для промышленности и медицины.

Приведенные доводы делают очевидной большую актуальность исследований левой спирали типа поли-1-пролин II и пролина как регулятора процессов структурообразования коллагенов и других белков, а также структуры и физических свойств материалов, сконструированных на основе фибриллярных коллагеновых систем.

Цель и задачи исследования.

Главной целью проведённой работы было установление молекулярных механизмов влияния иминокислот, пролина и оксипролина, на термодинамические характеристики коллагенов и одноцепочечных полипептидных систем в конформации левой спирали типа поли-1-пролин II.

В задачи работы входило:

• анализ термодинамических характеристик коллагенов из различных источников и с различным содержанием иминокислот;

• расчет параметров переходов, включая оценку размеров кооперативных областей на основании сравнения калориметрической и Вант-гоффовской энтальпий;

• сравнительный анализ архитектуры гидратации трехспиральных макромолекул коллагенов и амино- и иминокислот;

• сравнительный анализ характеристик сеток водородных связей в коллагенах по совокупности данных термодинамического, спектрального анализа и анализа возможных типов гидратации структур;

• поиск вытянутых левоспиральных конформаций в линкерных пептидах белков, установление роли линкерных пептидов в комплексах двуспиральная ДНК-белок.

Научная новизна.

Впервые установлен молекулярный механизм влияния иминокислот на физические характеристики коллагенов. Показано, что дегидратация пептидных групп в местах расположения пролинов приводит к разделению кооперативных областей на несвязанные части. Далее в несвязанных частях бывшей кооперативной области варьируют параметры КИ-валентных колебаний, что выражается в уширении соответствующих полос в ИК-спектрах денатурированных коллагенов. Последующий разрыв Н-связей, казалось, позволил бы произойти гидратации пептидных групп. Однако это не совместимо с кооперативной гидратацией олигопептидов, содержащих аминокислоты. Как следствие, на участках, где одиночная цепь имеет

разрывы в кооперативной сетке Н-связей воды, а азот иминокислоты дегидратирован, увеличивается информационная подвижность иминогруппы. Таким образом, увеличение числа дефектов в кооперативной сетке водородных связей воды вокруг одиночных (после денатурации трехцепной макромолекулы коллагенов) цепочек приводит к росту энтропии перехода по мере роста содержания иминокислот в коллагенах.

Впервые для интерпретации результатов термодинамических данных по плавлению коллагенов проведен систематический расчет числа кооперативных областей в фибриллярной макромолекуле.

Впервые показано, что характер гидратации одиночной левой спирали типа поли-1-пролин II зависит от последовательности расположения остатков пролина в полипептидной цепи.

Анализ линкерных пептидов показал, что левая спираль типа поли-1-пролин II часто возникает на линкерных участках белков. При образовании контактов этими участками полипептидных цепей левая спираль на них часто сохраняется, при этом средняя длина участков поли-1-пролин II составляет шесть остатков, что означает некооперативность гидратации пептидных групп, то есть поверхность узнавания таких мест определяется скорее боковыми радикалами, чем профилем поверхности кооперативной сетки воды.

Установлены участки контактов ДНК и пептидов в конформации левой спирали типа поли-1-пролин И.

Практическое значение работы.

Результаты данной работы могут представлять ценность при создании системы предсказания участков взаимодействия полипептидных цепей в коллагенах разного типа и разного происхождения. Тонкая регуляция таких контактов осуществляется

6

за счет специфики структур гидратной воды в разных последовательностях амино- и иминокислот.

Установление роли иминокислот в коллагенах допускает возможность на новой основе прогнозировать следствия мутационных замен в генах коллагенов, что позволит уже в ближайшее время начать разработку соответствующих терапевтических подходов.

Полученные новые знания о термодинамике коллагенов дадут возможность проектировать коллагеновые материалы с заданной температурной стабильностью и адгезионными свойствами.

Апробация работы и публикации.

По материалам диссертации опубликовано три печатные работы, в том числе две статьи в реферируемых журналах из списка ВАК и одна в тезисах III съезда биофизиков России.

Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 101 странице, иллюстрирована 35 рисунками и содержит 14 таблиц, список литературы включает 131 ссылку. Диссертация состоит из введения, пяти глав, включая обзор литературы, выводов, списка цитированной литературы.

Краткое содержание работы. Введение

Введение содержит обоснование актуальности темы диссертации, ее научной новизны и практической значимости, приведены положения, выносимые на защиту.

Глава 1. Обзор литературы.

В обзоре литературы рассматриваются: общие характеристики структур коллагенового типа, обсуждаются возможности классификации этих макромолекул в ряду хорошо охарактеризованных типов белковых структур. Значительное внимание уделяется описанию и анализу пространственных структур коллагенов, рассматривается влияние иминокислот, точнее пирролидиновых колец пролина и оксипролина, на стереохимию этих структур. Выделяются содержащиеся в литературе данные, требующие биоинформатического анализа. Коллагены - основные белки предохранительных, опорных и соединительных тканей в организмах животных встречаются так же во всем таксономическом ряду организмов от одноклеточных, например, бактерий до организмов беспозвоночных и позвоночных животных, аналоги коллагенов замечены в царстве растений. В структурном отношении это большой класс белков, включающих значительную фибриллярную часть, сформированную тройными спиралями, образованными специфическими периодическими

последовательностями аминокислот, типа (01у-Х-У)„, где в1у -глицин, а X и У любой остаток амино- или иминокислоты, причем содержание последних достигает 15-20% процентов. В последнее время круг уровней организации, на которых фибриллярные структуры коллагенового типа оказываются функционально значимыми, резко расширился. Стало очевидным, что функциональная роль поверхностей тройных спиралей коллагенового типа разнообразна и простирается от уровня макромолекул, через уровень клеток на уровень тканей. Так же ясно, что не только надмолекулярный уровень организации тройной спирали

коллагенового типа (см. Рис.1) важен для функционирования, но поверхность одиночной тройной спирали оказалась активной в аспекте ряда функций.

■Д Г

* } V- *

^ "'Л1 ( ^ * л

- »- -г- —' '

' ' 1 ■ 1 -

Рис.1. Тройная спираль коллагенового типа.

Поэтому представляется важным анализ возможных конформационных состояний пространственной структуры трехспиральной молекулы коллагена. Это существенно для понимания возможностей регуляции термодинамических и других физико-химических характеристик фибриллярных макромолекул. В самом деле, совершенно не обязательно, чтобы те усредненные структурные параметры спирали, которые мы определяем по рентгенограммам коллагеновых фибрилл, генерировались в целой одиночной тройной спирали. Поэтому анализ структур одиночных макромолекул коллагенов до сих пор представляет существенный интерес не только для понимания структурных основ функционирования рецепторных элементов пространственной структуры и построения моделей «созревания» коллагеновых фибрилл, но также и для понимания особенностей регуляторного влияния пирролидиновых колец на температурную и механическую стабильность фибриллярных структур.

Как распределение пролина в последовательности аминокислот полипептидной цепи сказывается на способности макромолекул коллагенов к взаимодействию с водой и другими макромолекулами -вопрос по-прежнему важный, однако он до сих пор не решен.

В обзоре литературы рассматриваются способы гидратации макромолекул коллагенов и одиночных левых спиралей типа поли-1-пролин II. Делается вывод, что вариации структуры вдоль оси волокна у коллагеновой макромолекулы, связанные с пирролидиновыми кольцами, требуют нового анализа, прежде всего термодинамических характеристик отдельной макромолекулы. Отмечается дефицит данных по стереохимии одиночных левых спиралей типа поли-1-пролин II и возможным механизмам адсорбции на белках и нуклеиновых кислотах с образованием тройных белково-нуклеиновых спиралей.

Глава 2. Методы.

В первой части главы содержится описание методов термодинамического анализа кривых поглощения тепла макромолекулами коллагенов. Использовались кривые поглощения тепла макромолекулами проколлагенов, выделенных из кожи пяти различных коллагенов пойкилотермных и гомойотермных животных. Впервые обращается особое внимание на проблему выявления числа кооперативных единиц, проявляющихся в кривых плавления в виде неравенства калориметрической и Вант-гоффовской энтальпий. Предполагалось, что установление зависимости между числом кооперативных единиц и содержанием иминокислот в макромолекулах соответствующих коллагенов должно показать, как пролин влияет на строение кооперативных областей в макромолекуле. В качестве показателей состояния водородных

ю

связей в макромолекулах с различным содержанием иминокислот использовались инфракрасные спектры коллагенов. На простейшей модели одномерной решетки, образуемой длинной линейной молекулой, на которой имеются какие-либо молекулярные группы, расположенные на . одинаковом расстоянии друг от друга, продемонстрирован эффект неоднородного уширения в колебательных спектрах и установлена его связь с содержанием пирролидиновых колец.

Во второй части главы приводится описание использованных подходов к анализу влияния пролина на свойства одиночных левых спиралей типа поли-1-пролин II в аспекте возможной роли одиночных левых спиралей типа поли-1-пролин II в процессах образования комплексов с ДНК.

Рисунок 2. Тетрапептид пролина. Псевдо ось симметрии второго порядка проходит перпендикулярно оси симметрии третьего порядка и через СО-группу второй иминной группы тетрапептида.

Методической основой такого анализа является наличие у левой спирали типа поли-1-пролин II псевдо оси симметрии второго порядка, перпендикулярной оси третьего порядка (см. Рис.2).

и

Это дает основание предполагать возможность образования прочного комплекса между левоспиральными участками полипептидных цепей и малой и большой бороздками ДНК в местах расположения осей симметрии второго порядка двойной спирали ДНК.

Чтобы решить эту задачу достаточно наглядно, следовало проанализировать контакты структуры типа поли-1-пролин II на одиночных участках полипептидных цепей белков, а этому условию, как известно, удовлетворяют линкерные участки. Поэтому в данной работе был предпринят поиск линкерных участков полипептидных цепей в белках, среди них выделены ДНК-связывающие белки, а далее проанализирована стереохимия вторичных структур линкерных участков этих белков и среди них отобраны те, которые находятся в левой спирали типа поли-1-пролинп И, будучи в комплексе с ДНК.

Для поисков линкерных участков использовались базы данных PDB, SCOP, а также база данных линкеров: http://ibivu.cs.vu.nl/.

Метод поиска линкеров оригинален: из базы данных SCOP сначала выбирались домены по ряду сформулированных признаков. Участок пептида между доменами трактовался как линкер. Рассматривали и подвергали дальнейшему стереохимическому анализу только цельные линкеры. Обратим внимание на важность линкерных участков для ДНК-белкововго узнавания: разрыв линкера обычно сопряжен с патологией.

Глава 3. Термодинамический анализ механизмов влияния имнокислот - пролина и оксипролина на физические характеристики коллагенов.

В этой главе приводятся основные результаты анализа влияния иминокислот на термодинамические характеристики структур

коллагенового типа в коллагенах из различных источников. Установлено, что основной механизм увеличения энтропии системы белок-вода при увеличении содержания иминокислот в полипептидной цепи состоит в изменении числа кооперативных участков, выявляющихся при плавлении фибриллярной макромолекулы. Разброс физических характеристик кооперативных единиц определяет, в частности, разброс значений параметров водородных связей, что проявляется в уширении полос ]ЧтН-валентных колебаний, т.е. в уширении полуширин переходов в постденатурационных структурах. Таким образом, основной механизм влияния иминокислот на термодинамические характеристики коллагенов связан со сложным ходом процесса денатурации, при котором механизмы дегидратации-гидратации нативного и денатурированного состояний существенно меняются при замене любых аминокислот на иминокислоту.

В данной главе, помимо акцента на анализ уникальной структуры обращается внимание на то, что коллаген является системным белком, определяющим значительное число процессов структурообразования в биологических объектах на разных уровнях их организации, прежде всего - на клеточном и тканевом. Однако, невзирая на значительное количество работ, затрагивающих самые разные стороны структурообразования и функционирования коллагенов, принципиального прорыва в понимании закономерностей образования и стабилизации этих белковых структур до сих пор нет.

Достаточно большая неопределенность в наших знаниях о белковых структурах связана с иминокислотами, которые, как оказалось, не только играют ключевую роль в стабилизации трехцепных макромолекул коллагенов, но и они же определяют

необычные физические свойства коллагеновых макромолекул. Пролин входит в список основных, так называемых, кодируемых аминокислот и обладает уникальной химической структурой. Из-за наличия пирролидинового цикла в нем отсутствует №-Н-группа, способная при адсорбции воды служить донором водородной связи. Тот же пирролидиновый цикл фиксирует двугранный угол <р в основной цепи в районе -60°, создавая тем самым существенные конформационные ограничения.

Пролин наилучшим способом подходит для третьего типа вторичной структуры белков - левой спирали типа поли-1-пролин II (пп II). Спираль обладает псевдо симметрией Сз и служит основой фибриллярной части коллагена, представляющего собой уникальный комплекс трех спиралей типа поли-1-пролин II, и также достаточно часто встречается в глобулярных белках.

Растворимость пролина в воде доходит до 7 М, в то же время он хорошо растворим в водноспиртовых смесях с большим содержанием спирта. СО-группа пролина более электроотрицательна, чем соответствующие карбонильные группы других аминокислот и является поэтому наиболее сильным акцептором протонов. Расположение водных мостиков вокруг одиночной полипептидной цепи поэтому зависит расположения иминокислот. При включении пролина в полипептидную цепь из-за уменьшения количества и хаотизации распределения доноров протонов в полипептидной цепи сокращаются в размерах области кооперативной гидратации пептидных групп, т.е. растет энтропия одиночной полипептидной цепи.

Мы провели термодинамический анализ результатов калориметрии коллагенов, выделенных из животных, далеких в

таксономическом отношении, по следующим причинам. Во-первых, коллагены имеют специфическую структуру, термостабильность которой соответствует температурным условиям среды обитания. Во-вторых, эта структура стабилизируется водой, причем упорядоченная гидратная оболочка образуется на основе карбоксильных СО-групп полипептидной цепи, т.е. при образовании водной спирали вокруг трехцепной макромолекулы коллагена не используются МН-группы, т.е. пептидный азот.

Специфическая водная структура вокруг коллагенов -единственный пример образования кооперативной сетки воды вокруг полипептида без АгН-группы как донора протонов. Кооперативная сетка воды вокруг денатурированной одиночной цепи коллагена принципиально другая: ИН-группы аминокислот являются важными опорами сетки Н-связей вокруг левой спирали типа поли-1-пролин II в аминокислотном полипептиде.

Таким образом, в процессе денатурации коллагена должна происходить перестройка спирали гидратной воды, т.е. изменяться геометрия и деформироваться симметрия спирали воды.

Каков же механизм перехода в денатурированное состояние с участием иминокислот? Две группы данных: термодинамические характеристики переходов в коллагенах, во-первых и изменения в спектрах водородных связей в процессах денатурации - во вторых -могут подсказать, какие стадии процесса денатурации определяют этапы изменения стабильной полипептидной трехцепной спирали и как регулируется этот процесс.

Важно отметить еще раз, что коллагены - белки с уникальной фибриллярной структурой: средняя величина проекции остатка на ось спирали в коллагенах с различным аминокислотным составом, в том

числе и содержанием иминокислот, определяемая методом рентгеноструктурного анализа, постоянна и составляет 2,86 А. Таким образом, изменение физических свойств коллагенов определяется не изменениями их пространственной структуры, но физико-химическими свойствами пептидных групп и боковых радикалов.

В Табл. 1 приведены параметры тепловых переходов для макромолекул коллагенов с разным содержанием иминокислот. Таблица 1. Термодинамические характеристики коллагенов разного

происхождения.

Источник коллагена Из кожи Число иминокислот /1000 а.к. Q, кал/г АН, ккал/моль белка дт, полуширина Перехода т„ К ДН5*1, ккал/ моль Кол-во кооперативных участков, N= АН/ ДНс0Г Энтропия, ккал/ моль К

Трески 155 10,65 3840 2,0 292,3 341 11,3 13,14

Мерланга 160? 10,0 3600 2,5 294,6 278 12,9 12,22

R. temp. 165 12,0 4320 2,5 304,4 297 14,5 14,19

R. ridib. 171 ? 13,4 4824 3,0 310,5 257 18,8 15,54

Щуки 199 13,6 4896 2,5 303,2 294 16,6 16,15

Крысы 226 17,0 6120 2,3 312,9 341 18,0 19,56

Курицы 228 17,2 6192 2,5 318,1 324 19,1 19,46

Как известно из калориметрических данных, с ростом количества иминокислот растут и энтальпия и энтропия денатурационных переходов. Долгое время полагали, что объяснение может состоять в дополнительных молекулах воды, адсорбируемых на тройной спирали коллагена в местах концентрации аминокислот. Однако, эксперименты показывают, что гидратация коллагена ткане-

но не видоспецифичца, т.е. не коррелирует с содержанием иминокислот. В то же время в денатурированном состоянии упорядоченность систем №Н-связей (по полуширине полос вапентных колебаний) падает с ростом числа иминокислот в макромолекуле, что и объясняет рост энтропии системы белок-вода.

В данных Табл. 1 обращает на себя внимание увеличение числа кооперативных единиц при плавлении коллагенов по мере увеличения количества иминокислот.

Это можно понять, если учесть, что первый этап процесса денатурации коллагенов - это дегидратация тройной спирали макромолекулы*. При этом в местах локализации иминокислот на участках левой спирали типа поли-1-пролин II постденатурационная гидратация не происходит, что и приводит к разобщению участков тройной спирали коллагена на различные кооперативные единицы*.

Рассмотрим одну из простейших моделей этого процесса, позволяющих продемонстрировать эффект неоднородного уширения в колебательных спектрах. Рассмотрим длинную линейную молекулу, на которой имеются какие-либо молекулярные группы, расположенные на одинаковом расстоянии друг от друга. Т.е. эти группы образуют своего рода одномерную линейную периодическую решетку. Если мы рассмотрим колебательный спектр этих групп, то он будет достаточно узок, поскольку все эти группы находятся в одинаковых условиях и неоднородное уширение отсутствует. Но если из-за дегидратации части пептидных групп молекула перестает быть однородной и периодичность нарушается, то разные молекулы будут

' Подчеркнем, что при денатурации коллагена должна происходить перестройка гидратной оболочки спирали, а по данным В.И. Лобышева энергетика денатурационного перехода в коллагене определяется водой.

давать линии колебаний, сдвинутые друг относительно друга. Соответственно по сравнению с нативным состоянием суммарный спектр окажется уширенным.

Таким образом^ механизм роста энтропии переходов в коллагенах под влиянием иминокислот связан со следующими этапами: 1) дегидратацией пептидных групп в местах расположения иминокислот; 2) разделением кооперативных областей на несвязанные части; 3) вариацией параметров ЫН-валентных колебаний в различных кооперативных единицах; 4) разрывом N4-.пептидных связей; 5) лабиализацией динамики в местах расположения иминокислот.

Поэтому тонкая регуляция термостабильности коллагенов иминокислотами осуществляется как за счет изменения числа кооперативных участков в еще нативной структуре, так и за счет нарушения кооперативной гидратации постденатурационной одиночной левой спирали типа поли-1-пролин II в местах включения в нее иминокислот.

Глава 4. Левая спираль типа поли-1-пролин II в линкерных областях ДНК-связывающих белков

В этой главе изложены результаты исследований взаимодействий ДНК-левая спираль типа поли-1-пролин II. По базам данных белков и линкеров, как это описано в Методах, в рамках данной главы проведен поиск участков линкеров в конформации типа поли-1-полин И, в составе комплексов ДНК-белок. В РБВ найдено 268 комплексов РНК-белок и 778 комплексов ДНК-белок. В них найдено 1260 линкерных участков. Среди них найдено 73 комплекса линкер-ДНК. Показано, что средняя длина участков левой спирали типа пп11

составляет шесть остатков, причем пролин в них не является доминирующим остатком.

Знание доменной структуры белков, существенное в аспекте структуры и функций этих важнейших макромолекул, предполагает, наряду с информацей о доменах, сведения о междоменных областях или о так называемых линкерах. В отличие от доменных субъединиц (компактных, структурно независимых образований в составе белковой глобулы) линкеры не характеризуются плотной упаковкой, не образуют контактов с доменами белков но, вместе с тем, нередко являются самостоятельными структурными и функциональными единицами белка. Для нас линкеры интересны как пример непосредственных трехспиральных комплексов между одиночными левыми спиралями типа поли- 1-пролин II и ДНК.

Мы провели разметку вторичной структуры для всех найденных линкеров. Отличие от ранее применённых методов разметки вторичной структуры состоит в использовании более точного разделения структур по классам, и впервые добавлен тип вторичной структуры типа поли-1-пролин-И, составляющий существенную долю всех встречающихся в белках конформаций. В существующей базе данных линкеров разметка левой спирали отсутствует.

Для нас особый интерес представляет взаимодействие линкеров в лево-спиральной конформации с ДНК. Оказалось, что лево-спиральные линкеры в основном располагаются в узкой бороздке ДНК, но в ряде случаях мы нашли их и в широкой.

Мы рассматрели все лево-спиральные линкеры предполагая, что при определенных условиях возможно образования комплексов белок-нуклеиновая кислота (см. Табл. 2). Показано, что средняя длина

левоспирального линкера составляет шесть остатков, аминокислотный состав: Gin, Pro, Arg, Lys, Ile.

Наибольший интерес представляют левоспиральные линкеры, непосредственно контактирующие с ДНК или РНК (мы проанализировали 23 примера). В диссертации представлен большой графический материал.

Таблица 2. Фрагменты линкеров в конформации левой спирали типа

поли-1-пролин II в комплексах с ДНК, содержащие пролин.

Идентификатор белка и цепи в банке PDB Номера остатков Аминокислотная последовательность

PdblecrA 229-237 Ile Lys Arg Pro Val Lys Val

pdblecr_A 279-300 Туг Asp Ala Asp Asn Val Gin His Arg Туг Lys Pro Gin Ala Gin Pro Leu Arg Leu Ile

pdblfiu_A 52-70 Ser Glu Thr Val Ser Glu Arg Leu Pro Gly Gin Thr Ser Gly Asn Ala Phe

pdbtmse_C 138-148 Asn Pro Glu Val Lys Lys Thr Ser Trp

pdblqf6_A 529-536 Ala Gly Phe Phe Pro Thr

pdb2upl_A 88-108 Ala Val Ser Arg Glu Asp Ser Gin Arg Pro Gly Ala His Leu Thr Val Lys Lys Ile

pdb6pax_A 62-77 Ile Arg Pro Arg Ala lie Gly Gly Ser Lys Pro Arg Val Ala

В главе приводится ряд примеров контактов левоспиральных линкеров с ДНК и РНК. Отмечается, что симметрия расположения пролиновых остатков не допускает образования кооперативной сетки воды, длиной, большей одного витка спирали волы. Контакты, как и предполагалось, допускают возможность правильного расположения оси симметрии второго порядка, перпендикулярной оси ДНК, и псевдо оси симметрии второго порядка левоспирального участка.

Глава 5. Обсуждение результатов

В главе проведено общее обсуждение данных глав 3 и 4, с привлечением данных по расчетам гидратации пептидов, с различным расположением пролина в полипептидной цепи. Приведем только короткое резюме.

В данных Табл.1 и Рис. 3 обращает на себя внимание увеличение числа кооператиных единиц при плавлении коллагенов по мере увеличения количества иминокислот.

О —1-1---г--г--1-1-1-1-1-1—

60 80 100 120 140 160 150 200 220 240

содержание иминокислот

Рисунок 3. Зависимость числа кооперативных единиц в коллагенах различного происхождения от содержания иминокислот.

Это легко понять, если иметь в виду, что первый этап процесса денатурации есть дегидратация тройной спирали трехцепной макромолекулы, а в местах локализации иминокислот на участках левой спирали типа поли-1-пролин II постденатурационная гидратация не происходит. Это и различные параметры спирали вдоль

макромолекулы коллагена, вызывающие деформацию спирали гидратной воды, приводят к разобщению участков тройной спирали коллагена на различные кооперативные единицы.

Таким образом, механизм роста энтропии переходов в коллагенах под влиянием иминокислот, повторим еще раз, связан со следующими этапами: 1) дегидратацией пептидных групп в местах расположения иминокислот; 2) разделением кооперативных областей на несвязанные части; 3) вариацией параметров №Г-валентных колебаний в различных кооперативных единицах; 4) разрывом ЫН-пептидных связей; 5) лабилизацией динамики в местах расположения иминокислот. Именно таким образом гидрофобный боковой радикал не приводит к нерастворимости полипептида с пролином - поли-1-пролина, а тонкая регуляция термостабильности коллагенов иминокислотами осуществляется как за счет изменения числа кооперативных участков в еще нативной структуре, так и за счет нарушения кооперативной гидратации постденатурационной одиночной левой спирали типа поли-1-пролин II в местах включения в нее иминокислот.

Такое же несовершенство гидратной оболочки участков левой спирали типа поли-1-пролин II имеет место в линкерных областях белков, что, способствуя дегидратации части пептидных групп, обеспечивает непосредственные контакты ДНК и линкера, управляемые их собственной симметрией. При этом расположение пролинов определяет участок плотного контакта ДНК-белок.

Выводы

1. Установлено, что важный аспект механизма увеличения энтропии системы белок-вода при увеличении содержания иминокислот в полипептидной цепи состоит в изменении числа кооперативных участков, выявляющихся при плавлении фибриллярной макромолекулы.

2. Показано, что механизм влияния иминокислот на термодинамические характеристики коллагенов связан со сложным ходом процесса денатурации при котором механизмы гидратации-дегидратации существенно меняются при замене иминокислот на любую аминокислоту.

3. На простейшей модели одномерной решетки, образуемой длинной линейной молекулой, на которой имеются какие-либо молекулярные группы, расположенные на одинаковом расстоянии друг от друга, продемонстрирован эффект неоднородного уширения в колебательных спектрах и установлена его связь с содержанием пирролидиновых колец.

4. Установлено, что тонкая регуляция термостабильности коллагена иминокислотами осуществляется как за счет изменения числа кооперативных участков в еще нативной структуре, так и за счет нарушения кооперативной гидратации в постденатурационной левой спирали типа поли-1-пролин II в местах включения в нее иминокислот.

5. Установлено, что кооперативный характер гидратации одиночной полипептидной цепи в конформации поли-1-пролин II определяется последовательностью и симметрией расположения пролинов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рубин М.А., Тиктопуло Е.И., Намиот В.А., Туманян В.Г., Есипова Н.Г. К вопросу о механизмах влияния иминокислот на физические характеристики коллагенов. Биофизика, 2008, т. 53, с. 407-410.

2. Власов П.К., Будзко A.B., Рубин М.А., Туманян В.Г., Макаров A.A., Есипова Н.Г. Левая спираль типа полипролин II в литерных областях ДНК-связывающих белков. Биофизика, 2008, т. 53, с.1149-1150.

3. Филатов И.В., Мильчевский Ю.В., Опарина Н.Ю., Рубин М.А., Есипова Н.Г. Расчет трехмерной структуры молекулы коллагена III человека. III съезд биофизиков России, 24-29 июня 2004 г, Воронеж, стр. 117.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 11.01.2009 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 003. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Рубин, Максим Андреевич

Глава 1. Обзор литературы.

Глава 2. Методы.

Молекулярная модель.

Получение статистических характеристик.

Глава 3. Термодинамический анализ механизмов влияния иминокислот пролина и оксипролина на физические характеристики коллагенов.

Расчет гидратации одно цепочечных спиральных полипептидов.

Расчет гидратации трехцепочечных спиральных полипептидов.

Глава 4. Левая спираль типа поли-1-пролин II в линкерных областях ДНКсвязывающих белков.

Глава 5. Обсуяедение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние пролина на конформационную стабильность полипептидных цепей коллагенов"

Коллаген считается самым распространенным белком. Его содержание в тканях животных превышает 60%. Долгое время полагали, что фибриллярный коллаген ответственен лишь за опорные и предохранительные функции. Однако установление коллагеновых участков в Сд1-компоненте комплемента, в ацетилхолинэстеразе и, наконец, открытие различных типов коллагена показало, что для коллагенового семейства характерно большое функциональное разнообразие. Но что делает коллагены уникальными белковыми объектами, так это разнообразие тех уровней организации, на которых происходит реальное функционирование коллагеновых полипептидов.

Общепринято, что физико-химические свойства макромолекул определяются последовательностью их химических единиц. Понимание молекулярных основ функционирования макромолекул предполагает знание системы взаимодействий, приводящих к формированию различных уровней организации. А это, в свою очередь, предполагает детализацию роли каждого из элементов структуры в определении физических свойств макромолекул.

Вместе с тем в наших знаниях практически о любом из уровней организации имеются существенные пробелы. Например, количественному изучению до сих пор поддаются лишь две из трех регулярных вторичных структур - се-спираль и /З-структура. Важнейший, как ясно сегодня, третий тип структуры - левая спираль типа поли-1-пролин II - а это основа структурообразования коллагенов - до сих пор недостаточно охарактеризован количественно, прежде всего, в смысле физических характеристик, где наибольшую неясность вносит боковой радикал пролина, ответственный за само название типа структуры. Действительно, гидрофобный боковой радикал пролина - пятичленное пирролидиновое кольцо - не снижает высокую растворимость как пролина, так и пептидов с пролином и поли-1-пролина, которые значительно выше, чем это требовал бы индекс гидрофобности бокового радикала. Эти свойства пролиновых пептидов, несомненно, определили необычные явления, наблюдаемые при денатурации (плавлении) фибриллярных макромолекул коллагенов. С ростом содержания иминокислот растет энтропия денатурационного перехода, что не вяжется с ограничениями на конформационное состояние пролина - пятичленного кольца, замыкающегося С^-связью, в основной цепи полипептида. Вместе с тем именно структуры коллагенового типа являются основой многих новых материалов для промышленности и медицины.

Приведенные доводы делают очевидной большую актуальность исследований левой спирали типа поли-1-пролин II и пролина как регулятора процессов структуроо.бразования коллагенов и других белков, а также структуры и физических свойств материалов, сконструированных на основе фибриллярных коллагеновых систем. Цель и задачи исследования.

Главной целью проведённой работы было установление молекулярных механизмов влияния иминокислот, пролина и оксипролина, на термодинамические характеристики коллагенов и одноцепочечных полипептидных систем в конформации левой спирали типа поли-1-пролин II.

В задачи работы входило:

• анализ термодинамических характеристик коллагенов с различным содержанием иминокислот;

• расчет параметров переходов, включая оценку размеров кооперативных областей на основании сравнения калориметрической и Вант-гоффовской энтальпий;

• сравнительный анализ архитектуры гидратации трехспиральных макромолекул коллагенов и амино- и иминокислот;

• сравнительный анализ характеристик сеток водородных связей в коллагенах по совокупности данных термодинамического, спектрального анализа и анализа возможных типов гидратации структур;

• поиск вытянутых левоспиральных конформаций в линкерных пептидах белков, установление роли линкерных пептидов в комплексах двуспиральная ДНК-белок.

Научная новизна.

Впервые установлен молекулярный механизм влияния иминокислот на физические характеристики коллагенов. Показано, что дегидратация пептидных групп в местах расположения пролинов приводит к разделению кооперативных областей на несвязанные части. Далее в несвязанных частях бывшей кооперативной области начинают варьировать параметры №1-валентных колебаний, что выражается в уширении соответствующих полос в ИК-спектрах денатурированных коллагенов по сравнению с нативными. Последующий разрыв Н-связей, казалось, позволил бы произойти гидратации пептидных групп. Однако это не совместимо с кооперативной гидратацией олигопептидов, содержащих аминокислоты. Как следствие, на участках, где одиночная цепь имеет разрывы в кооперативной сетке Н-связей воды, а азот иминокислоты дегидратирован, увеличивается конформационная подвижность иминогруппы. Таким образом, разрушение кооперативной сетки водородных связей в одиночной после денатурации трехцепной макромолекулы коллагенов приводит к росту энтропии перехода по мере роста содержания иминокислот в коллагенах.

Впервые для интерпретации результатов термодинамических данных по плавлению коллагенов проведен расчет числа кооперативных областей в фибриллярной макромолекуле.

Впервые показано, что характер гидратации одиночной левой спирали типа поли-1-пролин II зависит от последовательности расположения пролинов в полипептидной цепи.

Анализ линкерных пептидов показал, что левая спираль типа поли-1-пролин II часто возникает на линкерных участках белков. При образовании контактов этими участками полипептидных цепей левая спираль на них часто сохраняется, при этом средняя длина участков поли-1-пролин II составляет шесть остатков, что означает некооперативность гидратации пептидных групп, то есть поверхность узнавания таких мест определяется скорее боковыми радикалами, чем профилем поверхности кооперативной сетки воды. Установлены участки контактов НК и пептидов в конформации левой спирали типа поли-1-пролин II.

Практическое значение работы. Результаты данной работы могут представлять ценность при создании системы предсказания участков взаимодействия полипептидных цепей в коллагенах разного типа и разного происхождения. Тонкая регуляция таких контактов осуществляется за счет специфики структур гидратной воды в разных последовательностях амино- и иминокислот.

Установление роли иминокислот в коллагенах допускает возможность на новой основе прогнозировать следствия мутационных замен в генах коллагенов, что позволит уже в ближайшее время начать разработку соответствующих терапевтических подходов.

Полученные новые знания о термодинамике коллагенов дадут возможность проектировать коллагеновые материалы с заданной температурной стабильностью и адгезионными свойствами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Рубин, Максим Андреевич, Москва

1. Бурджанадзе Т.В., Тиктопуло Е.И. Энтальпия денатурации коллагена- нелинейная затухающая функция 4-оксипролина. Биофизика, 2001. 46:607-

2. Власов П.К., Килосанидзе Г.Т., Украинский Д.Л., Кузьмин А.В., Туманян В.Г. Есипова Н.Г. Левоспиральная конформация типа поли-Ь-пролин II в глобулярных белках. Статистика встречаемости и роль последовательности. Биофизика, 2001. 46:573-

3. Дьяконова Л.П., Маленков Г.Г. Моделирование структуры жидкой воды методом Монте Карло. Ж структ. химии, 1979. 20:854-

4. Ермаков М. Метод Монте Карло и смежные вопросы. Москва: Наука, 1971, 471 стр. 102 Есипова Н.Г. О характере некоторых водородных связей в коллагене. Биофизика, 1957, 2:461

5. Есипова Н.Г., Андреева Н.С., Миллионова М.И. Об особенностях строения коллагена. Кристаллография, 1957. 4:470-

6. Есипова Н.Г., Андреева Н.С., Гатовская Т.В., О роли воды в структуре коллагена. Биофизика, 1957,3:529-

7. Есипова Н.Г., Айзенхабер Ф., Айзенменгер Ф., Туманян В.Г. Новая трактовка термодинамической роли иминокислот в коллагене. Разрешение термодинамического парадокса. Биофизика, 1992. 37:68-

8. Есипова Н.Г., Григолава М.В., Щеголева Т.Ю., Рогуленкова В.Н., Малеев В.Я. Почему температура денатурации коллагена должна быть близка к температуре развития вида? Биофизика, 1981.26:355-

9. Есипова Н.Г., Лазарев Ю.А., Лазарева А.В., Спектральные исследования коллагена и родственных ему полипептидов. О характере основной системы водородных связей. Биофизика, 1972. 17:949-

10. Лобышев В.И., Соловей А.Б., Бульенков Н.А. Компьютерный модульный дизайн параметрических структур воды. Биофизика, 2004. 49:1011-1

11. Луговской В.А., Дашевский В.Г. Конформационый анализ кислород-содержащих гетероциклов. I. Метод расчета. Ж. структ. хим., 1972. 13:122-

13. Метод Монте Карло в статистической физике. Под ред. Х.Биндер, Москва: Мир, 1982, 400 стр. 100,

14. Мильчевский Ю.В., Жоров Б.С., Есипова Н.Г., Туманян В.Г. Структура коллагена с новой сеткой водородных связей Биоорганическая химия. 1999. 25:348-

15. Мильчевский Ю.В., Раменский В.Е., Жоров Б.С, Котовская Е.С., Есипова Н.Г., Туманян В.Г. Молекулярной моделирование коллагена II человека в связи с болезнями, ассоциированными с аминокислотными заменами. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2003. 7:27-

16. Милионова М.И. Дисперсия и температурная зависимость оптического вращения для полимера (глицил-1-пролил-1-оксипролин)п. Биофизика, 1964. 9:145-

17. Петрушенко И.Ю., Лобышев В.И. Неравновесное состояние электрохимически активированной воды и ее биологическая активность. Биофизика, 2001. 46:389-

18. Петрушенко И.Ю., Лобышев В.И. Физико-химические свойтсва водных растворов, полученных в мембранном электролизере. Биофизика, 2004. 49:22-

19. Туманян В.Г. Уточнение структуры полипептида (глицил-иминокислота-иминокислота)п как модели коллагена методом теоретического конформационного анализа. Биофизика, 1980.25:1097-1108. 93

20. Туманян В.Г., Рогуленкова В.Н., Есипова Н.Г., Айзенхабер Ф. Конформация тройной спирали коллагена как функция первичной структуры. Биофизика. 1992. 37:5-

21. Туманян В.Г., Есипова Н.Г. Исследование структуры коллагенового типа. Биофизика, 1973. 18:977-

22. Филатов И.В., Мильчевский Ю.В., Есипова Н.Г., Туманян В.Г. Расчет структуры фрагментов молекулы коллагена. Биофизика, 2004. 49:1047-1

23. Филатов И.В., Мильчевский Ю.В., Есипова Н.Г., Туманян В.Г. К проблеме анализа конформаций боковых радикалов в методах молекулярной механики. О возможностях редукции библиотеки конформаций боковых радикалов в спиральных белках Биофизика, 2004.49:1044-1

24. Abraham L.C., Vorrasi J., Kaplan D.L. Impact of collagen structure on matrix trafficking by human fibroblasts. J. Biomed. Mater. Res. A 2004. 70:39-

25. Adam M., Deyl Z., Rosmus J. Changes in the stability of the collagen structure in adjuvant disease and their modifications by heavy metals. Fysiatr. Revmatol. Vestn. 1969:175-

26. Adam M., Deyl Z. Alteration in the collagen structure in collagenosis and osteoarthrosis. Reumatologia 1978. 16:75-

27. Andreeva N.S., Esipova N.G., Milionova M.I., Rogulenkova V.N., Shibnev V.A. Polypeptides with regular sequence of amino acids as model of collagen structure. In: Conformation of biopolymers, ed. Ramachandran G.N.., New York, Acad. Press, 1967. 2:469-

28. Bansal M. Stereochemical restrictions on the occurrence of amino acid residues in the collagen structure. Int. J. Pept. Protein. Res., 1977:9:224-

29. Barkers J.A., Watts R.O. Structure of Water. A Monte Carlo Calculation. Chem.Phys.Lett., 1969. 3:144-

30. Bear R.S. The structure of collagen molecule as fibril. J. Biophys. Biochem. Cytol., 1956. 2, N:363

31. Bella J., Eaton M., Brodsy, B. Berman, H.M. Crystal and molecular structure of collagen like peptide at 1.9A resolution. Science, 1994. 266:75-

32. Bhattacharjee A, Bansal M. Collagen structure: the Madras triple helix and the current scenario. IUBMB Life, 2005. 57:161-

33. Bozec L., de Groot J., Odlyha M., Nicholls В., Nesbitt S., Flanagan A., Horton M. Atomic force microscopy of collagen structure in bone and dentine revealed by osteoclastic resorption. Ultramicroscopy, 2005. 105:79-

34. Brown F.R., di Carato A., Lorenzi G.P., Blout E.R. Synthesis and structural studies of two collagen analogues: poly(L-prolyl-L-seryl-glycyl) and poly(L-prolyl-L-alanyl-glycyl). J. Mol. Biol., 1972. 63:85-

35. Byers P.H., Bonadio J.F. Lethal mutations in type I collagen: structure-function relationships in the type I collagen molecule. Birth Defects Orig. Artie Ser. 1984. 20:65-

36. Cole W.G. Collagen genes: mutations affecting collagen structure and expression. Prog. Nucleic. Acid. Res. Mol. Biol., 1994.47:29-

37. Doillon C.J., Dunn M.G., Silver F.H. Relationship between mechanical properties and collagen structure of closed and open wounds. J. Biomech. Eng. 1988. 110:352-

38. Doyle B.B., Traub W., Lorenzi .G.P., Glout E.R., Conformational investigation of the polypeptide and oligopeptides with relating sequence L-alanyl-L-prolyl-glycine. Biochemistry, 1971. 10:30523

39. Engel J., Chen H.T. Prockop D.J. Klump H. The triple helix coil inversion of collagen-like tripeptides in aqueous and nonaqueous solvent. Comparison of the thermodynamics parameters and binding of water to (L-Pro-L-Pro-Gly)n and (L-Pro-L-Hyp-Gly)n Biopolymers, 1977.16:601-

40. Engel J., Kurtz. J., Katchalski E., Berger A. Polymer of tripeptides as collagen model. II. Conformation changes of poly(L-prolyl-glycyl-L-prolyl) in solution. J. Mol. Biol., 1966. 17:255-272 94

41. Fraser R.D., MackRae T.P., Suzuki E. Chain conformation in the collagen molecule. J. Mol. Biol., 1979. 129:463-

42. Fraser R.D., Macrae T.P. Possible role of water in collagen structure. Nature, 1959. 183:179-

43. Gabuda S.P., Gaidash A.A., Viazovaia E.A. Collagen structure and the disordering of the water subsystem in fibrillar polypeptides according to 2H-NMR data. Biofizika, 2005. 50:231-

44. Griko Yu.V., Privalov P.L., Venyaminov S.Yu., Kutyshenko V.P. Thermodynamic study of the apomyoglobin structure. J. Mol. Biol., 1988, 202:127-

45. Hanagata N., Takemura Т., Monkawa A., Ikoma Т., Tanaka J. Pre-adsorbed type-I collagen structuredependent changes in osteoblastic phenotype. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006. 344:12341

46. Hansen L.K., Wilhelm J., Fassett J.T. Regulation of hepatocyte cell cycle progression and differentiation by type I collagen structure. Curr. Top. Dev. Biol., 2006. 72:205-

47. Harrington W.F., Karr G.M. Collagen structure in solution. II. Analysis of refolding kinetics in terms of nucleation and growth processes. Biochemistry, 1970. 9:3725-3

48. Harrington W.F., Rao N.V. Collagen structure in solution. I. Kinetics of helix regeneration in singlechain gelatins. Biochemistry, 1970. 9:3714-3

49. Hauschka P.V., Harrington W.F. Collagen structure in sllution. V. Kinetic mechanism of refolding of cross-linked chains. Biochemistry, 1970. 9:3754-3

50. Hauschka P.V., Harrington W.F. Collagen structure in solution.

51. Effect of cross-links on thermal stability and refolding kinetics. Biochemistry, 1970. 9:3734-3

52. Hauschka P.V., Harrington W.F. Collagen structure in solution. IV. Conformational properties of refolded cross-linked chains. Biochemistry, 1970. 9:3745-3

53. Heidemann E., Bernhardt H.W. Synthetic polypeptydes as model for collagen. Nature, 1968. 220:13261

54. Heymer G.R. Die struktur kollagernahnlicher homound heteropolytripeptide,

56. Hoeve С A., Kakivaya S.R., On the structure of absorbed water in collagen. J. Phys. Chem., 1976. 80:745-

57. Hudson BG, Reeders ST, Tryggvason K. Type IV collagen: structure, gene organization, and role in human diseases. Molecular basis of Goodpasture and Alport syndromes and diffuse leiomyomatosis. J. Biol. Chem. 1993. 268:26033-26

58. Kobayashi Y., Sakai R. Kakichi K., Isemura T. Physiochemical analysis of (Pro-Pro-Gly)n with defined molecular weight-temperature dependence of molecular weight in aqueuos solution. Biopolymers, 1970. 9:415-425. L.Ala-Kokko, S.Kontusaari, C.Baldwin, H.Kuivaniemi, D.Prockop, Biochem. J. 1989. 260:509-

59. Lakshmandram B.R., Ramamkrishnan C Sasisekharan V., Thathachari Y.T., X-ray diffraction pattern of collagen and the Fourier transform of the collagen structure. In: Collagen. New York, Willey, 1962, pp. 117-

60. Makhatadze, G.I., and P.L. Privalov. 1

61. Energetics of protein structure. Adv. Protein Chem. 47:307

62. Makarov A.A., Protasevich 1.1., Frank E.G., Grishina I.B., Bolotina I.A., EsipovaN.G. The number of cooperative regions (energetic domains) in a pepsin molecule depends on the pH of the medium. Biocim. Biophys. Acta, 1991. 1078:283-

63. Manley J.H. Electron chemistry and collagen structure. J. Ultrastruct. Res., 1969. 29:383-397. McBride D.J., Jr., Choe V., Shapiro J.R., Brodsky B. Altered collagen structure in mouse tail tendon lacking the alpha 2(1) chain. J. Mol. Biol. 1997. 270:275-

64. Metropolis N., Rosenbluth A.W., Rosenbluth M.N., Teller A.H., Teller E. Equation of State Calculation of Fast Computing Machines. J. Chem. Phys., 1953. 21:1087-1092. 95

65. Miller M.H., Sheraga H.A. Calculation of the structure of collagen model. Role of the interchain interaction in determining the triple-helical coiled-coil conformation. I. Poly(glycyl-prolyl-prolyl). Polymer Sci., 1

67. Momany F. A., McGuire R. F., Burgess A. W., Scheraga, H. A., Energy Parameters in Polypeptides VII, Geometric Parameters, Partial Charges, Non-bonded Interactions, Hydrogen Bond Interactions and Intrensic Torsional Potentials for Naturally Ocurring Amino Acids, J. Phys. Chem. 1975. 79:2361-2

68. Momany F.A., Carruthers L.H., McGuire R.F., Scheraga H.A. J. Phys. Chem. 1974. 78:1596-1620 Nagarajan V., Kamitori S., Okuyama K., Structure analysis of a collagen-model peptide with a (ProHyp-Gly) sequence repeat. J Biochem. (Tokyo). 1999. 125:310-

69. Nandi PK, Grant ME, Robinson DR. Destabilization of collagen structure by amides and detergents in solution. Int. J. Pept. Protein Res., 1985. 25:206-

70. Nemethy G., Miller M.H., Scheraga H.A., Calculation of the structure of collagen models. Role of interchain interaction in determining the triple-helical coiled-coil conformation. Poly(glycyl-alanylprolyl).- Macromolecules, 1980. vl3:914-

71. Nemethy G., Pottle M.S., Scheraga H.A. Energy Parameters in Polypeptides,

72. Updating of Geometrical Parameters, Non-bonding Interactions and Hydrogen Bonding INteractions for Naturally Occuring Amino Acids, J. PHys. Chem. 1983. 87: 1883-1

73. Nemetschek T. Hierarchy of collagen structure. Verh. Anat. Ges. 1981. 75:47-

74. Neumann Т., Vollmer A., Schaffner Т., Hess O.M., Heusch G. Diastolic dysfunction and collagen structure in canine pacing-induced heart failure. J. Mol. Cell Cardiol. 1999. 31:179-

75. Neumark Т., Toth G., Marot I. Alterations of collagen structure after urea treatment. Acta Histochem., 1967.28:1-

76. Okuyama K., Arnott S., Takayanagi M., Kakudo M. Crystall and molecular structure of a collagen-like polypeptide (Pro-Pro-Gly)10. J. Mol. Biol., 1981. 152:427-

77. Okuyama K., Takana N., Ashida Т., Kakudo M., Sakakibara., Kishida Y. An X-ray study of the synthetic polypeptide (Pro-Pro-Gly). J. Mol. Biol., 1972. 72:571-

78. Okuyama K., Takayanagy M., Ashida Т., Kakudo M., A new structural model for collagen..Polymer J., 1977.9:341-

79. Okuyama K.k, Okuyama K., Arnott S., Takyanagi M., Kakudo M. J. of Mol. Biol. 1981. 162:427-

80. Panasik N.J., Eberhardt E.S., Edison A.S., Powell D.R., Raines R.T., Inductive effects on the structure of proline residues. Int. J. Pept. Protein Res. 1994. 44:262-

81. Paterlini M.G., Nemethy G., Scheraga H.A. The energy of formation of internal loops in triple-helical collagen polypeptides. Biopolymers. 1995. 35:607-

82. Privalov P.L. Therdynamic investigathion of biological macromolecules. Pure and Appl. Chem., 47:293-304 Privalov P.L. Stability of proteins. Small globular proteins. Adv. Protein Chem. 1979. 33:167-2

83. Privalov P.L. Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system. Adv. Protein Chem. 1982. 35:1-

84. Privalov P.L. Thermodynamic problems of protein structure. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1989. 18:47-

85. Privalov P.L. Cold denaturation of proteins. CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1990. 25:281-

86. Privalov P.L. Physical basis of the stability of the folded conformations of proteins. In Protein folding, ed. Т.Е. Creighton, 1992. 83-126. New York: Freeman and Co. Privalov P.L. Intermediate states in protein folding. J. Mol. Biol. 1996. 259:707-

87. Wintrode, P.L., and P.L. Privalov. 1

88. Energetics of target peptide recognition by calmodulin. J. Mol. Biol. 273:1048-1060. 96

89. Unfolded proteins. In Encyclopedia of Molecular Biology, ed. T. Creighton, 2723-2725. New York: Wiley. Privalov P.L. Forces stabilizing protein structure. In Perspectives in Structural Biology. A volume in honor of G.N. Ramachandran, eds. M. Vijayan, N. Yathindra, and A.S. Kolaskar, 1999. 449-

90. Hyderabad, India: Universities Press (India) Ltd. Privalov P.L., I. Jelesarov, CM. Read, A.I. Dragan, and С Crane-Robinson. The energetics of HMG box interactions with DNA. Thermodynamics of the DNA bonding of the HMG box from mouse sox-5. J. Mol. Biol. 1999. 294:997-1

92. Problems and prospects in the microcalorimetry of biological macromolecules. Methods Enzymol. 323:31-

93. Privalov P.L., Tiktopulo E.I., Tischenko V.M. J. Mol. Biol. 1979. 127:203-

94. Ramachandran G.N. structure of collagen at molecular level. In: Treatise on collagen, New York, Acad. Press. 1967, 1:103-

95. Ramachandran G.N., Kartha G. Structure of collagen. Nature, 1955. 176:593-

96. Ramachandran G.N., Bansal M., Bhatnagar R.S. A hypothesis on the role of hydroxyproline in stabilizing collagen structure. Biochim. Biophys. Acta, 1973. 322:166-

97. Rich A, Crick F.H.C. The molecular structure of collagen.- J. Mol. Biol. 1961. 3:483-

98. Rich A., Crick F.H.C. The structure of collagen. Nature, 1955. 176:915-

99. Rickert W.S., Forbes W.F. Changes in collagen with age. II. Modification of collagen structure by exposure to the gaseous phase of tobacco smoke. Exp. Gerontol. 1972. 7(:99-

100. Rigby B.J., Robinson M.S. Thermal transitions in collagen and the preferred temperature range of animals. Nature, 1975. 253:277-

101. Rogulenkova V.N., Mililonova M.I., Andreeva N.S., On the close structural similarity between polyGly-L-Pro-L-Hypro and collagen. J. Mol. Biol., 1964. 9:253-

102. Rosen H., Kessler A., Levenson S.M. Collagen structure and metabolism. Surg. Forum, 1960. 11:295

103. Sakakibara S., Inouye K., Shudo K., Kishida H., Kabayashi Y., Prockop D.V., Synthesis of (Pro-HypGly)n of defined molecular weights. Evidence for the stabilization of collagen triple helix by hydroxyprolyne. Biochim. Biophys. Asta (P), 1973. 303:198-

104. Segal D.M., Traub W. Synthesis and structural investigation of poly(L-alanyl-L-prolyl-glycune). J. Mol. Biol., 1969. 43:487-

105. Seidler DG, Faiyaz-Ul-Haque M, Hansen U, Yip GW, Zaidi SH, Teebi AS, Kiesel L, Gotte M. Defective glycosylation of decorin and biglycan, altered collagen structure, and abnormal phenotype of the skin fibroblasts of an Ehlers-Danlos syndrome patient carrying the novel Arg270Cys substitution in galactosyltransferase I (beta4GalT-7). J Mol. Med. 2006. 84:583-

106. Steven K.H., Lynn E.B., Kimbery M.T., Ronald T.R., A hyperstable collagen mimic. Chemistry Biology. 1999. 6:No

107. Sugeta H., Miyadzava T. General method for calculating helical parameters of polymer chains from bond length, bond angles, and internal-rotation angles. Biopolymers, 1967. 5:673-

108. Takigawa R, Tomita K. [Crystalline structure of poly-L-prolineits relation to collagen structure]. Tanpakushitsu Kakusan Koso 1966.11:1321 -1

109. Tamura, A., and P.L. Privalov. 1997. The entropy cost of protein association. J. Mol. Biol. 273:10481

110. Tanaka T, Wada Y, Nakamura H, Doi T, Imanishi T, Kodama T. A synthetic model of collagen structure taken from bovine macrophage scavenger receptor. FEBS Lett., 1993, 334:272-

111. Tiktopulo EI, Kajava AV, //Biochemistry 1998. 37:8147-8

112. Tiktopulo EI, Privalov PL, Andreeva AP, Aleksandrov V. [Mobility of collagen structure and temperature adaptation of animals]. Mol Biol (Mosk) 1979. 13:619-

113. Traub W., Yonath A. Polymers of tripeptides as collagen models.III. Structural relationship between two form of poly (L-prolyl-L-alanyl-glycine). J. Mol. Biol., 1967, 25:351-355. 97

114. Tumanyan V.G. Investigation of fibrous structures. I. Computation for collagen. Biopolymers 1970. 9:955-

115. Tumanyan V.G., Rogulenkova V.N., Esipova N.G. Modelling and Computer Method in Mol.Biol. and Genetics. Eds. V.A.Ratner, N.A.Kolchanov. New York: Nova Science Publisher. 1992, pp. 197-

116. Tumanyan V.G. Biophysika (Russian) 1960, 25:1097-1

117. Tumanyan V.G. Докторская диссертация. M., 1

118. Venugopal M.G., Ramshaw J., Braswel E., Zhu D., B.Brodsky, Electrostatic Interaction in Collagenlike Triple-Helical Peptides. Biochemistry. 1994. 33:7948-7

119. Vitagliano L., Nemethy G., Zagari A., Scheraga H.A., Stabilization of the triple- helical structure of natural collagen by side-chain interactions. Biochemistry 1993. 32:7354-7359. Yee R.Y., Englander S.N., von Hippel P.H. Nature. Native collagen has a two-bonded structure. J. Mol.Biol. 1974. 83:1-

120. Yonath A., Traub W. J. of Molecular Biology 1969. 43:461-477. 100 Zhorov B.S. Comparison of Lowest-Energy Conformations of Dimethylcurine and Methoxyverapamil: an Evidence of Ternary Association of Calcium Channel, Ca2+, and Calcium Entry Blockers. J. Membr. Biol. 1993. 135:119-

121. Zhorov B.S. Vector method for calculating derivatives of energy of deformation of valence angles and torsion energy of complex molecules according to generalized coordinates. J.Struct.Chem. 1982. 23:3-

122. Zhorov B.S. Vector method for calculating energy derivatives of atom-atom interactions of complex molecules according to generalized coordinates. J.Struct.Chem. 1981. 22:8-

123. Zhorov B.S., Ananthanarayanan V.S. Conformational Analysis of Free and Ca2+-bound forms of Verapamil and Methoxyverapamil. J.Biomol.Struct.Dynam. 1993. 11:529-

124. Zhorov B.S., Ananthanarayanan V.S. Similarity of Ca2+ bound conformations of morphine and Metenkephalin: a computational study. FEBS Letters 1994. 354:131-

125. Zhorov B.S., Brovtsyna N.B. Conformational analysis of d-tubocurarine: implications for minimal dimensions of its binding site within ion channels. J. Membr. Biol. 1993. 135:19-

126. Список работ, опубликованных по теме диссертации

127. Рубин М.А., Тиктопуло Е.И., Намиот В.А., Туманян В.Г., Есипова Н.Г. К вопросу о механизмах влияния иминокислот на физические характеристики коллагенов. Биофизика, 2008, т. 53, с. 407-410.

128. Власов П.К., Будзко А.В., Рубин М.А., Туманян В.Г., Макаров А.А., Есипова Н.Г. Левая спираль типа полипролин II в линкерных областях ДНК-связывающих белков. Биофизика, 2008, т. 53, с. 1149-1150.

129. Филатов И.В., Мильчевский Ю.В., Опарина Н.Ю., Рубин М.А., Есипова Н.Г. Расчет трехмерной структуры молекулы коллагена III человека. III съезд биофизиков России, 24-29 июня 2004 г, Воронеж, стр. 117. 98