Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО СУБСТРАТА И ПРОДУКТОВ БРОЖЕНИЯ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ КУЛЬТУРЫ PBGPIONIBACTISRIUM SHEHMANII

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО СУБСТРАТА И ПРОДУКТОВ БРОЖЕНИЯ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ КУЛЬТУРЫ PBGPIONIBACTISRIUM SHEHMANII"

Академия наук СССР Институт микробиологиз

На правах рукописр

ИБРАГИМОВА

Я ИвЛНО,м,а

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО СУБСТРАТА И ПРОДУКТОВ БРОЖЕНИЯ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ КУЛЬТУРЫ РН0РЮМХВАСТ^Н1иЫ 5НКШАЮС1

(Микробиология - 03.00.07)

Диссертация написана на русском языке

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

1974

t i ce (/- (£■. Г |7 ? C-í ' f

АКАДЕНИЯ НАУК СССР

институт иикроншогш

На правах рукописи

ИБРШ1ША СВЕШАНА ИВАНОВНА

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО СУБСТРАТА И ПРОДУКТОВ БРОШШЯ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ ЮГЛЬЗХРИ -PROPIONIBACTERIUM ШЕЯМ АЛИ

С Микробиология - 03,00,07 ) < Диссертация написана на. русской я*ыкв )

Азторефе р а т диссертации на соискание ученой с те п. sue кандидата биологических наук

И о с к в а - ШЧ

f.... ¡btúu.u'i---•;„.,tjo:iC3Cfl tipA. ЯсжйаСеы<и^. ; гл. ÎLA, ticsçracï"

I ЛЗ-^flL

Работа «шолнена в Института цикробилогин АН СССР

Научный руководитель - доктор биологических наук И.Л.Райотнова

Официальные оппоненты 1

доктор Сиол. наук А.Ы,Беэбородов канд. биол, наук И,|1,Повиогова

Диссертация, направлена на официальной отяда а-Институт физики СО.АН СССР, г. Красноярск Автореферат разослан 1574 г.

Защита диссертации состоится Б74 г.

часЗО чин, ка заседании Ученого Совета Института микробиологии АН СССР, Москва В-3,Профсо сз а ая, 7а, корпус «?,

С диссертацией моано ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР

' Ученый секретарь Ученого Совета ИНИИ АН СССР с т.нау чн.. ■ с о труд и., ка ши Ои ол ■ и ау к

СИ.Я.Осницная)

раздел физиологии микроорганизмов, касающайся влияния внешних факторов среди /недостаток в избыток субстрата« продукты обмена, рН, температура« давление, яда в т.д./ на физиологическое состояние микроорганизмов - один из наименее разработанных, Причина этого заключается в том, что до недавнего временв не были преодалены технические трудности, связанные с вычленением действия каждого фактора в отдельности.

Изучение влияния каждого фактора на различные функции клеток dea одновременного влияния других факторов» невозможно в обычных периодически* культурах,-в которых но ходу развития происходит непрерывная смена факторов,- влияющих на состояние клеток. Широкие возможности для изучения влиония каждого фактора в отдельности представляет метод проточного хе-иостатного выращивания, а также такие приеш периодического культивирования, когда удается изучить действие одного фактора на клетки, исключая влияние других.

Изучение поведения микроорганизмов в зависимости от внешних условий, кроме чисто теоретического значения имеет большое практическое значение- для промышленной микробиологии. Получение микробной биомассы не сталкивается с теоретическими затруднениями и в настоящее время удачно решается микробиологической технологией. Если же встает вопрос о Заданном составе биомассы, об определенном соотношении полимеров клетки пли о направленной синтезе тех или иных продуктов метаболизма, млеющих прошшлекноз значение, то при этом возникают принципиальные затруднения. До сих пор подобрать уоловия среды для наилучшего синтеза того или иного метаболита 'удается только эмпирически. Слишком мало известно общих закономерностей изменения поведения микроорганизмов в ответ ha те или иные изменения условий внешней средн.

Важнейшими характеристиками состояния культуры микроорганизмов являются скорость роста ц и экономический коэффициент использования энергетического Субстрата -У( » Эти величины зависят от условий среды и изменяются под влиянием внешних факторов. В настоящее время имеется довольно ограниченное количество исследований зависимости между этими величинами. изучение общих закономерностей изменения основных показателей микробного роста под влиянием различных факторов

внешней среди на розных модельных организмах дает возможность понять характер действия внутриклеточных регудяторных. механизмов, позволяющих клетке изменить скорость роста в ответ на измененва среды, найти общие законы поведения ьшкрооргациз-мов. Это позволит предвидеть поведение чистых культур микроорганизмов и в дальнейшем регулировать производственные ш-роаиологичеокне процессы.

В настоящей работе модельный организмом для исследования влияния внешних факторов на физиологическое состояние культуры были пропионовокислые бактерии, Исследования ведись с при-ыенениеи периоднчеокого /кетод острых опытов Иерусалимского/ и непрерывного культивирования.

Основное * внимание уделялось изучению влияния различных кон-центраций-субстрата брожения - лактата натрия, продуктам брожения, в основном пропионату натрия, величине рН.

Экссеришнтальная часть.

Объектом исследования служил штамм Ргор1оп1Ьас(вг1ит еьешапи' ВЮЛВ-103,

Для поддержания роста культуры Ргор, аъ^гтопи использовали агарнэованнув среду следующего состава /в граммах на I л. водопроводной воды/| 1С>ИР04 - 1,0} Ме304 -.0,2; /я Н^/^ 50^' - 3.0, СоС12 - 30 МГ[ 40® дрожжевой автолиэат-- 80 мл| лактат На- 1,0; агар-агар - 20,01 рИ среда 6,8-7,0. Для основных оштов но пользовалась жидкая среда того же сое- ). тага. Содержание лактата натрия варьировали в зависимости от поставленной задачи. Культуру ргор, виеиоади выращивали на поверхности атаризованноВ среды в чашках Петри помещенных в эксикатор ори давлении примерно мм рт. ст. в течении 10 суток при температуре 26-30 градусов. Затеи клетки из одной колония пересевали в жидкую среду. Лак посевной материал, в проводитх. экспериментах, использовали двухсуточную куль- ' туру,

. : Метода исследования.

Дня изучения влияния, одного изолированного фактора на рост культуры применяли метод острых, остропроточных опытов /Воронова с соавторами, 1967/ и проточное культивирование.

В острых- опытах растушуй периодическую культуру разливала в серию колб и в каждую из них вносили то дли иное количество вещества, действие которого изучалось / лактат'натрия, про— ' пионат натрия и др./» При этом принимали в расчет и продукты, которые- ухе накопились в культуре да её разлива. Сразу посла разлива,. а также в конце опыта,, который обычно продолжался 4 часа, определяли количество бактериальной биомассы путем нефе ламетрироваиия культуры на ФЗК-56. lia основавши полученных даннкх вычисляли удельную скорость роста бактерий. Принцип остропроточных опытов состоит в том, что культуру шращенную в большюм культиваторе, разливают в 5 маленьких, где продолжаемой рост при разных концентрациях исследуемого вещества* Вес сухой биомассы определяли нефелометрически на ФЛС-56, высушиванием до постоянного веса мембранных фильтров в эксикаторах над Св&2 и высушишнием биомаосы в стеклянных пробирках при температуре 103. Определение исходного достаточного количества лакгата натрия в культуральной жидкости велось методом отгонки оо Фридеману,, Калорииетричеснам методом с napa-оке иди^нилом и спектрофотометрическим методом Ско-лендера и Бредстрита. Общее количество летучих кислот определяли, методом Фролова-Еагреева и Агабальянца /1951/, про-пиоровув кислоту - методом Цанр /1932/, а такие методом гаэо-жидкостной хроматографии на хроматограф СЬгоп- 2. Щавелево-уксусную, яблочную, фумаровую и янтарную кислоты определяли, методом бумажной хроматографии / whereat et al.»1966/ Для определения витамина В12 применяли биоавтографнческнй чашечный кетод* с использованием в качестве тест-объекта культуры б, cali II3-3 / иерусалимский и др., 1961/..

Белок в клетках определяла по методу Лоури с соавторами / Lowry et al., I93IiplUw определения белка были применены различные способы разрушения клеток. Суспензию культуры Prop, е&егтапti . разрушали на прессе. Френча и на ультразвуковых аппаратах типа USE и типа УЗиЯ-í* Оптимальное разрушение клеток получали на прессе френча и на ультразвуковом аппарате типа ОДШ-1 при экспозиции 3 мин* И1К определяли спектрометрически / Спирин, 1958/, ДНК-по методу Дише в модификации Бартоиа / Burton ( 1956/, белоксинтезмрущую ак-

тивнооть ШС рассчитывала по формуле; где ^-удель-

ная скорость роста бактерий .itjsldgaardt a, Kurland, 1963/, Полисахарида определяли со реакции о антроноы /Зайцева ж Афанасьева, 195?/, общеа содержание липвдов - по Фольчу / loleli a. Leee, 195?/.' "

I. Предварительны ft последовая ил культуры Prop, bheraanli

При исследовании роста культуры Prop, stisraanil в периодических условиях выла'обнаружена неравномерность скорости роста. ~

В аппарата для проточного культивирования была получена кривая роста проточной культуры. Кривая изменения плотности популяции в зависимости от скорости потока среды ври одинаковой концентрации субстрата - лактата натрия в поступающей

РЕЗУЛЬТАТЫ liC СЛДДОВАШЯ

"3

а

среде имеет резко ниспадающий

К

характер. Такой характер кривой свидетельствует а том, что по

мере увеличения скорости протока ~ и, следовательно, - скорости роста, происходит смена лики-тирующих рост факторов. При низких скоростях разбавлен ИД /Л=

=0,04} 0,06; 0,10час,*1/ скорость роста культуры лимитирована как недостатком субстрата, так и довольно высоки«« количествами об-' разованных летучих кислот /рис Л/ Дальнейшее увеличение скорости

разбавления приводит к резкому

снижен«« количества летучих кислот к, оудя so остаточным кон-

v__j ^ 5й u к

. . I#Л<А

цент рациям субстрата, лимитирующим рост фактором становится избыток субстрата - лактата натрия.

Am : |нм, •---* »«мке«-

ш—<f MKtat Лл,-

\J

2. Влияние различных концентраций энергетического субстрата на рост и развитие культуры Prop* ehermanll.

Концентрация энергетического субстрата - одни из основных факторов« определяющих развитие микроорганизмов» При низких концентрациях энергетического субстрата в среде организм испытывает голодание.* Присутствие высоких концентраций, субстрата в среде ингиОирует рост я приводит к изменению направления энергетического метаболизма микроорганизмов. В настоящее врет имеется мало данных относительно изменения физиологических свойств микроорганизмов, как при действии недостатка, так и, особенно, при действии избытка энергетического субстрата,

В нашеЗ работе исследовалось влияние различных концентраций субстрата брожения - лактата натрия на изменение скорости роста, кислотообразование, соотношение основных продуктов брожения: пропионовой и уксусной кислоты» .потребление субот-рата и химический состав клеток prop, вЬегтавИ, . 1

Ыетодом острых и остропроточных опытов было показано, что изменение скорости роста культуры Prop, ehermanil при низких концентрациях лактата натрия описывается уравнением

Полученные в различных условиях опыта экспериментальные данные достаточно хорошо согласуются с теоретической кривой, вычисленной no уравнению Моно, при содержании лактата натрия ниже 1,2%. дальнейшее увеличение концентрадиа лактата натрия в среде приводит к угнетению роста культуры Prop, ehermautl и к всё,большему отклонения полученных экспериментальных значений скорости роста от предсказанных уравнением Ыоно /рис.2/.

Анализ культуральной жидкости в острых опытах показал, что увеличение концентрации лактата натрия в среде приводит к повышенному образованию летучих кислот культурой Prop. eiisnaaall

Возникло предположение, что снижение скорости роста при действии высоких концентраций субстрата обусловлено не самим субстратом, а образующимися продуктами брожения. Для проверки этого предположения была проведена серия острых опытов, в одном варианте которых клетки культуры развивались в *

дрксугстви* образуешхлетучих кислот, а в другом.,образуемы* летучие кислотыудалялись через полупроницаем?» пленку, е метки невоштивадивх ингввнрулцее влияние.

^ I 0т1МНММ КИНЦ*и«1ВМ«и смнмм меч ««и»» -

(Ч«^ тчл*» им»« . »ни и й, манммал ^кЛшЛя» Нона

{Ц основании полу че1 шы х данных был построен график зависимое 1Щ удельной скорости роста д откощдентрашш еуйстрата /¿шо.ЗЛ нэ которого видно, что рост культуры в присутствии летучих киолот в 1,5 раза ниже, чей в их отсутствие. Параллельное иэианениа обеих кривы* яри увеличении концентрации -субстрата ' /лактата натрия/1 позволяет эаклпчить, что скорость роста вактеряй тормозят оба фактора: и высокая концен.-

й*.I. уЛнм&афжяя ркят/а}

традая субстрате и образующиеся летучие киолоты, но фактором определяющим снижение кривой роста при высоких концентрациях лактата натрия является сам субстрат. Данные, полученные в острых опытах без удаления продуктов брожения показали, что о увеличением концентрации субстрата в среде уменьшается прирост биомассы и, следовательно, уменьшается скорость роста, тогда как потребление лактата натрия.и образование лету-. чих кислот в расчете на грамм образованной бвомаосы эначитель-; но увеличивается /рис.4/.

«и V •V

м Я» Ър ¿>А нонцснтмцм) мюата Мо. & ср«д«

мямм млмвто На ив иди < » Р Л ммимшм* Мтжчт яа «иапкижи*.;

'1-11-О юивоет щипнем • опг»1 «ыт»'

- Рис 4 - Вм*мм н*«ыточкы* ммдапипхии скктю н т имжеи «мт, мгтммн« мнтата и . амтанн« лмлиомага Ха, 1 Анализ химического состава клеток, в острых опытах показал, что при действии высоких концентраций энергетического субстрата состав основных полимеров клеток культуры Ргор. аЬег-щааН остается практически неизменным за исключением количества белка, которое резко уменьшается.

Таким образом, избыточные концентрации субстрата приводят к интенсификация энергетических и снижении активности конструктивных процессов, т.е., происходит разобщение катаболизма и анаболизма. Степень разобщения вызываемого этим факте-

IQ

ром зависит от физиологического состояния исследуемой культуры. Культура Prop. ehemaaii в начале логарифмической фазы роста:значительно чуотвительнее к действию высоких концентраций оуйотрата, чем в конце логарифмической фазы и в фаза замедления роста,.т.е.', степень разобщение энергетических и конструктивных процессов при .действии высоких концентраций оу(Затрата значительно выша у быстро растущих клеток /табл.1/.

Таблица I. Влияние избытка субстрата на некоторые свойства Prep, ehemanii . в зависимости от возраста культуры.

Физиологическая характеристика культуры

Перед острым опытом в момент отбора проб для острых опытов.

Через 4 часа инкубации , проб.

"Тг-

За

время острого опыта.

Плотность популяции

по нефед.

Летучие кислоты г/л

Общее к-во

Про-пионовая к-та

Уксусная. К-та

Конц.

лак-

тата

(Га %

•Дот-реб-ле-нне лак-тата

Jfa %

Образование летучих К-Т в Г на Г обр, биом.

Соотношение лропион, кислота

уксусв. кислота.

0,32

0,72

0,36

0,136

1,34 0,067

2S.I

4,0

0,92

4,96 (о,009

320,0

50,0

0,95

0.46

0,90

0,70

0,20

1,28 0,063

25,5

Х.о

4,50

4,20 }0,043

97,7

2,1

4,75

1,00

3,90

2,92

1,01

0,72 0,099

4,78

0,006

21,1 13,4

2.4 1,3

5,96

3. Влияние продуктов брожения на некоторые физиологические свойства культуры Prop, shenaanii. ■

Исследование отравлявшего влияния конечных продуктов метаболизма на жизнедеятельность кикроорганизмов является одним из важнейших вопросов физиологии. Большая интенсивность обмена веществ у микроорганизмов и накопление ими больших количеств метаболитов в окружающей среде, открывает большие возможности изучения этого вопроса на бактериях, как модельных ,организмах, для которых конечные продукты брожения являются одним из основных факторов, определяющих скорость роста. В настоящее время имеется довольно мало сведений о влиянии конечных продуктов на скорость роста и фаз иол огни микроорганизмов при не сошен ной важности этого вопроса, как с теоретической, так и с практической точки зрения, Поэтому исследование этого вопроса и нахождение подходов, содействукщих его поятанию, является целесообразный и своевременный.

Развитие периодической хультуры prop, sheimanii сопровождается увеличением концентрации биомассы, истощением углеродного субстрата /лактага .натрия/ и накоплением в культу-ралькой среде продуктов брожения в основном укоусной и про-пионовой кислоты.

Изучалось влияние продуктов брожения на изменение скорости роста /X , химического состава клеток, потребление энергетического субстрате и кислотообразование у культуры prop. Bhermaaii, Методом острых а остропроточных опытов было установлено /рас.5/, что пропионовая кислота оказывает более ингибирующее действие па рост культуры Prop, &h«xmanil, чем уксусная кислота. Зависимость между концентрацией про-шшвата и скорость» роста бактерий графически выражается гиперболической кривой. Кривая зависимости между скоростью роста Prop, shoimanii и концентрацией уксусной кислоты имеет иной характер. До концентрации в,4 г/я ацетат вообще не влияет на скорость роста бактерий и только выше этой концентрации начинается угнетение роста, действие смеси пропионата к ацетата /в соотношении 2sl/ на скорость роста Prop, «barman Ц не отличается от действия одного пропионата. Следо-

вателыю,, действие двух кислот не суммируется, а девствует та еэ них Которая находится в относительно большем количестве.

!ре&*шщ ¡ч сщног'ш роста - .

Рхцр гЛ*чтаЯ11 па острых гиш>щЛ

Г

пг

Анализ данных полу- . ченных в острых я остропрсяочных опытах показал,'. что изменение скорости роста ■ при увеличении, кон* центрадии'продионата. натрия описывается; уравнением Иерусалимского I

. Р

где // -удельная скорость роста при полном отсутствии а

^питательной среде тормозящего рост вещества; 1

I Р -» концентрация ' этого.вещества /про- ■

* пионатаЛ ■ ; Кр » константа, чис-

ленно равная тай концентрации лропиолата, при которой ,' Данныа оотрых и остропроточных опытов, показали, что о увеличением концентрации про пион ат а натрия в среде уменьшается скорость роста культуры Рюр. бЬегюапИ '"»снижается образование летучих кислот, главным образом, пропионата и в 'ТО же время потребление лактата яатркя в расчете на грамм . 'образованной биомассы' повышается, Было показано, что при этом 'а культуральной среде увеличивается количество янтарной кио-|лоты и нейтральных продуктов брожения. | На основа полученных данных было предположено, что часть ¡потребленного субстрата окисляется,'так как у лропионовонио-;дых бактерий известна способность к окислительным процессам

Я-1 Ыс&гг* aam.it . ■

/а&Ам л/мпиен&п!

щ ■ ( чттен , (• с е^г^а^па

I $0 Я я» гт&шгну/е »

/Воробьева, 1972/, Дня проверки этого предположения было определено поглощение кислорода у суспензии клеток,,взятых в . экспоненциальную фазу .роста, в контроле и при добавлении пропионата натрия.

Таблица 2. - - 4

Влияние пропионата ffa на поглощение кислорода и образование конечных продуктов у Prop, eheraanli /определения проводились в сосудах Варбурга/.

Концентрация Образование через 1,5 часа опыта >

пропионата £а - , г/л . ■ 4 • °2 Уксусной кислоты г/л ... Пропионата На г/л "Сумма-... нейтралы«, летучих .продуктов;

.-■-- 0 • 3.4 15,5 33,2 . 2,06, * а.ео 3,33 15,5 ■: 1,02 4,fi5 ,

■ТасшиЦа з.

Изменение состава полимеров клеток культуры Руор, еЬегшапИ в зависимости от концентрации пропионата Яа в острых опытах.

Концентрация Белок РНК дас Полиса- Лшш-

пропионата * ' * % харида ды

Ха г/л Si % •

0,40 27,74 9,31 1,80 32,2 23,3

7,21 26,53 10,01 . 1,70 29,3 21,6

31,ю ■ . 21,99 12,44 1,70 24,е 17,3

¡Сак показывают данные табл.2 при добавлении пропионата натрия значительно увеличивается поглощение кислорода, т.е. , ' ' - пропионат натрия усиливает окислительную активность клетки. Таким образом, можно полагать, что пропионат Ха производит изменения,в энергетических процессах, повышая доло побочных продуктов брожения - нейтральных продуктов и янтарной кисло-

ты к усиливая окислитилькыв процессы. Анализ полимеров клетки* отравляемой продуктами обмена показал» что происходит уменьшение, содержания липидов* полисахаридов и белка в клетках, количество ДНК постоянно, а количество FIIK лаже несколько увеличивается / табл.3/. Возможно, что изменения происходящие в процесса брожения под влиянием пропионата приводят к подавлению активности или синтеза некоторых ферментативных белков», связанных с образованием пропионата. Вследствие этого происходит вкгибврованиб синтеза липидов и полисахаридов и. в конечном счета уменьшение их содержания в клетках. Таким образом, увеличение концентрации пропионата в среде сопровождается существенными нарушениями, как в энергетическом, так к в конструктивном обмене культуры Prop, ehsrmimll, Укеяь— -шение скорости роста при значительном увеличении потребления энергетического субстрата в расчете на грамм образованной биомассы свидетельствует о том, что при действии высоких концентраций крояйоиата происходит разобщение энергетического и конструктивного обмена,

4. Изменение некоторых физиологических свойств культуры

Prop, ahexnaiillври'лимитации роста ионами водорода.

Изменение скорости роота культуры prop. abermanll в зависимости. от значения рН среды изучали методом острых и проточных опытов» Развитие культуры возможно в широких пределах : значений £>Н от 3,1 до 8,5. Кривые, изображенные на рисунке 6, показывают изменение скорости роста в зависимости от значения рН средн'У культуры Prop, ebennanli взятой из разных точек кривой роста, и, следовательно, находящейся в различном физиологическом состоянии. Наиболее благоприятной зоной рН для культуры Prop, ehermanli в любом физиологическом состоянии является зона между 6,3 - 7,5, Было показано, что торможение скорости роста культуры гидроясмльными и водородными ионами подчиняется уравнению иерусалимского, аналогичного уравнению неконкурентного торможения,Однако эта закономерность для гидроксилышх ионов найдена у культуры только в стадии, ускорения роста, а для водородных ионов на значительно более поздних стадиях развития. При культивировании

s режиме хемостата были определены пределы pli для роота культуры при Д*0,й. Кроме того, отмечена способность культуры к регуляции рН среды. В зависимости от pit поступающей среди культура подкисляет или подщелачивает ее, сдвигая.pli в более благоприятную для роста сторону /табл.4/. При. снижении рН поступающая среды до 4,35 такак регуляция уда невозможна л культура выминается.

Таблица 4,

Определение pli, лимитирующего рост prop, siwroanil в хе-мостате'при Д= 0,1 часТ*

рИ среды, поступайсеЯ рЦ среды в tec-

в культиватор. культиваторе сухоЯ биомассы г/л

7.45 о, lib 0.S3

5,65 ' 5,95 0,53

ii,3S 5,75 1 0,53

4,60 5,20 0,50

4,40 \ 5.Й - 4.3Q 0,38- 0,25

. 4.U5 4,35 выьиваниа

■ Без ко выраженная лиштация роста ионами водорода а нелрерыв—: них условиях культивирования при Д=0,1ч1 происходит в узких : , пределах рН от 5,20 до 4,95.. Ери всех исследованных значена-ях рН. имелась несброженная остаточная молочная кислота в среде примерно в равных концентрациях /1,44-1,70 г/л/. У культуры ahermaatt Кр. для лактата равна 0,19 г/л, следовательно, молочная кислота не являлась фактором лимитирующим рост/Рост лимитировали накопившиеся продукты брожения.

С увеличением концентрации водородных ионов изменяется степень диссоциации летучих кислот в сторону .увеличения количества недкссациировашшх молекул, Целые молекулы органических кислот токсичнее ионов, потому что они лучше прон екают в , клетку / Andrews а, Авее, 1969/ следовательно, янгибмрую-щее действие кислот про, низких значениях рй складывается из инмОирушего действия ионов и целых молекул органических кислот.;При нейтральном рН пропионат полностью диссоциирован ■ на ионы, для прооионаха у культуры Prop, ehermanli равна 0,81 г/л, т„е., оря концентрации пропаоната натрия 0,81 г/л.' скорость роста уменьшается вдвое, следовательно, при изменении значении рН ст. 6,85 до 4,95 культура испытывает ингибвруь шее влияние пропионата натрия / 3,36 -й,04 г/л//габл.5/

Таблица Влияние рН на отепёнь диссоциации летучих кислот, образованных культурой prop, ailermanll.

рн.

среды в фер-мен<-тере

Вес сухой, биомассы г/л

ваточная |<;олоч ная к-та г/л

Образованные летучие кислоты г/л

Уксусная х-та

всего

диссоц.

недвс-соц.

Пропионовая к-та

всего

диссоц.

недис-соц.

6,85 5,20 5,10 5,00 , 4,9й

0,63 0,50 0,38 0,30 0,25

1,78 1,55 1,78 Г, 44 1,67

0,46 0,60 0,70 0,79 0,80

0,456 0,450 0,486 0,498 0,492

0,004 0,150 0,214 0,207

о,зое;

3,38

•¿,гз 2,11 2,05 2,04

3,376 1,524 1,325 1,176 1,132

0,004 ,0.706 0,815 0,874 0,308

В то *з время, по мера снижения значения рН среды.уввличива-^ ет.ся количество недвссоциироваиных молекул уксусной и Пропионовой кислоты. Таким образом, при низких значениях рН культура подвергается действии 3-х ингйбвруищпх факторов) I/ непосредственного влияния ионов водорода; 2/ ионов ж 3/ целых лекул пропионовой и уксусной кислоты. /

Снижение значения рН.среды в культиваторе о? 5Т20 до 4(93 сопровождается резким падением количества биомассы, при змы резко возрастает потребление молочной кислоты и увеличивается,образование уксусной ипропионовой кислоты в расчете на I грамм сухой биомассы / рис. 7/, ■ -. ' -

В.1йя»и( различии* кичеипй pli срми н* платп«ть оолу. дннип, чо»(кЛиипе сувсграт« н <ii1píMi»,mit продукт« оОхсн* V Н4 I « в«a cyioft ¿nunifcu мелёсрионоЯ

ИгмосшноЙ иглчури Prop. thttmuiH| (ори Д-ц- -

t — l№t Г) киП ЛЙВН,£ЕЫ, е!Л1 I — rv*l [Il 6.l«<t». MdriWUtnt M11Л11Т u». *t . кЛ »'■* 41*14.1.1U+ J — а KJKMtUC iiiwiíkhiuwM .и.1" I u t.t *> * и А ^Wri'ltWL 4 — UÛH******" } Hi>i п.1Л „tilriu, t;t cv 111, (NtmdCÏU

Однако при снижении значении pU от й,В0 до 4,95 состав клеточных полимеров■/ белка, полисахаридов и липидов/ остается практически достоянным. Таким образом, при лимитации роста ионами водорода происходит разобщение энергетических и конструктивных процессов метаболизма культуры Prop,. ahe-raanii. , ■ .

Следовательно, независимо от природы исследуемых факторов: концентрации субстрата, продуктов брожения а исков водорода, уменьшение скорости роста под аашцшем их избыточных

концентраций а среде, сопровождается снижением степени сопряжения энергетических и конструктивных процессов: чем больше угнетен рост; тем большее количество субстрата потребляется в расчете на грамм прироста биомассы. Даяиые всех опытов.были нанесены на график / рис* 8/ где по оси ординат откладывали /1 , а на оси абсцисс - количество субстрата, потребленного

"граммом прироста биомассы. *» Оказалась, что зксперимвнталь-

но'полученные величины закономерно легли вокруг гиперболической кривой. Зга кривая зависимости удельной скорости роста ¡X от количества субстрата, потребленного в расчете на грамм образованной биомассы /Бр / может быть ошсаяа формулой, выражающей обратную пропорциональную за' л, " & .^дигчимогтк. Дри выведении фор-Уинчи* ** мулы выл11 ис"ользованы коли-

Амв™ чественные изменения /1 и Ер

от олиб® из основных характе-^•^»»••••т« ристик клетки - белоксинтези- ;

л-г» реющей активности РШС

А*. I ^^имппл, /ятш /> Д — йрР + £

¡<* *■*»» фШ*** Лг-ок* ****»<*» гдв. о _ коэффициент ПрОПОр-[млм ¡тяля^ч фктфи ______1 " _

. циональности изменения удельной скорости роста от белоксинте зирующеи активности РНК}

С^ " коэффициент пропорциональности, изменения белоксинте-эирующей активности РНК;от количества субстрата, потребленного граммом образованной биомассы}.

, В -' такое значение удельной скорости роста, ори которой белоксинтеэирумцая активность РНК практически равна нулю,+

/ / При. Д близком к нулю зависимость белоксинтезирующей активности. ШК отц перестает быть линейной, искривляется и носит параболический характер*

Как видно из графика, при самом экономичном потреблении суб—, ! страта, набдидавтся наибольшие скорости роста. Действие любых ■ исследовании х внгибирующих факторов приводии к уменьшению скорости poeta: и к увеличению затрат энергетического материала. Найденная зависимость позволяет, зная /i , предсказать количество субстрата, затраченного ца прирост биомассы в условиях лимитации роста весьма различными факторами среды»

5. Изменение образования витамина Bj¿ культурой Prop, ehermaaii под влиянием различных концентраций субстрата /лактата натрия/ и продуктов брожения /летучих кислот/.

Ввиду того, что пропионовокаслые бактерии являются активными продуцентами витамина Bj¿, представляло интерес исследовать влияние внешних условий ца синтез винашша В^о У Prop. бЬепнааЦ. Высокие концентрации лактата натрия в среда яриводят к увеличению продолжительности фазы задержки poeta культуры Prop, ebermaoii. Это экономически невыгодно дли производства в иг шин на Bj2. Чтобы взбежать этого, бы лиас штаны различные, варианты' дробного добавления лактата /табл. ft/. Дактат вносили в культуральную жидкость разными порциями в течении 96 часов, так чтобы его общее количество было 4$. Как видна из таблицы, дробное прибавление лактата натрия В Последних трех вариантах, еде его содержание в среде в nept-вые сутки ферментации было около привело к повышение синтеза витамина В12.

Витамин накапливается в клетках к концу развития культуры Prop. She noun i i поэтому можно било бы ожидать, что в непрерывных условиях выращивания:, при низких скоростях раэ-бавления/Д=0,Шч,~1/когда физиологическое состояние культуры мало отличается от стационарной фазы периодической культуры, клетки могут быть odaтащены витамином Bjg. Однако оказалось, что в непрерывных условиях образование витамина Bj¿ в 3-4 раза меньше, чем обычно наблюдалось при периодическом выращивании этой культуры. Возможно, что ддя активного биосинтеза витамина культура Prop. Eíjeriaaait должна быть еще более лимитирована в своем росте каким-то фактором, чем это наблюдалось в проводимых экспериментах. Чтобы проверить это пред-,

Таблица б,:

Образования ?ятамина Bj2 Prop, shermanli . в опытах О дробным внесеяием лактата натрид в П'льтурадьную жидкость.

Прибавление лак- Остаточный лактат Внх&нвн Биомасса

тата натрия % натрия % В12мкг/г сух; вес

г/л

■ - $ ЧАСЫ -

0 24 48 72 0 24 48 72 96 72 96 96

4 - _ . . ■ 4 3,65 2,65 1,70 0;3в 311 1233 1,75

2 2--. 2 3,60 2,39 0,78 0,34 901 1138 2,40

I 3 - - X 3,52 2,02 0,72 0,21 1352 1412 2,12

I 1,5 1,5 - I 2,12 2,33 0,77 0,2в IS59 1788 2,17

112- I 1,59 2,29 0,84 0,48 1629 1802 2,16

XII I I- 1,63 1,36 1,40 0,54 — 1718 2,30

Таблица 7.

Образование .витамина Bj2 °РЙ дображивании проточной' культуры Frop, shernaaii выращенной при Д*0Д6час.~*

Гомогенно непрерывное культивирование при, Дс 0,16 час

Концентр; лактата натрия % яех. Ост;

Биомасса г/л

Витамин

V

МКГ/МЛ

пег/г

Дображивании через 48 часов в периода-' ческах услов. роста

Остаточная кои-центрац. лахт.Ла%,

£ио-1 мае. г/л

Витамин

в12

2,3 3,8 2,3

1.3 2,61*3

0,07 6,24 0,37

0,15 213 0,19 377 0,15 213

Г,00 0,90 0,88

2,25 2,05 2,10

1,43 826 1,00 620 3,50 1400

А/ Через. 24 часа от начала дображивая ия прибавляли предшественник витамина 5,6.- диметилбекзимидазол.

положение были постаалшш опыты по " добра* яванию". Витекад- - 1 щую из культиватора при Д*0, 16 ч*ч1 культу ральную жидкость в М-; чадшн 5 чаоов собирали в.приемник и виде ржи вал м при 30 градусах - 48 часов. Через 24 часа от начала добраяачшнин м 1 вариант опита дополнительно добавляли лактат ТОК, чтебц Общая концентрация внесенного в среду лактата ооста^ДЯДй 3,£iX как и во II варианте. Как ввдно из таблицы 7 общий орои.ферментации при атом сократился до 4U часов вместо 96 чаоов при обыг-ном периодическом методе выращивания, Количество аиошюсв, выросшей при. дображиванки было одинаковым /порядка 2,0 г/л/. Образование витамина й12 культурой зависало от того при каком остаточном лактате она находилась в условиях проточного культивирования, которые предшествовали ей дображиваяаю в стационарных условиях. Увеличение концентрации лактата натрия /1,3-2,6$/ приводило к снижении образования витакика И12 /826-620 ккг/г /. Но выход витамина li^ j> в конце добралишания в I варианте можно повысить до 1400 ькг/r, прибавляя предшественник витамина Вjj /5,6-Диматилбензимидазал/ через 24 часа от начала дображивания, .

Анализ длительных опытов, в которых в питательную среду С начала ферментации были добавлены ацетат и пропионат натрия, показал, что пропионат ингибирует биосинтез витамина Bjj к> рост культуры Prop, shermanit в то время как ацетат только незначительно ингибирует рост и не оказывает существенного влияния на образование. витамина lij^,

ЬШОШ,-

1. Изменение скорости роста культуры Prop.' вьегюти при низких концентрациях лактата натрия описывается уравнением Моно до концентрации 1,2%, iiuioe этой концентрации наблюдается угнетение роста культуры Рюр. uherminU избытком лактата натрия.

2. Кривая, отражающая зависимость скорости роста культуры Prop, i;hejwuanil от высоких концентраций лактата натрия, представляет совой палого ниспадающую гиперболу. Культура

Prop, shertoanii вначале логарифмической фазы роста эыа-чительно чуетвительнев к действию избыточных концентраций

* 22 лактата,чем в коше логарифмической фазы и в фазе замедленна роста. Под влияние» высоких концентраций энергетического субстрата происходит интенсификация процессов брожения« что выражается в повышении потребления лактата натрия и, соответственно, повышения образования летучих кислот в расчете на граш образованной биодоссы* Однако усиленное потребление субстрата не. сопровождается соответствующим синтезом биомассы. Наблюдается разобщение катаболизма и анаболизма,

3. Продукт брожения - уксусная кислота, подавляет рост культуры значительно слабее., чем прошаововая, Тормозящее действие кислот на суммируется, при наличии двух кислот скорость роста культуры определяется той кислотой, которая находится в относительном максимуме. Зависимость между удельной скорость«! роста и концентрацией пропионата в среде описывается уравнением Иерусалимского, Повышенные концентрации пропиона-та производят изменения в характере брожения. Наблюдается повышенное потребление лактата натрия культурой, снижение об- ■ разоваяия летучих кислот, главным образок, пропионовой, повышается образование нейтральных продуктов и янтарной кислоты и увеличивается аэробное окисление, НаЯладается понижение интенсивности конструктивных процессов, что выражается а уменьшении количествабелка в клетках и в уменьшении скорости роста культуры Prop, sheriaanii,

4. Торможение скорости роста культуры Prop. Bbermanll ч ионами водорода и гадроксшгьными ионами описывается уравнением Иерусалямского, которое аналогично уравнения неконкурентного торможение энзиматическдх реакций» Эта зависимость для гвд-роксильных ионов найдена в стадии ускорения роста после лаг-фаэы, а^ для водородных ионов на значительно более поздних стадиях' развития. При лимитация роста ионами водорода происходит холостое сбраживание лактата натрия без соответствующего синтеза биомассы. Это свидетельствует о том, что ионы водорода не влияют на поступление субстрата брожения в клетку, но разобщают энергетические и конструктивные процессы,

5. У Prop; sheraanii • снижение степени сопряжения энергетических и конструктивных процессов /которое выражается в уменьшении скорости роста ори повышенном потреблении энерге-

тического субстрата на грамм образованной биомассы/, ре зависит от природа лимитирующих рост факторов /высокие кон- : центрации субстрата, продукта брожения иди ионов водорода/, а только от скорости роста. Между велачиной скорости роота в. количеством анергетического субстрата, потребленного в расчете на грамм образованной биомассы, существует обратно* пропорциональная зависимость, которая графически вмражаатоя гиперболической кривой и описывается формулой!

&. Отмечено, что избыточные концентрации субстрата /4,С$/ снижают образование культурой витамина В12. Предложено вносить то же количеств субстрата но ходу ферментации дробно, Поскольку витамин Bjj, является продуктом II-ой фазы роста Prop. Eheiraaall получить его высокий выход в односту-

пенчатом культиваторе без последующего дображиваиня невозможно.

Список работу опубликованных по теме диссертации: ■

1. Нерояова ü.M., Анчурова А.И., Ибрагимова С,И.,и Иерусалимский Й.Д. Исследование закономерности роста Prop, shertnanll методом остро-вроточных опытов* {Ликробиология; * 1967». 36 , 2, 259..

2. Неронова H.H., Ибрагимова С.И., Иерусалимский Н.Д. Влияние концентрация пропиопата на удельную скорость роста- Prop. Bhemanli ЫаЯробиология, 1967, 36, 3, 404.

3* Неронова Н.М., Ибрагимова С,И. Образование летучих кислот л витамина Bjg Вгор, оьагиапи растущей в проточной культуре при избытка лактата. Микробиология, 1969 , 38, 3, 420,

4» Неронова Н.М., Ибрагимова С,И., Работнова И.Л. Кинетика торможения скорости роста Prop. аНелжалИ водородными Н гидрокснлышми. ионами* Микробиология, 1969, U8, 6, 933. 5* Ибрагимова С.И,, Неронова Н.М., Влияние избытка субстрата /лактата натрия/на развитие и образование витамина Bj^

Prop* äwmea&ii 1970, Изв. AK CCGP, I, 77. в, Ибрагимова■С.И., Неронова Н.Ы., Работнова й.Л, Влияние

ИОНОВ ВОДОрОДа На некоторые свойства Ргзр. ehennanii.

Микробиология* Л971, 40, 5, 633. '

?.РаботноваЩЛ., Иванова И.И., Лирова С.А., Андреева ¿.А,; Ибрагимова С.И,; Сахарова З.В,, Шафоростова Л.Д.. Шуль-говская S.M. Особенности роста культур микроорганизмов. Тезисы.докладов 1У съезда Всесоюзного микробиологического общества. Из-во "Наука и техника" Ыинск, 1971, в. Ибрагимова С.И., Сатарова Э.В. Влияние избытка субстрата на некоторые физиологические свойства Prop, etierraanii. Микробиология* 1972, 41, 5* 834. 9, Работнова И.Л., Неронова H.H., Шрахимова С.й., Сахарова З.В», Андреева В.А., Шульговская £!,!■», Исследования кинетики роста некоторых гетеротрофов в зависимости от 1Н1+ и ICKI" в среде. В сб. "Непрерывное и периодическое культивирование микроорганизмов"'. Красноярск, 1972, 86, 10. Ибрагимова С.И., Сахарова З.В., Ингибирущее действие Иродионата натрия на Prop, ahsraanll. . Микробиология ,1974, 43» I, 18.

3,517р. Т.200. "Знание".