Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние факторов водолазного спуска на геном животных и человека

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние факторов водолазного спуска на геном животных и человека"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 1 СЕН П0 ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

РОСТОВСКШ-на-ДОНУ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ' УНИВЕРСИТЕТ

Специализированный совет Д,063.52.08 по биологическим наукам

На правах рукописи

ШИМАНСКЛЯ Елена Игоревна

УДК: 576.312.32/35

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВОДОЛАЗНОГО СПУСКА НА ГЕНШ ЕИВОТШХ И ЧЕЛОВЕКА

03.00.13. - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой стбпени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1994'

Работа выполнена в ' НЖ Биологии Ростовского ордена Трудового Красного Знамени государственного университета и в Институте Эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова (г.Санкт-Петербург)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Е.П.Гуськов ( г.Ростов-на-Дону ) Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Л.Г.Медведев ( г.Санкт-Петербург )

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Г.А.Вилков ( г.Ростов-на-Дону ) кандидат биологических наук В.Н.Гусатинский ( г.Ростов-на-Дону )

Ведущая организация : Военно-медицинская Академия

( г.Санкт-Петербург)

Зашита состоится " 5 " октября 1994 г. на заседании

специализированного совета Д.063.52.08 по биологическим наукам

в Ростовском государственном университете (344006, г.Ростов-на-

Дону, ул. Б.Садовая 105)

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РТУ.

Автореферат разослан " 5 ." сентября 1994г.

Ученый секретарь ^-специализированного совета, доктор биологических наук

- I -

I.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ I.Актуальность проблемы: Перестройка системы отечественного здравоохранения ьключаьт дальнейшие меры по сохранению здоровья и продлению профессионального долголетия специалистов, занятых на вредных производствах. К таким специалистам относятся'лица, работающие в условиях поваленного давления окружающей среда: водолазы, кессонные рабочие, подводники. К основным неблагоприятным факторам, действующим на организм в условиях повышенного давления, относятся увеличенные парциальные давления кислорода и индифферентных газов, входящих а состав дыхательных смесей. Диапазоны парциальных давлений используемых газов достаточно широки, и у кислорода составляют от 0,025 до 0,3 Ша, гелия - до 6-8 МПа и азота - от 0,08 до 0,88 МПа. Действие повышенных парциальных давлений "указанных газов приводит к функциональным изменениям в организме и снижению его резервных возможностей, а в случае действия предельных значений -вызывает патологические сдвиги, ведущие к сокращению профессионального долголетия.

В основе мер профилактики и защиты от неблагоприятного, действия повышенного давления традиционно используется 3 принципа: ограничение содержания кислорода в составе дыхательных смесей пределом его переносимости организмом в зависимости от давления и экспозиции; оптимальное соотношение концентраций азота и гелия в зависимости от глубины или давления и целенаправленный профессиональный отбор. ( Зальцман Г.Л., 1961; Медведев Л.Г.,1986; П.Беннетт, 1988 ). В целом меры защиты и профилактики, разработанные на основе указанных признаков, позволили осуществить в 1981 году компрессию 4 водолазов до давления, соответствующего глубине 686 м^(П.Беннетт), а в морских условиях провести 30 суточное пребывание на глубинах до ЗОТ м (Семко В.В., 1986; Медведев Л.Г., 1986 ). Однако длительные эффекты последействия повышенного давления на организм полностью не изучены.

При' определении связи характера повреждающего агента внешней среды-или их совокупности с возможными мерами защиты и профилактики задача исследователя, по нашему, мнению, состоит в выявлении интимных механизмов функциональных или патологических реакций организма при данном коде воздействия. В области физиологии и патофизиологии подводных погружений механизмы действия неблаго-

- г -

.приятных факторов на большинство функций организма (обмен веществ, кровообращение, дыхание, выделение и др.) исследованы достаточно полно и подробно (А.Бенке, 1968; ЗальцманГ.Л., 1961, 1967, Смолин В.В. 1970; Сапов H.A., 1952,1984; Семко В.В., 1983; Медведев Л.Г., 1983; Lambertsen C.J. 1963; 1974,; . 1.98J; П.Ббннетт, 1988 и др.). Что же касается влияния повышенного давления на пролиферируицие ткани и гемопоэтические клетки, то в зтом вопросе положение не совсем ясное в силу недостаточных сведений о механизмах повреждающего влияния неблагоприятных факторов на хромосомный аппарат клетки, в силу чего меры профилактики и защиты организма в условиях повышенного давления не имеют законченной научной основы.

Одной из причин, тормозящих понимание общих механизмов -развития патологических последствий воздействия факторов .водолазного спуска является недостаточное внимание к использованию цитофизио-логических методов. Школой Насонова и Александрова было показано, что цитофизиологические критерии являются объективным отражением функционального состояния целостного организма.

Применительно к обоснованию мер профилактики и защиты,-а также выявлению "весовой" доли влияния различных факторов водолазного спуска на ядерный аппарат клетки исследования ранее не проводи' лись.

Цель и задачи исследования.Основной целью настоящей работы являлось определение степени влияния основных газов, входящих в состав дыхательных смесей на деление клеток различных тканей в диапазоне глубин, доступных водолазам, и качественная оценка отдаленных последствий этих воздействий.

Для достижения указанной цели представлялось необходимым решить ряд конкретных исследовательских задач:

- в опытах на животных выявить изолированное и сочетанное воздействие основных факторов водолазного спуска в диапазоне глубин доЮОО м на клетки соматических и репродуктивной тканей;

- в опытах на животных выявить возможные генетические последствия в отдаленные сроки после имитационных спусков;

- при лабораторных испытаниях, имитирующих спуски на глубины до 100 м и пребывание подводников в аварийные отсеках под избыточным давлением до 1,0'ЫПа с участием людей, а также после терапевтических сеансов ГБО, исследовать характер изменения хромосом лимфоцитов.

- по результатам исследований обосновать рекомендации по повышению работоспособности и продлению профессионального долголетия лиц, трудовая деятельность которых связана с влиянием повышенного давления.

Научная новизна работы Впервые исследовано влияние изолированного и сочетанного Действия кислорода и индифферентных газов, входящих в состав дыхательных смесей на митотическое деление клеток животных и человека. Впервые показано, что индивидуальная чувствительность клеток организма к повышенному давлению кислорода зависит в большей степени от их генетической природы, чем от продолжительности пребывания в измененной газовой среде.

Практическая значимость работы состоит в обосновании способа оценки индивидуальной чувствительности человека к повышенному давлению кислорода и прогнозирование отдаленных последствий действующих факторов водолазного спуска на лимфоцитах периферической крови.

Основные положения, выносшше на защиту:

1. Повышенные парциальные давления кислорода и индифферентных газов, используемые в практике водолазных спусков оказывают влияние на ядерный аппарат соматических тканей. Наиболее выраженным онтогенетическим эффектом обладает кислород. Функциональное состояние клеток репродуктивных тканей не подвержено сколько-нибудь значимым изменениям в условиях повышенного давления, соответствующего глубинам до 800 м.

2. Клетки кроветворной ткани оказались наиболее чувствительными к повышенному парциальному давлению кислорода.

3. Кластогенным фактором, определяющим нарушение ядерного аппарата лимфоцитов, после воздействия повышенного давления кислорода являются продукты деградации эритроцитов.

Апробация работы.Материалы работы доложены на заседании секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" МНТС ГКНТ, Орджоникидзе, 1986г.; на всесоюзном совещании "Биоантиоксидант", Черноголовка, 1989г.; на IV Всесоюзном симпозиуме "Гиперб-рическая оксигенация" в г.Москве,1989г.; на двух конференциях, посвящениях памяти Е.М.Крепса, проходивших в г.Ленинграде в ВМедА и в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова в 1989г.; а также на кафедре Физиологии подводного плавания ВМедА в 1990г. и в Институте Биологии РГУ в 1991г и 1994г.

Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 19 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация выполнена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав, выводов и библиографического указателя, включающего 83 отечественных и 99 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 28 рисунками и 13 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Постановка исследований на швотных включала анализ аберраций хромосом (АХр) в клетках костного мозга, роговицы глаза и семенников после длительного пребывания животных в условиях повышенного давления кислорода (при давлении 0,3 МПа, изопрессии -5 часов, ступенчатой декомпрессии - 4 часа ), воздушной среда ( с даапэнием 1,1 МПа, компрессией - 15 мин, изоггрессией- 5 часов, ступенчатой декомпрессией - 4 часа ) и гелио-кислородной среды (при давлении 10,1 Ша,парциальном давлении кислорода - 0,21%, температуре - 35,8°С, влажности - 65-75%, компрессии - 5,5 суток, изопрессии 5,5 суток, декомпрессии - 10 суток), а так же изучение цитогенетического и гонадотоксического действия гипербарической оксигенации (при давлении 0,3 Ша кислорода, компрессии и изопрессии по 15 мин., изопрессии - I час), каждое животное получило по 5 ежедневных сеансов. Материалом служили половозрелые крысы - самцы с массой тела 150-200г.,по 10 особей в каждой группе. Животных де-капитировали сразу после окончания воздействия, через сутки, трое, 7, 18 и 90 суток. Исследования контрольной группы проводились параллельно с опытными.' •

Исследование гонадотоксического действия проводили общепринятыми методами морфологии и физиологии, которые позволяют контролировать состояние гонад экспериментальных животных. Изучали характер движения сперматозоидов и его длительность ( Егорова и др., 1966 г.), количество патологических форм, концентрацию сперматозоидов, их осморезистентность ( Саноцкий и др., 1987 г.).

Морфологический статус семяродного эпителия определяли по четырем основным показателям в соответствии с вышеуказанными руководствами: количество нормальных сперматогоний, число канальцев с 12-ой стадией мейоза, индекс сперматогенеза, число канальцев со слущенным эпителием.

Об активности ПОЛ в плазме судили по количеству первичных (диеновые кот,ыогаты) и конечных (шпйфовы основания) молекулярных продуктов ПОЛ. (Shackterler Pollock., 1973). Содержание диеновых коньюгатоь оценивали по характерному для них поглощению при 233 нм 'Владимиров, Арчаков, 1972). Количество цифровых оснований определяли по интенсивности флуоресценции липидного экстракта при 440 нм и длине волны возбуждающего света 360 нм. В качестве стандарта использовали раствор сернокислого хинина в 0,1Н серной кислоте(1 мг. в 1 мл.). Содержание общих лигшдов определяли суль-фованилиновым методом (Колб, Камышев, 1982). Внеэритроцитарный гемоглобин определяли цианметгемоглобиновым методом.

Постановка' и проведение исследование!* с участием человека. Водолазные спуски имитировали аварийные отсеки подвгдных лодок с повышенным давлением сжатого воздуха после возможных аварий. Спуски проводились в гидрорекомпрессионной камере ГРК,Сжатый воздух, подаваемый водолазам, отвечал требованиям ПВО ВМФ 8Б. Двуокиси углерода -0,1%, окиси углерода - 8 мг/м3, уг;:еродов (в пересчете, на углерод) - 50 мг/м3 В исследованиях прълимало участив 18 практически зг.оровых мужчин в возрасте от 25 до 35 лет, имеющих водолазный стаж 5 -15 лет и общее количество спусковых часов от 700 до 7600. Компрессия и декомпрессия проводилась на сжатом воздухе по специальным режимам.Парциальное давление кислорода в период всего водолазного спуска составляло на 100 м - и,231 МПа.

Сеаноы ГБО проводили в ппточно-декомпрессионной камерь ЦЦК-2, снабженной системами повышения и снижения давления и устройствами для подачи кислорода в маски. Для дыхания ис: шьзочали медицинский кислород по ГОСТ 5583 - 78. В качестве испытуемых в сеансах ГБО приняло участие 8 здоровых мужчин в возрасте 18 лет, не имеющих опыта подводных погружений, либо пребывашм в условиях повышенного давления 09. Давление о помощью сжатого воздуха повы-

w

шалось до избыточного давления, соответствующего глубине 15 метро" со скоростью 0,05 Мпа в минуту. На глубина 15 метров испытуемые включались на дыхание кислородом и дышали в течение 90 мгнут. В период пребывания под избыточным давлением кровь брали на 30, 60 и 90 минутах экспозиции. После чего давление снижали дс нормального и испытуемые выключались из масок.

Исследования по выявлению влияния сеансов ГБО - терапии про-

водили с участием бочышх в возрасте от 37 до 52 лет, страдавших различными заболеваниями. Пациенты проходили курс лечения из 10 сеансов ГЕО - терапии в барокамере "ОКА - МТ" при давлении кислорода 0,15 - 0,25 МПа и экспозиции 40 минут, ежедневно. Время компрессии и декомпрессии - 15 минут. Кровь для иссдадоващд брали до первого и сразу после последнего сеанса ГБО - терапии.

Постановка модельных экспериментов : флаконы с культурой крови помещали в стерильную барокамеру, 1\де после пятиминутной продувки кислородом создавали давление 0,7 МПа. Время обработки во всех случаях составило 1 час. Материалом для исследований служила кровь водолазов, практически здоровых доноров и больных с различными заболеваниями.

В одйом из экспериментов повышенным давлением кислорода обрабатывали отдельно цельную'кровь, "чистые" лимфоциты, выделенные в градиенте плотности фикола - вирографина, и эритроциты,.также отделенные от остальных форменных элементов крови. В кавдом случае был проведен цитологический контроль на наличие только "чистых" клеток. Разделение форменных клеток крови проводили по стандартным методикам Линга, 1965 г. при применении прерывистого градарнта плотности'; .

Препараты метафазных хромосом готовили по стандартной методике (Мурхед, 1960 г.) и окрашивали по Романовскому - Гимза. Анализ препаратов проводили по Международным стандартам (Захаров и др. 1982 г.).

Результаты исследований статистически ббрабатывали методом многофакторного дисперсионного анализа о помощью компьютера СМ 1209 по определению главной компоненты, а также по критерию Стыо-дента - Фишера (Владимирский, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛВДОВАНИИ Влияние длительного пребывания яиеотных ь условиях повышенного давления кислорода, воздуха и кислородногелиевой среда на генеративную и сонатичеекие ткани крыс. Результаты однофакторного дисперсионного анализа частоты перестроек хромосом в клетках костного мозга, эпителия роговицы глаза и семенников крыс представлены на рисунке I.

К вотних в тьчение 5 часов подвергали длительному воздействию повышенного давления кислорода 0,3 МПа (3), сжатого воядуха

1,1 МПа в течение 5 часов (4), а в условиях повышенного парциального давления кислородногелиевой смеси ( КТО ) 8,1 (5) и 10,1 МП? (6) при парциальном давлении кислорода 0,2Г МПа в течение 5 суток, а также представлены результаты виварийного (1)и берокамер-ного контролей(2).

Как видно из рис I не обнаружено существенных различий в количестве индуцированных аберрашй в клерках роговицы и костного мозга у животных, находившихся в среде кислорода при 0,3 МПа, воздуха 1,1 МПа и кислородногелиевой смеси при Й,I МПа. Этот факт может косвенно свидетельствовать,что именно собственно кислород играет наиболее существенную рель в индукции перестроек хрсмосом.

ЕЗ - роговица глаза [чч]- костный мозг семенники

Рис Л. Влияние длительного пребывания животных в среде кислорода (0,3 МПа), воздуха (1,1 МПа), КГС (8,1)' МПа и КГС (10,1 МПа) на индукцию перестроек хромосом в разных тканях.

Время пребывания т КГС не повлияло существенно на индукцию перестроек хромосом после и суток при 8,J МПа , по сравнению с пятичасовым пребыванием животных в среде " чистого " кислорода при 0,3 МПа. Однако , воздействие КГС в течение 5 дней под давлением 10,1 МПа ¡значительно усиливает мутационный процесс во всех тканях.

Известно,- что давление кислородогелиевой смеси свыше 10 МПа влияет на проницаемость клеточных мембран (Roth 1980, Bennett 1S88), что может усиливать токсический эффект кислорода. Однако, особенности биологических эффектов режим" КТО требуют специального исследования, которое молвт столкнуться со значительными методическими трудностями, т.к. данный режим оказался высокотоксичным для животных и вызвал летальный эффект у 50% сразу после окончания декомпрессии и 100% гибел1- г течение последующих 24 часов.

Поскольку ранее рядом авторов был обнаружен эффект продленности мутационного процесса после воздействия "чистого" шслорода, нашей следующей задачей явился анализ динамики выхода перестроек хромосом в тканях животных в различные сроки после окончания действий воздуха и кислорода под повышенным давлением.

Сравнительный анализ влияния повышенного давления кислорода и воздушной среда на соматические и репродуктивную ткани крыс в различные сроки последействия. Сравнительный анализ онтогенетических эффектов сжатого воздуха (1,1 МПа-5 часов) и повышенного давления кислорода (0,ЗМПа-5 часов) в течение семи суток после, окончания воздействий свидетельствуют о том, что пребывание животных под давлением в измененной газовой среде не вызывает онтогенетического эффекта в семенниках животных и ткани роговицы глаза. Наиболее существенными оказались результаты воздействия повышенного давления кислорода и воздуха на клетки костного мозга (рис.2).

Обращает внимание факт, что у животных, подвергавшихся действию кислорода уровень аберраций хромосом имеет тенденцию к постоянному увеличению. Это свидетельствует о том, что пребывание животных в атмосфере "чистого" кислорода вызывает в организме по явление каких-то эндогенных метаболитов, которые обладают класто-генной активностью. В этой связи следует обратить внимание на то, что реакция тканей разных животных на воздействие гипероксии и

% перестроек

А

-время-последейст. (сутки)

К

О

I

3

7

§ - воздух 1,ШПа-5час.

п - кислород 0,ЗМПа~5час.

а - достоверные отличия от контроля.

Рис. 2. Пере стройки хромосом в клетках костного .лозга животных после окончания эксперимента.

гипербарии демонстрирует индивидуальные особенности, д то время как после воздействия воздухом уровеш аберраций хромосом в ро говице глаза и костном мозге после 1,1 МПа-5 часов в значительной мере сглажен и имел крайние значения соответственно для названных тканей 2,1-3,6% и 3,1-6,6 %, то после воздействия к.слорода обнаружен значительный индивидуальный разброс и крайние значения для роговицы глаза варьировали от 1,4% до 9,4%, а для костного мозга от 2,0% до 6,4%. Это свидетельствует о том, что различные организмы имеют разный биохимический статус автиоксидантных систем. Этот статус может определяться генотипом особи, стэдый онтогенеза и физиологическим состоянием на момент воздействия стрессорно-го фактора.

В современной литературе, посвященной первичным механизмам развития патологических состояний после воздействия различных видов стресса, основная роль отводится генерации активных форм кислорода. В этой связи были поставлены эксперимьлты по срэвнблию эффективности воздуха и кислорода под дпвлешкм ка". индукторов

АФК. Поскольку прямое определение динамики уровня АФК технически трудновыполнимо на "биологических объектах, для оценки интенсивности свободно-радикальных реакций используют такие косвенные показатели, как уровень диеновых коньюгатов и шиффовых оснований. Сравнение результатов воздействия сжатого воздуха и кислорода на динамику фободнорадакйльных процессов в сыворотке крови крыс (рис.3.) показывает, что общая картина динамики продуктов пере-кисного окисления п^сле воздействия кислорода и воздуха сходна. Некоторые различия заключаются в том, что на 3 сутки после воздействия .кислородом продуктов ПОЛ определяется несколько больше, чем после воздействия воздухом. Эти данные подтверждают то, что главным действующим началов в развитии патологии, вызванной факторами водолазного спуска является не барометрическая компонента, а собственно кислород.

мкм/мг

липида ДИЕНОВЫЕ КОНЬЮГАТЫ

отн.&д./ыг липида

ШИФФОБЫ ОСНОВАНИЯ

20-■16= 12= 8Е

4= О

К

* *

1

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

* 1.

*

0 13 7 (сутки) К • О I 3 * - достоверность

% - воздух 1,1МПа-5ч. § - кислород 0,ЗМ11а-5ч.

Рис.3..Динамика изменения продуктов перекисного окисления в крови животных после пребывания в газовой среде под давлением.

Влияние гипербарической океигенацяи на организм животных

СраЕ.штелькый аьзлиз индукции перестроек хромосом в клетках костного мозга, эпителия роговицы глаза и семенников

крыс.подвергавшихся однократной обработке повышенным давлением кислорода в режиме 0,3 МПа в течение 5 часов и многократному ( 5 сеансов по I часу ежедневно ) воздействию гипербарической оксигенации показал, что многократное кратковременное воздействие "чистого" кислорода вызывает в организме более значительные пов-ревдения, чем длительное пребывание в среде кислорода. Это может указывать на то, что многократные кратковременные погружения способны оказывать более значимое влияние на развитие патологических процессов в организме, по сравнению с однократным длительным погружением. Значительное увеличение уровня аберраций хромосом после фракционированного воздействия позволяет предположить возможность длительно•сохраняющихся изменений генома соматических и генеративных клеток, в связи с чем возникает необходимость оценить характер отдаленных последствий у животных, подвергавшихся фракционированным воздействиям гипербарического кислорода.

Результаты анализа цитогенетического эффекта фракционированного воздействия кислорода при давлении 0,3 Ша по I часу в течение 5 ежедневных, сеансов приведены в таблице I. Суммарные результаты свидетельствуют о различии выхода перестроек хромосом в клетках соматических и генеративной ткани крыс по мере прохождения времени после окончания воздействия.

Так,в клетках костного мозга высокий уровень перестроек хромосом зарегистрирован уже через сутки и к 18 суткам равномерно возрастает до своего максимального значения , однако к 90 суткам он значительно снижается, хотя и продолжает достоверно превышать контрольные значения.

В клетках эпителия роговицы тлаза через 24 часа госле воздействия ГБО также наблюдается почти четырехкратное превышение уровня спонтанного мутационного процесса, которое несколько снижается к 18 суткам, а к 90 - не превышает контроля.

В клетках тестикул через I сутки после окончания сеансов отмечено двухкратное увеличение уровня хромосомных аберраций, 'которое возвращается к контрольному значению к 18 суткам и снова возрастает к 90 суткам. Необходимо особо отметить, что как через сутки, так и через 90 суток восстановительного периода увеличение количества аберрантных клеток зафиксировано только в первом мейотическом делении, в то время как количество аберраций хромосом после второго мейотического деления по-прежнему

ТАБЛИЦА I.

ВЛИЯНИЕ ГБО НА ВЫХОД ПЕРЕОТРОЕК ХРОМОСОМ В КЛЕТКАХ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ КРЫС ПОСЛЕ 5 СЕАНСОВ ПО I ЧАСУ ПРИ ДАВЛЕНИИ 0,3 МПа

ТКАНЬ Время пселе действия (сутки) Кол-во животных Кол-во просмот ренных анафаз % анафаз с перестройками

Контроль 5 2500 1,8 - 0,42

Костный мозг I 3 б г 2500 2500 4.5 ± 0,41 * 6.6 ± 0,56 *

5 5 2340 6,9 ± 0,52 *

10 3 1500 7,3 ± 0,67 *

18 10 4800 8,7 ±0,40 *

90 5 2500 3,5 ± 0,36 *

Контроль 5 2500 1,5 ± 0,18

Эпителий роговицы глаза I 3 18 5 4 4 2000 1800 2000 5,0 ± 0,45 * 4,8 ± 0,49 * 3,2 ± 0,32 *

90 6 2500 . 1,9 ± 0,32

Контроль 5 5000 3680/1320 1,9 ± 0,19 1,6^0,16 / 0,3^0,1

I 4 4000 4,8 ± 0,42 *

Семенники 2800/1190 3,1-0,29 / 1,7-0,2

18 7 3600 2,3 ± 0,67

2592/881 1,9-0,23 / 0,4-0,1

90 6 2978 2260/718 3,2 ± 0,32 * 2,8-0,30 / 0,4-0,1

* - отмечены достоверные изменения по сравнению с контролем Через дробь обозначено I и II мейотическое деление соответственно

находилось на уровне контроля. Это может быть связано с тем, что клетки с грубыми структурными нарушениями, зарегистрированные, нами в анафазах первого мейотического деления, Элиминируются в процессе мейотического отбора.

Сколько - нибудь значительного изменения в спектре количественного распределения типов хромосомных • перестроек в клетках эпителия роговицы глаза по сравнению с контролем не выявлено, тогда как в клетках семенников и костного мозга отмечено явное увеличение доли парных и одиночных фрагментов, причем в клетках костного мозга это увеличение идет постепенно, в зависимости от времени после окончания эксперимента .

Одной из особенностей действия ГБО на организм является то, что структурные и метаболические изменения в течение длительного времени не только не ослабевают, но и прогрессируют, отмечается длительный период последействия. Для выявления отдаленных 1 генетических последствий у животных, находящихся в условиях многократного воздействия низких доз повышенного давления кислорода, нами был поставлен эксперимент, задачей которого являлось изучение влияния данного агента на некоторые показатели сперматогенеза, а также способность ГБО индуцировать доминантные летали.

По функциональным показателям сперматогенеза только относительная масса семенников незначительно падает через 2 недели после обработки самцов повышенным давлением кислорода. Остальные показатели находились на уровне контрольных значений.

Необходимо отметить, что морфологические показатели семяродного эпителия крыс через 2 недели после окончания сегчсов ГБО выявили изменение количества нормальных сперматогоний. Однако, эти изменения нельзя считать существенными, т.к. они укладываются в физиологические нормы ( Трахтенберг и др.,1978). Кроме того.качественный анализ семенных канальцев опытных и контрольных животных показал идентичную картину при микроскопическом исследовании их срезов : семенные кэнальш обычной вытянутой формы, отмечена правильность рядов эпителия, целостность их структуры и лишь незначительное слущивание. Клетки находились на разных стадиях сперматогенеза.

Не находятся в противоречии с этими результатами и данные, по оплодотворяющией способности самцов, подвергавшихся ГБО. Процент

забеременевших, самок в контроле и опыте одинаков и совпадает со среднестатистическими данными, описагчыми в литературе.

Анализ частоты доминантных летальных мутаций показал, что спаривание самцов, подвергавшихся действию ГБО с самками сразу после воздействия ( в течение первой недели ) дает повышение постимплантационной гибели"-по сравнению с контролем, однако эти различия статистически де достоверны. Результаты спаривания, полученные на второй неделе после окончания ГБО , также статистически не отличаются от контроля. Повторное скрещивание животных, проведенное через три месяца восстановигельного периода тоже не выявило достоверного увеличения доминантных летьлей.

Таким образом.воздействие на самцов к^ыс 5 сеансов повышенного давления кислорода (0,3 МПа) не обусловило мутагенный эффект в половых ^летках опытных жиеэт шх, находящихся на стадии стволовых сперматогониев и зрелых сперматозоидов.Устойчивость по этому показателю проявили и сперматида.Можно предположить, что повышен-:шй уровень аберраций в соматических клетках может быть дополнительным источником эндогенных антиоксидантов, образующихся в результате катаболизма биополимеров, которые обеспечивают повышение степени защищенности генеративной ткани от неблагоприятных последствий ГБО (Гуськов,Шкурат 1989).

Результаты исследований,проведенных на живоЧных, указывают на то, что пребывание организма в измененной атмосфере вызывает главным образом нарушения в соматических клетках, которые носят не генетический, а паратипический характер.

Результаты исследований на лимфоцитах периферической крови человека. Модельные эксперименты на животных помогают понять механизм некоторых сторон патофизиологического • действия на организм газовой" среды под давлением, однако ряд объективных показателей могут быть получены только при исследовании человека. Одним из вопросов, ответ на который можно получить только от профессиональных водолазов- как влияет ли длительность времени прибывания на грунте на уровень аберрантных лимфоцитов в клетках периферической крови. Из таблицы 2 видно, что корреляции между количеством часов , проведенных на грунте и частотой аберраций хромосом не обнаружено, хотя среднестатистический уровень аберраций несколько выше популяционной нормы (Бочков 1994). Анализ хромосом этих водолазов, проведенный после

экспериментального погружения ( воздух 1,1 ИПа, 48 чаооь) ыа ¡¡ал возрастание количества клеток с нарушениями ядерного аппарата и эти данше хорошо коррелируют с результатами, полученными г.рп обработке сингьнной цельной крови in vitro (0,7 fffia 60 мин.). Ma таблицы видно, что испытуемые делятся на две группы , в одной из которых уровень аберрантных клеток составил до 25%, причем он не зависел от профессионального стажа или от возраста. Тесты.на работоспособность и субъективные показатели самочувствия та;, же оказались, хуже в группе водолазов, имевшей повышенный уроаынь аберраций хромосом. Это указывает на наследственно обусловленную нестабильность ядерного аппарата клеток, подвергавшихся воздействию повышенного давления кислорода.

Таблица 2

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ ВОДОЛАЗОВ ДО И ПОСЛЕ ПОГРУЖЕНИЙ

Испытуемый Количество часов на грунте Контроль IN VITRO 0,7 Ша 0 IN VIVO 1,1 Ша воздух 3 месяца спустя

1. 2. 3. 4. 5. 4000 ■ 2500 1000 7600 7000 7,6+4,0 6,54-2,8 2,1+0,7 7,0+2,9 4,5+3,3 51,2+7,7 30,4+10,4 36,0+5,5 34,1+5,1 26,3+5,1 71,J+7,6 26,7+4,1 41,0+5,9 56,0+7,6 28,3+4,5 20,4+3,0 24,2)2,1

6 7 8 9. 10 1000 1000 700 800 1000 6,9+2,5 4,3+2,2 0 6,4+3,5 0 16,0+3,4 23,0+4,2 14,2+3,7 17,0+3,9 14,0+2,3 23,0+4,2 20,3+2,9 11,6+2,7 1и,0+6,3 18,6+4,0 9,0+2,2 *

* - достоверных отличий по сравнению с контролем нет. Во всех остальн: х случаях Р > 0,05.

С целью проверки возможности использования такого показателя как нестабильность хромосом в теоте на индивидуальную чубст: и-тельность к .шслороду, на "¡аза отделения 'ПБ0 больниц" 20 г. Poj-

- 16 -

■ • ТАБЛИЦА. 3.

ПЕРЕСТРОЙКИ ХРОМОСОМ У ПАЦИЕНТОВ ДО И ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ СИНГЕННОЙ КРОВИ КИСЛОРОДОМ ПО Д^£ЕНИЕМ И ПОСЛЕ ПРОХОЖДЕНИЯ ПОЛНОГО КУРСА ГБО-ТЕРАПШ

ПАЦИЕНТ.. . ДИАГНОЗ % МЕТАФАЗ С ПЕРЕСТРОЙКАМ

пол.возраст Контроль IN VITRO 0,7МПа, 1час та vivo 0,15-0,25МПа 10 сеансов

1.Г-ов,М. 39 лет ИБС 0 22,2 ± 3,8 20,0 ± 3,6

2.В-В, U. 38 лет Бронх, астма 2,5 - 2,3 * 11,3 ± 4,0 14,3 ± 4,2

З.Н-в, М. 31 год Гастродуоденит 0 12,0 ± 4,0 15,0 ± 4,2

4.Д-ий.М. 49 лет ИБС ' 0 29,7 ± 5,6 30,4 - 6,7

5.Ф-ва,Ж. ' 37 лет Язвенная болезнь 0 18,3 ± 2,2 15,0 - 5,6

б.Ы-ваД. 50 лет Ревмоваскулит 5,5 ± 3,3 21,4 ± 4,6 ' * 14,3 ± 4,2

7.K-6B.M. 43года Облитерирущий атеросклероз 0 16,0 ± 3,6 16,6 i 3,9

8.П-ко,М. 56 лет Бронх, астма 0 26,4 ± 4,8 28,9 ± 6,2

■ 9.с-ва,Ж. • 35 лет Ревматизм 2,2 * 1,8 21,0 ± 4,8 19,4 ± 4,5

Ю.с-ко;м. .52года Язвенная болезнь 5,7 - 2,8 32,4 ¿ 3,7 30,9 ¿ 6,4

* - достоверных отличай по сравнению с контролем нет. Во всех остальных случаях Р > 0,05.

това-на-Дону, у пациентов,которым били назначены сеансы ГБО-терапии,перед сеансами были проанализированы результаты обработки крови 1л vitro (0,7 МПа-60 мин.) и сопоставлены с уровнем перестроек хромосом после окончания сеансов ГБО. Денные анализа приведены в таблице 3. Они демонстрируют высокий уровень совпадения результатов, полученных In vi70 и 1n vitro, причем самочувствие больных не улучшалось в том случае, когда уровень /слеток с аберрациями превышал 25 %, Такш образом, количество клеток с нарушениями хромосом после воздействия кислородом 1л vitro может служить прогностическим тестом на чувствительность к измененной газовой среде под давлением.

Кластогенный эффект эритроцитов крови при воздействии повышенного давлешя кислорода. Ранее было показано, что содержание БЭР значительно варьирует у пациентов после сеансов ГБО. Значительный рззброс по этому показателю бвл обнаружен и в1 наших экспериментах на животных. В этой связи было высказана предположение , что продукты деструкции эритроцитов обладают кластогенной активностью по отношению к ядрам лимфоцитов.

Для решения^ данной задачи был поставлен модельный эксперимент, в котором повышенным давлением кислорода (0,7 МПа, I час.) обрабатывали цельную кровь m vitro (3); чистые лимфоциты,-выделенные в градиенте плотности фиколл-вирогрвфина (2); и эритроциты, также отделенные от остальных форменных элементов крови и отмытые средой 199 Затем обработанные ГБО "чистые" эр1троциты в различной концентрации (4-5цл/мл; 5-10рл/мл; 6-25(ал/мл; 7-50рл/мл; 8-100|хл/мл) были соединены с лимфоцитами, не подвергавшимися обработке, стимулированы ФРА и культивированы в течение 72- часов. Также на кластогенность была проверена культуральная среда (I)(рис.4).

Уровень хромосомных аберраций в " чистых " лимфоцитах, обработанных в среде 199 повышенным давлением кислорода незначительно отличается от спонтанного мутационного процесса. При обработке цельной крови данного донора процент аберрантных метафзз возрос по сравнению с контролем в 8 раз. Эритроциты, обработанные повышенным давлением кислорода, индуцировали аберрации хромосом причем порог кластогенности зависел только от объема эритроцитов, добавленных в среду. Так ,прп добавления в культуральную среду 10 мкг/мл. эритроцитов, обработанных ГБО, сказалось достаточно для

пятикратного увеличения выхода аберрантных метафаз в лимфоцитах. При добавлении 50 мкг/мл. и 100 мкг/мл. эритроцитов количество аберранлых кт^ток, соответствовало величине, получеглой при обработке только повышенным давлением кислорода цельной крови.

% аберрантных лимфоцитов

Рис.4. Кластогенный эффект эритроцитов крови доноров.

Результаты модельного эксперимента показывают, что индивидуальная чувствительность генома лимфотических, клеток к воздействию гипербарического кислорода может быть опосредована чувствительностью мембран эритроцитов к воздействию свободных радикалов. Отсутствие линейной зависимости выхода перестроек хромосом от количества эритроцитов, т.е. пороговый эффект указывает на то, что клястогенный эффект металсодержащих белков, выявленный в проведенном выше эксперименте может быть'" обусловлен не прямым воздействием кислорода на нуклеопротеидный комплекс ядра клеток, а опосредован сложным взаимодействием внеэритроци-тарного гемоглобина с мембранами лимфоидных клеток.

Таким образом, результате представленных экспериментов позволяют выявить последовательность этапов развития патологических реакций клеток на факторы водолазного спуска. В изученных преде-

ВАРИАНТ

1 - контроль

2 - лимфоциты + ГБО

3 - кровь + ГБ0- .

4 - эритр. 5 (хг/мл + ГБО

5 - эритр. 10 цг/мл + ГБО

6 - эритр. 25 цг/мл + ГБО

7 - эритр. 50 цг/мл + ГБО

8 - эритр. 100 цг/мл + ГБО

лах давлений основным источником, инициирующим нарушения ядерногы аппарата клеток является не собственно давление, а содержание кислород- в ере "е. Повышение концентрации кислорода вызывает нарушение эритроцитарных мембран, высвобождение мзталсодержащих протеинез, которые, контактируя с клетками лимфоцитов инициируют процессы перекисного окисления липидов, которые.. в свою "очередь вызывают нарушение структурной целостности хромосом соматических клеток. Так ткани с высоким содержание.,1 метатротешюв (костный мозг) являются наиболее чувствительны™ к кислороду, а гематотес-тикулярный барьер эффективно защищает генератиЕШв клетки от продуктов деструкции макромолекул, возникающих в организме после воздействия кислорода под давлением.

ВЫВОДИ

1. Воздействие на гивотшх 5 часов повышенного давления кис лорода 0,3 Ша, воздуха.1,1 МПА и ге ^кислородной смеси 8,1 ЫПь вызывает повышение уровня аберраций хромосо:: в клетках роговицы глаза и костного мозга. Ведущим фактором индукции перестроек является содержание кислорода, а не степень давления.

2. Наиболее чувствительными к воздействию кислорода под дар лением являются клетки костного мозга по сравнению с клетками роговицы глаза и семенников.

3. Фракционированное воздействие кислородной среда в модель ных погружениях животных 0,3 МПа-5 сеансов по I часу вызывает большее количество абарраций в клетках костного мозга, роговицы глаза и гонад по сравнению с однократным воздействием кислорода 0,3 Ша- б часов.

4. Анализ функциональных показателей сперматогенеза и частоты доминантных деталей у животных, подвергавшихся воздействию кислородом 0,3 Ша - 5 сеансов на выявил достоверных различий по сравнению с контролем. Генеративная ткань явилась наиболее устойчивой, по сравнению с соматическими тканями.

Б.- Анализ лимфоцитов периферической крови водолазов показал незначительное увеличение зависимисти количества клеток с труше -ниями хромосом от суммарного времени проведенного под водой.

6 Воздействие 0,7 Ша кислорода на кровь in vitro виз ;ваот увеличение аберраций хромосом, которое хорошо коррепрует п количеством аберраций, индуцированных пребыванием человека в атмос-

-гофере кислорода 0,3 Wla - 90 мин., воздуха - 1,1 МПа~ 90 лин. и терапевтическими сеансами ГБ0- 0,15-0,25 Ш1а 60 мин.- 10 сеансов. Этот показатель может служить тестом индивидуальной чувствительности к кислороду.

7, Основным фактором, ответственным за индукцию аберраций хромосом в лимфоцитах человека после окислительного стресса является ВЭГ, устойчивость мембран эритроцитов определяет общую устойчивость организма к действию гипероксии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гуськов Е.П., Шиманская Е.И., Шкурат Т.П. Об участии а-токоферола в снятии патогенетических последствий гшюрбаричес-кого стресса //Всесоюзный симпозиум "Стресс и адаптация функциональна нарушений" - Кшенев.-1984. -C.II8-II9.

2. Шкурат Т.П., Шиманская Е.И., Янушевич C.B. Модификация цитогенетического эффекта гипэрбарической оксигенации ILiBK и ее производными. //Депон.ВИНИТИ.- 1985.-Н 3654-85.

3. Гуськов Е.П., Шкурат Т.П., Шиманскаг Е.И., Золотарев Н.4. О цитог.адетических последствиях ГБО-терапии //"Человек и биосфера".-ШТС ГКНТ.- Орджоникидзе.-1986.-С.149.

4. Гуськов Е.П., Шиманская Е.И., Шкурат Т.П. Антиоксидаъгные эффекты предшественников фолиевой кислоты //2 Всесоюзн. совещ, "Биовнтиоксидант".-Черноголовка .- 1989.- С.215.

5. Шкурат Т.П., Шиманская Е.И., Гуськов'Е.П. Прогнозирование отдаленных онтогенетических последствий оксигенобаротерапии //4 Всесоюзн. симп. "Гипербарическая оксигенация" -Москва. -1989. -С.178

6. Шиманская Е.И., Шкурат Т.П., Лукаш А.И., Внуков В.В., Гуськов Е.П. Роль эритроцитов в индукции аберраций хромосом повышенным давлением кислорода //4 Всесоюзн. cirai. "Гипербарическая 01-жгенация" -Москва. -1989. -179.

7. Шиманская Е.И., Гуськов Е.П., Внуков В.В. Сравнительный анализ цигогене тиче ских последствий гипербарии и гипероксии// Всесоюзн. конф. посвященная памяти Е.М.Крепса.- Ленинград.-1989.-0.68.

• 8. Гуськов Е.П-, Шкурат Т.П., Шиманская Е.И. Костный мозг -как универсалвн£ i система адаптации к стрессу.//Всесоюзн. конф.

- 21 -

посвященная памяти Е.М.Крепса.-'Ленинград.- 1989.-С.100.

9. Кощеева Т.А., Нечепуренко А.Э., Шкурат Т.П., Шиманскдя Е.И. Использование микроядерного теста для оценки генетического эффекта гипербарии //Всесоюзн. конф. посвященная памяти Е.М. Крэпса.- Ленинград.- 1989.-0.30.

10.Нечепуренко Â.3., Шкурат Т.П., Шиманская Е.И., Кощеева Т.А. Реакция генеративной и соматических тканей на длительные сеансы гипербарии //Всесоюзн. конф. посвященная памяти Е.М.Крепса.- Ленинград.- 1989.-0.72.

11.Милютина Н.П., Шерстнев К.В., Гуськов Е.П., Шиманская Е.И., Косткин В.Б. Взаимосвязь между некоторыми биохимическими и генетическими показателями после длительной гипербарии //Всесоюзн. конф. посвященная памяти Е.М.Крепса.- Ленинград.- 1989.

12.Гуськов Е.П., Шиманская Е.И..Шкурат Т.П., Янушевич C.B. Николаева Е.Е.Цитогенетические последствия оксигенобаротерапии // . Космическая биология и авиакосмическая медицина.- I990.-N 4.-С.48-54.

13.Гуськов Е.П., Гуськова С.И., Шиманская Е.И., Шкурат Т.П. Влияние гипербарической оксигенации на соматические и генеративные клетки крыс // Цитология и генетика.- 1990.- Т.24.-II г.- С.25-30.

14.Кощеева Т.А., Шкурат Т.П., Шиманская Е.И., Медведев Л.Г. О возможности оценки адаптивной роли соматического мутагенеза //3 Цитология.'-1991.-Т.33.-N 5.-C.I08-I09.

15.Шиманская E.H., Шкурат Т.П., Гуськов Е.П., Медведев Л.Г. Прогнозирование реакции генома соматических клеток водолазов на гхшероксическую среду //Физиологический журнал.- Киев.- 1991.- N 4 »-G.119-124.

IG.Guskov Е.Р. Shcurat Т.P., Shimanskay E.I. Nikolaeva Е.Е. Genetic effects of hyperbaric oxygen therapy.// Mutation research.-1990.- 24I.-P.34I-347.

17.Шкурат Т.П., Милютина Н.П., Нечепуренко А.Э., Кощеева Т.А., Сапожников В.M., Новикова Е.И., Тимофеева И.В., Шиманская Е.И., Дашевский B.C. Перекисное окисление липидов и хромосомные аберрации у мышей после многократного воздействия гелиокислород-ной дыхательной смесью в режиме гипербарии//Физиологический журнал.- Киев.- 1993.- T.39.-N I.-С.89-96.

18.Гусъков Е.П., Шкура? Т.П., Шиманская E.W., Николаева Е.Е. Способ определения индивидуальной чувствительности генома к гипербарической оксигенации. Изобретение. Авторское свидетельство СССР N 1246935.

I9.Shkurat Т.P., SfrUnanskay E.I., Azarova А.Е. The mutagen action of air and oxygen under pressure.//The ill World Congress the In.Society for Adaptive Medicine.-Japan- 1993.-P.115