Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ВИРУСНЫЕ БОЛЕЗНИ ГЕОРГИНЫ И ОЗДОРОВЛЕНИЕ ОТ НИХ МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ВИРУСНЫЕ БОЛЕЗНИ ГЕОРГИНЫ И ОЗДОРОВЛЕНИЕ ОТ НИХ МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ"

303-/0

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ШАТИЛО Вера Ивановна

УДК 635.92 : 632.38 : 58.085

ВИРУСНЫЕ БОЛЕЗНИ ГЕОРГИНЫ И ОЗДОРОВЛЕНИЕ ОТ НИХ МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ

- Специальность: 06.01.11 —защита растений от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1991

Диссертация выполнена в отделе защиты растений Главного ботанического сада АН СССР

Научный руководитель — доктор сельскохозяйственных наук, профессор Ю. И. Помазков.

Официальные оппоненты доктор биологических наук профессор В. А. Шмыгля, кандидат биологических наук, доцент А. Ф. Константинова.

Ведущее предприятие — Всесоюзный научно-исследовательский институт цветоводства и горного садоводства.

К 120 35 03 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева

Адрес 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49 Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА. Автореферат разослан « . . . 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических н

состоится

доцент

В. А. Шкаликов

ОНДАЙ ХАРАКТЕРЯСтаКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Вирусные болезни георгины вызывают потери декоративных качеств, свойственного сорту габитуса куста, ухудшение физиологического состояния растений и, в конечном итоге, вырождение сортов, что приводит к обеднении генофонда ценной декоративной культуры. Георгина поражается рядом широкоспециализировашшх и вредоносных вирусов, многие из которых обладают векторами, тлеющими широкий круг кормовых растений, и, таким образом, является резерватором и источником инфекции для различных сельскохозяйственных и декоратианых культур.

Изучение вирусных болезней георгины и разработка методики оздоровления от них культурой меристемы позволит снизить инфекционную нагрузку, использовать в качестве исходного посадочного материала только безвирусные клоны с тем,, чтобы сохранить в коллевдии ценные, редкие и вырождающиеся сорта. 4 • -

Цель и задачи исследований. Целью являлась разработка оптимальной методики оздоровления георгины от комплекса вирусов. Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи: \ . '

1. определить ввдовой состав возбудителей вирусных заболеваний георгины, их взаимоотношения, распространенность, вредоносность;

2. разработать оптимальные условия получения в культуре .укорененных регенерантов из изолированных апексов георгины; ' ' '

3. определить оф^^ур^у^^одоровяеьтя георгины

.комплекса вир;

ОТ

сй^М^а^йЬЁйоййкШай^ э^ссплантатов Мо«с. свльскохоз. академии ' • 1».!. К. А.

Ил в. ИаА^.

размером 250*50 мкм и 5dq-5ü мкм;

4. выявить возможный вирус-ингибирующий эффект индукторов органогенеза я их влияние на продвижение вирусов в апикальную часть стебля и величину безвирусной зоны.

Научная новизна результатов исследований. На георгине описаны ранее необнаруженные и считавшиеся несвойственными виду Dihiia variabilis возбудители вирусных болезней: неповирусы strawberry latent rin~apot viru3 (вирус латентной кольцевой пятнистости земляники), -irabia mosaic virus (вирус мозаики резухи), raspberry rinsanot virus (вирус кольцевой пятнистости малины), tomato rine-spot virus (вирус кольцевой пятнистости томата), потиви-русн freesia mosaic virus (вирус мозаики фрезии), been yellow mosaic virus (вирус желтой мозаики фасоли), относящийся к груше тобамовирусов tobacco nosiic virus <"вирув табачной мозаики), карлавирус chrysanthemum •virus в (B-вирус хризантем), кукумовирус tom-vto азрегшу virus (вирус аспермии томата), потексвирус potato «Virus x (Х-ВИрус картофеля) И carnation mottle virua Ч вирус крапчатости гвоздики).

Tomato spotted wilt virus (вирус бронзовой пятнкс-'•тости томата) и cucumber nosaio virus (вирус огуречной мозаики) впервые идентифицированы на георгине по внутриклеточным включениям. При сопряженной вирусной инфекции показан как синергизм, так и антагонизм партнеров. Определен гормональный состав питательной среды для полученщ регенерантов из- изолированных меристем георгины. Показано, что индуктором регенерации меристем in vitro

является" гибберелловая'кислота (ГХ). Установлены наилучшие сроки для изолирования меристем георгины. Разработаны оптимальные:условия для ризогенеза. Определена эффективность оздоровления от.комплекса' вирусов при использовании эксплантатов различного размера. Показано, что ГК не охсазнвает влияния на продвижение вирусов в апикальную часть стебля и увеличениебезвирусной■.зоны." '.

Практическая ценность работы.Предложена методика оздоровления сортов георгины от комплекса вирусов, начиная от оценки исходного материала и кончая тестированием полученных растений-регенерантов. ' ■

Апробация -работы. Основные положения диссертации были доложены на конференции молодых ученых и специалистов ВНИИ цветоводства и Торного садоводства (г.Сочи,1988г.), XIII рабочем совещании руководителей служб защиты растений ботанических сйдов СССР (г .Саласпилс ,1989г.). • • " " ♦ *

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 5 статей, отражающих ее основные положения.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах машинописного текста и состоит из введения,', обзора литературы,' экспериментальной части, включающей 5 глав, выводов и списка - цитированной литературы, насчитывающего 356 наименований,.в том числе 244 на иностранных, языках. Работа включает 24 таблицы и 15 рису»-ков. , г -;'.'. '

'.•.,' ; содеркаше рабош , , •■.'

Введете. Обоснована актуальность проблемы, сформулирована цель и, задачи исследования. -

Обзсп литературы. Показана вредоносность вирусных бо-лсз^е] георигш. Приведены данные по видовому составу их возбудителе^.' Аргументировано иедуцее положение метода культуры ткани в ряду приемов получения безвирусных растений к рассмотрены факторы, влияищие на его эфйектив-иость. Проанализированы сведения по оздоровлению сортов Dahlia variabilis.

Натетг*алы и методы исследования» Работа проводилась в группе вирусологии отдела защиты растении Главного ботанического сада АН СССР.

В диагностике и идентификации вирусов, поражающих георгину, а также для проверки оздоровленного материала пользовались следующими методами: визуальнол оценкой зараженности, серологическим тестом двойной иммунодиффузии в агаровом геле по Ouchteriony (1962), индикаторным методом, иммуноферментным анализом и электронной микроскопией ультратонких-срезов. Для электронной микроскопии ультратонких срезов материал фиксировали в 2,5* растворе глутарового альдегида и 1,3% растворе четырехокиси осмия, дегидратировали в этаноле возрастающей концентрации и ацетоне и заключали в смесь эпона с аралдитом. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме "it:b -3", контрастировали 3$ раствором цинкуранияацетата и раствором цитрата свинца. Просматривали в электронном микроскопе

"Philips EII-301".

Изучение взаимоотношений вирусов при сопряженной инфекции проводили на S8 образцах соответствующего числа сортов георгины. Интенсивность накопления и пзатюде^ст-

вив; вирусов в комплексдай. инфе кции расчитывали*. на основании • данных- SLISA; -теста,,принимая;за;100^ 'глнсалалыше:. значения, положительных ■ ре-акций, в ; каэдом ;, эксперименте..„

В:,' опытах ..по. органогенезу , изолированных' апексов : Enhila variabilis использование сорт--^i-iunph de. fcrio ,, в экспериментах - по индуцированному ркз ore незу — с орта Triumph de Paris гг Golden Chàrrn ...В'лсачестве; эксплантатов."

использ овали : верхушеи.: размером • 5, мм±50 ; мш - ( с : последующим изолированием .от: -регенерантов,, полученных .из i них-, in vitra , f апексов 500±50.; мкм) ;.ллеристеш;размером-500±50. мгсл и -250±50..мкм.,Изолирование . проводили ■:в ;стер:шьннх.условиях ■: под ; бинокулярным. микроскопом ,МЕС-1. „Для, стерилизация.;,, растительного ; материала ; использовали:.; 0,1% .раствор, диа— цида, 7С$ раствор этилового спирта^в„сочетании с.дпацздом и : 0,1% ' раствор, сулемы с последующей 3-х- кратной : промывкой стерильной водой. „ Питательная .среда;! для • культивирования. -, эксплантатов включала .макроэлементы по lîurashige, skoog • (1962), микроэлементы.noiiielier. (1956),..витамины по Бу— тенко ,(1974) >и сахарозу..Использовали как .твердые среды, с добавлением агара¿, так ;И -жидкие*,В;экспериментах. примешиись следующие регуляторы роста: ГК;в концентра— днях 3 мг/л, .4;мг/л, 5 мг/л, ,кинетин в.-кондентрациях. -0,5 мг/л, Д. мг/л,., 2 от/л, квдсишлуксусная кислота (ИУК) в концентрациях 0,05 да/л,,0,1 мг/л, .0,2 мг/л; индслил--масляная кислота (ШК)ï0,03 мг/л, 0,05• мг/л,.0,1 мг/л,. нафтилуксусная.кислота.(НУК)> 0,03 кг/л, 0,05 мг/л,, 0,1;мг/л, 2,4 дихлорфеноксиуксусная; кислота:(2,4 Д) -0,01 мг/л, 0,05 мг/л¿; ОД мг/л. Изолирование апексов

проводили 2 конце марта - начале апреля и середине июня, культивировали при освещении люминесцентными лаг злами с интенсивностью 8500 люкс на 16 часовом фотопериоде.

Статистическая обработка данных проводилась ггетодом дисперсионного анализа по Доспехову (1985).

Автор приносит благодарность за постоянную помощь и консультации при выполнешш работы к.б.н. Келдш 1Л.А. и к.б.н. Морозовой С.Е.

Результаты исследовании.

Диагностика и иденти"икация вирусов, попачащих георгину. Определен еидоеой состав возбудителен вирусных болезней георгины. Среди них диагностированы и идентифицированы различными методам! как описанные в литературе в качестве характерных для георгины патогенов: d-i^lia nosi-io virus, potato virui Y, TSi.v u ci:v, так и ранее необнаруженные и считавшиеся несвойственный этому виду хозяина кеповярусы sutU, ai.v, krsv, TorJisv, потивирусы xwt jm:v, отнооящйЯЬЯ к группе тобшловярусов xrv, карланирус ста, кукуьтовкрус tav, потексвирус P'/z и car л 7 (табл.1).

Таблица I.

Диагностика возбудителей вирусных болечне^ георгины

Метод Выявленные в/русы

серологический pvy

иммуноферментный PVY, BIV, ?VX, 31Д7, КЕЬУ, ii:v, TAV, Carl/, era, U!V, Ci:v, BZUV, ТотЛЭУ

индикаторнын pa, ElV, cry

олектронномлгрсс ко- скv, n:v пическлй

В 98 образцах соответствующего числа сортов георгины не обнаружено ни одного случая моноинфекции, как минимум; два возбудителя являются источником патогенеза. Вирусные заболевания проявляются на растениях георгины разнообразными симптомами, в том числе зарегистрировано укорачивание центральной жилки листа, в результате чего' формирует- , .ся специфически деформированная листовая пластинка, напоминающая натянутый лук ("луковая деформация") (табл.2).

Таблица 2. Проявления комплексных вирусных инфекций на растениях георгины.

.Состав ' Частота встречае- Основной тип •.

. патогенов мости .в % . проявления.

■ ЯЬКУ/ syx/ aiv ,. 100/ 71/ 57- морщинистость лис-

CarUV/.RRSV ' товой пластинки. .

S1RV/ АШГ ' 100/ 80 . кольцевая пятнис-

; raiv. . тость

, PVY/ PVX/ TUV 93/78/56 посветление жилок

RRSV/ SLRV 86/ 71 окаймление жилок

CarMV/ AMY

. , PVY/ SXRV/ TAY , 79/ 75/ 71 мозаика •

m/:®7/. SliRV 77/ 69/ 62 . "луковая деформа-

"• • • imsv . ■ ЦЕЯ"

1 SXÄV/ PVY/ RRSV 74/ 70/ 59 линейный узор

• JtlY • ■ ' ' • - \ •

Примечание: неперечисленные в таблице возбудители реже встречаются.в сопряженной;инфекции;

Наиболее:распространенным вирусом среди внешне больных

растений: георгины является рте ,,.. реге. других .встречается ТопНЭУ (табл.3).

; ' . " '.Таблица-3.

.. • ■. Оценка:зарат^енности:вирусами внешне.

больных -растений'георгины с помощью еива -теста. Вирус'! Распространен- . Вирус .Распространен-

. .ность. 1 • / '■ •. ность

•• РТГУ ; '" , 77 V ' •. .." СахИУ . 43

• '.72 ■ : сув- ; 38

т ■ '' . .61 ■ ■ JU.IV 32

БЮТ - ' ' : 56 ' " V ; ■ ca.iv • '-.:■ .28

• шцу; .. 55 ' вхиу ., 16

•'•елг. ■ ;:.■..■ 52 • • 'ТоавДвУ 12

• тау V .. : 50

c2.iv и"тзглг,' идентифицированы по внутриклеточным" включениям. на ультратонких -срезах листьев георгины." Показано что сиу "'формирует в гиалоплазме инфицированных'клеток кристаллические включения - агрегаты с регулярной упаковкой вирусных частиц диаметром около' 30 нм. ; •г.. В гиалоплазме зар^егашх'ТЗЪУ'"клеток обнаружеш специфические; скопления вирусных частиц, диаметром 85 км; На ршшшс.этапа•х..Х1атогенеза.:встречались единичные. частицы -ели• мелкие', скопления, окрухошше мембраной,..предположи-■ ; тельно прбдсзакляидей' собой, элементы, эндоплазматического

- ретикулума (1:11пе,'197Ь;1в- ;1971); Йа/поздншс' стадиях

- развития заболевания отмечены..только ..¿фушше вирусные.

. скопления,-' причей, > оболочка,", их ;"о^ужавдаяД"-имвла'-йевы-"

раженную электронную' плотность. • :

-'.:'' ШУ выявлялся йа ультратошасс срезах'листьев георгины по характерны:.! включениям - пироплазмам.

Пироплазмы представляют собой сферические частицы диаметром 40-50 юл, расположенные в фибриллярном ■ электронно-плотном глатриксе. Обычно клетки содержат одну неограниченную мембраной вироплазму, имеющую округлую или кепра- -вильнуи (Тхзрму.- . . ' •

Сравнительные ультраструктурные.исследования к анализ литературных данных показали, что видовая .принадлежность сот, тзэт-и пну не детерминирует специфичности в изменениях. клеточных органелл* При варьировании степени прояв-. лешш 'под действием разных вирусных инфекций, нарушения в структуре и функциях органелл достаточно универсальны. Уста новлено, что вирус-индуцированные изменения в определенной степени схожи с вызываемыми различннмк повреждающими: клетку. воздействготли либо сопровождающими про- ' "цессы старения. Показано,,что единственным надежным диагностическим критерием является надичие специфических включений -.вироплазм ЮТ , кристаллических включений с:"/ и скоплений частиц ггот в гиалоплазме зараженных клеток.'

-,'' Взаимодействие вирусов при комплексной щкТтещии.

Взаямоотношения вирусов оценивались по интенсжвноати накопления различных возбудителей в комплексной инфекции. Сравнивались варианты,сопряженной инфекции, отличающиеся наличием (отсутствием) в наборе вкусов одного патогена с тем, чтобы выявить фактор, влияющий на концентрацию изучаемых объектовг, ; ' '•/■•• 7

Р7?,.' нгу,. ста, тк?, таг-'- . ; . 2. жгу, ТКУ, ТЛУ. , •■-.". ;.'■'."•.'.. . ;

3. р7х,. pvy, havf ; cvb, et, tay, tonrsy .

4. ?V2, CVB, ..EJV . .

" Дисперсионный анализ данных по накоплению pvx при сопряженной инфекции с различными воз будите лями показал существенность различий меяду концентрациями PVZ в 1 .и 2,1 и 3, 2 и 4 вариантах (табл.4).Во 2 варианте интен-

; , ■ . Таблица 4;

Интенсивность накопления Pia: при сопряженной инсбекции с другими возбудителям ; ""

Вариант Сопутствующие вирусы .Средняя концентрация,^. •

I PVÏ, irv, CV3,\ TS.IV, ÏAV 128 -

. 2 PVY,: b:v, n.:v, tav ..,. * 155

3 •. PVÏ, n:v, cvb, niv, tav, ToiaRSV ' • 161

4 .; PVY, H.ÏV, CVB, TiïV ' ■ ; 121 '

НСР05 24,22 НСР05 3(5,64 ; НСР05 30,64 ■

нср05 2-4= 32«4&' ;'..":.• . 'Улл-

сивность, накЬпления .РТ/х была значимо больше, чем в1,

Что можно - отнести на .-счет подавляющего репродукцию ртх действия ств. В'; 3 варианте концентрация;РУХ также существенно' больше, чем; в Iу следовательно,' присутствие ТотйЗУ ■ в: комплексе возбудителей~~вызывалоуеиление репродукции .

. В 4. варианте гта накапливался, статистически 'значи--; мо: меньше ,- чем:.во 2,' что можно объяснить как уже зареги- • стрированным ингибирувдш действием сув .;> так и "стимули- • рушцим Ф АV. •

"Обработка данных по\ковден^ации • азгтг вила статистическую недостоверность различий мевду вариантами, что явилось следствием,большого разброса.зкаче--

ний и недостаточного для него объема выборки, однако, ' даже в этом случае отмечены некоторые тенденции во взаимодействии патогенов . цри сопряженной инфекции: ' СоиПЗУ и з?ау оказывали стимулирующее действие на'репродукцию руг и к;у. ■ . ■ ■ ■. '

При анализе накопления ti.iv в комплексе с другими возбудителями обнаружилась полная инверсия установленных для рух, РУУ и елу закономерностей: ТоиНЭУ подавлял репродукцию , в то время, как ста ее стимулировал, я ау не оказывал заметного действия на накопление ® »V.

Таким образом, для Вирусов, поражающих георгину, выявлен как синергизм, так и антагонизм партнеров, которые проявляются в зависимости от кошфетных взаимодействующих возбудителей. Проведенный количественный анализ концентрации патогенов, позволяет сделать вывод о том, что и' стимуляциями интерференция вирусов реализуется на уровне репродукции.

Получение растений-регене-рантов'из . изолированных апексов георгины. Испытание различных; приемов получения стерильной культуры апексов георгины показало, что использование 0,1$ раствора сулемы в 5 минутной экспозиции дает высокий процент стерильных эксплантатов;

Изучалось действие ГК, кинетина, эффект их совместного применения без ауксинов и в сочетании с НУК в качестве индукторов органогенеза для изолированных меристем георгины размером 250±50 мкм. Контролем служила среда: без регуляторов роста; Установлено, что ГК в составе среды ус-

коряет рост сформировавшихся органов и позволяет полу- -тать; добеги с развитой надземной 'частью. ■ Статкстичесхсая • обработка данных эксперимента показала, что фятогормон в концентрации 3 кг/л ц 4 мг/л существенно симулирует- по • сравнению с контролем процесс морфогенеза, in vitro-; при: концентрации 5.кг/л:эта тенденция,сохраняется, хотя раз. личия статистаческк.незначиш. (табл;5).•

. . ■ '•' • . -Таблица 5. • -;; ;

Органогенез меристем георгины на средах с раз-

Состав среды для Состав среды для изолированных ° пересадки меристем. % полученных Средние. регекерантов -по ■ I 2 эс. варианту

контроль - 1.1—С без. фктогоршнов Ц-С без йито-" гормонов •■■' 10,0 9,1 '' ' 9,55.

М-С.+ ГК 3 ыг/л ■■ М-С +. ГК 3 мг/л •30,0 27,3 .'/ -28,65

• • ~ - 11' Ь!-С + ГК 4 иг/Л .,'■ 0,0' 0,0 ' 0,0

Ц-С + ГК 4 мг/л -М-С .+ ГК 4 мг/л 41,7 37,5 ■ 39,6 ■

: ' . - " .-. • Ы-С + ГК 4 мг/л-+ кннетин I мг/л. / 0,0 0,0 .'■ 0,0

М-С + ГК 5.мг/л ' IWJ + ГК 5 ыг/л ; . 10,015,4 . ,- ./. 12,7

!«-С + ГК 5 мг/л +■кинетин*!" мг/л : ; 0,0 0,0 ". 0,0 ;

; ■••:;;; V- V;■ 7v,.■. /■* :-кср^ 4,69 /;; • . Примечание:, к да^авд'обозначена. повторНость, .'; '' . г При:сравнении.вариантов с..'раэличной концентрацией ПС.'-1 между собой,.'4 кг/л выявляется оптимальной, так'как-она • существенно улучшает, по'-'сравнению с друтиглл,' органогенез -эксплантатов (табл.5)Кидетин■ г.е проявил свойств шгдутс— тора органогенеза изсшфэвашпос меристе^ георгины: вари-

ант . с концентрацией фетогориона-О.б мг/л cysecucirio не отличался от контроля,.: повышенно" содераангг kzh&tzm. в .'среде-до 1-2 кг/л•угнетало развитие эксплантатов. Если-■ чке-юшегана в: составе среди в комплексе с друп^гс горг-:о-нами.илп без них стимулировало образование ьздгауса и за-„œsjme адвентивных почек, что является хгр-ззгсри^: для действия этого гормона. Использование коиплгжнкх со со. ставу регуляторов роста сред такие не давало положительного результата. Угнетение общей активности. шрСдгенсти-ческих процессов в варианте с ГК 4 ur/л, кгнетагкхг I мгД и НУК 0,05 мг/л вплоть, до гибели растительнкг тканей да-яет объясняться слЕспсом высокой гормональной. Еаськен— ностью'питательной среды. .

Для изучения влияния продолжительности. верасда по:шя . допорных растений на успех индуцированного органогенеза в культуре меристемы георгины проводился эиотерпжнт, в _ котором эксплантаты'изолировали в середина вш г шеа-

живали lia среды сГК в концентраций 3 мт/л. ш' 4 мг/л ■.. как оказывающие; наибольший стимулирующий эффект иареге-

нерацию апексов dahlia variabilis.

Результаты статистической обработки данных двухфак-, :./торного .эксперимента ' по .влиянию■ срока изолирования и состава питательной среды на регенерацию меристем георгины . показали, что ' оптимальными" условиями, являются изолирова-: ние эксплантатов в середине виня и культивирование их на среде, содержащей '4Чп?/л ГК, что существенно увеличивает, по сравнению с остальныглг шриантами, процент получешшх регеиерантов (табл.6).'

' Влияние гибберелловой кислоты на органогенез изо_лкрсванкнх в разное время года меристем георгины

Срок изолкроЕа- Состав среды % полученных ■ Средние

ния меристем регенерантов по

I 2 X варианту

конец марта -

начало.апреля М-С + ГК 3 мг/л 30,0 27,3 . 28,65-

М~С + ГК 4 мг/л 41,7 37,5 39,60 .

середина июня 1Л-С + ГК З мг/л 30,8 33,3 . 32,05 ■

_ ■■ - М-С + ГК 4 мг/л^ 69,2 .72,7 70,95

. НСР05= 6,48

Примечание: к цифрами обозначена повторность.

Статистически значимая разница в количестве регенерантов, полученных на среде с ГК в концентрации 3 мг/л и 4 • кг/л, выявленная при весеннем изолировании меристем, становится еще более заметной в июньском эксперименте при совместном действии факторов продолжительности периода , покоя и концентрации регулятора роста. В то же время,; при культивировании меристем на среде с ГК 3 мг/л коли- . чество регенерантов из меристем июньской посадки несущественно увеличилось по сравнению с весешпш изолированием.

Установлено, что важным фактором, ускоряющим процессы; органогенеза в культуре апексов георгины, является пере- ■ нос регенерантов размером свыше 3 мм на жидкую среду/с : добавлением ИУК в концентрации 0 ,1 мг/л.,

При.изучении влияния размера эксплантата на органогенез в культуре георгины, установлено, что 500±50 мкм . апексы, также, как и меристемы размером 250^50 мкм,. су— «

ществекно лучше, чем в других вариантах, регенерируют на среде, содержащей ГК в концентрации 4 Йг/л. Сравнение успеха регенерации апексов различного размера летнего срока изолирования на этой среде показало статистическую незначимость различия средних значений ( ,23 < FqqI8,51). Это, вероятно, объясняется тем, что на фоне оптимальных, условий культивирования, которыми является, изолирование апексов в середине июня.и культивирование, их на среде с ГК 4,мг/л различия в потенциях к органогенезу; которые обычно вше у эксплантатов большего размера, сглаживаются. ' . " .

Сопоставление данных по органогенезу 500-50 мкм апексов и эксплантатов такого же размера, изолированных от регенерантов, полученных.в.результате 3-4 недельного . культивирования . in vitro 5 мм верхушек георгины на срезах с ГК в концентрации 4 ыг/л и ГК 4 мг/л + кинетиноы . I мг/л,. обнаружило существенное увеличение процента регенерации, в последнем "варианте в случае предкультивиро-вашш доноров 500^50.'мкм апексов (табл.7); В то же время на-среде,, содержащей 4 мг/л ГК этот прием значило да * увеличивал количество'образовавшихся регенерантов, следовательно ,при использовании наилучшей для регенерации . апексов георгины среды, предварительное культивирование 'верхушек побегов,;являющихся'донорами эксплантатов, не. играет' существенной роли» . Напротив;';при использовании ' почти непригодной для органогенеза апексов среды, пред-■верительное культивирование регенерантов, выступающих в "качестве источника изолированных апексов, существенно

Таблица 7.

«.тллцzb градкультквирования донорных 5 мм эксплантатов из сгавивэгенез изолированных от них апексов раз-г'хгсох 50CfeQ мил._' ___

Состги следы Размеры • - -. % полученных Средние эксплантатов тюгенеракхов по ва-_■ - ' I 2 * тжанту

15-С + 13. 4 кг/л : 500±50.мкм •':- ' 57,1 70,0 ~ 63*65 '

- " - . 5 мм - 500±50глкм .71,4 77,8 74,60

VL-C'+ IS 4 жЕр/а . • :.v .. . . • :

+ клеэтен I гг/л 500=50 мкм 25,0 0,0 12,50

- " - 5' мм - 500±50мкм 42,9 50,0 46,45 /. : : ' : ~ НСРС5=29,20 '

-Примечание: ж цифрами обозначена повторность. : увеличивало число полученных побегов, что можно обленить гзыенензем гяорфогенетических. способностей изолированных алаасов в процессе предкультивирования донорных растенкА-ретеаврантов.- \ .

В энехюршентальной индукции ризогенеза у регене— ■' рантов геергиш in vitro испытывались ауксины: ИУК.ИМК, НУК, к 2,4 Д в составе жидких и твердых сред. Показано, что под действием ИУК и ИЖ в концентрации О,05-0,2мг/л: формируется нормально развитая: корневая система. В зави-сгол ости от сорта и агрегатного состояния питательной . среды процент укоренения черенков, in vitro монет составлять '32-92^. Ауксины НУК и 2,4 Д можно применять только в минимально! шзвдентрации, соответственно 0,03 и 0,СЕмг/л. Большие кошентрации являются неприемлемыми* так как вызывают формирование каллуса в основании побега, обильное заложение корневых зачатков, рост в длину которых подав-

лен. Следствием ютибкруюцего воздействия НУК п 2,4 Д па корне образование является формирование ненормально укороченных, утолщенных и деформированных органов л:, , в конечном итоге, .угнетение роста пробирочных растении.

Показано, что рН-среды в интервале.5,5 - 6,5 не ока-■ олвает существенного, воздействия на формлровашю корневой "системы.. ..." ■. ".'. ''..

Оздоровление" клонов георгины от -комплекса- втаусов..

Для'выявления оздоровительного эффекта культивирования в искусственных условиях изолированных апексов_георгины полученные растения-регенеранты проверяли в два этапа: на стадии пробирочного роста и высаженные в горшки. Найдено, что количество безвирусных растений, полученных из меристем размером 250±50 мкм составляло 29$, а • из апексов размерил 500^50 мкм - 10%, следовательно, в работе по элиминированию комплекса вирусов нужно исполь-; зовать размер эксплантата не.более 250±50 мкм, в то ме, .время для оздоровления только от- сну достаточен размер " изолируемой зоны 500±50 ш. . • ' •' ' ■'.;■■; Возможное шггибирующее' воздействие ГК на взфусы, по-ражавдйе. георгану, определяли в эг.сперо.:енте с предкуль-; тивированиём. донорных эксплантатов. - верхушек; размером _ 5 мм-, на. питательной среде с ГК в концентрации 4 мг/л, от которых через' 3-4 недели культивирования изолировали . апексы размером 500±50 мал и-кульигвировали 'на такой на .. среде. Сравнение результатов оздоровления в варианте с . предкультивированием дснорных эксплантатов и без него показало', что различия в проценте получешшх без вирус них

регенерантов очень незначительны, следовательно, ГК не оказывала заметного влияния на продвижение вирусов в апикальную часть стебля-и увеличение безвкусной зоны. -

■ ВЫВОДи. .. . I .При обследовашш. коллекций георгины ТЕС АН СССР и • МГУ- им. М.З.Ломоносова выявлено 15 возбудителей вирусных болезней этой культуры, вызывающих изменение-габитуса ' куста, морщинистость и деформации листовой пластинки, различные типы мозаик.. Ухудшение вследствие вирусного патогенеза'декоративных качеств георгины приводило к: снижению потребительских свойств и вырождению сортов;

й'.Срвди'вдентлфицировашшх вирусов обнаружены характерные для георгины патогены: rnv, fvy, ïstîVu ckv, так-и считавшиеся ранее несвойственными виду Dahlia va-riabili.o НвПОВИрусы: SIRV, , AMV, RRSV, TomUSV, no-тивирусы kjv, bxwv, ' относящийся к группе тобамовиру-сов mv, карлавирус cvb, tav . из группы кукумоЕиру-сов, PVX ■ из группы потексвирусов и еще несистематизированный CarllV. ■

З.На ультратонких срезах меток листа георгины идентифицированы внутриклеточные включения. Ш7, ïswv u сшг. Описаны вярус-индуцированные цитопатологические ■ изменения, которые по большей части носят неспецифический ха-' рактер. . - -" - - ■' ' „

, 4.По результатам ишуноферментного анализа .расчитана'* интенсивность накопления различных вирусов в .комплексной инфекции: Установлен как синергизм, .проявляющийся".не только по выраженности симптомов,, но и по концентрации

вирусоЕ, так к антагонизм партнеров. Показано, чго характер взаимодействия патогенов при сипря-епно, е::цпи зависит от конкретных возбудителе1. Tai., заявлено, что ста подавляет репродукцию rV3- и стпиулкрует репродукцию Т1V , в то время, как Тотззу , усиливащ:!:* пагопде-"ие в клетках георгины ftm, ? г: u хт , сюсслет накопление Т1V.

5.Определен гормональный состав питательной среды для получения регенерантов из изолигюваннше апексоЕ георгины размером 250±50 мкм. Показано, что индуктором регекэра-ции меристем in vitre является ГК, и ее ошммальная концентрация - 4 от/л. Кипе тин в ьебольшо^ концентрации 0,5 ыг/л существенно не влияет на развитие апикальных меристем, повышение содержания титогоопона в среде до 1-2 мг/л угнетает развитие эксплантатов.

Использование комшюхлннх по составу регуляторов роста сред (ГК 4 мг/л + Hinteтин I мг/л + НТК 0,05 мг/л) вызывает подавление общей активности торйогенетических процессов вплоть до гибели растительных тканей, что г*о-яет объясняться слишком высокой гормональной насыщенностью питательной среды.

6.Отмечено, что вали ¡км фактором, ускоряющим рост регенерантов свыше 3 мм, является перенос их на -чндкую питательную среду, содеркадую ИУК в концентрации 0,1 мг/л.

7.Впервые для георгины определены закономерности изменения морфогенетических потенций эксплантатов в зависимости от протяженности! перлода покоя докорных растениГ и установлены наидучиге ct о:::- z. я гзодл^вашч. • ер, стег

георгины - середина поня. .Применение - оптимальных/услог-впй: изолирование .'эксплантатов в середине .июня'и культивирование их па среде с-ГК в концентрации 4 . мг/л дает. 71$ регенерации меристем. . " '

б.Найдено, что на фоне оптимальных условий культивирован:'^!, который! является изолирование апексов в сере-дине нюня и введение-В'среду.ГИ-в концентрации-4.мг/л,,. различия в потенциях к органогенезу/у. эксплантатов размером 500*50 мкм и 250±50 мкм сгла-киваются;. вследствие чего'выход рс^екерантов-существенно не различается в обоих: вариантах....

9.Впервые для:культуры георгины in vitro разработаны.; оптимальные условия для ризсгенеза* .Показано, что на. процесс заложения и развития корней оказывает, заметное , воздействие наличие регуляторов роста в.питательной среде. Установлено, 'что природный ауксин ИУК и его синтетический аналог ЮЖ . дают устойчивый положительный эффект,-в кориеобразовании при применении их в концентрации 0,05-0,2-.мг/л.: В зависимости от сорта георгины-и агрегатного состояния питательной среды процент укоренения;черенков in vitro мсжет составлять 32 — 92$.

Показано,,что рН среды в интервале 5,5 - 6,5 не оказывает существенного влияния на.формирование. корневой системы..

Ю.Найдено, что количество безвирусных растений-реге-нерантов, полученных из меристем размером 250±50 мкм,", -. составляет 29$, а из апексов размером 500±50'мкм - 10$,. следовательно,, неэффективно ..увеличение размера эксплан-

татов георгины, культивируемых хл vj.tro с целью оздоровления от комплекса вирусов. В то ле время, для элиминирования cr.v достаточен размер изолируемой зош 5СС-50 мкм.

II.Сравнение результатов оздоровления в вариантах с ьредкультивированием донорных эксплантатов на среде, содержащей ГК, и без него показало, что различия в проценте полученных безвирусных регекерангов очень незначительны и, следовательно, ГК не оказывает заметного влияния на продвижение вирусов в апикальную часть стебля и увеличение безвирусной зоны.

От комплекса вирусов оздоровлены сорта георгины Tri-ш ph de Riria и Преферанс.

Список работ, опубликованных по тс-е диссертации.

1.Шатило В.И. Оздоровление георгины от вирусной инфекции методом культуры ткани // Ускорение научно-технического прогресса в цветоводстве и горном садоводстве: Тез.докл.конф.мсд.учен.-С очи,1988.С.127.

2.Прокошна И.И.,Шатало B.I1. Некоторые вопросы противовирусной защиты коллекции жимолостей и георгины в ботанических садах // Защита растений в ботанических садах и сохранение экологического равновесия : Тез.докд.ХШ раб.совещ.руков.служб защ.раст.регион.бот.садов.-Рига, 1Э89.С.100Л01.

3.Прокошина И,И. »Шаткло В.П. .Келдыш М.А. Контроль распространения вирусов жиг'олсстей и георгины // Бзл.Гл. бот.сэда.-1990.-Вып.157.-С.69-72.

4.1лтило 3.И. .Келдыш М.А..Исрсзова С.Е. Гор"очалы:£_ч

индукция органогенеза изолированных апексов георгины // Бш .Гл. б от. с ада,-1991.-Вып. 159.-С.68-72...

' б.Шатило В.И. Некоторые закономерности ризогенеза у-побегов георгины'in vitro // Вал.Гл.бот.сада.-1991,-Вып.159.-С»72-75.

Объем l'/j п л

Заказ 2139

Тираж 100

Типография Московской с -х академии им К А Тимирязева 127550, Москва И 550 Тимирязевская ул, 44