Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вегетативная совместимость у Verticillium dahliаe Kleb.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Вегетативная совместимость у Verticillium dahliаe Kleb."

РГ 6 Ом

- 3 |'! • 1 1'. 7 На правах рукописи

УДК 575.22.75:582.28

АКИМОВ Георгий Иванович

ВЕГЕТАТИВНАЯ СОВМЕСТИМОСТЬ У УЕ1ШС1ШиМ РАНЫАЕ К1.ЕВ

03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ДУШАНБЕ- 1997

Работа выполнена в Институте физиологии растений I генетики ЛН Республики Таджикистан.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

академик АН Республики Таджикистан, доктор бноло гическнх наук, профессор Усманов П. Д.,

кандидат биологических наук, старший научный сотруд ннк Портенко Л. Г-

доктор биологич'ескнх наук, профессор Бободжанов В- А кандидат биологических наук, старший научный сотруд ник Шахобова Б. Б.

Ведущая организация — Таджикский Аграрный Упивер ситет.

защита состоится « 1997 год

н « 40 » часов на заседании диссертационного совст Д 065.01.06. по защите докторских диссертаций при Таджнь ском Государственном Национальном Университете' (73402^ г. Душанбе, пр. Рудакн, 17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке уш г.ерситета.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Автореферат разослан

И. о. Ученого секретаря диссертационного совета, доктор химических наук,

профессор

КИМСАНОВ Б. X.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность Т5мы. Среди почвенных мицелиальных грибов 1Льзое хозяйственное значение имеют-виды вызывающие заболева- 1 [я культивируемых растений. Серьезный экономический ущерб на-юят штаммы вида Vertlclllium dahliae Kleb. Этот патоген вы-шает трахеомик.оэное увядание,, известное как вилт или верти-1ллез, у примерно 800 видов древесных, кустарниковых и травя-ютых раотений, сведи которых много ценных сельскохозяйствен-dc культур (Филиппов.Андреев , Базилинская, 1980). Основной ¡рой борьбы с заболеванием является селекция им; ;нных соитов стений. Для этого требуется детальное знание биологии и ге-!ткки возбудителя вилта.

V. dahliaeотносится к классу Несовершенных грибов утрати-[их d процессе эволюции половую.стадию раьлножения. Их единс-|енным источником комбинативной изменчивости служит парасек-'альный цикл. Первая- стадия цикла - г.етерокариоз ограничивает-[ существованием групп вегетативной совместимости (ГВС). 06-!Н генетической информацией возможен только между вегетативно 1вместимыми штаммами, которые входят в одну ГВС. Вегетатиь .о ^совместимые штаммы н^ способны формиропать жизнеспособный ге-¡рокарион при совместном росте и входят в разные ГВС. Анализ «знака вегетативной совместимости проводится у многих видов целиальных грибов (Дьяков, Долгова, IS95). Главным методом нарушения различных ГВС в настоящее время стал метод основа-[й на использовании мутантов, не способных утилизировать нит-т ( nit-мутантов), являющийся нетрудоемким и позволяющим оце- ■ вать большие выборки популяций (Портенко, 1992.' .

Изучение вегетативной совместимости у возбудителя вертици-;езного вилта позволит оценить вклад парасексуального цикла в. 'щую гёнотипическую изменчивость патогена, в том числе его 1ль з возникновении новых физиологических рас; расширит знание генетической гетерогенности природных популяций й внутривидо-'й дифференциации; прояснит ряд микро э п олюцн онных процессов ¡отекающих п поп; гчциях, поскольку отсутствие вегетативной со-;естимости препятствует интеграции клонов в популяции, а полиций в виды. Полученные данные послужат хорошим инструментом я наработки мер борьбы с патогеном и разработке теоретических но:) селекции растений на вмлтоустсйчнпссть.

Цели и задачи исследования. Цели нашей работы заключались . в разработке метода применения nit -мутантов в исследованиях вегетативной совместимости у штаммов .V.dahlias и изучении этим ■ мет дом вегетативной совместимости у штаммов V.dahliae изолированных из различных растс-ний-хозяев в разных странах и принадлежащих ко всем физиологическим расам вызывающих вилт хлопчатника в Средней Азии.

В работе ставились следующим основные задачи:

- подобрать оптимальные условия для выделения nit -мутантов; •

- идентифицировать спектр фенотипических классов nit -мутантов.и выделить у исследуемых штаммов мутанты пригодные для тестов на вегетативную совместимость; ,

- оценить вегетативную совместимость физиологических рас возбудителя вилта распространенных в Средней Азии;

- оценить вегетативную совместимость штаммов V.dahliae вц-• зывающих вилт хлопчатника в Средней Азии с штатами из разных

растений-хозяев и стран;

- изучать особенности гетерокариоза и диплоидизации у веге тативно совместимых nit-мутантов разных штаммов.

Научная новизна работы. Впервые составлен фенотипический спектр nit-мутаций у ..dahliae," изучена вирулентность nit-мута-нтов к хлопчатнику, проанализированы гетерокариоз и диплоидиза-ция nit -мутантов вегетативно совместимых штаммов. Показана перспективность применения nit -мутантов для изучения вегетативной совместимости у v.dahliae. Установлено, что все тестированные .штаммы возбудителя вертициллезного ви.ты хлопчатника из Таданки стана и Узбекистана, принадлежащие кп воем известным в настояще :время физиологическим расам распространенным в Средней Азии, ве . гэтатпвно совместимы. Среди 60-ти изучавшихся штаммов пз семи растений-хозяев и одиннадцати стран идентифицировано 4 ГВС. Абсолютное большинство штаммов (57) вошло в ГВС-I, что указывает на низкий уровень гетерогенности по признаку вегетативной совме отимости у V.dahliae и возможность практически неограниченного обмена генами ¡з природных популяциях этого фитопатогена.

Практическая ценность тботы. Отсутствие генетической изоляции между раз точными физиологическими расами возбудителя вертициллезного вк-та хлопчатника указывает на возможность их гибридизации в природных условиях- и возникновении новых рас в ре-

>ультате осуществления парасексуального цикла. Новые расы мо-'ут вызывать поражения культивируемых устойчивых сортов. Зная' Расовый состав штаммов патогена на хлопковых полях и генет^-1еокий механизм процесса' раоообразования, который происходит .' ] ходе комбинатияной изменчивости; можно прогнозировать возмо-сные эпифитотии. Jmет этого положения при•сортосмене позвдлит • [збежать еопышки заболевания. Необходимо вести направлены^ по-ick или создание цитоплазматичеоких агентов, таких как вирусы I вирусоподобные частицы, снижающие общую жизнеспособность па-■огена. Возможность их передачи в природных популяциях латоге-ia в результате горизонтального переноса; который происходит [ри слиянии гиф разных'штампов, может существенно повлиять на 'лучиение фитосанитарного состояния полей.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на: ¡асииреуных заседаниях лаборатории генетики микроорганизмов эдела генетики АН' Республики Тадаикиотан (Душанбе, 1992,1993); торой Научной конференции биохимического общества Республики 'абяикистан (Душанбе, 1996); научной конференции посвященной 0-летию со дня рождения доктора биологических наук, профессора A.A. Прокофьева (Душанбе,' 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура, и объём работы.' Диссертация изложена на 116 границах машинописного тедста и.состоит из введения, обзора и.тературных данных (I глава), описание использованных в рабсь- • е материалов и методов (I глаза), (экспериментальной части (3 лав'.:) , заключения, выводов и-списка использованной литерату-ы. Работа содержит 23 таблицы и 10 рисунков (фото). Перечень «тированной литератур вклачает Г7Б названий, из них 43 на усоком языке. ■ .. • . . ,' - , "

- С0ДЕИШ1КЕ РАБОТЫ

Исследования проводились в лаборатории генетики ыикроор-аннзмов Отдела генетики АН Республики Таджикистан с I99C по | Э95 года. -■ . .

ОБЗОР ЛШЕРАГУРЫ

Б этой главе представлены литературные дашыз по вегетати-ной совместимости - явлению широко раслсзстраненнсму среди ци-елнальгелс грнбоь, мзтгдах г.з оценю:'и' "лсполь:?счтнии пгтежейв 2гета?ивноП с0ьмяста!гс?;: для она-иза яр-гюднис пспуящлВ. гри-

бов.' Показана перспективность оценки вегетативной совместимости методом основанном на использовании nit-мутантов и его недостаточная разработка для V.dahliae и слабея изученнооь признака вегетативной совместимости у этого гриба.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования служили 60 штя; .лов v.dahllae поддерживающиеся в коллекции лаборатории. Штаммы были изолированы из следующих растений-хозяев и субстрата: хлопчатник - 21 штамм, почва хлопковых.полей - 15, земляника - 7, томат - 7, перец - 5, почва - I, баклажан - 2, бамия - I, огурец - I. ИзО' ляция проводилась в следующих странах: Таджикистан - 25 штаммо: Узбекистан - 10, Великобритания - 7, Молдавия - 5, Израиль - 3 Россия (Краснодар) - 3, Марокко - 2, США (Калифорния) - 2, Бра зилия - I, Испания - I, Франция - I. Вирулентность к хлопчатнику у всех штаммов, иоключая израильские, была изучена ранее в лаборатории. Штаммы отнесли к физиологическим расам - О, I, 2, 3, 4 распространенным в Средней Азии. Так же ранее в США бы ла оценена вегетативная совместимость у двух штаммов - штамм_ Т-'? вошел в ГВС-1, а лтамм SS-4 вошел в ГВС-2 ( Joaqulm, Rowe, 1990).

Выделение nit-мутантов и исследования на вегетативную о-вместимость проводились по методике предложенной Пухалла ( Puh-alla, 1985). Селекцию хлоратустойчивых мутантов осуществляли на трех питательных средах: зерновой среде с хлоратом (ЗСХ),-картофельной среде с хлоратом (КСХ) и минимальной среде с хлоратом (МСХ). Селекцию nit-мутантов, тесты на вегетативную совместимость, изучение гетерокариоза и диплоидизяции проводили на минимальной среде (MC), которая содержала в качестве единственного источника азота - нитрат. Спектр фенотипических классов nit -мутантов иде;.тифщировали на четырех питательных средах содержащих различные источники.азота - нитрат, нитрит, ги-поксантин и.аммоний по »-етодике предложенной Корреллом и др.

( Correll et al., 1987).

'Вирулентность штаммов дикого типа и nit-мутантов к хлопчатнику определялась в срагскерейных условиях по общепринятым методикам - методом инокуляции суспензией конидий патогена в стебель растения и методом инокуляции растет.;я путем погрукет его корневой системы з суспензию конидий патогена. Б качестве сортов-дифференциаторов использовались сортаАндптан-S,

:08-2> Соззур1ии Мгзи1;ит (Ъ.) И ЛИНИЯ 0144 О.агЬогеит..

Гетерокариоз и диплоидизацш у п!1;~-.:утантов изучали по об-¡епринятым методикам. •

Все лабораторные и оранжерейные оп^гы проводились в 3-5-и кратных повторностях. Статистическая обработка эксперимен-альных данных дана по Г.Ф. Лакину (1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Селекция и. идентификация фенотипических клаосов п!1;-мутан-ов проводились у 60-ти штагялов у.ааЫЛае. В> таблицах по данно-у разделу представлены результаты полученные при тестировании яти штаюлов показавших характерные результаты для всей изуча-шейся группы штаммов. Во всех таблицах приводятся значения ве-ичин средней арифметической. Значения величин среднего квадра-ического отклонения были подсчитаны во всех тестах. Они явля-тся незначительными и в таблицах не приводятся.

Ингибкрованиа радиального роста штаммов у.д^ипк на хло-атсодещащей среде. Шгзг.лга зыращизали на МСХ с концентрацией лорат'а калия л среде - 15 и 30 г/'л. При этом определялась оп-имальная концентрация добавления хлората в питательную среду инимально ограничивающая скорость роста штаммов, но позволя-дая выделять мутант'• И хлоратустойчивый мицелий. В качестве знтроля штаммы выращивали на МС (табл. I). .

Таблица I.

Ингибирование радиального роста штаммов У.йаЬНае на МСХ

.....г саг,ял ! 1 1 ! | Растение-хозяин г .........—"Г ! Страна ! 1 ' I 1 ' ! ! ! ! ! Диаметр колонии в % от контроля при концентрации хлората калия 15 г/л 1 30 г/л

Э-4 хлопчатник СС'А • 21,3 18,0

-9 зиипчатник США 81,9 68,4

г1-3 хлопчатник 'Таджикистан 33,1 25 2

-70 почва Таджикистан 47,7 39,7

¡-2 перец Россия 49,4 38,4

)едчее 46,5 37,9

Наименьший диаметр колоний штаммов- ипбл-эдался на МСХ с ко-¡ентрацие.1 хлората калия - ЗС.г'/л.и составлял з.среднем -',97о от контроля..Нф::'этои..жгйЙнрЬвание радиального.' роста ита-

: б

ммов было максимально и составляло от 31,6 до 82^0^ отконтро-. ' ля. Средний диаметр колонии при росте штаммов на МСХ с копцен-трацией хлората калия - 15 г/л был больше на 8,ь/!, а ингибиро-вание радиального роста штаммов было ниже и сослвляло от 18,1 до 78,7?$. Таким образом, хлорат калия в кг центрации 15 г/л меньше ограничивал рост большинства штаммов, лить у наиболее чувствительного штамма - SS—4 диаметр ко. :>нии составлял 21,3% от контроля.

Fuaariun oxynporum более чувствителен к хлорату калия. Концентрация 15 г/л в питатзльной среде практически полностью подавляла рост птаммов этого'вида ( Puhalla, 1985). Уу.а1Ьо-atrua данная концентрация сильно не ограничивает рост штаммов (Correll et al., 1988).

Исходя гз полученных результатов в дальнейших опытах по селекции хлоратустойчивых мутантов использовала среды - 3GX, КСХ и МСХ-с добавкой хлората калия в концентрации 15 г/л.

Селекция хлоратустойчивых мутантов. На питательных средах - ЗСХ, КСХ, МСХ отменно 2 типа хлоратустойчивых мутантов. Первый - образуется мутантньм мицелием обладающим более обильной споруляцией и скоростью роста, чем мицелий дикого типа. Он проявляется как пятна плотного роста среднего размера 0,5 см хо- • poíno заметных на поверхност" основной колонии дикого типа. В ' данном случае хлоратустойчивые мутанты возникают- внутри колонии дикого типа. - Если хлоратустойчи :-1й мицелий возникает с крш основной колонии, то он опережает ее по скорости роста образуя второй тип мутантов - хлоратустойчивые сектора.

Из обоих типов хлоратустойчивых мутантов были получены nit-мутанты.'Но при выделении последних из пятен всегда существовала вероятность тгго, что вместе с хлоратустопчивым мицелием захватывался и мицелий дикого типа при отборе микробиологической иглой, так как толщина пятен в большенство. случаев не значительна. На МС рост мицелия дикого типа всегда подавлял рост"nit-мутантного мицелия. Это вызывает искажение результато: экспериментов. При селекции nit-мусайтов ил хлоратустойчивых секторов случайный захват мицэлия. дикого типа исключен - хлора' устойчивы" мицелий легко- отбирается с края колонии дикого типа Ввиду этого все тесты проводились только с хлоратустойчивыми секторами.

На всех хгорятсо,,' рт&'цпх средах наблюдалась 3 типа хлорат

стойчивых "екторся. Первый - мицелиаль 'i:!i, характеризуется азЬитием быстрорастущего мицелия без образования микроскле-. оциев, Второй - -ицелиально-микросклероциальный, характери-уется развитием быстрорастущего мицелия образующего микроск-ероции. Визуально он отличается от мицелиального наличием бо-ее темней окраски. Третий - мнцелиальный с обильной слоруля-ней, микросклероциев но образует. Он зозникает на ранней ста-ии роста колонии дикого типа и почти полностью i эдавляет рост той колонии. Основная колония язляется хлоратустойчивой, а ицелий дикого типа просматривается как небольгаа. впадина по рая роста этой колонии. Сектора первых двух типов возникают а более поздних стадиях развития колонии дикого типа, не по-авлдат joct этой колонии, которая является основной, и прос-атриваются как выпуклости на краю этой колонии. Они могли ыть по одному и болыпе на основную колонию, отдельно или вме-Т8. Сектора третьего типа всегда были, только по одному и не огда не росли совместно с другими секторами. Наиболее часто у сех штаммов возникали сектора мицелиального типа. Из секторов . сех трех типов были получены nit-мутанты.

Частота возникновения хлоратустойчипых секторов зависила т типа хлоратсодеряащей среды и'1 которой выращивали штаммы табл. 2). Число секторов на колонию было максимально на ЗСХ я

Таблица 2.

Частота возникновения хлоратустойчивых сек: оров у штамтлов V.dahliae

!тамм j Среднее число секторов на колонию на средах

! КСХ ! КСХ 1 ЗСХ

SS-4 2,2 1,3 2,9

'-9 1,1 0,9 2,6

л1-3 2,4 3,6 2,9

-70 2,4 1,0 2,7

.0-2 1,8 2,0 2,7

¡реднее 2,0 1,8 2,8

вставляло 2,8. Анализ данных по всем 60-ти штаммам показал, 1ТО- в бсльшенстЕе случаев наименьшая частота в ;някновс!ГОя иу-•аций хлоратустойчивосги наблюдалась на более бедной сродо. Таща же результаты показаны и на Р.охуорогит (РиЬаНа, 1905;

Correll et al., 19S7). *

Селекция nit -мутантов. Мутация хлоратустойчивости может быть связана с неспособностью утилизировать нитрат. Для обнаружения такой связи кусочек мицелия хлоратустойчивого сектору высевали на МС. Хлоратустойчивый мицелий обладающий способностью усваивать нитрат давал начало плотной колонии темного цвета, нормально образующей воздушный мицелий - фенотип роста дикого типа. При неспособности хлоратустойчивого мицелия усва^ ивать нитрат возникали' истонченные, бесцветные, полупрозрачны! колонии практически лишенные воздушного мицелия - фенотип роо-та nlt-мутантного типа. Различий по скорости роста между обоими типами колоний не наблюдалось. Выделенные nit-мутанты из разных штаммов обладали одинаковым фенотипом независимо от фа-нотипического сходства или различия этих шта?.мов.

В ходе экспериментов нами получено около 800 nit-мутан-тоь. Частота их возникновения определялась по их доле среди общего количества хлоратустойчивых мутантов, выделенных на различных хлоратеодержащих средах (табл. 3). Доля nit-мутантов

Таблица 3,

Частота возникновения nit-мутантов у штаммов V.dahliae i . Штамм ! Доля nit-мутантов среди хлоратустойчивых, % на

| средах_______

! МСХ ! КСХ ! ЗСХ

SS-4 33,3 25,0 46,8

Т-9. 38,2 27,4 32,6

Хл1-3 27,2 ■ 50,0 49,1

П-70 33,3 30,2 39,7

Пе-2 25,0 33,3 33,3

Среднее 31,4 • 33,2 40,3

была максимальна на ЗСХ и составляла 4.0,3% и минимальна на МСХ - 31,4%. Ни у одного из 60-ти изучавшихся штаммов доля . nit -мутантов не превысила 50/ь и не была кике 25%. YF.oxyepo-rrm так же отмечен меньший выход nit-мутантов на ...СХ, чем на ЗСХ и КСХ (Correal et Ü1..I9B7), в целом, у штаммов v.dahli-ае наблидалась более высокая частота возникновения хлоратусто-йч'. бьех г.ег.торов я богл'о нн.зче»л - nit -мутантов сроки них, по сравнению с наиболее кэуче в пт.-.t плане r.oy.vcporun (Cor-

ell et al. 1907). Ото может быть частично обусловлено при-.'Сью спонтанно возникающих мицелиальных вариантов у v.clahl-аеобладающих повышенной скоростью роста, но не устойчивых.к 1здействига хлората. Они по внешен виду идентичны быстрорас-гщим хлоратустойчивым секторам.

У nit -мутантов представляемый в таблицах штаммов было юанализировоно I'10 спор. Среди•выросших колоний 100% сос-1вляли nit -мутантные. Учет пересевов nit -мутанте 60-ти штам-)В на МС и среды с различными источникам! азота позволил выя-1ть реверсии к дикому типу. Частота реверсий составляла от 2 ) 1% от о дего числа пересевов. При хранении nit -мутантоь она юрастала и достигала 15%.

Иде л'ификация фенотипических классов nit -мутантов. Различ-ю фенотипические классы nit-мутантов hcti.j идентифицировать визуально по типу роста колоний nit -мутантов на 4-х пита-зльных средах с различными источниками азота. Наблюдались то->ко 2 типа роста - рлст дикого типа и рост nit -мутантного ти-j. По характеру роста на азотсодержащих средах идентифицир„-1HO 4 фэнотипических класса nit-мутантов. Для их обозначен я [¡пользовали символику ранее введенную на других в"дах грибов Cove, 1976, 1979;Karzluf, 1981: Corrcll et al., 1987): мута-гы, не утилизирующие нитрат, но обладающие ростом дикого типа i средах с нитритом, гипоксантином и аммонием - nitl; не утп-язирзтощие нитрат и гипоксантин, но растущие как дикий тип на редах с нитритом и аммонием -,nltM;He утилизирующие нитрат я итрит, но растущие как дикий тип на средах с гипоксантином и ммонием - nit3; но утилизирующие нитрат, нитрит и гипоксантин, о обладающие ростом дикого типа на среде с аммонием - nit2; астущио как дикий тип на всех азотеодерпеащих средах считались, евертантами.

у Р.охупрогии (Correll et al., ¿997) и F.BsonilifoKne (Kli-tioh, Leslie, J987) йдеитифицированно только 3 фенотипичоекпх ласса nit-мутантов: nitl, nitlt и nit3. Предпологается, что у '.osysporua nit—м^ ?анты класса nit2 могут быть неустойчивы к оздействии хлората, что исклю ..от возмоотость их выделения на. лоратсодеряащих средах (Correll et al., 1987). Мутанты класса

были выделены у Aspergillus nidulano (Cov<5,1976, 1979), еигоарога сгааяа (Мэ-zluf et al., 1985).

ю

Выделенные нами фенотипическис классы п^-мутантов были I представлены б следующих соотношениях: - 41,0^, ПШ1 -37,пПЗ - II,4/о, nit2 - 10,4% (табл. 4). > всех 60-ти из:

Таблица 4.

Распределение п^-мутантов У.йаШае По фэнотипичеоййм классам

--г—--1----

Штамм ! Число яроана-I лизированных' _! мутантов_

33-4 5G 37,5 41,1 12,5 8,9

T-9 . 37 40,6 37,8 10,8 10,8

XnI-3 41 46,4 26,8 12,2 14,6

П-70 48 43,7 41,7 8,3 6,3

Пе-2 52 36,5 36,5 13,5 11,5

Всего 234 41,0 37,2 11,4 10,4

чавших.ся штаммов hl наблюдалось существенных различий по соо' ношению классов. Мутанты класса nitu всех штаммов были более стабильны, по сравнению с мутантами других фенотипических .Jiai сов.

В настоящее время в работах по изучению вегетативной со: местимостп у v.dahliac представленных другими авторами фенот] пические классы nit-мутантов детально нз рассмотрены. Описан получение мутантов классов - nitl, nit:.: ц, возможно, класса nit3 (strausbaugh, 1993; Chen, 1993, 1994). Выявленное нами ' отношение значительно отличается от такового, наблюдавшегося штаммов P.oxyaporum (Corrcll et til.,1987), где абсолютное бо льпикство выделенных г.^тантов (59-96^) принадлежали к классу nitl а число мутантов класса niti," ни у одного из изучаваихс, штаммов не превысило 25%.

Вирулентность nit-мутантов к хлопчатнику. Была изучена рулентность 11-ти nit-мутантов всех идентифицированных фенот пических классов к сортам-дифференциаторам хлопчатника. В ка стве стандартов в опыты были включены 8 штаммов дикого типа, которых были получены эти мутант i. Исходные штампы являлись изолятами из хлопчатника и почвы хлопковых полей и принядлея ли ко всем известны.' в настоящее время физиологическим' расам возбудителя вилта распространенны«' в Средней'Азии (табл. 5).

Количество мутантсе по классам в % nitl • nitti j nit3 J nit2

Таблица 5.

Вирулентность nit-мутантов и исходных штаммов v.clahliae к хлопчатнику

■юкулюм _! Поражение листовой поверхности сортов. %

---------Г"......Г............ ..... тамм !раса! мутация ! I08-<2 'Um <жан-9 h линия 0144

i I ! 2 ! I ! 2 ! I ! 2

-242 0 _ 0 0 0 0 0 0

-242 0 nitl 0 0 0 0 0 0

-242 0 nitM 0 0 0 0 0 0

л1-3 I - 99,1 98,2 0 0 100 97,1

л!-3 I nit2 100 95,1 0 0 . 97,5 95,6

л-ПОо I - 43,2 41,3 0 0 38,1 40,2

л-1105 I nit3 40,9 57,8 0 0 36,7 35,5

л-1105 I nit 2 41,4 36,4 0 0 39,7 37,2

л4-6 2 - 78,3 72,3 41,5 42,5 0 0

л4-б 2 nitM 34,7 39,2 30,7 29,7 0 0

-70 3 - 41,1 40,3 33,4 33,9 38,2 40,1

-70 3 nitM 38,5 40,1 32,6 31,2 39,1 37,4

-70 3 nitl 40,4 38,8 23,9 20,4 28,8 22,9

'-9 3 - 97,3 93,5 88,7 80,3 39,8 37,2

'-9 3 nitl 100 95,2 89,6 8b,9 40,2 45,5 '

33-4 4 - 19,4 16,4 0 0 0 0

>3-4 4 Hit3 16,3 18,2 0 - 0 0 0

л-1104 4 - 74,3 70,6 0 0 0 0

;л-11С4 4 nit2 40,9 42,8 0 0 0 0

[римечание: I - представленные данные получены при использовании метода инокуляции растений в стебель, 2 - инокуляция путем погружения корневой системы растения в суспензия конидий патогена;

Зсе тестировавшиеся nit--мутанты поражали те же сорта, что и негодные штаммы, то есть- обладали их вирулентностью. Агрессивность лутпнтов, оцененная по доле поражения листовой поверхности, так ш была близка к агрессивности соответствующих штаммов. Исклаче- / -jue составили мутант класса nitM штамма Хл4-6 и мутант класса ; nit2'штамма Хл-П04 вызывавши более слабое поражение сортов-ди-рференциаторов. Все мутанты и исходные штаммы были реизолирозаны ¿а пораженных растений.

В литературе отсутствуют данные о сравнительной характерно-'

тике исходных штаммов грибов и выделенных из них nit-мутантов по вирулентности к растению-хозяину. Нами продемонстрировано, что всс. тестировавшиеся мутанты сохранили вирулентность, а бо льшинство из них и агрессивность исходных штаммов у v.dahliae и могут использоватся для оценки вегетативной совместимости возбудителя вертицйллезного вилта с последующим выявлением ко рреляции этого признака с вирулентностью к хлопчатнику.

Применение двух методов изучения вирулентности у nit-мутантов и исходных штаммов V.dahliae показало аналогичные резу льтаты. Но метод инокуляции растений хлопчатника в стебель бы менее трудоемок и в связи с этим более предпочтителен для исп льзования.

Тесты на вегетативную совместимость. Вегетативно оовмест: мыми считались nit-мутанты образующие гётерокарион при совмес тном росте на МС. Появление.гетерокариотического роста отмеча ли визуально.-На границе между двумя мутантными колониями возникал вытянутый вдоль границы валик морфологически похожий к мицелий дикого типа - имеющий темный цвет и нормальную спорул цию. Вегетативно несовместимые мутанты срастались взаимопрони кая в области роста друг друга без какой-либо отмечаемой реак ции. Других типов взаимодействия мутантов не наблюдалось;.

У каждого штамма была найдена хотябы одна пара мутантов комплементирующих мелзду собой с образованием гетерокариона. Т ким образом, вое изучавшиеся штамьл были самосовместиш. Для тестов на межштаммовую комплементацию у каждого 'тамма взяли вегетативно совместимую пару мутантов двух классов - nitl и nitM в связи с четкой реакцией комплементации между ними и наиболее частим использованием их разными исследователями для разных видов грибов.

Эксперименты были начаты с изучения вегетативной совмест мости коллекции штаммов изолированных из хлопчатника и почзы хлопковых полей в странах Средне Азии - Таджикистане й Узбекистане. В результате проведенных экспериментов было выявлено что между всеми испытанными штаммами образуются г.етерокарионы в одной или нескольких комбинациях спаривания их тестерных па мутантов. Все изучавшиеся штаммы были вегетативно совместимы и, следовательно, отнесены к одной ГВС. Данные резуль-эты ука с-иыпим' ка что гонйуичссйяя изоляция между штаммами возбуд ■геля верхицм.'и.дмкогэ залса .ч-:->:,»аун>!.;а этих странах являете :-.! г;:«ч!:?сльиой или (••.•¿•учттпуе;-.

Тесты :э вегетативную совместимое1: с мутантами тестер-штаммов ГВС-I и ГВС-2 показали, что изучавшийся коллекция алмов из Средне Л Азии вегетативно совместима с штам?.юм Т-9 .. ¡егетативно несовместима с штаммом ss-4 то ость принадле-; К ГВС-1.

При оценке .вегетативной совместимости 27-ми шташов из ' них растений-хозяев и стран друг с другом и со всею! штам-¡и ГВС-I и ГВС-2 все штаммы, кроме двух, были внесены к ¡-I. Ни один из изучавшихся штаммов не был совместим с штам-[ SS-4 - тестером ГВС-2. Штага 345 изолированна из зем^яни-в Великобритании и штамм 3-190 изолированный из томата в .зилии были вегетативно несовместимы "с остальными 58-о птам-и и ¡..езду собой. По результатам проведенных иследований набило выделено 4 ГВС (табл. 6). Многочисленной оказалась то-

Таблица б.

Распределение изученных шташов v.dahliae по ГВС

-1--!-;—!-

-I ! ГВС-2 ! ГЗС (3)! ГВС (4)

SS-4 345 3-190

опчатник, (хлопчатник, (земляника, (томат,

) + 55 СМ) Зеликобрнта- Бразилия)

ммов из раз- ния)

растений-зяев и стран

о одна ГЕС - ГВС-I, в которую вошли 57 из 60-ти изучавшихся шов. Три другие ГВС представлен!« одним штаммом каздая. (3) и ГВС (4) выделены нами условно. . Штаммы ГВС-I принадлежат ко всем известным в настоящее ия физиологическим рзсам возбудителя вертициллезного вилта пчатннка распространенным в Средней Азии (табл. 7). Таким ■ азом, разньгэ физиологические расы вегетативно совместимы и цу ними монет осуществляйся парасексуальный цикл. При этом цвух разных рао монет возникнуть новая,способная поролать эйчивый сорт, что было продемонстрировано для штаммов из Тд-:систана (Касьяненко, Портенко, 1978). Вхоядение в одну ГВС эгенных к хлопчатнику и непатогенных к homj лтаммов указывала отсутствие дифф ренцяации по признаку патогенности у ¿гнх лмов при возникновении иелду ними гетерокариотического сос- * :ия.

Таблица 7.

Структура ГВС-1 У.йаЫЛае по вирулентности к хлопчатник

Раса Реакция сортов-дифйеренциатороп Число штаммов

_108-Ф ! Андижан-9 линия 0144

0 _ _ _ 3'

I + . - + 27

2 + + - II

3 + + + 16

4 + - - 6

Примечание: + - восприимчивость, — устойчивость.

Штаммы ГВС-1 пс скорости и интенсивности формирования г терокариона между их комплементарными пП-мутантами были ^од разделены на 5 подгрупп. Большинство штаммов (51) вошли в пе вую подгруппу. Во вторую и "третью вошли" по 2 штамма в какдую в четвертую и пятую по одному штамму. Между штаммами из одно подгруппы наблюдался быстрый и интенсивный гетерокариотическ рост, из разных пс,групп - медленный и слабый. Така,. реакция была характерна для абсолютного большинства штаммов. В едини них случаях между штаммами из разных подгрупп формировался г терокарион по типу быстрого и интенсивного роста, а между шт ммами из одной подгруппы - по типу медленного и слабого рост Подгруппы внутри одной ГВС по эти-- признакам у У.с1аЫ1ае выделяют И другие авторы (Б1;гаивЪаив11 ег а1., 199?; З^аивЪа-и811,1993). Данное деление затруднительно из-за отсутствия к личественного метода оценки. Все изучавшиеся штаммы из Среди Азии вошли в первую подгруппу, гетгпокариоз между ними был т лько одного типа формирования - быстрого и интенсивного. Этс дополнительно указывает на их близкое родство.

Гетерокариоз и днплоидизация у пЗЛ-мутантов. Был изучен гетерокариоз мезду мутантами различных штаммов входящих в о,п ГВС и относящихся к одной или разным физиологическим расам л раяающим хлопчатник. Отмечено 2 типа образования гетерокарис между мутантами: сильный и слабый. Гетерокарион сильного тиг нг.чинал образовыпатся после первых трех дней инкусации совмс но растущих п1Л-мутантоо па "С при температуре 24°С. Темная раска ха[«ктегнаг для рост! унцелия дикого типа появлялась г ело неаоли иикуб.чцни, ч:ири:т т. г.гг.чркэтической зоны спуст*

эли инкубации достигала до 0,7 см. Гетерокарион слабого а начинал формироватся к седьмому дню инкубации, после ¡с недель появлялась темная окраска, а ширина гетерокариоти-кой зоны достигала до 0.4 см. При посеве гетерокариотического мицелия на МС вокруг то-посева .развивалась гетерокариотическая колония диаметром Э,5 см. При дальнейшем ее росте происходило выщепление од-о из составляющих ее компонентов (nit-мутантов), вокруг ерокариотической колонии развивалась колония nit-мутанта, обное явление наблюдалось у всех изучавшихся гетерокарио-

Анализ края гетерокариотической колонии показал, что он всех случаях был представлен nit -мутантным.мицелием только ого компонента. Гетерокарионы 12-ти комбинаций спаривания и изучены более детально (табл. 8). В первой половине ком-

Таблица 8.

Структура гетерокарионов образованных nit-мутантами V.'dahliae

поненты гетерокарионов (1+2) [ Растущий { Соотношение

I 1ЛТЛЫ i i •утанты ! край j колонии I компонентов | (I : 2)

-3 + Т-9 nitM + nitl 2 ' I : 5

0 + 335 nitM + nit3 2 I : 4

■2 . +• Хл-ПбЗ nitH + nit2 2 I : 5

+ Т-2 nitl + nit3 .1 7 : I

+ C-I nitl nit2 ' ' . о-" " I : 6

+ Хл-962 nit3 nit2 ■'• , . .2 'I • 5

-1104 + Т-9 _ h i til ■f nitl . ■ Г 83 : .1

>асполь-? + Хл4-б' nitM + mt3 2 I : 6

' + Г!-922 nitM + nit2 I 18 : I

'ул-5 + 339 • ■ " nitl + nit3 I 66 : I

■ Хл-1235 :' ;' • ■nitl + nit2 2 I : 8

■ Хл-73 . . nit3 + nit2 2 I : 62

!аций спаривания формируемый гетерокарион был сильного типа, ¡сех.'гетеро'карионов растущий край колонии был представлен ком-¡рн'.том доля которого была наибольшей. Соотношения исхолннх пгнектов-' з гетерокэрионах (по результатам спорового анализа)

варьировали в зависимости от типа гетерокарнотического роста. , При образовании гетерокарионов сильного типа доля преобладающего компонента в разных комбинациях спаривания варьировала н значительно и составляла в среднем 5,3 к одной юле меньшего компонента. У гетерокарионов слабого типа доля преобладающего .компонента в зависимости от комбинации спаривания колебалась от б до 83.

Спонтанная диплоидизация в гетерокарионох образованных nit-мутантами и инкубируемых при оптимальной температуре- 24°' происходит с крайне низкой частотой. Нами было проанализирова но 1,2'10^ спор с ряда гетерокарионов и не обнаружено ни одно прототрофной колонии. При инкубации при температуре 30°С гете рокариотический рост замедлялся и полностью прекращался. У ге .терокариона образованного nitií мутантом штамма Хл1-3 и nitl ц тантом штамма Т-9 выделялись диплоидные споры с частотой I•10' Диплоидные споры характера. > зались большей длинной (почти в 2 раза) чем гаплоидные. По ширине отличие было незначительно. Размер диплоидных спор составлял в среднем 12,0Х4,5|а,' а гапло! дных - 6,5X4,4j¿.. Диплоидного роста в виде выщепляющихся секторов, ■ отмеченных рядом авторов (Puhaila, kayfield, 1974), не bi зникало. При расеве на МС суспензии спор, состоящей из смеси гаплоидных и диплоидных спор, диплоидные колонии не образовывг лись, как наблюдалось в теслах Л.Г. Портенко и др. (1978). Наряду с nit-мутантнкми колониями формировались прототрофные -гаплоидные .сегреганты возникшие в результате парасексуального цикла.

Сравнение полученых нами результатов с ранее установлент ыидля гетерокарионов образованных пигментными, ауксотрофными бенлейтоустойчивнми мутантами V.dahliae (Портенко и др., 1970; Коновалова и др., 19Vd) выявило ряд различий. Гетерокарионы ос ■ разованные nit-мутантами менее стабильны при самостоятельном росте, не удалось получить и стабильного гетерозиготного диплс ида. Такая нестабильность вероятно связана с большем гшиянием на гетерокариоз и диплоидг ацию у 1r.daUlioe nit-мутаций, по сравнению с мутациями "вменяющими окраску колоний, вызывающих ауксотрофность или бенлейтоусто;*ч:-1вость. Однако, выявленная нй ми нестабильность не влияет на проведение тестов на вегетативную совместимость у этого гриба. Использование ке nit-мутантов дает более надежные результаты при выявлении числа.ГВС y:v.da-• hliae чем использование пигментных мутантов. . Так^-;Пбрй0нач'чпь

при применении пигментных мутантов было выявлено 16 ГВС halla, Hummel, 1983). При повторном тестировании этих же iMMOB с применением nit-мутантов ввдылили только 4 ГВС (Jo-im, Rone, 1990).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами результаты показывают, что Использование -мутантов является удобным инструментом при изучении веге-[•ивной совместимости у v.dahliae. Hit -мутации возникают с !окой частотой без применения мутагенов и легко ввделяются селективных средах. Впервые идентифицировано 4 фенотипичес-с класса nit-мутантов у V.dahliae и показано, что nit-мутан-сохраняют вирулентность исходных штаммов к хлопчатнику. По-1ены гетерокарионы и зафиксирован полный парасексуальный сл между nit-мутантами различных физиологических рас возбу-геля вертициллезного вилта хлопчатника. Ранее гетерокарионы ■•етерозиготные диплоиды между некоторыми расами были получе-с применением ауксотрофных мутантов (Касьяненко, Шевцова, 31; Портенко, 1986). Наши данные указывают на корректность юльзованияnit-мутантов для анализа вегетативной совместили у V.dahliae, которая обеспечивает возможность гетерока-зза как первой стадии парасексуального цчкла, а так же для авнения вегетативно"! совместимости штаммов этого гриба с их рулентностью к хлопчатнику и обсуждения возможности возникно-■шя новых физиологических рас в результате гибридизации су* зтвующих.

Тесты на вегетативную совместимость штатов выявили 4 ГР", и, этом только одна из них сказалась многочисленной. Посколь-в одной ГВС оказались штаммы из разных стран и разных рас-чий-хозяев, а штаммы из одной местности и растения-хозг:'ча гут принадлежать к разным ГВС и аналогичные результаты полупи рядом, авторов ( Jo^uim, Howe, 1990; Chen, 1994), модно елать вывод об отсутствии уv.dahliae приуроченности ГВС к ределенной местности и растению-хозяину. Это утверждение наи-лее наглядно подкреплено данными в отношении растения-хозяи-, что, по-видимому, связано с широкой специализацией по пато-нности уV.dahliae. Так, в ГВС-2 помещены штаммы изолиройзн-е из хлопчатника, картофеля, томата, перца, фисташки ( Joa.^«-1, Roue, 1990). Что же касается географического происхождения, , хотя в одной местности обнаруживается несколько ГВС, часто

преимущественное распространение получает только одна (Strau augh et al., - 1992; Chen, 1994). Преобладание в одном район одной ГБС отмечено и у F.oxyaporum (Jacobeon, Gordon, 1988¡ Katan et al., 1989).'

К .настоящему времени накопилось много данных о связи па тогенности и вегетативной совместимости, полученных при изуч нии природных популяций фитопатогенных грибов, лишенных поло вого процесса. Приведенные в нашей работе результаты изучени вегетативной совместимости у v.dahliae и имеющиеся в литерат, ре данные по другим фитопатогенным грибам указывают на то, ч в отличии от специализированных форм, различающихся по патог ности к видам растений, между физиологическими расами, разли чающимися по вирулентности к сортам одного вида, может не на' людаться генетической-изоляции. Число ГВС, установленное у У dahliaec применением nit-мутантов нами и в ряде других рабо (Joaquim, Eowe, 1990; Strausbaugh et al-, 1992},Chen, 1994), показывает, что уровень гетерогенности по вегетативной совме> тимости у .возбудителя вёртициллезного вилта не.столь высок и обмен генами не так ограничен, как предпологалось ранее (Puh la, Hummel', 1983 ¡ Haalo, 1989).

выводы

1. Работа посвящена изучению вегетативной совместимости штаммов v.dahliae из разных растений-хозяев и стран методом < нованноы на использовании мутантов, не способных утили^ирова' нитрат, или nit-мутантов. v ■ .

2. Идентифицировано 4 фенотипических luiaccanit -мутанто: V.dahliae: nitl, nitM, nit.2, nit3. Установлено, что спонтанн частота возникновения nit-мутантов зависит от типа питательн среди и колебалась в пределах от 31,4^ и до 40,352 от общего : еда хлоратустойчивых.

3. Показано, что nit-мутанты возбудителя вертициллезноп еилта хлопчатника сохраняют "вирулентность исходных штаммов.

4. Среди 60-ти изучавшихся штаммов V.dahliae изолирован! ив различных растений-хозяев в разных'странах выделено 4 ГВС Абсолютное большинство штаммов - 57 вошло в ГВС-1, 3 остал mí:

.штамма распределились по одному в ГВС-2, ГВС (3), ГВС (4)..

5. Генетическая изоляция между физиологическими расами dahlia» распрострпнешгыми в Средней Азии - отсутствует.

6. Штаммы вошедшие в ГВС-I подразделены в зависимости' • гипа формируемого гетерокариона на 5 подгрупп. В первую сруппу. вошло 52 штамма, во вторую и третью по два, в чет- , гую й пятую по одному штамму в кавдую.

7. Гет'е'рокарионы сформированные nit-мутантами штаммов од-подгруппы обладают большей скоростью роста и интенсивнос-образования, более сбалансированным соотношением кошонен-.- доля преобладающего компонента у разных гетерокарионов ьирует незначительно'. ,

8. Наиболее общим итогом проделанной нами работы, в-целом, яется следующее:-в природных популяциях V.dahliae Kleb« ляционные барьеры на пути.осуществления парасексуального

ла - незначительны. Это, с одной стороны, может затруднять ьбу с вилтом, в связи с возможностью возникновения более ессивных штатов и интенсивного расообразования с появлени-новой расы, поражающей устойчивый сорт. С другой стороны,об-чает эту борьбу, так как позволит прогнозировать возможные фитотии и разработать биологические меры борьбы о заболева-м.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Портенко Л.Г., Акимов Г.И. Изучение вегетативной сов-тимости у штаммов Vorticilliun dahliae Kleb.различного графического происхождения. - Труды первой научной конферен-

биохимического общества Республики ТаджикистаиТГроблены хлмии". - Душанбе, 1993, о. 80.

2. Portenko L.G., Akimov G.I.', Po3hnagova V.G. Study of jstativQ compatibility in Verticillium dahliae. - Phytopa-îitica, 1995, 23, 1, p. 46. .

3. Акимов F.И. Гетерокариоз и парасексуальный цикл у мута-ib, не утилизирующих нитрат, Tertieilliura dahliae. - Труда »рой нау-iftÈr конференции биохимического общества Республики 1дккистан "Проблеш биохимии". - Душанбе, 1996, с. 5-6.

4. Акимов Г.И. Изучение вегетативной совместимости у штам-I Verticilliixa dahliae, распространенных в зоне хлопкосеяния ¡публики Таджикистан. - Тезисы докладов научной конференции, ¡вященной 90-летию со дня рождения доктора биологических на, профессора A.A. Прокофьева "Фотосинтез, продукционный про-:с и регуляция плодоношения у хлопчатника". - Душанбе, 1996, 5. ' . •

5. Акимов Г.И., Портенко Л;Г. Изучение вегетативной совместимости у Уег1;1с1111ит АаЬНае К1еЪ. на основе использования мутантов, не утилизирующих нитрат., - Генетика, 1996, 32', 1? 2, с. 211-217.

Подписано в печать ti.Qt3.97r, Формат 60x04^/16. Бумага тип №2. О^сотноя печат^. Усг.псч.лЛ&. Уг.л.кр.

отТ.2,12.Уч.^зд.л.1,Ь. Тирпдс сЭ.Заказ ЕЙ7._

Тжюграфия Академии наук Республики Таджикистан..