Ультраструктурная организация печени крыс в онтогенезе в условиях дефицита белка в пренатальном и раннем постнатальном периодах

Скуридина, Елена Геннадьевна

Автореферат диссертации по теме "Ультраструктурная организация печени крыс в онтогенезе в условиях дефицита белка в пренатальном и раннем постнатальном периодах"

08461

На правах рукописи

Скуридина Елена Геннадьевна

УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПЕЧЕНИ КРЫС В ОНТОГЕНЕЗЕ В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА БЕЛКА В ПРЕНАТАЛЬНОМ И РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДАХ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВ ТОРЕ ФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2010

004611175

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Бгатова Наталия Петровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Клинникова Марина Геннадьевна доктор биологических наук,

профессор Селятицкая Вера Георгиевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава

Защита диссертации состоится «_»_2010 г.

в_час. на заседании диссертационного совета Д 001.037.01 в

Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2, тел. 334-84-38.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.03 7.01

доктор биологических наук Молодых Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Питание является одним из важнейших факторов, опосредующих связь человека с внешней средой, оказывая решающее влияние на здоровье и устойчивость организма к воздействию экологически вредных факторов производства и среды обитания (Спиричев В.Б., 2001). Развитие науки и техники, появление новых технологий производства продуктов питания позволяют человечеству в меньшей степени зависеть от природных условий. Однако обилие продуктов, произведенных с использованием технологий, повышающих вкусовые качества, срок хранения и снижающих себестоимость, породило проблему несбалансированности рациона. В рационе современного человека преобладают легкоусваиваемые жиры и углеводы, в то время как белки, витамины и различные микроэлементы оказываются в дефиците (Алексеева О.П. и др., 2009). Особенно серьезно эта проблема проявляется во время беременности, поскольку рацион матери оказывает значительное влияние на организм плода. Показано (Gomez-Angelats et.al., 1995; Edwards et. al., 1996; Desai et.al., 1997; Ozanne et.al., 1998; Bertram et.al., 2001), что недостаток белка во время беременности приводит к уменьшению массы тела потомства и вызывает изменения, связанные с повышенным риском возникновения метаболического синдрома в последующем развитии и снижением продолжительности жизни. Предложены гипотезы, частично объясняющие механизмы этого явления. Например, согласно гипотезе «экономного фенотипа», изменения в организме потомства при белковой недостаточности в пренатальном периоде носят характер преадаптации к будущему дефициту белка (Hales, Barker, 1992,2001).

Литературные данные о последствиях низкобелкового питания матери для организма потомства во многом носят противоречивый характер (Armitage et al., 2004). Большинство исследователей сходятся во мнении, что реализации предрасположенности к метаболическому синдрому способствует высококалорийная или высокожировая диета в постнатальной жизни (Souza-Mello et al., 2007; Langley-Evans, 2007; Feres et al., 2009). Оптимальное или повышенное количество белка позволяет догнать сверстников в массе и физическом развитии, однако также может способствовать ожирению и являться фактором, обусловливающим сокращение продолжительности жизни (Eriksson et al., 2000), хотя это не является строго доказанным

(Armitage et al., 2004; Minana-Solis, Escobar, 2008). Имеются данные, что содержание мышей, перенесших пренатальный дефицит белка, на низкобелковой диете может увеличить продолжительность жизни (Chen et al., 2009). Ранее увеличение продолжительности жизни при низкобелковой диете было установлено для дрозофилы (Vigne, Frelin, 2008; Vigne et al., 2009; Simpson, Raubenheimer, 2009).

Проблема влияния белковой недостаточности в период беременности на развитие метаболического синдрома, продолжительность жизни потомства и предрасположенность к заболеваниям остается актуальной. При анализе литературных данных обращает на себя внимание ряд нерешенных вопросов:

Во-первых, требует решения проблема выбора экспериментального рациона. Зарубежными исследователями используются, как правило, промышленные комбикорма, имеющие в качестве единственного источника аминокислот казеин, что позволяет точно соблюсти условия эксперимента, но уводит его от естественных условий и затрудняет интерпретацию результатов (Armitage et al., 2004).

Во-вторых, подавляющее число работ, касающихся проблемы развития метаболического синдрома, выполнено с использованием методов молекулярной биологии и биохимии. Это позволило получить достоверные данные о содержании метаболических маркеров в крови и органах экспериментальных животных, а также однозначно судить об изменениях в экспрессии генов и продукции регушггорных молекул и рецепторов к ним. Однако, в этой области наблюдается дефицит морфологических работ, позволяющих оценить характер влияния факторов, способствующих развитию метаболического синдрома, на клетки и ткани организма.

В-третьих, наблюдается дефицит работ, посвященных длительному мониторингу состояния организма потомства при низкобелковом питании матери, что необходимо для достоверной оценки направления происходящих в организме изменений.

В связи с вышеизложенным, представляется целесообразным проследить в эксперименте развитие потомства в течение всего онтогенеза при дефиците белка в пренатальном периоде и выявить возможную зависимость структурных преобразований в организме от содержания белка в рационе в постнатальном периоде. Наиболее адекватным морфологическим объектом для решения поставленной цели является печень — как центральный орган метаболизма. Име-

ются данные, что именно в печени происходят основные изменения, связанные с дефицитом белка в раннем онтогенезе (Ьаг^ку-Еуаш, 2007; Боига-МеИо е1 а1., 2007).

Цель исследования - выявить особенности структурной организации печени крыс на протяжении онтогенеза в условиях нормы, при дефиците пищевого белка в пренатальном и раннем постна-тальном периодах и при смене характера питания в постнатальном периоде.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику прироста массы тела крысят, рожденных самками, получавшими в период беременности и лактации сбалансированный рацион и рацион, дефицитный по содержанию белка.

2. Исследовать структурную организацию печени и ультраструктурную организацию гепатоцитов крысят сразу после рождения, в период молочного вскармливания и после его окончания в норме и при дефиците белка в рационе беременных и кормящих самок.

3. Исследовать структурную организацию печени и ультраструктурную организацию гепатоцитов половозрелых и стареющих крыс, рожденных самками, получавшими в период беременности и лактации сбалансированный рацион, при переводе их в постнатальном периоде на рацион, дефицитный по содержанию белка.

4. Исследовать структурную организацию печени и ультраструктурную организацию гепатоцитов половозрелых и стареющих крыс, рожденных самками, получавшими в период беременности и лактации низкобелковый рацион, при переводе их в постнатальном периоде на сбалансированный рацион и рацион, дефицитный по содержанию белка.

Научная новизна. Впервые с помощью методов световой, электронной микроскопии и морфометрии выявлены морфологические изменения в печени и ультраструктурной организации гепатоцитов крысят на протяжении периода молочного вскармливания при дефиците белка в рационе беременных и кормящих самок: повышение объемной и численной плотностей жиронакапливающих клеток, снижение концентрации цитоплазматических органелл и накопление гликогена в гепатоцитах.

Впервые установлено, что при переводе крысят, рожденных самками, получавшими в периоды беременности и лактации низкобелковый рацион, в период самостоятельного кормления на сбалансированный рацион, в печени происходят структурные изменения,

свидетельствующие о повышенной функциональной нагрузке на орган: появление локальных воспалительных инфильтратов, чрезмерное накопление включений и набухание митохондрий в гепатоцитах. С возрастом печень этих животных возвращается к норме.

Впервые показано, что у половозрелых крыс, содержавшихся на низкобелковом рационе в течение всего периода развития, морфо-метрические показатели печени и ультраструктурная организация гепатоцитов достоверно не отличаются от структуры печени и гепатоцитов животных контрольной группы.

Впервые установлено, что при содержании крыс на низкобелковом рационе в течение всего периода развития, структурные признаки старения в печени (утолщение стенок синусоидов, снижение объемных и численных плотностей органелл в гепатоцитах) в возрасте 16 мес выражены в меньшей степени, чем у животных контрольной группы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты работы дополняют и расширяют современные представления о структурной организации печени крыс в постнатальном онтогенезе. Полученные данные способствуют более полному пониманию механизмов влияния дефицита белка в пренатальном и раннем постанатальном периодах на структурную организацию печени в последующем развитии.

Выявленную зависимость структурных изменений, происходящих в печени потомства при белковой недостаточности рациона в период беременности и лактации следует учитывать при разработке рекомендаций по оптимальному питанию детей, испытывавших дефицит белка в пренатальном и раннем постнатальном периодах.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Низкобелковое питание крыс в период беременности и лактации приводит к снижению массы тела и замедленному развитию детенышей, развитию структурных изменений в печени потомства, свидетельствующих о снижении интенсивности процессов энергетического обмена и синтеза белка.

2. При низкобелковом питании беременных и кормящих самок происходит адаптация печени потомства к рациону со сниженным содержанием белка. Перевод животных после перехода к самостоятельному питанию на сбалансированный рацион приводит к развитию структурных изменений, свидетельствующих о функциональном напряжении органа.

3. Содержание крыс на низкобелковой диете с окончания периода молочного вскармливания до наступления половозрелости обусловливает изменения структурной организации печени в онтогенезе, свидетельствующие о повышенной функциональной активности органа.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 25-летию НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН «Север-Человек: проблемы сохранения здоровья» (Красноярск, 2001), XXXIX и ЬХ международных научных студенческих конференциях (Новосибирск, 2001, 2002), Международном научном симпозиуме по проблемам саногенного и патогенного эффектов экологических воздействий на внутреннюю среду организма (Бишкек, 2001, 2007), научной конференции «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии» (Новосибирск, 2002), II научной конференции с международным участием «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), I Сибирском съезде лимфологов с международным участием (Новосибирск, 2006), XIII Международном научном совещании и VI Школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), Международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» (Новосибирск, 2008), Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте», посвященной 80-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РФ проф. П.В.Дунаева (Тюмень, 2008), XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2010), ученом совете в Научно-исследовательском институте клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН (Новосибирск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 2 - в научных журналах, рекомендованных ВАК России.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 195 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, иллюстрирована 86 рисунками. Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (254 работы, из них 48 отечественных и 206 - зарубежных авторов).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Взятие материала производилось у потомства, полученного от спаривания 12-ти самок и 4-х самцов крыс линии Вистар - всего у 74-х крыс-самцов. Работу с животными проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

В качестве сбалансированного был использован рацион, утвержденный приказом Министра здравоохранения СССР № 1179 от 10.10.1983 г. Низкобелковый рацион был составлен путем пропорционального снижения содержания компонентов, за исключением свежей моркови, хлеба, рыбьего жира, соли и дрожжей. Изокалорий-ность рациона достигалась путем добавления густого крахмального коллоида и нерафинированного подсолнечного масла. Количество корма подбиралось исходя из возрастных норм (табл. 1).

12 самок крыс в возрасте 3-4 мес массой 180 - 200 г были разделены на 2 группы и помещены в клетки вместе с самцами. Первую группу содержали на сбалансированном, вторую - на низкобелковом рационе в просторных общих клетках по 4 животных (3 самки и 1 самец, итого 4 клетки).

При рождении крысят самку с выводком отсаживали в отдельную клетку, не меняя рациона. По достижении крысятами возраста 40 сут самцов каждой группы в свою очередь разделяли на 2 подгруппы и содержали либо на сбалансированном, либо на низкобелковом рационе (табл. 2). По достижении ими возраста 3 мес всех животных переводили на стандартный рацион вивария (комбикорм) до окончания эксперимента.

Забор материала производили в возрасте 2,21,40 сут, 3 и 16 мес. Животных декапитировали под эфирным наркозом.

Подготовку образцов ткани, планирование и проведение морфо-метрических исследований выполняли в соответствии с общепринятыми принципами и методами (Шахламов В.А., 1968; Катинас Г.С., Полонский Ю.З., 1970; Автандилов Г.Г. и др., 1984; Непомнящих Л.М. и др. 1986; Weibel E.R. 1979).

Образцы печени фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида на фосфатном буфере и после промывки дополнительно фиксировали в 1% растворе 0s04 на фосфатном буфере (рН=7,4) (Milloning G., 1962), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон (Lugt, 1961). Из полученных блоков готовили

Продукты Сбалансированный рацион Низкобелковый рацион

масса, г белок, г калории масса, г белок, г калории

Овес 8 1,36 38,83 4 0,68 19,42

Пшеница 3,2 0,75 18,94 1,6 0,37 9,47

Просо 1,6 0,27 7,42 0,8 0,13 3,71

Семя подсолнечника 3,2 0,89 30,34 3,2 0,44 15,17

Хлеб 6 0,85 26,4 6 0,85 26,4

Овсяная крупа 4 0,86 26,64 2 0,43 13,32

Творог 3 0,82 4,1 1 0,27 1,37

Мясной фарш 5 1,77 10,6 1,6 0,53 3,18

Морковь 10 0,48 8,5 10 0,18 8,5

Рыбий жир 0,2 0 3,43 0,2 0 3,43

Дрожжи 0,15 0,13 0,83 0,15 0,13 0,83

Подсолнечное масло 0 0 0 1 0 16,56

Крахмал 0 0 0 7,5 0 56,1

Соль 0,15 0 0 0,15 0 0

Итого: 89 7,88 176,02 75 4,03 177,45

Таблица 2. Схема эксперимента

Экспериментальная группа Рацион Количество животных / с учетом падежа

до 40 сут 40сут-3 мес 2 сут 21 сут 40 сут 3 мес 16 мес

Контроль (К-К) сбалансированный сбалансированный 6 5 5 5 7/5

К-НБ сбалансированный низкобелковый 5 6/5

НБ-НБ низкобелковый низкобелковый 6 5 5 5 7/7

НБ-К низкобелковый сбалансированный 5 7/5

полутонкие срезы толщиной 0,5 мкм, окрашивали толуидиновым синим, изучали под световым микроскопом и выбирали необходимые участки тканей для исследования в электронном микроскопе. Ультратонкие срезы толщиной 35 - 45 нм получали на ультратоме LKB-NOVA, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата (Уикли Б., 1975), цитратом свинца (Reynolds, 1963); и изучали в электронном микроскопе JEM 1010.

Морфометрию паренхимы печени проводили на полутонких срезах с помощью светооптического микроскопа Leica DME, при использовании квадратной тестовой системы (площадью 6400 мкм2) из 25 точек и 5 линий при увеличении в 1000 раз.

Морфометрию объемных, численных плотностей митохондрий гепатоцитов, поверхностной плотности их внешних и внутренних мембран проводили с помощью закрытой тестовой системы из квадратов площадью 25 мкм2 из 42 узловых точек с длинной тестовой линии 35 мкм при конечном увеличении в 42 000 раз. Объемные, численные плотности лизосомальных структур, пероксисом, объемные плотности липидных включений гепатоцитов определяли с помощью закрытой тестовой системы из квадратов площадью 25 мкм2 из 3 78 точек при конечном увеличении в 42 000 раз. Измерения объемной и поверхностной плотностей эндоплазматической сети проводили с помощью закрытой тестовой системы из квадратов с 378 узловыми точками, д линой тестовой линии 3 5 мкм при конечном увеличении в 42000 раз. Численные плотности рибосом определяли в регулярно расположенных квадратных тестовых системах площадью 4,17 мкм2 при конечном увеличении в 42 000 раз.

Отдельно морфометрировали цитоплазму гепатоцитов перипор-тальных и перицентр альных областей (за исключением 2-дневных крысят, у которых, по литературным данным, функциональная гетерогенность гепатоцитов практически не выражена) (Усынин, 2007).

Измерение уровня гаюкозы в сыворотке крови 16-месячных животных проводили ферментативным колориметрическим методом с использованием набора «Flutest Glu» (Biocon, Германия), измерение уровня триглицеридов—с помощью набора «Триглицериды-Ново» производства компании «Вектор-БЕСТ».

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Excel и Statistica. Для каждого параметра определяли средние значения и ошибку среднего (для р>99,9%). После проверки распределения на нормальность, достоверность различий средних

величин определяли по t-критерию Стьюдента или по критерию Краскелла-Уоллеса. Для оценки степени влияния низкобелковой диеты на разных периодах развития использовали двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Структурная организация печени крысят при дефиците белка в рационе беременных и кормящих самок. При низкобелковом питании беременных и кормящих крыс масса тела детенышей была снижена на протяжении всего периода молочного вскармливания. Разница в массе тела увеличивалась с возрастом: в возрасте 2 сут крысята весили на 14,6%, а в 21 и 40 сут-на 35,9% и 52,2% меньше по сравнению с крысятами, рожденными самками, получавшими сбалансированный рацион (рис. 1).

У крысят этой группы отмечали более позднее открытие глаз -на 16- 17-й день после рождения (в контроле-на 14- 15-й день), что свидетельствует об отставании в развитии. Показано, что дефицит белка в рационе матери вызывает подавление синтеза IGF-1 в гепатоцитах, снижение его концентрации в плазме крови, и, как следствие, замедление роста (Langley-Evans, Jackson, 1994; Vickers et al., 2001; Luther et al., 2007; Mortensen et al., 2010).

Структурная организация печени 2-дневных животных характеризовалась отсутствием четко выраженного балочного строения и наличием многочисленных островков гемопоэза, в которых выявляли клетки эритроцитарного и гранулоцитарного ростков, единичные мегакариобласты, а также бластные формы клеток. У крысят, получавших в пренатальном периоде недостаточное количество белка, суммарная численная плотность кроветворных клеток не изменилась, однако наблюдалось смещение распределения клеток различных ростков кроветворения в сторону преобладания более ранних стадий дифференцировки и бластов (рис. 2). У 21-дневных животных признаков кроветворения в печени отмечено не было, однако четкая структура долек, характерная для печени половозрелых животных, была окончательно сформирована к 40-м суткам развития.

В синусоидах 2-дневных крысят отмечали значительное повышение объемной плотности жиронакапливающих клеток (с 0,07 до 0,34%, р>95%), их численная плотность также имела тенденцию к возрастанию. Содержание жиронакапливающих клеток было

120 100 и 80

л

О 60 л

2 40

20

0

| —♦—контроль - -•- - низкобелковый рацион"!

Рис. 1. Динамика прироста массы тела крысят в норме и при дефиците белка в рационе беременных и кормящих самок. 8 7 6 5

~ 4

3 2 1 0

Рис. 2. Численная плотность кроветворных клеток в печени крысят 2-дневного возраста (* - достоверность различий с контрольной группой).

наибольшим в печени 21-дневных крысят (объемная и численная плотности возросли в 2,5 раза (р>99%) и на 58,2% (р>99,9%) соответственно). У 40-суточных животных эти показатели не имели достоверных различий с уровнем в контроле.

При анализе ультраструктурной организации гепатоцитов крысят в возрасте 2,21 и 40 сут была отмечена общая закономерность - повышенное содержание гликогена на фоне снижения объемных, численных и поверхностных плотностей органелл, что было наиболее выражено в периценгральных гепагоцитах. При этом, в контрольной группе

эритроцитарные гранулоцитарные

бласты

о контроль в низкобелковый рацион

Рис. 3. Суммарные объемные плотности органелл и включений в цитоплазме перицентральных гепатоцитов крысят (* - достоверность различий с контрольной группой).

и у 2-дневных крысят группы низкобелкового питания органеллы и включения располагались равномерно в цитоплазме, а у животных в возрасте 21 и, особенно, 40 сут, в цитоплазме гепатоцитов преобладали включения гликогена, образующие «поля» с расположенными в них островками органелл (рис. 3). Повышенное накопление гликогена в печени потомства при низкобелковом питании в период беременности было отмечено и другими авторами (Franko et al., 2009).

У 2-суточных животных отмечали двукратное возрастание объемной плотности липидных включений (6,19±0,96% в контроле и 17,56±1,55% в группе низкобелкового питания). У 21-дневных крысят контрольной группы отмечали значительное накопление липидов в перипортальных гепатоцитах.

Известно, что в гепатоцитах перипортальной зоны происходит поглощение хиломикронов (Усынин. И.Ф., 2007). У крысят из группы низкобелкового питания не наблюдали повышения содержания липидов в перипортальных гепатоцитах, что, видимо, было связано с отставанием в развитии органа (в контроле объемная плотность липидных включений составляла 17,83±2,47% в перипортальных гепатоцитах и 3,82±0,99% - в перицентральных, в группе низкобелкового питания - 4,86±1,12 и 4,66±1,27%, соответственно). В дальнейшем

у крысят группы низкобелкового питания также сформировалось преобладание липидных включений в перипортальной области, причем объемная плотность липидов в дальнейшем была выше, чем в контроле, как в перипортальной, так и в перицентральной области.

Количество липидов в клетке зависит не только от их экзогенного поступления, но и от синтеза жирных кислот в цитоплазме, этерифи-кации липидов жировой ткани, интенсивности выведения с желчью. Кроме того, по данным некоторых исследователей, при низкобелковом питании матери у потомства происходит изменение метаболизма и жирные кислоты используются в качестве энергетических субстратов. Это позволяет снизить процесс глюконеогенеза за счет белков при дефиците калорий (Holness et.al., 1998, Parimi et al., 2004).

Изменения в содержании органелл в цитоплазме гепатоцитов у крысят группы низкобелкового питания по сравнению с контролем были неравномерными. В основном происходило снижение объемной и численной плотностей митохондрий (более, чем в 2 раза в перипортальных гепатоцитах 40-дневных крысят, р>99,9%), поверхностной плотности цистерн гЭПС (в 3,4 раза в перипортальных гепатоцитах 40-дневных крысят, р>99,9%), а также численной плотности прикрепленных, свободных и полисомальных рибосом (в 2,5 - 4 раза у животных 40-дневного возраста, р>99,9%). Объемная и поверхностная плотности аЭПС, напротив, у 2-дневных животных и в перипортальных гепатоцитах 21-дневных достоверно не отличались от контрольных значений, а в перицентральных гепатоцитах 21-дневных, а также по всей зоне дольки у 40-дневных животных увеличивались по сравнению с контролем, что, по-видимому, можно объяснить участием ферментов, локализованных на мембранах аЭПС, в процессах метаболизма гликогена.

Таким образом, при низкобелковом питании беременных и лактирующих крыс в печени потомства происходят структурные изменения, свидетельствующие о замедлении развития органа, снижении интенсивности процессов синтеза белка и накоплении гликогена. Максимальная выраженность большинства изменений развивается к окончанию периода молочного вскармливания.

Структурная организация печени крыс при переводе их со сбалансированного рациона в пренатальном и раннем постна-тальном периоде на низкобелковьш рацион (с 40 сут до 3 мес жизни - группа К-НБ). Промежуток с 40 дней до 3 мес - период полового созревания крыс. Имеются данные, что питание в течение

0 -1--1-г—---i

40 суток 3 месяца 6 месяцев 16 месяцев возраст

Рис. 4. Динамика прироста массы тела крыс в норме и при дефиците белка на различных этапах онтогенеза.

короткого периода после лактации (у крыс - до 55 сут) имеет наибольшее значение для программирования углеводного метаболизма (Minana-Solis, Escobar, 2008).

Результаты взвешивания животных показали, что в возрасте 3 мес масса тела крыс данной группы (К-НБ) была ниже контрольной на 24,5% (р>99,9%) и составила 271,00 ± 6,78 г, однако в возрасте 6 и 16 мес масса тела этих животных соответствовала контролю (рис. 4). Измерение уровня глюкозы и триглицеридов в плазме крови, а также индекса жира в 16-месячном возрасте не выявило достоверных отличий от уровня в контроле.

В возрасте 3 мес в печени животных отмечали повышенную численную плотность жиронакапливающих клеток (на 79,2%, р>99%). Выявляли тенденцию к увеличению численной плотности двуядерных клеток и ядерно-цитоплазматического отношения. Морфометрический анализ полутонких срезов печени животных в возрасте 16 мес не выявил достоверных отличий от соответствующих значений в контрольной группе.

Структурная организация цитоплазмы гепатоцитов животных в возрасте 3 мес отличалась от цитоплазмы животных соответствующего возраста контрольной группы в первую очередь повышенным содержанием гликогена в перипортальных клетках (его объемная плотность превысила контрольный уровень на 54%, р>99,9%) и

снижением численной плотности митохондрий как в перипортальных, так и в перицентральных клетках (на 17 и 22%, соответственно, р>99%) на фоне устойчивой тенденции к увеличению размера этих органелл. В гепатоцитах перицентральной зоны выявлена преимущественная локализация глюкокиназы и, соответственно, синтез гликогена (Усынин, 2007). Высвобождение глюкозы из гликогена происходит преимущественно в перипортальной области дольки (Непомнящих Д.Л. и др., 2006). Логично предположить, что полученные нами данные о возрастании объемной плотности гликогена в перипортальной области свидетельствуют о сниженной его мобилизации, а не об активизации синтеза. Следует отметить, что мы не наблюдали повышенного содержания вторичных лизосом и аутофа-госом в гепатоцитах, что было отмечено у половозрелых животных, содержащихся на низкобелковой диете (Бгатова Н.П., 1989).

В возрасте 16 мес в цитоплазме гепатоцитов крыс контрольной группы были отмечены признаки старения (Калашникова М.М., 2003; Jin et al., 2009): снижение суммарной объемной плотности органелл и, в частности, объемной и численной плотностей митохондрий, появление коллагеновых пучков в пространствах Диссе. Наблюдали клетки с «пустой» цитоплазмой, содержавшие в основном гликоген и небольшое количество органелл. В цитоплазме перипортальных гепатоцитов животных из группы К-НБ эти изменения были менее выражены: объемные и численные плотности органелл в этой группе не снижались с возрастом (и были выше, чем у контрольных животных), хотя объемная плотность гликогена была выше, чем в возрасте 3-х месяцев, на 29,3% (р>99%) и достоверно не отличалось от соответствующего параметра в контроле. Ультраструктурная организация цитоплазмы перипортальных гепатоцитов свидетельствовала о более интенсивном протекании синтетических и метаболических процессов в печени по сравнению животными контрольной группы.

Структурная организация печени половозрелых крыс при содержании их в препатальном периоде и в течение последующих 40 дней на низкобелковой диете и дальнейшем переводе на сбалансированный рацион (группа НБ-К). Несмотря на достаточно длительное содержание животных на сбалансированном рационе, масса их тела оставалась сниженной по сравнению с контролем в 3 мес - на 18,7% (р>99%), в 6 мес - на 15,4% (р>99,9%) и лишь к 16 мес достигала уровня в контроле.

К-К К-НБ НБ-К НБ-НБ

□ перипортальные ■ перицентральные

Рис. 5. Объемная плотность гликогена в перипортальных и перицентраль-ных гепатоцитах крыс 3-месячного возраста (* - достоверность различий с контрольной группой, # - достоверность различий между перипорталь-ными и перицентральными гепатоцитами).

Структурная организация печени животных этой группы в возрасте 3 мес свидетельствовала о функциональном напряжении органа. По всей зоне дольки встречались локальные воспалительные инфильтраты. Средний объем гепатоцитов вырос по сравнению с контролем на 22,2% (р>99,9%) за счет увеличения объема цитоплазмы. I

При ультраструктурном анализе цитоплазмы гепатоцитов 3- |

месячных животных отмечали значительное накопление гликогена. По данным литературы, в норме объемная плотность гликогена в перипортальных гепатоцитах половозрелых крыс, как правило, равна или несколько выше, чем в перицентральных (Усынин, 2007). ;

У животных этой группы наблюдали обратную картину: объемная плотность гликогена в перицентральных гепатоцитах была выше, |

чем в клетках перипортальной области, на 21,9% (р>95%) и выше, чем в контроле, на 44,9% (р>99%) (рис. 5). Имеются данные, что [

повышенное накопление гликогена в перицентральной области может свидетельствовать о патологии, в частности, развитии цирроза печени (Кудрявцева М.В. и др., 2001). Кроме того, отмеченная гипертрофия митохондрий, не сопровождающаяся возрастанием содержания крист, также характерна для патологических процессов (Безбородкина H.H. и др., 2008).

Структурная организация печени животных этой группы в возрасте 16 мес в меньшей степени отличалась от печени животных контрольной группы. Отмечено снижение объемной и численной плотностей синусоидальных клеток по сравнению с контролем на 65,1 % (р>95%) и на 26,5% (р>95%), соответственно. Уменьшенной была численная плотность клеток Купфера на 25,2% (р>99%). Объемные и численные плотности основных органелл и включений в перипортальных гепатоцитах достоверно не отличались от уровня в контроле, а в перицентральных гепатоцитах суммарная объемная плотность органелл была на 22,5% ниже, чем в контроле (р>99,9%), в первую очередь за счет снижения содержания митохондрий и гЭПС. В то же время объемная плотность клеточных включений в этих клетках соответствовала контрольному уровню.

Структурная организация печени половозрелых крыс при содержании па низкобелковой диете на протяжении всего онтогенеза (группа НБ-НБ). Масса тела животных данной группы наиболее сильно отличалась от соответствующего значения в контроле и оставалась сниженной на протяжении всего эксперимента. Взвешивание эпидидимального жира не выявило признаков ожирения или истощения животных. В этой группе не наблюдали падежа животных от естественных причин к окончанию эксперимента.

В печени животных наблюдали возрастание численной плотности двуядерных клеток в возрасте 3 мес в 2,2 раза (р>95%) по сравнению с контрольной группой, в возрасте 16 мес этот показатель также имел тенденцию к повышению. Известно, что возрастание содержания двуядерных клеток свидетельствует о повышенной пролиферативной активности гепатоцитов (Бгатова Н.П., 1989).

По ультраструктурной организации гепатоцитов печень животных 3-месячнош возраста практически не отличалась от печени животных контрольной группы, за исключением сниженной численной плотности митохондрий на 17,6% (р>99%) в перипортальной области и на 27,3% (р>99,9%) в перицентральной на фоне повышения их размеров. Однако, в отличие от гепатоцитов животных предыдущей группы, гипертрофия митохондрий сопровождалась возрастанием концентрации крист на 30,9 (р>99%) и 71,4% (р>99,9%) соответственно.

В возрасте 16 мес ультраструктура гепатоцитов этой группы имела менее выраженные признаки старения, чем в группе К-НБ. Суммарное содержание органелл и включений, а также большинство других морфометрических показателей достоверно не отличались

□ перипортальные 0перицентральные

s

* 200

s а

5 150 но

£ 100 s

С, 50

о

I-

о

К-НБ

НБ-К

НБ-НБ

Рис. 6. Толщина стенки синусоида в печени крыс 16-месячного возраста (* - достоверность различий с контрольной группой, # - достоверность различий между перипортальными и перицентральными гепатоцитами).

от таковых у животных 3-месячного возраста этой группы. Тем не менее, как и в цитоплазме гепатоцитов животных остальных групп, происходило значительное снижение численной плотности рибосом (в большей степени полисомальных).

Известно, что одним из признаков старения является «капилля-ризация» печеночных синусоидов - снижение количества фенестр и утолщение сосудистой стенки (Warren et al., 2005, Le Couteur et al., 2008 и др.). Интересно отметить, что у животных контрольной группы стенка синусоида в перицентральной области была толще, чем в перипортальной; эта же тенденция наблюдалась в группах К-НБ и НБ-К. Видимо, процесс снижения проницаемости сосудистой стенки начинается в области центральных вен вследствие меньшего снабжения этой зоны кислородом и питательными веществами. В группе НБ-НБ утолщение перицентральных синусоидов в возрасте 16 месяцев не было выражено, тогда как в предыдущей группе (НБ-К) стенка синусоида была несколько утолщена не только в перицентральной, но и в перипортальной области (рис. 6).

Повышенные уровни глюкозы и триглицеридов в плазме крови отражают нарушения липидного и углеводного обмена и могут служить маркерами предрасположенности к ИБС, метаболическому синдрому и СД-2 (Березин А.Е., 2009). В нашем эксперименте эти показатели не превышали контрольных значений ни в одной

из групп, а в группе НБ-НБ имела место отчетливая тенденция к снижению их значений. Согласно гипотезе, предложенной Simpson и Raubenheimer (2009), низкобелковая диета через увеличение активности АМФ-зависимой протеинкиназы (АМРК) повышает чувствительность к инсулину, подавляет клеточный цикл, замедляя развитие и старение. Однако в этих условиях возможен запуск механизма избыточного потребления пищи, что приводит к обратному эффекту через развитие ожирения (Simpson, Raubenheimer 2009). В нашем эксперименте низкобелковая диета воздействовала на организм только по первому пути, что, по-видимому, связано с качественным составом использованного рациона.

Таким образом, в процессе экспериментальной работы показано, что дефицит белка в течение беременности и лактации приводит к значительным изменениям структурной организации печени потомства на всем протяжении онтогенеза. Характер влияния дефицита белка в пренатальном и раннем постнатальном периодах зависит от содержания белка в рационе в последующей жизни.

ВЫВОДЫ

1. Дефицит белка в рационе беременных и лактирующих крыс приводит к снижению массы тела и более позднему открытию глаз у потомства.

2. При низкобелковом питании беременных и лактирующих крыс в печени потомства развиваются структурные признаки, свидетельствующие об изменении метаболизма органа: повышается численная плотность жиронакапливающих клеток; снижается концентрация органелл в гепатоцитах на фоне значительного возрастания объемной плотности гликогена, что максимально выражено в конце периода молочного вскармливания.

3. Перевод крысят на низкобелковый рацион после окончания периода молочного вскармливания приводит к снижению массы тела и повышению содержания жиронакапливающих клеток в печени, накоплению гликогена в гепатоцитах крыс половозрелого возраста.

4. После отмены низкобелковой диеты масса тела и структурная организация печени крыс практически возвращаются к норме, за исключением структуры перипортальных гепатоцитов, демонстрирующих признаки умеренного увеличения интенсивности синтетических и метаболических процессов у стареющих животных.

5. Перевод крысят с низкобелкового на сбалансированный рацион после окончания периода молочного вскармливания приводит к структурным изменениям в печени (набуханию митохондрий, появлению локальных воспалительных инфильтратов), свидетельствующим о напряжении функции и дезадаптации органа на фоне сниженной массы тела у половозрелых животных. У стареющих животных появляются морфологические признаки, отражающие снижение метаболической активности гепатоцитов на фоне накопления питательных веществ, при восстановлении массы тела.

6. Содержание крысят, имевших дефицит пищевого белка в пренатальном периоде, на низкобелковом рационе до полового созревания приводит к развитию структурных признаков (отсутствие достоверных отличий структурной организации печени от печени животных контрольной группы), свидетельствующих об адаптации печени молодых половозрелых животных к низкобелковому рациону на фоне сниженной массы тела. У стареющих животных в печени развиваются изменения, свидетельствующие о повышенной метаболической активности гепатоцитов на фоне сниженной массы тела.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В связи с полученными данными о влиянии содержания белка в рационе в период беременности и кормления на структурную организацию печени потомства, следует уделять особое внимание качественному составу рациона беременных и кормящих женщин.

2. При сниженной массе тела ребенка вследствие дефицита пищевого белка в пренатальном периоде, следует соблюдать осторожность при назначении диеты для восстановления массы тела и ускорения развития.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Садыкова B.C., Кокшарова В.П., Скуридина Е.Г., Бгатова Н.П. Стимулирующее влияние Б АД «Литовит» на формирование органов в постэмбриональном периоде Н «Природные минералы на службе здоровья человека»: Материалы научно-практ. конф. с международным участием. - Новосибирск, 2001. - С. 62 - 63.

2. Скуридина Е.Г. Влияние введения БАД «Литовит» в рацион беременных крыс на структуру печени потомства // «Север -Человек: Проблемы сохранения здоровья». Материалы Всероссийской науч. конф. с международным участием, посвящ. 25-летию НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН. - Красноярск, 2001. - С. 487 - 488.

3. Скуридина Е.Г. Кроветворение в печени крыс в ранний постэмбриональный период // Материалы XXXIX международной научной студенческой конференции. - Новосибирск, 2001. - С. 130 - 131.

4. Скуридина Е.Г., БгатоваН.П. Морфологическое исследование печени новорожденных животных при использовании в составе рациона в течение беременности минеральной добавки «Литовит» // Международный научный симпозиум по проблемам саногенного и патогенного эффектов экологических воздействий на внутреннюю среду организма. - Бишкек, 2001. -Т.2. -С. 181 - 183.

5. Скуридина Е.Г. Влияние использования БАД «Литовит» в рационе беременных крыс на структурно-функциональную организацию печени потомства в норме и при недостатке пищевого белка // Материалы научной конференции «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии». - Новосибирск, 2002.-С. 349-350.

6. Скуридина Е.Г. Влияние минерального комплекса в рационе беременных животных на структуру печени потомства в норме и при недостатке пищевого белка // Материалы ЬХ международной научной студенческой конференции. - Новосибирск, 2002. - С. 196 - 197.

7. Скуридина Е.Г., Бгатова Н.П., Багинская Н.В. Влияние дефицита белка в рационе на структурную организацию печени потомства // П научная конференция с международным участием «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии». - Новосибирск, 2002.-С. 148.

8. Скуридина Е.Г. Изменение в структурной организации пространств Диссе печени крыс 2-дневного возраста при дефиците белка в рационе беременных самок // Материалы I Сибирского съезда лимфологов с международным участием. - Новосибирск, 2006.-С. 308-309.

9. Скуридина Е.Г., Бгатова Н.П. Изменения в структурной организации печени потомства в раннем постэмбриональном периоде при дефиците белка в рационе крыс в течение беременности // XIII Международное научное совещание и VI Школа по эволюционной физиологии. - Санкт-Петербург, 2006. - С. 201.

10. Скуридина Е.П, Бгатова Н.П. Структурная организация печени потомства при отсутствии белка животного происхождения в рационе крыс в период беременности // Бюл. СО РАМН. - 2007. - № 6. - С. 67-71.

11. Скуридина Е.Г., Бгатова Н.П. Структурные основы развития метаболического синдрома у потомства при дефиците белка в период беременности у крыс // «Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма». Материалы VIII Международного симпозиума и IX Чуйской научно-практической конференции. - Бишкек, 2007. -С. 185 - 187.

12. Скуридина Е.Г., Бгатова Н.П. Структурные признаки программирования метаболизма в печени в постнатальном периоде при дефиците белка в рационе крыс во время беременности // Международная конференция «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии». - Новосибирск, 2008. - С. 120 - 122.

13. Скуридина Е.Г., Кокшарова В.П. Влияние дефицита белка в рационе крыс в период беременности и лактации на структурную организацию перипортальных гепатоцитов 40-дневных крысят // Морфология. - 2008. - Т. 133, № 3. - С. 101.

14. Скуридина Е.Г., Бгатова Н.П. Отдаленные последствия влияния дефицита белка в рационе беременных и кормящих крыс на ультраструктуру цитоплазмы гепатоцитов детенышей // XXIII Российская конференция по электронной микроскопии. - Черноголовка, 2010.-С. 424.

Подписано в печать 25.06.2010. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 49. Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 333-37-39

Соискатель

Е.Г.Скуридина

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Скуридина, Елена Геннадьевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурно-функциональная организация печени

1.1.1. Структура и функции гепатоцитов

1.1.2. Структура и функции синусоидальных клеток

1.1.3. Структура и функции клеток Купфера

1.1.4. Структура и функции жиронакапливающих клеток

1.1.5. Структура и функции Pit-клеток

1.2. Изменение структурной организации печени в онтогенезе

1.3. Влияние белковой недостаточности рациона в течение беременности на организм плода

Глава П. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава HI. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Результаты исследования структуры печени крысят в возрасте 2-х суток.

3.2. Результаты исследования структуры печени крысят в возрасте 21 суток

3.3. Результаты исследования структуры печени крысят в возрасте 40 суток

3.4. Результаты исследования структуры печени крысят в возрасте 3-х месяцев

3.4.1 Исследование структуры печени крыс 3-х-месячного возраста, содержавшихся в течение всей жизни на сбалансированном рационе (К-К, контрольная группа)

3.4.2 Результаты исследования структуры печени крыс 3-месячного возраста, содержавшихся до 40 дней жизни на сбалансированном рационе и в дальнейшем переведенных на низкобелковый рацион (группа К-НБ)

3.4.3 Результаты исследования структуры печени крыс 3-месячного возраста, содержавшихся до 40 дней жизни на низкобелковой диете и в дальнейшем переведенных на сбалансированный рацион (группа НБ-К)

3.4.4 Результаты исследования структуры печени крыс 3-месячного возраста, содержавшихся в течение всей жизни на низкобелковом рационе (НБ-НБ, группа низкобелкового питания)

3.5. Результаты исследования структуры печени крысят в возрасте 16 месяцев.

3.5.1 Результаты исследования структуры печени крыс 16-месячного возраста, содержавшихся в течение всей жизни на сбалансированном рационе (К-К, контрольная группа)

3.5.2 Результаты исследования структуры печени крыс 16-месячного возраста, содержавшихся с 40 дней до 3 месяцев на низкобелковом рационе (группа К-НБ)

3.5.3 Результаты исследования структуры печени крыс 16-месячного возраста, содержавшихся до 40 дней жизни на низкобелковой диете и в дальнейшем переведенных на сбалансированный рацион (группа НБ-К)

3.5.4 Результаты исследования структуры печени крыс 16-месячного возраста, содержавшихся до 3-х месяцев на низкобелковом рационе (НБ-НБ, группа низкобелкового питания)

3.5.5 Результаты дисперсионного анализа данных морфометрии цитоплазмы гепатоцитов крыс в возрасте 16 месяцев

ОБСУЖДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ультраструктурная организация печени крыс в онтогенезе в условиях дефицита белка в пренатальном и раннем постнатальном периодах"

Актуальность темы. Питание является одним из важнейших факторов, опосредующих связь человека с внешней средой, оказывая решающее влияние на здоровье и устойчивость организма к воздействию экологически вредных факторов производства и среды обитания (Спиричев В.Б., 2001). Развитие науки и техники, появление новых технологий производства продуктов питания позволяют человечеству в меньшей степени зависеть от природных условий. Однако обилие продуктов, произведенных с использованием технологий, повышающих вкусовые качества, срок хранения и снижающих себестоимость, породило проблему несбалансированности рациона. В рационе современного человека преобладают легкоусваиваемые жиры и углеводы, в то время как белки, витамины и различные микроэлементы оказываются в дефиците (Алексеева О.П. и др., 2009). Особенно серьезно эта проблема проявляется во время беременности, поскольку рацион матери оказывает значительное влияние на организм плода. Показано (Gomez-Angelats М. et.al., 1995; Edwards C.R. et. al., 1996; Desai M. et.al., 1997; Ozanne S.E. et.al., 1998; Bertram C.E. et.al., 2001), что' недостаток белка во время беременности приводит к уменьшению массы тела потомства и вызывает изменения, связанные с повышенным риском возникновения метаболического синдрома в последующем развитии и снижением продолжительности жизни. Предложены гипотезы, частично объясняющие механизмы этого явления. Например, согласно гипотезе «экономного фенотипа», изменения в организме потомства при белковой недостаточности в пренатальном периоде носят характер преадаптации к будущему дефициту белка (Hales C.N., Barker D.G., 1992, 2001).

Литературные данные о последствиях низкобелкового питания матери для организма потомства во многом носят противоречивый характер (Armitage J.A. et al., 2004). Большинство исследователей сходятся во мнении, что реализации предрасположенности к метаболическому синдрому способствует высококалорийная или высокожировая диета в постнатальной жизни (Souza-Mello V. et al., 2007; Langley-Evans S.C., 2007; Feres N.H. et al., 2009). Оптимальное или повышенное количество белка позволяет догнать сверстников в массе и физическом развитии, однако также может способствовать ожирению и являться фактором, обусловливающим сокращение продолжительности жизни (Eriksson J. et al., 2000), хотя это не является строго доказанным (Armitage J.A. et al., 2004; Minana-Solis M.C., Escobar С., 2008). Имеются данные, что содержание мышей, перенесших пренатальный дефицит белка, на низкобелковой диете может увеличить продолжительность жизни (Chen J.H. et al., 2009). Ранее увеличение продолжительности жизни при низкобелковой диете было установлено для дрозофилы (Vigne Р., Freiin С., 2008; Vigne P. et al., 2009; Simpson S.J., Raubenheimer D., 2009).

Проблема влияния белковой недостаточности в период беременности на развитие метаболического синдрома, продолжительность жизни потомства и предрасположенность к заболеваниям остается актуальной. При анализе литературных данных обращает на себя внимание ряд нерешенных вопросов:

Во-первых, требует решения проблема выбора экспериментального рациона. Зарубежными исследователями используются, как правило, промышленные комбикорма, имеющие в качестве единственного источника аминокислот казеин, что позволяет точно соблюсти условия эксперимента, но уводит его от естественных условий и затрудняет интерпретацию результатов (Armitage J.A. et al., 2004).

Во-вторых, подавляющее число работ, касающихся проблемы развития метаболического синдрома, выполнено с использованием методов молекулярной биологии и биохимии. Это позволило получить достоверные данные о содержании метаболических маркеров в крови и органах экспериментальных животных, а также однозначно судить об изменениях в экспрессии генов и продукции регуляторных молекул и рецепторов к ним. Однако, в этой области наблюдается дефицит морфологических работ, позволяющих оценить характер влияния факторов, способствующих развитию метаболического синдрома, на клетки и ткани организма.

В-третьих, наблюдается дефицит работ, посвященных длительному мониторингу состояния организма потомства при низкобелковом питании матери, что необходимо для достоверной оценки направления происходящих в организме изменений.

В связи с вышеизложенным, представляется целесообразным проследить в эксперименте развитие потомства в течение всего онтогенеза при дефиците белка в пренатальном периоде и выявить возможную зависимость структурных преобразований в организме от содержания белка в рационе в постнатальном периоде. Наиболее адекватным морфологическим объектом для решения поставленной цели является печень — как центральный орган метаболизма. Имеются данные, что именно в печени происходят основные изменения, связанные с дефицитом белка в раннем онтогенезе (Ьап§1еу-Еуапз 8.С., 2007; Боига-МеНо V. & а1., 2007).

Цель исследования - выявить особенности структурной организации печени крыс на протяжении онтогенеза в условиях нормы, при дефиците пищевого белка в пренатальном и раннем постнатальном периодах и при смене характера питания в постнатальном периоде.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику прироста массы тела крысят, рожденных самками, получавшими в период беременности и лактации сбалансированный рацион и рацион, дефицитный по содержанию белка.

2. Исследовать структурную организацию печени и ультраструктурную организацию гепатоцитов крысят сразу после рождения, в период молочного вскармливания и после его окончания в норме и при дефиците белка в рационе беременных и кормящих самок.

3. Исследовать структурную организацию печени и ультраструктурную организацию гепатоцитов половозрелых и стареющих крыс, рожденных самками, получавшими в период беременности и лактации сбалансированный рацион, при переводе их в постнатальном периоде на рацион, дефицитный по содержанию белка.

4. Исследовать структурную организацию печени и ультраструктурную организацию гепатоцитов половозрелых и стареющих крыс, рожденных самками, получавшими в период беременности и лактации низкобелковый рацион, при переводе их в постнатальном периоде на сбалансированный рацион и рацион, дефицитный по содержанию белка.

Научная новизна. Впервые с помощью методов световой, электронной микроскопии и морфометрии выявлены морфологические изменения в печени и ультраструктурной организации гепатоцитов крысят на протяжении периода молочного вскармливания при дефиците белка в рационе беременных и кормящих самок: повышение объемной и численной плотностей жиронакапливающих клеток, снижение концентрации цитоплазматических органелл и накопление гликогена в гепатоцитах.

Впервые установлено, что при переводе крысят, рожденных самками, получавшими в периоды беременности и лактации низкобелковый рацион, в период самостоятельного кормления на сбалансированный рацион, в печени происходят структурные изменения, свидетельствующие о повышенной функциональной нагрузке на орган: появление локальных воспалительных инфильтратов, чрезмерное накопление включений и набухание митохондрий в гепатоцитах. С возрастом печень этих животных возвращается к норме.

Впервые показано, что у половозрелых крыс, содержавшихся на низкобелковом рационе в течение всего периода развития, морфометрические показатели печени и ультраструктурная организация гепатоцитов достоверно не отличаются от структуры печени и гепатоцитов животных контрольной группы.

Впервые установлено, что при содержании крыс на низкобелковом рационе в течение всего периода развития, структурные признаки старения в печени (утолщение стенок синусоидов, снижение объемных и численных плотностей органелл в гепатоцитах) в возрасте 16 мес выражены в меньшей степени, чем у животных контрольной группы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты работы дополняют и расширяют современные представления о структурной организации печени крыс в постнатальном онтогенезе. Полученные данные способствуют более полному пониманию механизмов влияния дефицита белка в пренатальном и раннем постанатальном периодах на структурную организацию печени в последующем развитии.

Выявленную зависимость структурных изменений, происходящих в печени потомства при белковой недостаточности рациона в период беременности и лактации следует учитывать при разработке рекомендаций по оптимальному питанию детей, испытывавших дефицит белка в пренатальном и раннем постнатальном периодах.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Низкобелковое питание крыс в период беременности и лактации приводит к снижению массы тела и замедленному развитию детенышей, развитию структурных изменений в печени потомства, свидетельствующих о снижении интенсивности процессов энергетического обмена и синтеза белка.

2. При низкобелковом питании беременных и кормящих самок происходит адаптация печени потомства к рациону со сниженным содержанием белка. Перевод животных после перехода к самостоятельному питанию на сбалансированный рацион приводит к развитию структурных изменений, свидетельствующих о функциональном напряжении органа.

3. Содержание крыс на низкобелковой диете с окончания периода молочного вскармливания до наступления половозрелости обусловливает изменения структурной организации печени в онтогенезе, свидетельствующие о повышенной функциональной активности органа.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 25-летию НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН «Север-Человек: проблемы сохранения здоровья»

Красноярск, 2001), XXXIX и ЬХ международных научных студенческих конференциях (Новосибирск, 2001, 2002), Международном научном симпозиуме по проблемам саногенного и патогенного эффектов экологических воздействий на внутреннюю среду организма (Бишкек, 2001, 2007), научной конференции «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии» (Новосибирск, 2002), II научной конференции с международным участием «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), I Сибирском съезде лимфологов с международным участием (Новосибирск, 2006), XIII Международном научном совещании и VI Школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), Международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» (Новосибирск, 2008), Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте», посвященной 80-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РФ проф. П.В.Дунаева (Тюмень, 2008), XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2010), ученом совете в Научно-исследовательском институте клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН (Новосибирск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 2 - в научных журналах, рекомендованных ВАК России.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Скуридина, Елена Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Дефицит белка в рационе беременных и лактирующих крыс приводит к снижению массы тела и более позднему открытию глаз у потомства.

2. При низкобелковом питании беременных и лактирующих крыс в печени потомства развиваются структурные признаки, свидетельствующие об изменении метаболизма органа: повышается численная плотность жиронакапливающих клеток; снижается концентрация органелл в гепатоцитах на фоне значительного возрастания объемной плотности гликогена, что максимально выражено в конце периода молочного вскармливания.

3. Перевод крысят на низкобелковый рацион после окончания периода молочного вскармливания приводит к снижению массы тела и повышению содержания жиронакапливающих клеток в печени, накоплению гликогена в гепатоцитах крыс половозрелого возраста.

4. После отмены низкобелковой диеты в этих условиях масса тела и структурная организация печени крыс практически возвращаются к норме, за исключением структуры перипортальных гепатоцитов, демонстрирующих признаки умеренного увеличения интенсивности синтетических и метаболических процессов у стареющих животных.

5. Перевод крысят с низкобелкового на сбалансированный рацион после окончания периода молочного вскармливания приводит к структурным изменениям в печени (набуханию митохондрий, появлению локальных воспалительных инфильтратов), свидетельствующим о напряжении функции и дезадаптации органа на фоне сниженной массы тела у половозрелых животных. У стареющих животных появляются морфологические признаки, отражающие снижение метаболической активности гепатоцитов на фоне накопления питательных веществ, при восстановлении массы тела.

6. Содержание крысят, имевших дефицит пищевого белка в пренатальном периоде, на низкобелковом рационе до полового созревания приводит к развитию структурных признаков (отсутствие достоверных отличий структурной организации печени от печени животных контрольной группы), свидетельствующих об адаптации печени молодых половозрелых животных к низкобелковому рациону на фоне сниженной массы тела. У стареющих животных в печени развиваются изменения, свидетельствующие о повышенной метаболической активности гепатоцитов на фоне сниженной массы тела.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В связи с полученными данными о влиянии содержания белка в рационе в период беременности и кормления на структурную организацию печени потомства, следует уделять особое внимание качественному составу рациона беременных и кормящих женщин.

2. При сниженной массе тела ребенка вследствие дефицита пищевого белка в пренатальном периоде, следует соблюдать осторожность при назначении диеты для восстановления массы тела и ускорения развития.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скуридина, Елена Геннадьевна, Новосибирск

1. Автандилов Г.Г., Невзоров В.П., Невзорова О.Ф. Системный стереометрический анализ ультраструктур клеток. Кишинев. 1984. 166с.

2. Авцын А.П., Шахламов В.А. Ультраструктурные основы патологии клетки. М. 1979. 320 с.

3. Алексеева О.П., Востокова A.A., Курышева М.А. Метаболический синдром: современное понятие, факторы риска и некоторые ассоциированные заболевания. Н. Новгород. 2009. 112с.

4. Бгатова Н.П. Структурная организация нормальной и поврежденной паренхимы печени при различном содержании белка в пище. Автореферат, Н-ск, 1989, 25с.

5. Безбородкина H.H. Сравнительный анализ метаболизма гликогена в гепатоцитах нормальной и цирротической печени. Автореферат. 2006. С-П. 26с.

6. Безбородкина H.H., Оковитый C.B., Кудрявцев Б.Н. Углеводный метаболизм при хронических поражениях печени. СПб. 2008. 176с.

7. Березин А.Е. Элевация концентрации триглицеридов в плазме крови и кардиоваскулярный риск. // Укр. Мед. Часопис. 2009. Т. 71. - №3. - С.70-76.

8. Бернар В. Ультраструктура клеточного ядра в интерфазе. // Клеточное ядро. Морфология, физиология, биохимия, М. 1972. — С. 11-15.

9. Бреслер В.М., Черногрядская H.A., Пильщик Е.М. и др. Нормальная и патологическая цитология паренхимы печени. Л. 1969. 197с.ю. Быков В.Л. Цитология и общая гистология. М. 1998. — С.31-64.

10. Ванюшин Б.Ф. Энзиматическое метилирование ДНК — эпигенетический контроль за генетическими функциями клетки // Биохимия. 2005. Т.70. -С.598—611.

11. Верин B.K. Дивергентная дифференцировка гепатоцитов и холангиоцитов в эмбриональном и репаративном гистогенезе печени. Автореферат. JI. 1983. 34с.

12. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Гистология, цитология и эмбриология: Атлас. М. 1996. 544с.

13. Гичев Ю.П. Печень: адаптация, экология. Н-ск. 1993. 152с.

14. Григорьев Н.И. Строение и регенерация печени после ее местного повреждения. JI. 1975. 192с.

15. Гумерова A.A., Титова М.А., Киясов А.П. Экспрессия маркеров различных типов клеток печени на ранних этапах пренатального развития человека. // Цитология. 2007.-Т.49. №2.-С. 133-141.

16. Давыдов В.В., Захарченко И.В., Овсянников В.Г. Особенности свободнорадикальных процессов в печени взрослых и старых крыс при стрессе. //Бюлл.Эксп.Биол.Мед. 2004. Т. 137. - №2. - С. 160-163.

17. Егорова В.В., Никитина A.A., Тимофеева Н.М., Влияние сроков отнятия и дефицита белка в питании крысят на активность пищеварительных ферментов // Журнал эволюц. биохим. физиол. 2008. - Т.44. - №5. - С.501-508.

18. Егорова Е.Г. Клинико-морфологические особенности поражения печени у больных с инсулинорезистентностью. Автореферат. М. 2008. 24с.

19. Емельянов A.B. Некоторые особенности метаболизма гликогена в гепатоцитах при хронических поражениях печени. Автореферат. С-П. 1997. 20с.

20. Звенигородская JI.A., Хомерики С.Г., Егорова Е.Г. Морфологические изменения печени при инсулинорезистентности. // Рус.Мед.Журнал. 2008. -Т.16. -№4.-С.161-165.

21. Иванников И.О., Сюткин В.Е. Общая гепатология М. 2003. 160с.

22. Калашникова М.М. Характеристика морфологической дифференцировки гепатоцитов животных разных классов в онтогенезе в зависимости отособенностей питания. // Бюлл. эксп. биол. мед. 1997. Т. 123. - №1. - С.4-10.

23. Калашникова М.М. Ультраструктурные аспекты приспособительных особенностей клеток печени позвоночных. М. 2003. 195с.

24. Каппас А, Альварес А. Превращения чужеродных веществ в печени. // Молекулы и клетки. 1977. Вып.6. - С.287-303.

25. Кудрявцева М.В, Безбородкина Н.Н, Нилова В.К, Кудрявцев Б.Н Влияние частичной гепатэктомии на уровни гликогена в гепатоцитах портальной и центральной зон дольки цирротически измененной печени крыс // Цитология. 2001. Т.43. - №.7. - С.674-680.

26. Jle Тхань-Уеан. Реакция организма в различные периоды действия малобелковой диеты. /УВопр. пит. 1983. №3. - С.35-58.

27. Логинов A.C., Аруин Л. И. Клиническая морфология печени. М. 1985. 240с.

28. Лукьянова Е.С, Ефремов A.B., Кузьменко Д.Б. Морфофункциональное состояние печени под влиянием различных методов коррекции при экспериментальном синдроме дляительного сдавливания. // Бюл.СО РАМН. 2009. Т. 140. - №6. - С.24-29.

29. Лукьянова Л.Д, Уголев А.Т, Дудченко A.M. Получение изолированных гепатоцитов и общие характеристики их функционально-метаболического статуса. // Гепатоцит: функционально-метаболические свойства. М. 1985. -С. 9-37.

30. Малахова М.Я. Эндогенная интоксикация как отражение компенсаторной перестройки обменных процессов в организме. Эфферентная терапия. 2000. -Т.6. -№4. С.3-14.

31. Маянский Д.Н., Виссе Э., Декер К. Новые рубежи гепатологии. Н-ск. 1992. 266с.

32. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М. 1981. 278с.

33. Мишнев О.Д., Щеголев А.И. Структурно-метаболическая характеристика ацинуса печени // Арх. патологии, гистологии и эмбриологии. 1988. T.XCV. - № 10. - С. 89-96.

34. Непомнящих Д.Л., Айдагулова C.B., Непомнящих Г.И. Биопсия печени: патоморфогеиез хронического гепатита и цирроза. М. 2006. 368с.

35. Непомнящих JI.M., Лушникова Е.Л., Непомнящих Г.И. Морфометрия и стереология гипертрофии сердца. Новосибирск. 1986. 303с.

36. ОзернкжН.Д. Рост и воспроизведение митохондрий. М. 1978. 263с.

37. Подымова С.Д. Жировой гепатоз, неалкогольный стеатогепатит. Клинико-морфологические особенности. Прогноз. Лечение. // Рус.Мед.Журнал. — 2005. Т.7. - №2. - С. 61-66.

38. Покровский А.А, Крыстев Л.П. "Печень, лизосомы и питание", София. 1977. 208с.

39. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М. 1975. 326с.

40. Усынин И.Ф. Адаптивная роль функциональной гетерогенности гепатоцитов. // Бюл. СО РАМН. 2007. - Т. 127. - №5. - С. 17-23.

41. Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени. Будапешт. 1961. 215с.

42. Ченцов Ю.С. Общая цитология. М. 1984. 352с.

43. Шашкина М.Я., Шашкин П.Н., Сергеев A.B. Биодоступность каротиноидов // Вопр. Мед. хим. 1999. — Т.45. № 2. — С. 47-55.

44. Штейн Г.И. Кинетика полиплоидизации гепатоцитов в процессе постнатального развития млекопитающих. Автореферат. С-П. 1991. 19с.

45. Южаков В.В. Ультраструктурный анализ развития гепатоцитов в постнатальном онтогенезе. Автореферат М. 1975. 19с.

46. Amenta P.S., Harrison D. Expression and potential role of the extracellular matrix in hepatic ontogenesis: a review. // Microsc. Res. Tech. 1997. Vol.39(4). - P.372-386.

47. Anthony B., Allen J.T., Li Y.S., McManus D.P. Hepatic stellate cells and parasite-induced liver fibrosis. // Parasit Vectors. 2010. Vol.3(1). - P.60.

48. Archer J.M., Papadimitriou J.M. Fat storage cells in the livers of protein deficient rats. // Pathology. 1969. Vol. 1(3). -P.205-209.

49. Arterburn L.M., Zurlo J., Yager J.D., Overton R.M., Heifetz A.H. A morphological study of differentiated hepatocytes in vitro. //Hepatology. 1995. -Vol.21. -P. 175-187.

50. Asumendi A., Alvarez A., Martinez I., Smedsrnid B., Vidal-Vanaclocha F. Hepatic sinusoidal endothelium heterogeneity with respect to mannose receptor activity is interleukin-1 dependent. // Hepatology. 1996. Vol.23(6). - P. 1521 -1529.

51. Baranov V., Rescan P.Y., Rissel M., Grimaud J.A., Guillouzo A. Ultrastructural localization of the major components of the extracellular matrix in normal mouse liver. // J.Submicrosc.Cytol.Pathol. 1990. Vol.22(4). - P.497-506.

52. Barger J.L., Walford R.L., Weindruch R. The retardation of aging by caloric restriction: its significance in the transgenic era. // Exp.Gerontol. 2003. — Vol.38(l 1-12). P. 1343-1351.

53. Barker D.J.P. The malnourished baby and infant. // Brit.Med.Bull. 2001. -P.69-88.

54. Begg D.P., Sinclair A.J., Stahl L.A., Garg M.L., Jois M., Weisinger R.S. Dietary protein level interacts with omega-3 polyunsaturated fatty acid deficiency to induce hypertension. // Am J.Hypertens. 2010. Vol.23(2). - P.125-128.

55. Benuck M., Banay-Schwartz M., DeGuzman T. et.al. Effect of diet on tissue protease activity. // J.Neurosci.Res. 1995. Vol.40(5). - P.675-679.

56. Bertram C.E., Hanson M.A. Animal models and programming of the metabolic syndrome. //Brit.Med.Bull. 2001. Vol.60. - P.103-121.

57. Biondo-Simoes M.L., Matias J.E., Montibeller G.R., Siqueira L.C., Nunes E.S., Grassi C.A. Effects of ageing on liver regeneration in rats. II Acta Cir.Bras. 2006. -Vol. 21(4).-P. 197-202.

58. Blakolmer K., Jaskiewicz K., Dunsford H.A., Robson S.C. Hematopoetic stem cell markers are expressed by ductal plate and bile duct cells in developing human liver. // Hepatology. 1995. Vol.21. - P. 1510-1516.

59. Bogdarina I., Murphy H.C., Burns S.P., Clark A.J. Investigation of the role of epigenetic modification of the rat glucokinase gene in fetal programming. // Life Sci. 2004. Vol.74(l 1). - P. 1407-1415.

60. Bogdarina I., Welham S., King P.J., Burns S.P., Clark A.J. Epigenetic modification of the renin-angiotensin system in the fetal programming of hypertension. //

61. Bort R., Signore M., Tremblay K., Martinez Barbera J.P., Zaret K.S. Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development. // Dev.Biol. 2006. Vol.290(1). — P.44-56.

62. BouaJga A., Bouchenak M., BellevillenJ. Low-protein diet prevents tissue lipoprotein lipase activity increase in growing rats. // Br.J.Nutr. 2000. -Vol.84(5). -P.663-671.

63. Bouwens L, De Bleser P, Vanderkerken K, Geerts B, Wisse E. Liver cell heterogeneity: functions of non-parenchymal cells. // Enzyme. 1992. — Vol.46(l-3). P.155-168.

64. Braet F., Riches J., Geerts W., Jahn K.A., Wisse E., Frederik P. Three-dimensional organization of fenestrae labyrinths in liver sinusoidal endothelial cells. //Liver Int. 2009. Vol.29(4). -P.603-613.

65. Brawley L., Itoh S., Torrens C., Barker A., Bertram C., Poston L., Hanson M. Dietary protein restriction in pregnancy induces hypertension and vascular defects in rat male offspring. // Pediatr.Res. 2003. Vol.54(l). - P.83-90.

66. Bronfenmajer S., Schaffner F., Popper H. Fat-storing cells (lipocytes) in human liver. // Arch.Pathol. 1966. Vol.82(5). - P.447-453.

67. Brosnan M.E., Brosnan J.T. Hepatic glutamate metabolism: a tale of 2 hepatocytes. //AmJ.Clin.Nutr. 2009. Vol.90(3). -P.857S-861S.

68. Burdge G.C., Lillycrop K.A. Nutrition, epigenetics, and developmental plasticity: implications for understanding human disease. // Annu.Rev.Nutr. 2010.- Vol.30.-P.315-339.

69. Cascio S., Zaret K.S. Hepatocyte différenciation initiates during endodermal-mesenchymal interactions prior to liver formation. // Development. 1991. — Vol.113.-P.217-225.

70. Cheema K.K., Dent M.R., Saini H.K., Aroutiounova N., Tappia P.S. Prenatal exposure to maternal undernutrition induces adult cardiac dysfunction. // Br J.Nutr. 2005. - Vol.93 (4). - P.471-477.

71. Cheluvappa R., Hilmer S.N., Kwun S.Y., Jamieson H.A., O'Reilly J.N., Muller M., Cogger V.C., Le Couteur D.G. The effect of old age on liver oxygenation and the hepatic expression of VEGF and VEGFR2. // Exp.Gerontol. 2007. -Vol.42(10). P.1012-1019.

72. Chen J.H., Tarry-Adkins J.L., Heppolette C.A., Palmer D.B., Ozanne S.E. Early-life nutrition influences thymic growth in male mice that may be related to the regulation of longevity. // Clin.Sci (Lond). 2009. Vol. 118(6). - P.429-438.

73. Cichoz-Lach H., Celiñski K., Slomka M., Kasztelan-Szczerbiñska B. // Pathophysiology of portal hypertension. // J.Physiol.Pharmacol. 2008. -VoI.59(2).-P.231-238.

74. Cogger V.C., Warren A., Fraser R., Ngu M., McLean A.J., Le Couteur D.G. Hepatic sinusoidal pseudocapillarization with aging in the non-human primate. // Exp.Gerontol. 2003. Vol.3 8(10). - P. 1101-1107.

75. Conboy I.M., Conboy M.J., Wagers A.J., Girma E.R., Weissman I.L., Rando T.A. Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment. // Nature. 2005. Vol.433. - P.760-764.

76. Conover C.A., Bale L.K., Mader J.R., Mason M.A., Keenan K.P., Marier R.J. Longevity and age-related pathology of mice deficient in pregnancy-associated plasma protein-A. // J.Gerontol.A.Biol.Sci.Med.Sci. 2010. Vol.65(6). - P.590-599.

77. Cottrell E.C., Seckl J.R. Prenatal stress, glucocorticoids and the programming of adult disease. // Front Behav.Neurosci. 2009. Vol.3. - 19.

78. Coupe B., Grit I., Darmaun D., Parnet P. The timing of "catch-up growth" affects metabolism and appetite regulation in male rats born with intrauterine growth restriction. // Am.J.Physio.Integr.Comp Physiol. 2009. - Vol.297(3). - P.813-824.

79. Crispe I.N. The liver as a lymphoid organ. // Annu.Rev.Immunol. 2009. -Vol.27.-P. 147-163.