Токсическое действие меди и механизмы ее детоксикации растениями рапса

Иванова, Елена Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Токсическое действие меди и механизмы ее детоксикации растениями рапса
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Токсическое действие меди и механизмы ее детоксикации растениями рапса"

На правах рукописи

ИВАНОВА Елена Михайловна

ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ МЕДИ И МЕХАНИЗМЫ ЕЕ ДЕТОКСИКАЦИИ РАСТЕНИЯМИ РАПСА

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва, 2011

9 ИЮН 2011

4849894

Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Учреждения Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Холодова Валентина Павловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Мейчик Наталья Робертовна

доктор биологических наук, профессор

Пронина Наталия Александровна

Ведущее учреждение: Московский педагогический государственный университет

Защита состоится «21» шопя 2011 г. в И часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

Факс: (499)977-80-18, е-таЦ:т-а2аг1«тс11@1ррга5.ги; ifr@ippras.ru. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан чМ^ъ (ЖМЛу 2011 года

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций,

кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Все возрастающее техногенное давление на среду обитания остро ставит вопрос о стратегиях и механизмах адаптации растений к действию абиотических стрессоров, среди которых особое положение занимают тяжелые металлы (ТМ). Медь (Си), являясь наиболее токсичным ТМ, принадлежит к эссенциальным элементам, которые в следовых количествах необходимы для метаболизма, роста и развития растений, но при избытке в среде могут проявлять сильное токсическое действие (Hall, Williams, 2003).

В физиологических условиях медь существует в восстановленном (Си+) и окисленном (Си2+) состояниях и, являясь кофактором ряда ферментов, вовлекается в процессы фотосинтеза и дыхания, в защиту растений от окислительного стресса, в метаболизм клеточной стенки, в восприятие этиленового сигнала и биогенез молибденового кофактора (Yruela, 2009; Cohu, Pilon, 2010). Однако диапазон концентраций Си, обеспечивающих оптимальный клеточный метаболизм и развитие растений, весьма узок. Считается, что даже их двукратное превышение может оказывать негативное действие, тогда как высокие концентрации Си вызывают токсичные синдромы (хлорозы и некрозы, ингибирование роста корней и побегов), вплоть до летальных эффектов. В связи с этим остро встает крайне важный вопрос, каким образом в условиях избытка Си растение регулирует ее гомеостаз, то есть, с одной стороны, обеспечивает клетки всех тканей и органов микроколичествами Си, без которой жизнедеятельность организма невозможна, и, с другой стороны, предотвращает ее токсические эффекты и собственную гибель. Адаптация растений к токсическому действию меди связана с функционированием как специализированных (хелатированис, секвестеризация и компартментация ТМ), так и общих механизмов устойчивости (низкомолекулярные органические стресс-протекторные соединения, защитные макромолекулы и антиоксидантные системы) (Hall, 2002; Clemens, 2006). И те, и другие в настоящее время интенсивно изучаются, при этом недостаточно внимания уделяется физиологическим механизмам защиты растений от меди в высоких концентрациях, хотя до полного понимания молекулярных механизмов детоксикации меди еще далеко. Остается также не выясненным характер распределения этого эссенциального элемента по растению, что имеет принципиальное значение для анализа регуляторных механизмов внутриклеточного

гомеостатирования. В настоящем исследовании предпринята попытка поиска ответов на поставленные выше вопросы.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в изучении особенностей повреждающего действия меди в высоких концентрациях на растения рапса (Brassica napus L.) с. Вестар и некоторых физиологических и молекулярных механизмов ее детоксикации.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Установить диапазон концентраций меди, в пределах которых растения рапса способны успешно завершить полный онтогенетический цикл.

2. Оценить степень токсического действия меди на некоторые физиологические параметры.

3. Изучить уровень аккумуляции меди и ее распределение по органам растений

рапса.

4. Определить влияние повышенного содержания меди на поглощение и перенос в надземные органы ряда эссенциальных металлов.

5. На уровне матриц исследовать потенциальную роль в реализации устойчивости к меди генов мембранных транспортеров плазмалеммы ZIP4 и НМА5, генов высокомолекулярных хелаторов металлотионеинов МТ1 и МТ2 и гена фитохелатинсинтазы PCS в клетках корней и листьев растений рапса.

6. Дать количественную оценку характера связи между содержанием накопленной в органах рапса меди и уровнем матриц изученных генов.

Научная новизна. Впервые выявлены биологические особенности локализации меди по органам растений рапса, в том числе распределение меди между корнями и листьями разного яруса. Проведена оценка подвижности меди в растениях в период восстановления, при удалении избытка меди из питательной среды. Экспериментально показано влияние меди на поступление и гранслокацию таких микроэлементов как Fe, Mil и Zn, а также взаимодействие меди и цинка при внесении их в питательную среду в высоких концентрациях. Впервые на одной растительной системе изучена динамика аккумуляции меди и экспрессии генов, кодирующих мембранные транспортеры и хелаторы. Установлены особенности коррелятивных связей между экспрессией каждого из изученных генов и содержанием меди в тканях корней и листьев растений рапса. Получены данные о скоординированной активации

генов двух групп хелаторов - МТ и PCS - на начальном этапе детоксикации избытка внутриклеточной Си.

Практическая значимость. Полученные в работе данные имеют существенное значение для выяснения механизмов детоксикации, одним из которых является удерживание меди в листьях нижнего яруса, что позволяет снизить нагрузку на растение этого высоко токсичного ТМ. Эти данные необходимо учитывать не только при изучении механизмов адаптации растений рапса к действию меди, но и при оценке возможностей использования этого растения для очистки загрязненных территорий. Настоящее исследование уточняет представление о возможном участии генов 7.1Р4, НМА5, MTl, МТ2 и PCS в детоксикации меди, и позволяет говорить о скоординированном действии генов двух групп SH-содержащих хелаторов — металлотионеинов и фитохелатинов. Теоретические обобщения и совокупность полученных экспериментальных данных могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов университетов и ВУЗов страны.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональней организации растений» (Екатеринбург, 2008); Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» (Апатиты, 2009); межинститутском молодежном семинаре «Актуальные проблемы физиологии, молекулярной биологии и биотехнологии растений» (ИФР РАН, Москва, 2010); XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (МГУ, 2010); Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского университета им. A.M. Горького «Биология будущего: традиции и инновации» (Екатеринбург, 2010); конференциях молодых ученных ИФР РАН (Москва 2009, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 2 статьи опубликованы в рецензируемых журналах.

машинописного текста, включая'/? таблиц,ХЬ рисунков; список литературы состоит

наименований, в т.ч.Л0£н& иностранном языке.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на растениях рапса (Brassica napus L.) с. Вестар.

Выращивание растений проводили при температуре 23-25°С/18-20°С, 12-часовом фотопериоде при освещенности 450 мкмоль/(м2с) металл-галогеновыми лампами (фирма «Philips», Нидерланды). В возрасте 3 недель растения, выращенные на перлите, высаживали на модифицированную питательную среду Хогланда-Снайдерс с Fe(N03)2, содержащую 0,25 мкМ CuS04. Исследования проводили на 6-недельных растениях с 3-4 полностью развитыми листьями. Опыты начинали внесением C11SO4 в питательную среду в концентрациях 10, 50 и 150 мкМ, продолжительность воздействия составляла от 3 ч до 10 дней. Контролем служили растения, росшие на стандартной среде с 0,25 мкМ CuS04. Среду сменяли каждые 5 дней.

Условия проведения опытов. В стандартных экспериментах физиологические показатели и уровень мРНК анализировали в корнях и листьях, включая в пробу корневого материала всю массу тонких корней, в пробу листьев - по 1-2 листа среднего яруса, при необходимости листья подразделяли на нижний и верхний ярусы. В отдельной серии экспериментов 3-недельные растения переносили с перлита в водную культуру на 'Л концентрации среды Хогланда-Снайдерс, полностью исключая CuS04 из ее состава. После 20 дней роста растений на среде без меди их подвергали воздействию повышенных концентраций CuS04. При изучении процессов восстановления после 5 суток роста растений рапса на среде, содержавшей высокие концентрации меди, растения переносили на стандартный питательный раствор, предварительно промыв корни проточной водой.

Измерение свежей массы отдельных органов (корней и листьев) и содержания в них воды проводили стандартными весовыми методами. Содержание пигментов в листьях рапса проводили по Шлыку (1971). Оценку аккумуляции Си в корнях проводили после энергичной промывки их водопроводной водой и дополнительно в течение 15 мин в 10 мМ ЭДТА. Содержание ТМ в тканях растений

рапса измеряли на атомно-адсорбционном спектрометре ААС-ФМ 400 (фирма «ЛАБИСТ», Россия) после кислотного озоления тканей (Холодова и др., 2005).

Оценку уровня мРНК генов мембранных транспортеров {7.1 Р4 и НМА5), высокомолекулярных хелаторов металлотиокеинов (МТ1 и МТ2) и гена фитохелатинсинтазы (PCS) проводили методом полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Тотальную РНК выделяли с использованием RNeasy Mini Kit фирмы «QIAGEN». Реакцию обратной транскрипции выполняли по руководству фирмы «Fermentas». ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе 2720 Thermal Cycler фирмы «Applied Biosystems» (США). Для оценки результатов ПЦР проводили электрофорез нуклеиновых кислот в 1-1,5% геле в присутствии бромистого этидия. Специфические праймеры для проведения ПЦР исследуемых генов конструировали с использованием базы данных NCBI (www.ncbi.nlm.nih.govi в Vector NTI 9.0.0. В качестве контрольного гена использовали ген I8SrRNA. Секвенирование кДНК последовательностей было выполнено в ЦКП «Геном» (Институт молекулярной биологии им. В.А. Эндельгардта).

Все опыты проводили в трехкратной биологической повторности. Обработку данных и корреляционный анализ проводили в программе Excel 2007. В таблицах представлены средние величины и их стандартные отклонения. Барами на рисунках обозначены стандартные отклонения от среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние меди на основные физиологические параметры

Одним из основных физиологических показателей состояния растений является накопление биомассы. Оценивали свежую биомассу корней и листьев рапса исходных растений, на 5-е и 10-е сутки действия меди в высоких концентрациях.

0,25 шМ ПЮмкМ ВбОмкМ МШмкМ 10 -

Начало опыта 5 дней

10 дней

Начало опыта 5 дней

10 дней

Рис. 1. Влияние меди в высоких концентрациях на накопление свежей массы корней и листьев растений рапса.

Как видно из данных, представленных на рис. 1, за 10 дней роста свежая масса корней растений контрольного варианта достигала 1,89 г/растение, листьев - 9,13 г. При действии меди в концентрациях 10 и 50 мкМ ингибирование накопления биомассы корней за 10 дней составило 24 и 60%, листьев - 25 и 49%. Однако при сравнении данных по накоплению биомассы за 5 и 10 суток воздействия 50 мкМ меди прирост свежей массы корней и листьев превышал 15 и 27% соответственно. Более значительное 73 и 64%-ое снижение биомассы корней и листьев происходило через 10 дней при действии меди в концентрации 150 мкМ, но, несмотря на это сохранялся небольшой прирост - на 8 и 21% для корней и листьев соответственно.

Доказательства жизнеспособности растений рапса при росте на среде, содержавшей медь в высоких концентрациях, были получены в опытах по восстановлению, в которых растения после 5-дневного роста на среде с избытком меди были перенесены на 5 дней на стандартный питательный раствор (рис. 2). В течение 5-дневного периода восстановления рост корней составил 22-14%, и в большей степени - на 36-27% восстанавливался рост листьев.

0.25 мкМ 10 мкМ 50 мкМ 150 мкМ 0,25 икМ 10 мкМ 50 мкМ 150 мкМ

Рис. 2. Изменение свежей биомассы корней и листьев растений рапса, растущих в течение 5 дней на среде с избытком Си (/) и в период 5-дневного роста на стандартной питательной среде (период восстановления) (2).

При росте на среде с избытком меди визуально наблюдалось подвядание растений и появление хлороза, поэтому была проведена оценка оводненности тканей и содержания в них пигментов. Оказалось, что рост растений на среде с медью в высоких концентрациях приводил к сильному снижению содержания воды в листьях рапса; со временем негативный эффект заметно усиливался (рис. 3).

Одной из причин падения содержания воды в клетках растений может быть уменьшение размеров корневой системы и снижение всасывающей

поверхности (Veselov et al., 2003: Титов и др., 2007).

Время воздействия, дни

Рис. 3. Содержание воды в листьях растений ^

Среди токсичных

рапса.

эффектов, вызванных высокими концентрациями меди, важно отметить не только снижение тургора листьев, но и появление хлороза, что связано со снижением содержания фотосинтетических пигментов (табл.1).

Таблица 1. Влияние меди на содержание фотосинтетических пигментов на 5- и 10-е сутки воздействия, мг/дм2

5 дней

Вариант Хл а Хл Ь а+Ь alb Кар Кс

0,25 мкМ 3,9±0,4 1,7±0,2 5,6 2,3 1,6±0,2 2,4±0,2

Си 10 мкМ 3,8±0,2 1,6±0,3 5,4 2,4 1,4±0,3 2,3±0,2

Си 50 мкМ 3,1±0,3 1,3±0,2 4,4 2,4 1,2±0,2 2,1±0,1

Си 150 мкМ 2,6±0,2 0,9±0,1 3,5 2,9 0,9±0,1 1,7±0,2

10 дней

Вариант Хл а Хл Ь а+Ь alb Кар 1 Кс

0,25 мкМ 3,7±0,3 1,5±0,2 5,3 2,4 1,5±0,2 2,2±0,3

Си 10 мкМ 3,5±0,3 1,3±0,3 4,8 2,7 1,2±0,2 2,1±0,3

Си 50 мкМ 2,5±0,3 0,9±0,1 3,4 2,7 1,0±0,1 1,8±0,2

Си 150 мкМ 1,9 ±0,2 0,5±0,1 2,5 3,2 0,4±0,2 1,3±0,2

Примечание: Определение содержания фотосинтетических пигментов проводили в листьях среднего яруса. Кар - каротиноиды, Кс - ксантофиллы.

Из данных, представленных в таблице 1, видно, что при продолжительном влиянии меди в концентрациях свыше 50 мкМ наблюдалось 2-3-кратное снижение содержания хлорофиллов, в большей степени хл Ь, что косвенно могло указывать на нарушение биосинтеза хлорофиллов (Maksymiec, 1997). Наиболее сильное негативное действие меди проявлялось в снижении содержания каротиноидов в 3,8 раза к 10 суткам эксперимента, что, вероятно, связано с выполняемой ими антиоксидантной ролью при развивающемся при высоких концентрациях меди в среде окислительном стрессе в листьях растений рапса (Кузнецов, Дмитриева, 2005).

Появление хлороза и снижение роста растений в целом могло происходить вследствие нарушения при избытке меди поступления других эссенциальных элементов. В связи с этим было изучено влияния меди на поглощение и транслокацию Fe, Мп и Zn (рис. 4). Опыты проводили на растениях рапса, выращенных на модифицированном питательном растворе Хогланда-Снайдерс, при содержании в среде 12 мкМ Fe(N03)2, 1 мкМ MnS04, 1 мкМ ZnS04, 0,25 и 150 мкМ CuS04.

§,600 о

| 500 p-400 oj 300

Содержание Fe

корни листья

г 140 2000 ,

- 120

1600 -

■ 100

- 80 1200 -

- 60 800 -

- 40

400 -

• 20

- п 0 -

Содержание Mn

нории листья

rfl

350 100

300 80 -

250

200 60 -

150 40 -

100

50 20 -

Содержание Zn

корн» листья

J-i2

г 60 к

• 50 CD

—I

- 40 ^

■ 30

■ 20 ^

■ 10 2 CD

• 0 О"

Рис. 4. Поступление и транслокация ряда эссенциальных элементов при действии меди в концентрациях 0,25 мкМ (/) и 150 мкМ (2) в течение 10 дней.

Анализ показал, что при действии меди в высокой концентрации происходило почти 7-кратное снижение поступления Ре в корни, но лишь 3-кратное снижение его транслокации в надземные органы. Значительно более сильным оказалось влияние меди на поглощение корнем Мп, снижение содержания которого достигло 90%, при этом поступление Мп в листья было задето в меньшей степени. Наименее заметным было влияние Си на поглощение Хп корнем, при этом снижение его транслокации в надземные органы было более значительным.

В отдельной серии экспериментов было изучено взаимовлияние Си и Ъп как при избытке каждого ТМ на «партнера», так и при нахождении обоих ТМ в среде в высоких концентрациях (рис. 5).

□ корень в нижний лист ■ верхний лист ^

гЬ

8 600 -[ ге Я

>§ 500 -

400

* зоо Й

| 200 • О)

1 100 -&

5 о

гЬ

I * I я

Г*1т Й -.

контроль

Си 50 мкМ Си 50 мкМ + Zn 1000 мкМ

контроль Zn 1000 мкМ Си50шМ + Zn 1000 мкМ

2500 £

(Ъ 1

2000 | 5

1500 |

1000 I

500 |

0 S

Рис. 5. Содержание меди (А) и цинка (Б) в корнях и листьях разного яруса при раздельном и совместном действии на растения рапса в течение 5 дней. Контролем служила стандартная питательная среда, содержавшая 0,25 мкМ СиЗО^ и 1 мкМ 2п504.

Как видно из рис. 5А, при совместном внесении ТМ Zn способствовал поступлению Си в корень, повышая ее содержание в 2,6 раза. Однако, накопившись в больших количествах в тканях корня, 2п препятствовал переносу Си в надземные органы. Напротив, избыток Си в среде очень сильно препятствовал поступлению 2.п в корень (рис. 5Б), при этом транслокация цинка в надземные органы была заторможена лишь незначительно.

Таким образом, возможными механизмами взаимовлияния ТМ являются конкуренция на уровне мембранных транспортеров, на уровне формирования фонда транслокации или непосредственно при процессе загрузки ксилемы.

Динамика поступления меди и ее распределение между корнями и листьями разного яруса

Следовало оценить, чем обусловлено такое сильное негативное действие меди. Было установлено, что при росте растений рапса на стандартной питательной среде, содержавшей 0,25 мкМ Си804, среднее содержание меди в корнях составляло 26,2±4,0 мкг/г сухой массы, в листьях среднего яруса - 15,3±3,2 мкг/г (рис. 6).

Рис. 6. Динамика накопления меди в корнях и листьях среднего яруса растений рапса при росте на среде с Си804 в высоких концентрациях.

Время воздействия: / - 3 ч, 2-6 ч, 3-1 сутки, 4-5 суток, 5-10 суток.

Уже в течение первых 3-6 ч опыта при действии меди во всех концентрациях было достигнуто 2-3-кратное превышение ее содержание в корнях по сравнению с уровнем контрольных растений. С увеличением продолжительности эксперимента накопление Си продолжалось, и к 10 суткам наблюдалась более чем 11-кратная аккумуляция по сравнению с контролем.

Поступление ионов меди в листья происходило несколько медленнее, в течение 3 ч двукратное превышение концентрации Си наблюдалось лишь при действии меди в концентрации 150 мкМ. К концу эксперимента при росте растений рапса на среде с 50 и 150 мкМ CuS04 содержание Си в листьях в 5,8 и 11 раз превосходило контрольные величины, превосходя 160 мкг/г сухой массы. При этом аккумуляция меди в листьях происходила пропорционально ее концентрации в среде, что характеризует рапс как растение-индикатор меди.

Для уточнения особенностей локализации Си в растении был проведен более детальный анализ распределения Си в корнях и листьях разных ярусов (рис. 7).

0,25 мкМ 10 мкМ 50 мкМ 150 мкМ 0,25 икМ ЮыкМ 50мкМ 150 иМ

Рис. 7. Распределение меди в органах растений рапса при действии меди в высоких концентрациях (А) в течение 5 и 7 дней воздействия, и в период восстановления (Б).

1 - содержание меди в органах растений рапса при росте в течение 5 дней на среде с высокими концентрациями меди, 2 - содержание меди в органах рапса, рссших в течение 5 дней на среде с высокими концентрациями меди, после чего перенесенных на 5 дней на стандартную питательную среду.

Как оказалось в ходе исследования, большая доля Си локализовалась в корнях и весьма слабо транспортировалась далее по стеблю, преимущественно накапливаясь в листьях нижнего яруса (рис. 7А). Причем, за 10 дней действия меди в концентрации 50 и 150 мкМ ее содержание в листьях нижнего яруса в 8 и 13 раз превышало контрольные значения, достигая 114 и 216 мкг/г сухого веса. Аналогичное распределение меди было обнаружено в опытах по восстановлению (рис. 7Б), в которых при переносе растений на стандартную среду без избытка меди наблюдался небольшой ее отток из корней и преимущественная ее аккумуляция в листьях нижнего яруса.

Внутриклеточные механизмы детоксикации меди

Такое значительное накопление Си в тканях растений рапса могло быть реализовано только при участии полноценной системы защиты от ее токсического действия. Изучение механизмов детоксикации меди проводили на уровне содержания мРНК, используя метод ОТ-ПЦР.

Была проведена оценка уровня матриц генов Z1P4 и НМА5, кодирующих транспортеры плазматической мембраны, из которых первый, не являясь специфичным для Си, может транспортировать этот ТМ внутрь клетки, тогда как второй, высоко специфичный, переносит Си из цитоплазмы в апопласт (Weitz et al., 2003; Andres-Colas et al., 2006; Yruela, 2009). Изучены также гены, кодирующие высокомолекулярные хелаторы Си металлотионеины - А/77, МТ2 и ген PCS, кодирующий фитохелатинсинтазу - фермент синтеза полипептидных хелаторов (Cobbett, Goldsbrough, 2002).

Поскольку нуклеотидные последовательности данных генов у рапса не известны, подбор праймеров для синтеза фрагментов изучаемых генов проводили по консервативным участкам последовательностей соответствующих генов близкородственных видов семейства Brassicaceae - Arabidopsis thaliana и Brassica junceae. В таблице 2 представлена характеристика подобранных праймеров.

Таблица 2. Список праймеров, использованных для ПЦР

Ген Последовательность праймеров (S'-3') Температура отжига, 'С Длина ПЦР продукта, п.н. Исходная последовательность

ZIP-t s-GCTGCTGGTAGTGAAGAGAT as-ATCAGCTGCGATGAGGTCCA 52 599 A. thaliana NM J 00972

НШ5 s- GACAACGACGATTCl CTGAGTAA as- TAACACAAGCAGCACAAGTCAT 68 349 A. thaliana AAL02122

МТ1 s- GGCAGATTCTAACTGTGGATGT as- CCCACAGCTGCAGTTTGAT 60 118 A.thaliana, NM J 00633

МГ2 s- GTCTTGCTGTGGAGGGAAACTGT as - GGGTTGCACTTGCAGTCAGAT 52 224 В. junceae, BJY10850

PCS s- ATCAGACCACCATTGACGACTT as-GAACTCACAAGACGAGGAACATCT 56 388 В. napus, AM265632

18SrRNA s-GAGTGATGTGCCAGACCTAGGAATT as- ATGCTGATCCGCGATTACTAGC 66 451 В. napus, NC.008285

Примечание: s - прямой праймер, as - обратный праймер.

Полученные в результате ОТ-ПЦР продукты элюировали из агарозного геля и секвенировали. Анализ секвенированных последовательностей Г1ЦР-продуктов | показал высокий процент сходства с предполагаемыми последовательностями, ( выбранными для изучения генов: ZIP4 - 92%, НШ5 - 86%, МТ1 - 82%, МТ2 - 89% и , PCS -96%.

| На электрофореграммах (рис. 8) представлены данные одного из типичных

( опытов по изменению уровня амщшконов исследуемых генов при действии меди в концентрации 50 мкМ в течение 3 ч - 10 дней. Уровень ампликонов ZIP4, МТ1, МТ2, PCS и НМА5 в опытных вариантах определяли относительно уровня экспрессии контрольного гена ¡8SrRNA. Изменения в экспрессии генов, вызываемые воздействием повышенных концентраций Си в питательной среде, оценивали как отношение содержания мРНК в органах растений опытных вариантов к уровню матриц того же гена у растений, выращенных на стандартной питательной среде. Данные ПЦР анализа были обработаны с помощью программы ID Scan Version 1.3 (фирма «CSP In с», США).

корни Зч 6ч 1д 5д 10д листья Зц 6ч 1д 5д 10д

ZIP4 НМА5 МТ1 МТ2 PCS 18SrRNA

Рис. 8. Электрофореграммы ампликонов исследуемых генов при действии меди в концентрации 50 мкМ.

В качестве примера на рис. 9 представлены количественные данные об изменении уровня транскриптов генов ZIP4, НМА5, МТ1, МТ2 и PCS при действии меди в концентрации 50 мкМ в течение 3 ч - 10 суток. Как оказалось, уровень мРНК гена ZIP4 в корнях уже через 3 ч воздействия был ниже контрольного уровня, а, начиная с 6 ч, совсем не обнаружена его экспрессия. Уровень матриц гена НШ5 с самого начала эксперимента был выше контрольных значений в 4,3 раза, к 10 суткам

максимальное превышение достигло 26,7 раза. Важными элементами детоксикации является хелатирование - связывание избыточного содержания меди в цитозоле.

Рис. 9. Уровень мРНК исследуемых генов в корнях и листьях растений рапса при действии меди в концентрации 50 мкМ в течение: 7-3 ч, 2-6 ч, 3-1 суток, 4 - 5 суток, 5 -10 суток воздействия.

Содержание транскриптов МТ1 повышалось уже с самого начала воздействия меди в концентрации 50 мкМ, достигнув к 10 суткам 15-кратного превышения. Значительно меньший эффект наблюдался в отношении мРНК МГ2, достоверное превышение контроля было достигнуто только к 6 ч опыта - в 2,5 раза, максимальное увеличение составило всего 4,7 раза. Помимо генов металлотионеинов, была исследована экспрессия гена фермента фитохелатинсинтазы. Статистически достоверный подъем уровня матриц РС&' проявился уже через 3 ч воздействия, к первым суткам наблюдалось 9-кратное превышение, но далее происходило существенное снижение уровня мРНК.

В листьях растений уровень транскриптов 21Р4 за 3 ч воздействия меди в концентрации 50 мкМ был несколько выше, чем в корнях, и превышал контрольные значения в 1,8 раза. Однако, уже начиная с 1 суток, экспрессия ШР4 прекращалась, что, видимо, было обусловлено 1,7-кратным накоплением меди в листьях. Уровень матриц гена НМА5 к 6 ч воздействия в 6 раз превосходил контроль, к концу эксперимента - в 13 раз (рис. 9). В листьях совсем не было обнаружено экспрессии гена Л/Т/, что вполне соответствует представлению о его корневой органоспецифичности (МигрИу, Так, 1995; СоЬЬей, ОоМэЬго^п, 2002). Достоверный уровень активации МТ2 был обнаружен лишь к первым суткам, к концу эксперимента наблюдалось относительно небольшое повышение экспрессии. Несмотря на более

медленное в сравнении с корнями поступление Си в клетки листьев, достоверное превышение уровня мРНК PCS над контролем наблюдалось уже после 3 ч. После достижения максимального уровня матриц PCS при 24 ч воздействии уровень транскриптов PCS'снижался в 2,3 раза от максимальных значений.

В дальнейшем был проведен корреляционный анализ, за основу которого взято соотношение матриц исследованных генов (см. рис. 9) и содержание Си непосредственно в тканях корней и листьев растений рапса (количественная оценка которой представлена на рис. 6).

До сих пор остается неясной роль транспортера, кодируемого геном ZIP4, в поступлении Си внутрь клеток (Wintz et а!., 2003). Как было установлено (рис. 10), содержание матриц ZIP4 в клетках корней быстро снижается уже при незначительном повышении содержания в них меди, вплоть до полного блокирования экспрессии. Эти результаты свидетельствуют о том, что первой реакцией растений в ответ на появление избыточных количеств меди в тканях является ограничение ее поступления внутрь клеток.

14 -

12 -

о Cl >. I

у = 0,3344*-2,9196 PCS

ниш

У = 0,0963* »2,1835

У = 0,0187х » 1,2465

МГ2

PCS

tZIP4 у =-0,0284х »5,8488 \ У =-0,2661* »7,6542

0 40 80 120 160 200 240 2S0 320 380

120 150 180

Содержание меди в корнях, мкг/г сухой массы Содержание меди в листьях, мкг/г сухой массы

Рис. 10. Корреляционная зависимость между содержанием транскриптов генов транспортеров ZIP4 и НМА5, генов металлотионеинов МТ1, МТ2 и гена фитохелатинсинтазы PCS и содержанием меди в корнях и листьях растений рапса.

Принципиально иная картина характеризовала уровень транскриптов гена НМА5; аккумуляция меди вызывала резкое повышение уровня мРНК, происходившее пропорционально содержанию поступившей в корни меди. Такой высокий уровень матриц НМА5 свидетельствовал о высокой вероятности того, что продукт этого гена принимает участие в удалении Си из цитозоля. Повышение содержания меди в клетках корней приводило к значительному увеличению уровня матриц А/77, которое далее продолжало интенсивно нарастать; значительно меньше повышался уровень мРНК МТ2. Сильный подъем уровня матриц PCS происходил па начальных этапах аккумуляции меди корнями, но при увеличении содержания в них Си. наблюдалось быстрое снижение мРНК PCS.

Сходная картина характеризовала изменение уровня транскриптов изученных генов в листьях растений. Уровень транскриптов ZIP4 был в 2 раза выше, чем в корнях, но при повышении аккумуляции меди наблюдали резкое снижение уровня матриц ZIP4 и прекращение его экспрессии (рис. 10). При этих же концентрациях меди происходило сильное повышение мРНК гена НМА5. Увеличение уровня транскриптов МТ2, единственных металлотионеинов, синтезирующихся в зрелых листьях, происходило значительно слабее, чем в корнях; лишь при накоплении 50-60 мкг Cu/г сухой массы дальнейшая аккумуляция Си вызывала довольно слабый рост содержания матриц. Вместе с этим, достоверное превышение уровня мРНК PCS наблюдалось уже при 20 мкг Cu/г сухой массы, но при достижении 50 мкг/г сухой массы уровень транскриптов PCS снижался в 2 раза от максимальных значений.

Еще один физиологический подход был использован для получения дополнительной информации о внутриклеточных механизмах детоксикции меди. Для этого растения выращивали на 'А концентрации среды Хогланда-Снайдерс без внесения CuS04 Проведенная проверка показала, что реальная концентрация Си в такой среде оказалось равным 0,021 мкМ, что в 11 раз ниже стандартных значений. Содержание меди в органах растений рапса, выращенных на этой среде, было несколько пониженным. Среднее содержание меди составляло 17,3±3,1 мкг/г сухой массы в корнях растений и 9,3±2,6 мкг/г сухой массы в листьях (по данным 3 опытов).

□ Зч ибчШсуг В5сут«10сут

Рис. 11. Аккумуляции меди в корнях и листьях растений рапса, выращенных на Уг концентрации среды без внесения СивСХ

При внесении в питательную среду меди в концентрациях 10, 50 и 150 мкМ

наблюдалась несколько большая ее аккумуляция, как в корнях, так и листьях

растений рапса в первые часы воздействия, по сравнению с обычной постановкой

опыта, когда растения выращивали на полном составе питательной среды. Однако

при продолжении эксперимента содержание Си в тканях недостоверно отличалась от

накопления меди в тканях растений при стандартной постановке опыта (рис. 11).

Аналогично предыдущим опытам было проведено исследование уровня матриц

генов транспортеров 21Р4 и НМА5, генов БН-содержащих хелаторов меди - МТ1,

МТ2 и гена фитохелатинсинтазы РС5 в корнях и листьях растений, росших на

концентрации среды без внесения Си804 в течение 20 дней, после чего перенесенных

на среду с медью в высоких концентрациях.

В условиях недостатка Си в питательной среде оказался резко повышенным

уровень мРНК 21Р4 гена транспортера плазматической мембраны как в корнях, так и

в листьях - в 14 и 7,5 раз по отношению к контрольному варианту растений,

выросших на полном составе стандартной среды (с добавлением 0,25 СиЭ04) (Рис.

12). При этом, уровень транскриптов МТ! и РСБ в корнях и МТ2 в листьях был в 2

раза ниже, чем в стандартных условиях и совсем не было обнаружено ампликонов

гена НМА5 ни в корнях, ни в листьях растений рапса.

16 п

I14

512

■а а §6

I н

1 г

корни

Ш45 MT!

итг

л «-I

I к

о 2

Zipd

HMA5

pes

Рис. 12. Уровень матриц генов транспортеров Z1P4 и НМА5, генов хелаторов меди МТ1, МТ2 и гена фитохелатинсинтазы PCS в корнях и листьях растений рапса, выращенных на Уг концентрации среды без внесения CuS04

При переносе растений, выращенных в условиях «дефицита» меди, на питательную среду, содержавшую медь в высоких концентрациях, наблюдали резкое снижение мРНК гена ZIP4 (рис. 13). Наоборот, активность гена НМА5, на уровне содержания матриц, резко повышалась пропорционально содержанию Си как в корнях, так и в листьях.

О 40 80 120 160 200 240 280 320 360 0 30 60 90 120 150 180 Содержание меди в корнях, мкг/г сухой массы Содержание меди в листьях, мкг/г суйзй массы Рис. 13. Корреляционная зависимость между уровнем транскриптов генов транспортеров ИР4 и НМА5, генов хелаторов меди МП, МТ2 и гена фитохелатинсинтазы РС8 и содержании меди в корнях и листьях растений рапса, выращенных на Уг концентрации среды без внесения Си804.

Зависимость накопления транскриптов генов хелатороз от содержания меди в органах растений была схожа с предыдущей картиной: подтверждалась органоспецифичность гена Л/77, экспрессирующегося только в корнях; наблюдалось быстрое повышение уровня транскриптов гена PCS уже при небольшом содержании меди в клетках корней и листьев и при несколько меньшем уровне матриц генов металлотионеинов и резкое снижение мРНК гена PCS при высоком накоплении меди в органах на фоне повышающегося содержания матриц генов МТ1 и А/72.

По результатам проведенных исследований составлена сводная таблица коэффициентов корреляции между концентрацией меди и уровнем транскриптов изученных генов (табл. 3). Высокие коэффициенты корреляции свидетельствуют о том, что интенсивность экспрессии изученных генов в высокой степени определяется содержанием накопленной в органах рапса меди.

Таблица 3. Коэффициенты корреляции между содержанием меди и уровнем транскриптов изученных генов в корнях и листьях растений рапса

Исследованные гены Корни Листья

полная среда* «дефицит» Си** полная среда* «дефицит» Си**

Z1P4 0,938 0,889 0,785 0,981

НМА5 0,965 0,958 0,852 0,775

МГ1 0,944 0,947 ***

МТ2 0,956 0,984 0,853 0,853

PCS начальный этап 0,964 0,845 0,968 0,896

PCS завершающий этап 0,807 0,882 0,717 0,812

Примечание: до переноса растений на среду с избыточными концешрациями меди они росли на полной среде (*) или на среде с пониженной концентрацией меди (**). *** - транскрипты отсутствуют.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе была проведена оценка токсического действия меди и изучение механизмов ее детоксикации растениями рапса с. Вестар.

Как показали проведенные эксперименты, уже при небольшом повышении концентрации меди в среде наблюдалось ингибирование роста и ряда физиологических параметров. Отчетливым признаком негативного действия меди является торможение развития корневой системы, нарушение водного статуса растений, пониженное содержание пигментов. Кроме того, обнаружено значительное ингибирование поглощения и переноса в надземные органы таких эссенциальных элементов как Fe и Мп, что, вероятно, происходит как из-за конкуренции на уровне мембранных транспортеров, так и наличия общего хелатирующего агента -никотианамина, который участвует в дальнем транспорте Си и Fe (Krämer, Clemens, 2005; Yruela, 2009). В проведенных опытах были установлены существенные различия по взаимодействию Си и Zn как при избытке каждого из изучаемых ТМ, так и при нахождении обоих ТМ в среде в высоких концентрациях.

Несмотря на сильное негативное действие избытка меди в среде на растения рапса, в ходе экспериментальной работы были получены доказательства довольно высокой их устойчивости к действию меди в высоких концентрациях. В первую очередь это проявлялось в способности восстановления роста после снятия действия меди, в сохранении жизнеспособности в течение 6 недель даже при концентрации 150 мкМ и в способности полностью завершать онтогенетический цикл при 100 мкМ CuS04.

Высокая устойчивость рапса связана, в частности, с преимущественной аккумуляцией Си в листьях нижнего яруса и довольно слабой транслокацией ее по побегу. При длительном воздействии меди в высоких концентрациях происходил опад нижних листьев, в которых наблюдалось 15-кратное превышение аккумуляции Си, что, видимо, следует рассматривать в качестве одного из механизмов детоксикации на органном уровне. Слабая подвижность меди отчасти определяется ее адсорбцией клеточными стенками, большей частью О-связями (Meychik, Yermakov, 2001; Wei et al., 2010; Kholodova et al., in press).

Безусловно, высокий уровень накопления меди в тканях и в то же время высокая устойчивость растений происходили благодаря полноценной системе

внутриклеточных механизмов детоксикации. На это указывают данные о сбалансированности между подавлением и активацией экспрессии генов, продукты которых участвуют в поступлении меди в клетку (ZIP4) и в выносе ее избытка в апопласт (НМА5). В настоящее время лишь в нескольких работах упоминалось об изменении уровня мРНК ZIP4 в ответ на действие меди (Grotz et al., 1998, Guerinot, 2000; Wintz et al., 2003), но не давалась характеристика вклада данного гена в детоксикацию меди. В представленной работе показано, что при недостаточном содержании Си в тканях растений рапса обнаруживался высокий уровень матриц гена ZIP4. Такое соотношение свидетельствует в пользу представления о вероятности участия белка-транспортера плазмалеммы, кодируемого этим геном, в переносе меди из среды при ее нехватке или стандартном содержании в органах растений рапса. Напротив, при избыточном содержании Си в органах происходило быстрое блокирование экспрессии ZIP4. Данные, полученные в работе, также вносят существенный вклад в до сих пор остающийся спорным вопрос - участвуют ли фитохелатины в детоксикации меди. Скоординированность ответов генов двух групп SH-содержащих хелаторов - металлотионеинов (А/Г/ и А/72) и фитохелатинсинтазы (PCS) подтверждает возможность участия этих высокомолекулярных хелаторов в связывании избытка меди.

Таким образом, в условиях стресса обнаруживается сложное и скоординированное изменение уровня матриц генов, отвечающих за поступление (ZIP4), связывание (Л/77, А/72, PCS) и удаление избытка меди из цитозоля (НМА5).

ВЫВОДЫ

1. Установлен относительно высокий уровень устойчивости растений рапса Brassica napus L. с. Вестар к меди в высоких концентрациях, обеспечивающий завершение полного онтогенетического цикла в присутствии 100 мкМ CuS04 в среде и проявляющийся в восстановлении роста при снятии действия стрессора.

2. Показано, что токсическое действие меди в повышенных концентрациях реализовалось в растениях рапса в ингибировании аккумуляции биомассы, в большей степени затрагивающем корневую систему, падении оводненности тканей, снижении содержания хлорофилла, ингибировании поглощения ионов железа, марганца и цинка и их транслокации по растению.

3. Продемонстрировано, что растения рапса накапливали медь пропорционально ее концентрации в среде, что характеризует рапс как растение-индикатор. Низкая подвижность меди в растениях рапса проявлялась в преимущественной ее аккумуляции в корнях по сравнению с надземными органами, а также в слабой транслокации по побегу. При продолжительном воздействии избытка меди максимальное ее накопление в листьях, тем не менее, превышало стандартные значения более чем в 15 раз и достигало 216 мкг Cu/г сухой массы при факторе транслокации 0,51.

4. Впервые на одной растительной системе изучена динамика аккумуляции меди и экспрессии двух основных функциональных групп генов, кодирующих мембранные транспортеры и хелаторы меди, продукты которых участвуют в регуляции внутриклеточного Cu-гомеостаза и детоксикации избытка меди.

5. Впервые установлена сбалансированность интенсивности экспрессии генов НМА5 и ZIP4, белковые продукты которых локализованы в плазмалемме и осуществляют транспорт ионов меди из цитозоля в апопласт и поступление ее в цитозоль, соответственно. Показано, что в ответ на повышение концентрации меди в среде интенсивность экспрессии гена НМА5 резко возрастает, тогда как экспрессия гена ZIP4 полностью блокируется, что позволяет говорить об возможном участии этих генов в регуляции внутриклеточного гомеостаза меди с целью ограничения ее аккумуляции до летальных концентраций.

6. Продемонстрирован скоординированный ответ двух групп генов, кодирующих высокомолекулярные хелаторы (металлотионеины, гены МТ1 и МТ2) и небольшие полипептиды (фитохелатины, ген фитохелатинсинтазы PCS) при воздействии меди в высоких концентрациях на растения. Эта скоординированность проявляется в доминирующей экспрессии гена PCS по сравнению с генами А/77 и МТ2 в первые часы воздействия избытка меди, которая на более позднем этапе адаптации сменяется преимущественной транскрипцией генов МТ1 и МТ2 при падении интенсивности экспрессии гена PCS.

коэффициенты корреляции - от 0,717 до 0,984 - свидетельствуют о том, что интенсивность экспрессии изученных генов в значительной степени детерминирована концентрацией аккумулированной в органах рапса меди.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1) Волков К.С., Иванова Е.М., Мещеряков А.Б., Холодова В.П. (2008) «Ингибирующее действие высоких концентраций меди и цинка на содержание железа и пигментов в листьях растений рапса» // Тезисы докладов Международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений». Екатеринбург, с. 116.

2) Иванова Е.М., Холодова В,П. (2009) «Сравнительный анализ процессов накопления и распределения в побегах рапса меди и цинка в условиях их избытка в среде и в период восстановления» // Тезисы докладов Международной научной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера». Апатиты, Мурманская область, с. 332.

3) Ралдугина Г.Н., Хмахми М., Кунда М.С., Иванова Е.М., Волков К.С., Кочетов А.А., Холодова В.П. (2009) «Влияние NaCl и CuS04 на трансгенные растения Brassica napus L., содержащие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы» // Тезисы докладов Международной научной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера». Апатиты, Мурманская область, с. 275.

4) Холодова В.П., Иванова Е.М., Волков К.С., Гринин A.JL, Кузнецов Вл.В. (2009) «Участие металлотионеинов в детоксикации меди и цинка в растениях» // Тезисы докладов Международной научной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера». Апатиты, Мурманская область, с.349.

5) Volkov K.S., Kuznetsov Vl.V., Ivanova E.M., Grinin A.L., Kholodova V.P. (2010) «Metallothionein participation in copper and zinc detoxification in plants». Abstracts of the XVIIIFESPB Congress, Valencia, Spain, p. 117.

6) Иванова E.M. (2010) «Скоординированные ответы генов двух групп высокомолекулярных хелаторов на избыток меди в растениях» // Тезисы докладов

XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». Москва, с. 253.

7) Иванова Е.М., Холодова В.П. (2010) «Влияние высоких концентраций меди на поступление и транслокацюо некоторых эссенциальных элементов» // Тезисы докладов по материалам Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского университета им. А.М. Горького «Биология будущего: традиции и инновации». Екатеринбург, с. 120.

8) Михальская JI.H., Иванова Е.М., Швартау В.В. (2010) «Современные представления о регуляции иогаюго гомеостаза растений» // Тезисы докладов XI конференции молодых ученых «HayKoei, прикладт та oceimm аспекти фЫологи, генетики, бютехнологп рослин í мшроогнаним1в». Киев, с. 119-120.

9) Гринин A.J1., Холодова В.П., Иванова Е.М., Кузнецов Вл.В. (2010) «Пролин функционирует в качестве химического шаперона при действии хлористого натрия и меди» // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». Москва, с. 119.

10) Иванова Е.М., Холодова В.П. (2010) «Взаимодействие меди и цинка при комплексном действии на растения рапса» // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». Москва, с. 168.

11) Холодова В.П., Киселева И.С., Иванова Е.М., Волкова А.С., Кузнецов Вл.В. (2010) «Устойчивость растений Coronaria flos-cuculi к высоким концентрациям меди в среде» // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». Москва, с. 374.

12) Иванова Е.М., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. (2010) «Биологические эффекты высоких концентраций меди и цинка и характер их взаимодействия в растениях рапса» // Физиология растений, т. 57, № 6, с. 864-873.

13) Иванова Е.М., Волков К.С., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. (2011) «Новые перспективные виды растений в фиторемедиации загрязненных медью территорий» // Вестник Российского университета дружбы народов, №2, с. 30-37.

14) Kholodova V.P., Iva nova Е.М., Kuznetsov Vl.V. (2011) «Initial step of copper detoxification: outside and inside of the plant cell» // Chapter in the Book: «Detoxification of Heavy Metals», Springer Heidelberg.

Подписано в печать: 19.05.2011

Заказ № 5572 Тираж - 110 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванова, Елена Михайловна

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Нахождение меди в природе, основные источники поступления в почву и растения

1.2. Биологическая роль меди

1.2.1. Физико-химические свойства меди

1.2.2. Функции меди в растениях

1.2.3. Поглощение и транспорт меди

1.2.3.1. Общая характеристика представителей семейства СОРТ

1.2.3.2. Общая характеристика представителей семейства ZIP

1.2.3.3. Характеристика семейства Pib-тип АТФаз; основные представители, участвующие в транспорте меди

1.2.3.4. Другие возможные транспортеры меди

1.2.3.5. Шапероны меди

1.2.3.6. Хелатирующие агенты, участвующие в дальнем транспорте меди

1.3. Токсическое действие меди и внутриклеточные механизмы ее детоксикации

1.3.1. Симптомы токсического действия

1.3.2. Внутриклеточные механизмы детоксикации 32 1.3.2.1. Детоксикация меди путем внутриклеточной компартментации

1.3.2.1.1. Иммобилизация меди клеточной стенкой

1.3.2.1.2. Роль плазматической мембраны в детоксикации меди

1.3.2.1.3. Компартментация меди в вакуоли 36 1.3.2.5.Хелатирование в цитозоли

1.3.2.5.1. Металлотионеины

1.3.2.5.2. Фитохелатины

1.3.2.5.3. Органические кислоты

1.4. Фиторемедиация

1.4.1. Стратегий накопления тяжелых металлов растениями

1.4.2. Проблема поиска видов гипераккумуляторов меди

Глава II. Объект и методы исследования

2.1. Характеристика Brassica napus L. в качестве модельного объекта исследования

2.2. Условия выращивания растений и проведения опытов

2.2.1. Обработка семян и работа с проростками

2.2.2. Посев и начальный этап выращивания ювенильных растений

2.2.3. Пересадка и выращивание растений

2.2.4. Условия проведения опытов

2.3. Физиологические методы исследований

2.3.1. Измерение всхожести семян и длины корня

2.3.2. Измерение биомассы растений

2.3.3. Определение содержания воды в листьях

2.3.4. Определение содержания пигментов

2.3.5. Определение содержания тяжелых металлов в тканях растений

2.3.5.1. Отмывка корней от ТМ

2.3.5.2. Кислотное озоление и измерение

2.4. Методы молекулярно-биологического анализа

2.4.1. Подбор праймеров к генам исследования

2.4.2. Выделение тотальной растительной ДНК

2.4.3. Определение количества и качества нуклеиновых кислот

2.4.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.4.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.4.6. Элюция фрагментов ДНК электрофоретическим методом

2.4.7. Секвенирование ДНК

2.4.8. ПЦР после обратной транскрипции

2.4.8.1. Выделение тотальной РНК

2.4.8.2. Электрофорез РНК в агарозном геле

2.4.8.3. Обратная транскрипция

2.4.8.4. ПЦР после обратной транскрипции

2.4.8.5. Обработка результатов ПЦР после обратной транскрипции

2.5. Математическая обработка данных

Глава III. Результаты и обсуждение 69 3.1. Изучение влияния меди на проростки растений рапса

3.1.1. Прорастание

3.1.2. Рост корня

3.2. Условия постановки опытов на ювенильных растениях

3.3. Токсическое действие меди в высоких концентрациях на растения рапса при длительном выращивании

3.3.1. Влияние меди на накопление биомассы листьев и корней растений рапса

3.3.2. Изменение водного статуса растений при действии меди

3.3.3. Влияние меди на содержание пигментов

3.3.4. Влияние меди на поглощение и транслокацию ряда эссенициальных элементов

3.3.5. Аккумуляция меди растениями рапса

3.3.5.1. Динамика накопления меди в органах растений рапса

3.3.5.2. Распределение меди по органам растений рапса

3.3.5.3. Фактор транслокации

3.4. Влияние избыточных концентраций меди на экспрессию генов системы ее детоксикации

3.5. Аккумуляция меди и система ее детоксикации в растениях рапса, выросших в условиях «дефицита» Си

Введение Диссертация по биологии, на тему "Токсическое действие меди и механизмы ее детоксикации растениями рапса"

Все возрастающее техногенное давление на среду обитания остро ставит вопрос о стратегиях и механизмах адаптации растений к действию абиотических стрессоров, среди которых особое положение занимают тяжелые металлы (ТМ). Медь (Си), являясь наиболее токсичным ТМ, принадлежит к эссенциальным элементам, которые в следовых количествах необходимы для метаболизма, роста и развития растений, тогда как в высоких концентрациях могут проявлять сильное токсическое действие (Hall, Williams, 2003).

В физиологических условиях медь существует в восстановленном (Си+) и окисленном (Си ) состояниях и, являясь кофактором ряда ферментов, вовлекается в процессы фотосинтеза и дыхания, в защиту растений от окислительного стресса, в метаболизм клеточной стенки, в восприятие этиленового сигнала и биогенез молибденового кофактора (Yruela, 2009; Cohu, Pilon, 2010). Однако диапазон концентраций Си, обеспечивающих оптимальный клеточный метаболизм и развитие растений, весьма узок. Считается, что даже их двукратное превышение может оказывать негативное действие, тогда как высокие концентрации Си вызывают токсичные синдромы (хлорозы и некрозы, ингибирование роста корней и побегов), вплоть до летальных эффектов.

В связи с этим остро встает крайне важный вопрос, каким образом в условиях избытка Си растение регулирует ее гомеостаз, то есть, с одной стороны, обеспечивает клетки всех тканей и органов микроколичествами Си, без которой жизнедеятельность организма невозможна, и, с другой стороны, предотвращает ее токсические эффекты и собственную гибель.

Адаптация растений к токсическому действию меди связана с функционированием как специализированных (хелатирование, секвестеризация и компартментация ТМ), так и общих механизмов устойчивости (низкомолекулярные органические стресс-протекторные соединения, защитные макромолекулы и антиоксидантные системы) (Hall, 2002; Clemens, 2006). И те, и другие в настоящее время интенсивно изучаются, при этом недостаточно внимания уделяется физиологическим механизмам защиты растений от меди в высоких концентрациях, хотя до полного понимания молекулярных механизмов детоксикации меди еще далеко. Остается также не выясненным характер распределения этого эссенциального элемента по растению, что имеет принципиальное значение для анализа регуляторных механизмов внутриклеточного гомеостатирования. В настоящем исследовании предпринята попытка поиска ответов на поставленные выше вопросы.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в изучении особенностей повреждающего действия меди в высоких концентрациях на растения рапса {Brassica napus L.) с. Вестар и некоторых физиологических и молекулярных механизмов ее детоксикации.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Установить диапазон концентраций меди, в пределах которых растение способно успешно завершить полный онтогенетический цикл.

2. Оценить степень токсического действия на некоторые физиологические параметры.

3. Изучить уровень аккумуляции меди и ее распределение по органам растений рапса.

5. На уровне матриц исследовать потенциальную роль в реализации устойчивости к меди мембранных транспортеров плазмалеммы ZIP 4 и НМА5, генов высокомолекулярных хелаторов металлотионеинов МТ1 и МТ2 и гена фитохелатинсинтазы PCS в клетках корней и листьев растений рапса.

6. Дать количественную оценку характера связи между концентрацией, накопленной в органах рапса меди и уровнем матриц изученных генов.

Научная новизна. Впервые выявлены биологические особенности локализации меди по органам растений рапса, в том числе распределение меди между корнями и листьями разного яруса. Проведены исследования по оценке подвижности меди в растениях в период восстановления, при удалении избытка меди из питательной среды. Экспериментально показано влияние меди на поступление и транслокацию таких микроэлементов как Fe, Мп и Zn, а также взаимодействие меди и цинка при внесении их в питательную среду в высоких концентрациях. Впервые на одной растительной системе изучена динамика аккумуляции меди и экспрессии генов, кодирующих мембранные транспортеры и хелаторы. Установлены особенности коррелятивных связей между экспрессией каждого из изученных генов и концентрацией меди в тканях корней и листьев растений рапса. Получены данные о скоординированной активации генов двух групп хелаторов - МТ и PCS - на начальном этапе детоксикации избытка внутриклеточной Си.

Практическая значимость. Полученные в работе данные имеют существенное значение для выяснения механизмов детоксикации, одним из которых является удерживание меди в листьях нижнего яруса, что позволяет снизить нагрузку на растение этого высоко токсичного ТМ. Эти данные необходимо учитывать не только при изучении механизмов адаптации растений рапса к действию меди, но и при оценке возможностей использования этого растения для очистки загрязненных территорий. Настоящее исследование уточняет представление о возможном участии генов ZIP4, НМА5, МТ1, МТ2 и PCS в детоксикации меди, и позволяет говорить о скоординированном действии генов двух групп SH-содержащих хелаторов - металлотионеинов и фитохелатинов. Теоретические обобщения и совокупность полученных экспериментальных данных могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов университетов и ВУЗов страны.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Международной конференции «Физико-химические основы структурнофункциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008); Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» (Апатиты, 2009); » межинститутском молодежном семинаре «Актуальные проблемы физиологии, молекулярной биологии и биотехнологии растений» (ИФР РАН, Москва, 2010); XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (МГУ, 2010); Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского университета им. A.M. Горького «Биология будущего: традиции и инновации» (Екатеринбург, 2010); конференциях молодых ученных ИФР РАН (Москва 2009, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов и обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, включая 14 таблиц, 23 рисунка; библиография содержит 215 наименований, в т.ч. 198 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Иванова, Елена Михайловна

выводы

3. Продемонстрировано, что растения рапса накапливали медь пропорционально ее концентрации в среде, что характеризует рапс как растение-индикатор. Низкая подвижность меди в растениях рапса проявлялась в преимущественной ее аккумуляции в корнях по сравнению с надземными органами, а также в слабой транслокации по побегу. При продолжительном воздействии избытка меди максимальное ее накопление в листьях, тем не менее, превышало стандартные значения более чем в 15 раз и достигало 216 мкг Си/г сухой массы при факторе транслокации 0,51.

5. Впервые установлена сбалансированность интенсивности экспрессии генов НМА5 и ZIP4, белковые продукты которых локализованы в плазмалемме и осуществляют транспорт ионов меди из цитозоля в апопласт и поступление ее в цитозоль, соответственно. Показано, что в ответ на повышение концентрации меди в среде интенсивность экспрессии гена НМА5 резко возрастает, тогда как экспрессия гена ZIP4 полностью блокируется, что позволяет говорить о возможном участии этих генов в регуляции внутриклеточного гомеостаза меди с целью ограничения ее аккумуляции до летальных концентраций.

6. Продемонстрирован скоординированный ответ двух групп генов, кодирующих высокомолекулярные хелаторы (металлотионеины, гены МТ1 и МТ2) и небольшие полипептиды (фитохелатины, ген фитохелатинсинтазы PCS) при воздействии меди в высоких концентрациях на растения. Эта скоординированность проявляется в доминирующей экспрессии гена PCS по сравнению с генами МТ1 и МТ2 в первые часы воздействия избытка меди, которая на более позднем этапе адаптации сменяется преимущественной транскрипцией генов МТ1 и МТ2 при падении интенсивности экспрессии гена PCS.

7. Корреляционный анализ показал высокую степень соответствия между уровнем матриц ZIP4, НМА5, МТ1, МТ2 и PCS и содержанием меди, аккумулированной в корнях и листьях растений рапса в течение всего периода воздействия во всем исследованном диапазоне концентраций Си в среде. Высокие коэффициенты корреляции - от 0,717 до 0,984 - свидетельствуют о том, что интенсивность экспрессии изученных генов в значительной степени детерминирована концентрацией аккумулированной в органах рапса меди.

Автор выражает искреннюю признательность, уважение и благодарность своему научному руководителю к.б.н. Валентине Павловне Холодовой за научное руководство, ценные советы, помощь, оказанную при работе над диссертацией, внимание и поддержку.

Глубоко признательна проф., чл.-корр. РАН Владимиру Васильевичу Кузнецову за внимание и интерес, проявленные к данной работе, за помощь в обсуждении результатов и решении важных вопросов.

Огромную признательность выражаю всем сотрудникам лаборатории Экспрессии генома, в частности Виктору Васильевичу Кузнецову и Евгению Анатольевичу Лысенко за помощь в работе. Огромную благодарность выражаю Наталье Сергеевне Белозеровой за помощь в освоении методов молекулярной биологии и интерпретации полученных результатов.

Отдельное спасибо хочется сказать своему школьному учителю биологии Наталье Владимировне Сазоновой, преподавателям УрГУ им. A.M. Горького -Некрасовой Галине Федеровне и Киселевой Ирине Сергеевне.

Признательна всем сотрудникам и аспирантам лаборатории Молекулярных и физиологических механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН за поддержку и дружеское отношение.

Благодарю всех родных и близких за заботу, поддержку и понимание.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время все больший научный и практический интерес вызывают проблемы адаптации растений к действию повреждающих абиотических факторов природного и антропогенного происхождения, среди них особое внимание привлекает токсическое действие тяжелых металлов (ТМ). Важное место среди ТМ занимает медь, резко повышенное ее содержание в почве - до 2000 мг/кг почвы некоторых территорий - может быть результатом не только хозяйственной деятельности человека, но и естественных почвообразовательных процессов, так как она содержится в высоких концентрациях в составе некоторых почвообразующих пород.

Медь в следовых количествах является эссенциальным элементом, вовлеченным во множество физиолого-биохимических процессов в живых организмах. Так, медь является ключевым компонентом, обеспечивающим функционирование ряда ферментов (цитохромоксидазы, аскорбатоксидазы и др.) и белков неферментативной природы (например, пластоцианина). Незаменимостью этого элемента, в частности, объясняется то обстоятельство, что при выращивании растений в водной культуре медь является обязательным компонентом питательных смесей. В частности, среда, использованная в опытах с рапсом, содержала 0,25 мкМ CuS04.

На уровне прорастания семян и начальной стадии роста проростков растения рапса проявляли высокую устойчивость к меди в избыточных концентрациях, поскольку ингибирование прорастания происходило при действии меди в концентрациях свыше 300 мкМ. Однако ювенильные растения сохраняли жизнеспособность при более низких концентрациях - до 150 мкМ.

Как показали проведенные эксперименты, уже при небольшом повышении концентрации меди в среде наблюдалось ингибирование роста и ряда физиологических параметров. Отчетливым признаком негативного действия меди является торможение развития корневой системы, нарушение водного статуса растений, деградация пигментов. Кроме того, обнаружено значительное ингибирование поглощения и переноса в надземные органы таких эссенциальных элементов как Fe и Мп, что, вероятно, происходит как из-за конкуренции на уровне мембранных транспортеров, так и наличия общего хелатирующего агента -никотианамина, который участвует в дальнем транспорте Си и Fe (Krämer, Clemens, 2005; Yruela, 2009). В проведенных опытах были установлены существенные различия по взаимодействию Си и Zn как при избытке каждого из изучаемых ТМ, так и при нахождении обоих ТМ в среде в высоких концентрациях.

Несмотря на сильное негативное действие, в ходе экспериментальной работы были получены доказательства довольно высокой устойчивости растений рапса к действию меди в высоких концентрациях. В первую очередь это проявлялось в способности восстановления роста после снятия действия избыточной меди, в сохранении жизнеспособности в течение 6 недель даже при концентрации 150 мкМ и в способности полностью завершать онтогенетический цикл при 100 мкМ CuS04.

При выращивании в водной культуре с избытком меди в среде растения рапса аккумулировали медь в листьях в концентрациях, превышавших 200 мкг Си/г сухой массы. При этом в значительной степени медь задерживалась в старых листьях нижнего яруса, содержание меди в верхних составляло не более 70 % от ее уровня в нижних. С преимущественной аккумуляцией Си в листьях нижнего яруса и довольно слабой ее транслокацией по побегу, в частности, связана высокая устойчивость рапса. При длительном воздействии меди в высоких концентрациях происходил опад нижних листьев, в которых наблюдалось 15-кратное превышение аккумуляции Си, что является одним из механизмов детоксикации на органном уровне. Слабая подвижность меди отчасти определяется ее адсорбцией клеточными стенками, большей частью О-связями (Meychik, Yermakov, 2001; Wei et al., 2010; Kholodova et al., 2011, in press).

Безусловно, высокий уровень накопления меди в тканях и в то же время высокая устойчивость растений происходили благодаря функционированию полноценной системы внутриклеточных механизмов детоксикации в органах растений рапса. На это указывают данные о сбалансированности между подавлением и активацией экспрессии генов, продукты которых участвуют в поступлении меди в клетку (ZIP4) и в выносе ее избытка в апопласт (НМА5). В настоящее время лишь в нескольких работах представлены данные об изменении уровня мРНК ZIP4 в ответ на действие меди (Grotz et al., 1998, Guerinot, 2000; Wintz et al., 2003), но не давалась оценка возможного вклада данного гена в детоксикацию меди. В представленной работе показано, что при низких концентрациях Си в среде и недостаточном содержании ее в тканях растений рапса обнаруживался высокий уровень матриц гена ZIP4. Такое соотношение свидетельствует в пользу представления о вероятности участия белка-транспортера плазмалеммы, кодируемого этим геном, в переносе меди из среды при ее нехватке или стандартном содержании в органах растений рапса. Напротив, при избыточном содержании Си в органах происходило быстрое блокирование экспрессии ZIP4.

Второй основополагающей позицией в проблеме детоксикации и сохранения гомеостаза Си является представление о том, что в цитоплазме растительной клетки ионы Си в свободном состоянии практически отсутствуют. Это является следствием функционирования в растениях высоко эффективных систем ее хелатирования и компартментации. Данные, полученные в работе, вносят существенный вклад в до сих пор остающийся спорным вопрос - какая из групп высокомолекулярных хелаторов вносит основной вклад в детоскикацию меди. Полученные результаты и корреляционный анализ показал высокую степень соответствия уровня матриц МТ1 и МТ2 в течение всего периода воздействия (10 дней) во всем диапазоне концентраций Си, тогда как для PCS - только на начальный период стресса, с последующим прекращением экспрессии. Возможно, именно этим, обнаруженным нами скоординированным действием генов двух групп лигандов, могут объясняться бытующие в литературе противоречивые выводы об их участии в хелаторовании меди.

Таким образом, в условиях стресса, вызванного избытком Си в среде, обнаруживается сложное и скоординированное изменение уровня матриц генов, отвечающих за поступление (ZIP4), связывание (МТ1, МТ2, PCS) и вынос меди из цитозоля (НМЛ5).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Елена Михайловна, Москва

1. Башмаков Д.И., Лукаткин A.C. (2009) Эколого-физиологические аспекты аккумуляции и распределения тяжелых металлов у высших растений. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 236 с.

2. Гигиенические нормативы (ГН 2.1.7.2042-06) по состоянию на 01.01.1991, Госкомприрода СССР, № 02-2333 от 10.12.90

3. Добровольский В.В. (1997) Биосферные циклы тяжелых металлов и регуляторная роль почвы. Почвоведение, 4, 492-497.

4. Жолик Г.А. (2006) Особенности формирования урожая семян ярового и озимого рапса в зависимости от элементов технологии и факторов среды. Горки: БГСХА, 188 с.

5. Иванова Е.М., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. (2010) Биологические эффекты высоких концентраций солей меди и цинка и характер их взаимодействия в растениях рапса. Физиология растений, 57, 864-873.

6. Кабата-Пендиас А., Пендиас X. (1989) Микроэлементы в почвах и растениях. М.: Изд. Мир, 312 с.

7. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г.А. (2006) Физиология растений. М: Высш. шк., 742 с.

8. Куликова А.Л., Кузнецова H.A., Холодова В.П. (2011) Влияние избыточного содержания меди в среде на жизнеспособность и морфологию корней сои. Физиология растений, 5, в печати.

9. Лапиров О.М., Микрякова Т.Ф. (2001) Влияние меди на формирование проростков частухи подорожниковой (.Alisma plantago-aquatica L.). Физиология растений, 48, 340-346.

10. Мейчик Н.Р., Любимова Е.Г., Ермаков И.П. (2010) Ионообменные свойства клеточной стенки кустистого лишайника Cladonia rangiferina. Физиология растений, 2, 273-279.

11. Протасов В.Ф. (2000) Экология, здоровье и охрана окружающей среды в России. М.: Финансы и статистика, 672 с.

12. Пустовой И.В., Филин В.И., Корольков A.B. (1995) Практикум по агрохимии. М.: Колос, 336 с.

13. Рационов Н.В. (2008) Физиологические и молекулярные ответные реакции растений рапса на воздействие солей меди и цинка. Дисс. канд. биол. наук., Москва, 163 с.

14. Титов А.Ф., Таланова В.В., Казнина Н.М., Лайдинен Г.Ф. (2007) Устойчивость растений к тяжелым металлам. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 172 с.

15. Холодова В.П., Волков К.С., Кузнецов Вл. В. (2005) Адаптация к высоким концентрациям солей меди и цинка растений хрустальной травки и возможность их использования в целях фиторемедиации. Физиология растений, 52, 848-858.

16. Черникова А.А., Цоглин Л.Н., Маркелова А.Г., Зорин С.Н., Мазо В.К., Пронина Н.А. (2006) Способность Spirulina platensis к накоплению марганца и его распределение в клетке. Физиология растений, 2, 903-909.

17. Шлык А.А. (1971) Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев. Биохимические методы в физиологии растений. М., Наука, с. 154170.

18. Abdel-Ghany S.E., Muller-Moule P., Niyogi K.K., Pilón M., Shikanai Т.2005b) Two P-type ATPases are required for copper delivery in Arabidopsis thaliana chloroplasts. Plant Cell, 17, 1-19.

19. Alonso J.M., Hirayama Т., Roamn G., Nourizadeh S., Ecker J.R. (1999) EIN2, a bifimctional transducer of ethylene and stress response in Arabidopsis. Science, 284, 2148-2152.

20. An Z., Jing W., Liu Y., Zhang W. (2008) Hydrogen peroxide generated by copper amine oxidase is involved in abscisic acid-induced stomatal closure in Vicia faba. J. Exp. Bot., 59, 815-825.

21. Angelini R., Tisi A., Rea G., Chen M.M., Botta M., Federico R., Cona A. (2008) Involvement of polyamine oxidase in wound healing. Plant Physiol., 146, 162-177.

22. Arguello J.M. (2003) Identification of ion-selectivity determinants in heavy-metal transport P IB-type ATPases. J. Membrane Biol., 195, 93-108.

23. Arguello J.M., Eren E., Gonzalez-Guerrero M. (2007) The structure and function of heavy metal transport PIB-ATPases. Biometals, 20, 233-248.

24. Arguello J.M., Gonzalez-Guerrero M. (2008) Cu+-ATPases brake system. Structure, 16, 833-834.

25. Arnon D.I. (1949) Copper enzymes in isolates chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiol., 24, 1-15.

26. Arru L., Regnoni S., Baroncini M., Bonatti P.M., Perata P. (2002) Copper localization in Cannabis sativa L. grown in copper-rich solution. Euphytica, 140, 33-38.

27. Axelsen K.B., Palmgren M.G. (2001) Inventory of the superfamily of P-type ion pumps in Arabidopsis. Plant Physiol., 126, 696-706.

28. Baker A.J.M. (1981) Accumulators and excluders-strategies in the response of plants to heavy metals. J. Plant Nutr., 3, 643-654.

29. Baker A.J.M., Brooks R.R. (1989) Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metallic elements — a review of their distribution, ecology and phytochemistry. Biorecovery, 1, 81-126.

30. Baker A.J.M., Walker P.L. (1990) Ecophysiology of metal uptake by tolerant plants, heavy metal tolerance in plants. In: Shaw AJ (ed) Evolutionary aspects. CRC, Boca Raton, 155-177.

31. Baker A.J.M., McGrath S.P., Sidoli C.M.D., Reeves R.D. (1994) The possibility of in situ heavy metal decontamination of polluted soils using crops of metal-accumulating plants. Resour. Conserv. Recycl., 11, 41-49.

32. Balandin T., Castresana C. (2002) AtCOX17, an Arabidopsis homolog of the yeast copper chaperone COX17. Plant Physiol., 129, 1852-1857.

33. Bellemare D.R., Shaner L., Morano K.A., Beaudoin J., Langlois R., Labbe S.2002) Ctr6, a vacuolar membrabe copper transporter in Schizosaccharomyces pombe. J. Biol. Chem., 29, 46676-86.

34. Bernal M., Sanches-Testillano P., Risueno M.D., Yruela I. (2006) Excess copper induces structural changes in cultured photosynthetic soybean cells. Funct. Plant Biol., 33, 1001-1012.

35. Bernal M., Sanchez-Testillano P.S., Alfonso M., Risueno M.C., Picorel R., Yruela I. (2007b) Identification and subcellular localization of the soybean copper PiB-ATPase GmHMA8 transporter. Journal of Structural Biology, 158, 46-58.

36. Bowler C., Vam Montagu M., Inze D. (1992) Superoxide dismutase and stress tolerance. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43, 83-116.

37. Briat J.F., Curie C., Gaymard F. (2007) Iron utilization and metabolism in plants. Curr. Opin. Plant Biol., 10, 276-282.

38. Brooks R.R. (1977) Copper and cobalt uptake by Haumaniastrum species. Plant Soil, 48, 541-544.

39. Brooks R.R., Naidu S., Malaisse F., Lee J. (1987) The elemental content of metallophytes from the copper/cobalt deposits of Central Africa. Bull. Soc. Roy. Bot. Belg., 119, 179-191.

40. Burkhead J.L., Reynolds K.A.G., Abdel-Ghany S.E., Cohu C.M., Pilon M.2009) Copper homeostasis. New Phytol., 182, 799-816.

41. Callahan D.L., Baker A.J.M., Kolev S.D., Wedd A.G. (2006) Metal ion ligands in hyperaccumulating plants. J. Biol. Inorg. Chem., 11, 2-12.

42. Carr H.S., Winge D.R. (2003) Assembly of cytochrome c oxidase within the mitochondrion. Acc. Chem. Res., 36, 309-316.

43. Chaney R.L., Angle J.S., Mcintosh M.S., Reeves R.D., Li Y.M., Brewer E.P.2005) Using hyperaccumulator plants to phytoextract soil Ni and Cd. Z. Naturforsch. Sect. C. Biosci., 60, 190-198.

44. Changela A., Chen K., Xue Y., Holschen J., Outten C.E., O'Halloran T.V., Mondragotn A. (2003) Molecular Basis of Metal-Ion Selectivity and Zeptomolar Sensitivity by CueR. Science, 301, 1383-1387.

45. Chen-Chou W., Шее W.J., Stokes D.L. (2008) Structure of a Copper Pump Suggests a Regulatory Role for Its Metal-Binding Domain. Structure, 16, 976-985.

46. Chipeng F., Hermans C., Colinet G., Faucon M.P., Ngongo M., Meert P., Verbruggen N. (2010) Copper tolerance in the cuprophyte Haumaniastram katangense (S. Moore) P. A. Duvign & Plancke. Plant Soil, 328, 235-244.

47. Clemens S. (2001) Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis. Planta, 212, 475-486.

48. Cobbett C.S. (2000) Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification. Plant Physiol., 123, 825-832.

49. Cobbet C., Goldsbrough P. (2002) Phytochelatins and metallothioneins: roles in heavy metal detoxification and homeostasis. Annu. Rev. Plant Biol., 53, 159-182.

50. Cobbet C.S., Hussain D., Haydon M.J. (2003) Structural and functional relationships between type IB heavy metal transporting P-type ATPases in Arabidopsis. New Phytol., 159,315-321.

51. Cohen C.K., Norvell W.A., Kochian L.V. (1997) Induction of the root cell plasma membrane ferric reductase (an exclusive role for Fe and Cu). Plant Physiol., 114, 10611069.

52. Cohu C.M., Pilon M. (2010) Cell Biology of Copper. In: Cell Biology of Metals and Nutrients, Hell R, Mendel RR (eds.) The: Berlin, Heidelberg, pp. 55-74.

53. Colangelo E.P., Guerinot M.L. (2006) Put metal to petal: metal uptake and transport throughout plants. Curr. Opin. Plant Biol., 9, 322-330.

54. Colman P.M., Freeman H.C., Guss J.M., Murata M., Norris V.A., Ramshaw J.A.M., Venkatappa M.P. (1978) X-ray crystal structure analysis of plastocyanin at 2.7 A resolution. Nature, 272, 319-324.

55. Coyle P., Philcox J.C., Carey L.C., Rofe A.M. (2002) Metallothionein: the multipurpose protein. Cell Mol. Life ScL, 59, 627-647.

56. Curie C., Alonso J.M., Le J.M., Ecker J.R., Briat J.F. (2000) Involvement of Nramp 1 from Arabidopsis thaliana in iron transport. Biochem. J., 347, 749-755.

57. Curie C., Cassin G., Couch D., Divol F., Higuchi K., Le J.M., Misson J., Schikora A., Czernic P., Mari S. (2009) Metal movement within the plant: contribution of nicotianamine and yellow stripe 1-like transporters. Ann. Bot., 103, 1-11.

58. Cuypers A., Vangronsveld J., Clijsters H. (2002) Peroxidases in roots and primary leaves of Phaseolus vulgaris copper and zinc phytotoxicity: a comparison. J. Plant Physiol., 159, 869-876.

59. De Vos C.H.R., Vonk M.J., Voojis R., Schat H. (1992) Glutathione depletion due to copper-induced phytochelatin synthesis causes oxidative stress in Silene cucubalus. Plant Physiol., 98, 853-858.

60. DiDonato R.J., Roberts L.A., Sanderson T., Eisley R.B., Walker E.L. (2004) Arabidopsis yellow stripe- like2 (YSL2): a metal-regulated gene encoding a plasma membrane transporter of nicotianamine-metal complexes. Plant J., 39, 403-414.

61. Domenech J., Mir G., Huguet G., Capdevila M., Molinas M., Atrian S. (2006) Plant metallothionein domains: functional insight into physiological metal binding and protein folding. Biochim., 88, 583-593.

62. Duvigneaud P., Denaeyer De Smet S. (1963) Cuivre et végétation au Katanga. Bull. Soc. Roy. Bot. Belg., 96, 92-231.

63. Ecker D.J., Butt T.R., Crooke S.T. (1989) Yeast metallothionein: gene function and regulation by metal ions. Met. Ions Biol. Syst., 25, 147-169.

64. Eisses J.F., Kaplan J.H. (2002) Molecular characterization of hCTRl, the human copper uptake protein. J. Biol. Chem., 277, 29612-29171.

65. Ernst W.H.O. (1990) Mine vegetation in Europe. In: Shaw JA (ed) Heavy metal tolerance in plants: evolutionary aspects, vol. 18. CRC, New York, 21-38.

66. Ernst W.H.O. (1998) Effects of heavy metals in plants at the cellular and organismic level. Ecotoxicol. Ed. Gerrit Schuurmann and Bernd Markert. John Wiley&Sons, Inc. and Spectrum Academischer Verlag., 587-619.

67. Evans K.M., Gatehouse J.A., Lindsay W.P., Shi J., Tommey A.M., Robinson

68. N.J. (1992) Expression of the pea metallothionein-like gene PsMTA in Escherichia coliand Arabidopsis thaliana and analysis of trace-metal ion accumulation—implications for PsMTA function. Plant Mol. Biol., 20, 1019-1028.

69. Faucon M.P., Ngoy Shutcha M., Meerts P. (2007) Revisiting copper and cobalt concentrations in supposed hyperaccumulators from SC Africa: influence of washing and metal concentrations in soil. Plant Soil, 301, 29-36.

70. Faucon M.P., Colinet G., Mahy G., Luhembwe N.M., Verbruggen N., Meerts P. (2009) Soil influence on Cu and Co uptake and plant size in the cuprophytes Crepidorhopalon perennis and C. tenuis (Scrophulariaceae) in SC Africa. Plant Soil, 317, 201-212.

71. Foley R.C., Singh K.B. (1994) Isolation of a Vicia faba metallothionein-like gene: expression in foliar trichomes. Plant Mol. Biol., 26, 435-444.

72. Frausto da Silva J.J.R., Williams R.J.P. (2001) The Biological Chemistry of the Elements, 2nd edn. Clarenton Press, Oxford, UK, 371-384.

73. Freisinger E. (2009) Metallothioneins in plants. Metal Ions Life Sci., 5, 107-153.

74. Garcia-Hernandes M., Murphy A., Taiz L. (1998) Metallothioneins 1 and 2 have distinct but overlapping expression patterns in Arabidopsis. Plant Physiol., 118, 387-397.

75. Gonzalez-Guerrero M., Arguello J.M. (2008) Mechanism of Cu+-transporting ATPases: soluble Cu+ chaperones directly transfer Cu+ to transmembrane transport sites. Proceedings of the National Academy of Science, USA, 105, 5992-5997.

76. Grotz N., Fox T., Connolly E., Park W., Guerinot M.L., Eide D. (1998) Identification of a family of zinc transporter genes from Arabidopsis that respond to zinc deficiency. Proceedings of the National Academy ofSciences, 95, 7220-7224.

77. Guerinot M.L. (2000) The ZIP family of metal transporters. Bioch. Bioph. Acta., 1465, 190-198.

78. Guerinot M.L., Salt D.E. (2001) Fortified foods and phytoremediation. Two sides of the same coin. Plant Physiol., 125, 164-167.

79. Guo W., Meetam M., Goldsbrough P.B. (2008) Examining the specific contributions of individual Arabidopsis metallothioneins to copper distribution and metal tolerance. Plant Physiol., 146, 1697-1706.

80. Ha S.-B., Smith A.P., Howden R., Dietrich W.M., Bugg S., O'Connell M.J., Goldsbrough P.B., Cobbett C. (1999) Phytochelatin synthase genes from Arabidopsis and the yeast Schizocaccharomycespombe. Plant Cell, 11, 1-12.

81. Hall J.L. (2002) Cellular Mechanisms for Heavy Metal Detoxification and Tolerance. J. Exp. Bot., 53, 1-11.

82. Hall J., Williams E. (2003) Transition metal transporters in plants. J. Exp. Bot., 54, 2601-2613.

83. Hamer D.H. (1986) Metallothionein. Ann. Rev. Biochem., 55, 913-951.

84. Hartley-Whitaker J., Ainsworth G., Vooijs R., Bookum W.T., Schat H., Meharg A.A. (2001) Phytochelatins are involved in differential arsenate tolerance in Holcus lanatus. Plant Physiol., 126, 299—306.

85. Hassett R., Kosman D. J. (1995). Evidence for Cu (II) Reduction as a Component of Copper Uptake by Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 270, 128-134.

86. Higuchi K., Kanazawa K., Nishizawa N.K., Chino M., Mori S. (1999) Purification and characterization of nicotianamine synthase from Fe-deficient barley roots. Plant Soil, 165, 173-179.

87. Himelblau E., Mira H., Lin S.J., Culotta V.C., Penarrubia L., Amasino R.M.1998) Identification of a functional homolog of the yeast copper homeostasis gene ATX1 from Arabidopsis. Plant Physiol., 117, 1227-1234.

88. Hirayama T., Alonso J.M. (2000) Ethylene captures a metal! Metal ions are involved in ethylene perception and signal transduction. Plant Cell Physiol., 41, 548-555.

89. Howden R., Goldsbrough P.B., Andersen C.R., Cobbett C. (1995) Cadmium sensitiven cad 1, mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatin deficient. Plant Physiol, 107, 1059-1066.

90. Huffman D.L., O'Halloran T.V. (2001) Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Ann. Rev. Biochem., 70, 677-701.

91. Jiang J., Nadas I.A., Kim M.A., Franz K.J. (2005) A Mets motif peptide found in copper transport proteins selectively binds Cu(I) with methionine-only coordination. Inorg. Chem., 44, 9787-9794.

92. Kaiser B.N., Moreau S., Castelli J., Thomson R., Lambert A., Bogliolo S., Puppo A., Day D.A. (2003) The soybean Nramp homologue, GmDMTl is a symbiotic divalent metal transporter capable of ferrous iron transport. Plant J., 35, 295-304.

93. Ke W., Xiong Z., Xie M., Luo Q. (2007) Accumulation, subcellular localization and ecophysiological responses to copper stress in two Daucus carota L. populations. Plant Soil, 292, 291-304.

94. Kieselbach T., Hagman A., Andersson B., Schroder W.P. (1998) The thylakoid lumen of the chloroplasts: isolation and characterization. J. Biol. Chem., 273, 6710-6716.

95. Kholodova V.P., Ivanova E.M., Kuznetsov VI.V. (2011) Initial step of copper detoxification: outside and inside of the plant cell. Chapter in the Book: «Soil Heavy Metals», Springer Heidelberg (in press).

96. Klaasen C.D., Liu J., Choudhuri S. (1999) Metallothionein: An intracellular protein to protect against cadmium toxicity. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 39, 267294.

97. Konno H., Nakato T., Nakashima S., Katoh K. (2005) Lygodium japonicum fern accumulates copper in the cell wall pectin. J. Exp, Bot., 56,1923-1931.

98. Kramer U., Cotter-Howells J.D., Charnock J.M., Baker A.J.M., Smith A.C.1996) Free histidine as a metal chelator in plants that accumulate nickel. Nature, 379, 635-38.

99. Kramer U., Smith R.D., Wenzel W.W., Raskin I., Salt D.E. (1997) The role of metal transport and tolerance in nickel hyperaccumulation by Thlaspi goesingense Halacsy. Plant Physiol., 115, 1641-1650.

100. Kramer U., Clemens S. (2005) Functions and homeostasis of zinc, copper, and nickel in plants. In: Molecular Biology of Metal Homeostasis and Detoxification, Tamas MJ, Martinoia E (eds.). The: Berlin, Heidelberg, pp. 215-254

101. Kramer U., Talkea I.N., Hanikenneb M. (2007) Transition metal transport. FEBS Lett, 581, 2263-2272.

102. Krotz R.M., Evancelou B.P., Wagner G.J. (1989). Relationships between cadmium, zinc, Cd-peptide, and organic acid in tobacco suspension cells. Plant Physiol., 91, 780-787.

103. Kuhlbrandt W. (2004) Biology, structure and mechanism of P-type ATPases. Nature Rev. Mol. Cell Biol, 5, 282-295.

104. Kumar V., Dooley D.M., Freeman H.C., Guss J.M., Harvey I., McGuirl M.A., Wilce M.C., Zubak V.M. (1996) Crystal structure of a eukaryotic (pea seedling) copper-containing amine oxidase at 2.2.A resolution. Structure, 4, 943-955.

105. Küper J., Llamas A., Hecht H.J., Mendel R.R., Schwarz G. (2004) Structure of the molybdopterin-bound CnxlG domain links molybdenum and copper metabolism. Nature, 430, 803-806.

106. Küpper H., Kroneck P.M.H. (2005) Heavy metal uptake by plants and cyanobacteria. Metal ions in Biological Systems, 44, 97-144.

107. Labbe S., Thiele D.J. (1999) Pipes and wiring: the regulation of copper uptake and distribution in yeast. Trends Microbiol, 7, 500-505.

108. Lasat M.M. (2002) Phytoextraction of Toxic Metals: A Review of Biological Mechanisms. J. Environ. Qual., 31, 109-120.

109. Lee S., Korban S.S. (2002) Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCSl) by cadmium during early stages of plant development. Planta, 215, 689-693.

110. Lee J., Pena M.M., Nose Y., Thiele D.J. (2002) Biochemical characterization of the human copper transporter Ctrl. J. Biol.Chem., 277, 4380-4387.

111. Lee J., Shim D., Song W.Y., Hwang L, Lee Y. (2004) Arabidopsis metallothioneins 2a and 3 enhance resistance to cadmium when expressed in Vicia faba guard cells. Plant Mol. Biol., 54, 805-815.

112. Lehmann C., Rebele F. (2004) Evaluation of heavy metal tolerance in Calamagrostis epigejos and Elymus repens revealed copper tolerance in a copper smelter population of C. epigejos. Env. Exp. Bot., 51, 199-213.

113. Li M.S. (2006) Ecological restoration of mine land with particular reference to the metalliferous mine wasteland in China: a review of research and practice. Sci. Total Environ., 357, 38-53.

114. Liang M., Haroldsen V., Cai X., Wu Y. (2006) Expression of a putative laccase gene, ZmLACl, in maize primary roots under stress. Plant Cell Environ., 29, 746-753.

115. Liao S.W., Chang W.L. (2004). Heavy metal phytoremediation by water hyacinth at constructed wetlands in Taiwan. J. Aquat. Plant Manage, 42, 60-68.

116. Ling H.Q., Pich A., Scholz G., Ganal M.W. (1996) Genetic analysis of two tomato mutants affected in the regulation of iron metabolism. Mol. General Genetics, 252, 8792.

117. Liu D.H., Kottke I. (2004a) Subcellular localization of copper in the root cells of Allium sativum by electron energy loss spectroscopy (EELS). Bioresource Technol., 94, 53-158.

118. Llugany M., Lombini A., Poschenrieder C., Dinelli E., Barcelo J. (2003) Different mechanisms account for enhanced copper resistance in Silene armeria ecotypes from mine spoil and serpentine sites. Plant Soil, 251, 55-63.

119. Maitani T., Kubota H., Sato K., Yamada T. (1996) The composition of metals bound to class III metallothionein (phytochelatin and its desglycyl peptide) induced by various metals in root cultures of Rubia tinctorum. Plant Physiol., 110, 1145-1150.

120. Maksymiec W. (1997) Effect of copper on cellular processes in higher plants. Photosynthetica, 34, 132 342.

121. Maksymiec W., Baszynski T. (1999) The role of Ca2+ ions in modulating changes induced in bean plants by an excess of Cu2+ ions. Chlorophyll fluorescence measurements. Physiol. Plant., 105, 562-568.

122. Malaisse F., Grégoire J. (1978) Contribution a la phytogéochimie de la Mine de l'Etoile (Shaba, Zaïre). Bull. Soc. roy. Bot. Belg., 111, 252-260.

123. Malaisse F., Grégoire J., Brooks R.R., Morrison R.S., Reeves R.D. (1978) Aeollanthus biformifolius. De Wild.: a hyperaccumulator of copper from Zaïre. Science, 199, 887-888.

124. Malaisse F., Brooks R.R., Baker A.J.M. (1994) Diversity of vegetation communities in relation to soil heavy metal content at the Shinkolobwe copper/cobalt/uranium mineralization, Upper Shaba, Zaïre. Bull. Soc. Roy. Bot. Belg., 127, 3-16.

125. Mari S., Lebrun M. (2005) Metal immobilization: where and how? In: Tamâs MJ, Martinoia E (eds.) Molecular Biology of Metal Homeostasis and Detoxification, Topics in Current Genetics, 14, 273-298.

126. Marschner H. (1995) Mineral nutrition of higher plants. Academic Press, London, 344-346.

127. Mayer A.M. (2006) Polyphenol oxidases in plants and fungi: going places? A reviewer. Phytochem., 67, 2318-2331.

128. Maser P., Thomine S., Schroeder J.I. (2001) Phylogenetic relationships within cation transporter families of Arabidopsis. Plant Physiol., 126, 1646-1667.

129. McGrath S.P., Zhao F.J. (2003) Phytoextraction of metals and metalloids from contaminated soils. Curr. Opin. Biotechnol., 14, 277-282.

130. Mengoni A., Gonelli C., Hakvoort H.W.J., Galardi F., Bazzicalupo M., Gabbrielli R., Schat H. (2003) Evolution of copper-tolerance and increased expression of a 2b-type metallothionein gene in Silene paradoxa L. populations. Plant Soil, 257, 451—457.

131. Meychik N.R., Yermakov I.P. (2001) Ion exchange of plant root cell walls. Plant Soil, 234, 181-193.

132. Mira H., Martinez-Garcia F., Penarrubia L. (2001a) Evidence for the plant-specific intercellular t ransport of the Arabidopsis copper chaperone CCH. Plant J., 25, 521-528.

133. Moller S.G., McPherson M.J. (1998) Developmental expression and biochemical analysis of the Arabidospsis ataol gene encoding and H202-generating diamine oxidase. Plant J., 13,781-791.

134. Monni S., Bucking H., Kottke I. (2002) Ultrastructural element localization by EDXS in Empetrum nigrum. Micron., 33, 339-351.

135. Mori S. (1999) Iron acquisition by plants. Current Opinion in Plant Biology, 2, 250-253.

136. Mukherjee I., Campbell N.H., Ash J.S., Connolly E.L. (2006) Expression profiling of the Arabidopsis ferric chelate reductase (FRO) gene family reveals differential regulation by iron and copper. Planta, 223, 1178-1190.

137. Murphy A., Taiz L. (1995) Comparison of metallothionein gene expression and nonprotein thiols in ten Arabidopsis ecotypes. Correlation with copper tolerance. Plant Physiol., 109,945-954.

138. Murphy A., Zhou J., Goldsbrough P.B., Taiz L. (1997) Purification and immunological identification of metallothioneins 1 and 2 from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol., 113, 1293-1301.

139. Nakajima K., Suzuki K., Otaki N., Kimura M. (1991) Epitope mapping of metallothionein antibodies. Methods in Enzymology, 205, 174-189.

140. Neumann D., zur Nieden U., Lichtenberger O., Leopold I. (1995) How does Armeria maritima tolerate high heavy metal concentrations? J. Plant Physiol., 146, 704717.

141. Nishizono H., Ichikawa H., Suziki S., Ishii F. (1987) The role of root cell wall in the heavy metal tolerance of Athrium yokoscense. Plant Soil, 101, 15-20.

142. Nukumura K., Go N. (2005) Function and molecular evolution of multicopper blue protein. Cell Mol Life Sci., 62, 2050-2066.

143. O'Halloran T.V., Culotta V.C. (2000) Metallochaperones, an intracellular shuttle service for metal ions. J. Biol. Chem., 275, 25057-25060.

144. Palmer C.M., Guerinot M.L. (2009) Facing the challenges of Cu, Fe and Zn homeostasis in plants. Nature chem. boil.,, 5, 333-340.

145. Palmgren M.G., Axelsen K.B. (1998) Evolution of P-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta, 1365, 37-45.

146. Panou-Filotheou H., Bosabalidis A.M., Karataglis S. (2001) Effects of copper toxicity on leaves of oregano (Origanum vulgare subsp. hirtum). Ann. Bot., 88, 207-214.

147. Panou-Filotheou H., Bosabalidis A.M. (2004) Root structural aspects associated with copper toxicity in oregano (Oreganum vulgare sudsp. hirtum). Plant Sci., 166, 14971504.

148. Patsikka E., Kairavuo M., Sersen F., Aro E.-M., Tyystjarvi E. (2002) Excess copper predisposes photosystem II to photoinhibition in vivo by outcompeting iron and causing decrease in leaf chlorophyll. Plant Physiol., 129, 1359-1367.

149. Penarrubia L., Andres-Colas N., Moreno J., Puig S. (2010) Regulation of copper transport mArabidopsis thaliana: a biochemical oscillator? J. Biol. Inorg. Chem., 15, 2936.

150. Peng H.-Y., Yang X.E., Tian S.K. (2005) Accumulation and ultrastructural distribution of copper in Elsholzia splendens. J. Zhejiang Univ. 6B, 311-318.

151. Pilson-Smits E. (2005) Phytoremediation. Annu. Rev. Plant Biol., 56, 15-39.

152. Pollard A.J., Powell K.D., Harper F.A., Smith J.A. (2002) The genetic basis of metal hyperaccumulation in plants. Crit. Rev. Plant Sci., 21, 539-566.

153. Pufahl R.A., Singer C.P., Peariso K.L., Lin S.J., Schmidt P.J., O.Halloran T.V. (1997) Metal ion chaperone function of the soluble Cu(I) receptor Atxl. Science, 278, 853-856.

154. Puig S., Thiele D.J. (2002) Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Curr. Op. Chem., Biol., 6, 171-180.

155. Puig S., Andres-Colas N., Garcia-Molina A., Penarrubia L. (2007) Copper and iron homeostasis in Arabidopsis: responses to metal deficiencies, interactions and biotechnological applications. Plant Cell Env., 30, 271-290.

156. Quartacci M.F., Pinzino C., Sgherri C.L.M., Dalla Vecchia F., Navari-Izzo F.2000) Growth in excess copper induces changes in the lipid composition and fluidity of PSII-enriched membranes in wheat. Physiol. Plant. 108, 87-93.

157. Ranathunge K., Steudle E., Lafitte R. (2005) A new precipitation technique provides evidence foe the permeability of Casparian bands to ions in young roots of corn (Zea mays L.) and rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Environ., 28, 1450-1462.

158. Ranocha P., Chabannes M., Chamayou S., Danoun S., Jaunean A., Boudet

159. A.M, Goffner D. (2002) Laccase down-regulation causes alterations in phenolic metabolism and cell wall structure in poplar. Plant Physiol., 129, 145-155.

160. Rauser W.E. (1995) Phytochelatins and related peptides. Structure, biosynthesis and function. Plant Physiol., 109, 1141-1149.

161. Rauser W.E. (1999) Structure and function of metal chelators produced by plants -the case for organic acids, amino acids, phytin, and metallothioneins. Cell Biochem. Biophys., 31, 19-48.

162. Rea G., Metoui O., Infantino A., Federico R., Angelini R. (2002) Copper amine oxidase expressin in defense responses to wounding and Ascochyta rabiei invasion. Plant Physiol, 128, 865-875.

163. Rees E.M., Lee J., Thiele J. (2004) Mobilization of intracellular copper stores by the Ctr2 vacuolar copper transporter. J. Biol. Chem., 279, 54221-29.

164. Rees E.M., Thiele D.J. (2007) Identification of a vacuole-associated metalloreductase and its role in C77?2-mcdiated intracellular copper mobilization. J. Biol. Chem., 282,21629-21638.

165. Reeves R.D., Baker A.J.M. (2000). Metal-accumulating plants, in I. Raskin and

166. B.D. Ensley (eds.), Phytoremediation of Toxic Metals: Using Plants to Clean Up the Environment, Wiley, New York.

167. Reeves R.D. (2006) Hyperaccumulation of trace elements by plants. In: Morel J.L., Echevarria G., Goncharova N. (eds) Phytoremediation of Metal-Contaminated Soils. NATO Science Series: IV: earth and environmental sciences, 68, Springer, New York.

168. Roberts L.A., Pierson A.J., Panaviene Z., Walker E.L. (2004) Yellow stripel. Expanded roles for the maize iron-phytosiderophore transporter. Plant Physiol, 135, 112-120.

169. Robinson N.J., Tommey A.M., Kuske C., Jackson P.J. (1993) Plant metallothioneins. Biochem., 295, 1-10.

170. Rodrigues F.I., Esch J.J., Hall A.E., Binder B.M., Schaller G.E., Bleecker A.B.1999) A copper cofactor for the ethylene receptor ETR1 from Arabidopsis. Science, 283, 996-998.

171. Roosens N.H., Bernard C., Leplae R., Verbruggen N. (2004) Evidence for copper homeostasis function of metallothionein (MT3) in the hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. FEBS Letters, 577, 9-16.

172. Salt D.E., Kramer U. (2000) Mechanisms of metal hyperaccumulation in plants. In: Raskin I, Ensley B (eds) Phytoremediation of Toxic Metals. John Wiley and Sons Inc., New York, 231-246.

173. Sancenon V., Puig S., Mira H., Thiele D., Penarrubia L. (2003) Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol., 51, 577-587

174. Sancenon V., Puig S., Mateu-Andres I., Dorcey E., Thiele D.J., Penarrubia L.2004) The Arabidopsis copper transporter COPT1 functions in root elongation and pollen development. J. Biol. Chem., 279, 15348-15355.

175. Scarano G., Morelli E. (1998) Polarographic behavior of metal phytochelatin complexes. Electroanalysis, 10, 39—43.

176. Schaaf G., Ludewig U., Erenoglu B.E., Mori S., Kitahara T., von Wiren (2004) ZmYSl functions as a proton-coupled symporter for photosyderophore- and nicotianamine-chelated metals. J. Biol. Chem., 279, 9091-9096.

177. Schaaf G., Schikora A., Harberle J., Vert G., Ludewig U., Briat J.F., Curie C., von Wiren N. (2005) A putative function for the Arabidopsis Fe-Phytosiderophore transporter homolog AtYSL2 in Fe and Zn homeostasis. Plant Cell Physiol., 46, 762-774.

178. Schafer H.J., Greiner S., Rausch T., Haag-Kerwer A. (1997) In seedlings of the heavy metal accumulator Brassica juncea Cu differentially affects transcript amounts for gamma-glutamylcysteine synthetase and metallothionein. FEBS Lett., 404, 216-220.

179. Schat H., Llugany M., Vooijs R., Hartley-Whitaker J., Bleeker P. (2002) The role of phytochelatins in constitutive and adaptive heavy metal tolerance in hyperaccumulator and non-hyperaccumulator metallophytes. J. Exp. Bot., 53, 2381-2392.

180. Schubert M., Petersson U.A., Haas B.J., Funk C., Schroder W.P., Kieselbach T. (2002) Proteome map of the chloroplast lumen of Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem., Ill, 8354-8365.

181. Shikanai T., Muller-Moule P., Munekage Y., Niyogi K.K., Pilon M. (2003) PPA1, a P-type ATPase of Arabidopsis, functions in copper transport in chloroplasts. Plant Cell, 15, 1333-1346.

182. Seigneurin-Berny D., Gravot A., Auroy P., Mazard C., Kraut A., Finazzi G.,2006) HMA1, a new Cu-ATPase of the chloroplast envelope, is essential for growth under adverse light conditions. J. Biol. Chem., 28, 2882-2892.

183. Silver S. (1996) Bacterial resistance to toxic metal ions a review. Gene, 179, 9-19.

184. Solioz M., Vulpe S. (1996) CPx-type ATPases: a class of P-type ATPases that pump heavy metals. Trends in Biochemical Science, 21, 237-241.

185. Southron J.L., Basu U., Taylor G.J. (2004) Complementation of Saccharomyces cerevisiae ccc2 mutant by a putative P1B-ATPase from Brassica napus supports a copper-transporting function. FEBS Letters, 566, 218-222.

186. Tabata K., Kashiwagi S., Mori H., Ueguchi C., Mizuno T. (1997) Cloning of a cDNA encoding a putative metal-transporting P-type ATPase from Arabidopsis thaliana. Biochim. Biophys. Acta: Biomembranes, 1326, 1-6.

187. Thomine S., Wang R., Ward J.M, Crawford N.M., Schroeder J.I. (2000)

188. Cadmium and iron transport by members of a plant metal transporter family in Arabidopsis with homology to Nramp genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4991-4996.

189. Tilstone G.H., Macnair M.R. (1997) The consequence of selection for copper tolerance on the uptake and accumulation of copper in Mimulus guttatus. Ann. Bot., 80 , 747-751.

190. Trindade L.M., Horvath B.M., Bergervoet M.J.E., Visser R.G.F. (2003) Isolation of a gene encoding a copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase and characterization of its promoter in potato. Plant Physiol., 133, 618-629.

191. Veselov D., Kudoyarova G., Symonyan M., Veselov St. (2003) Effect of cadmium on ion uptake, transpiration and cytokinin content in wheat seedlings. Bulg. J. Plant Physiol. Special issue, 353-359.

192. Wei L., Luo C., Li X., Shen Z. (2008) Copper accumulation and tolerance in Chrysanthemum coronarium L. and Sorghum sudanense L. Arch. Environ. Contamin. Toxicol., 55, 230-246.

193. Weisa J.S., Gloverb T., Weis T. (2004) Interactions of metals affect their distribution in tissues of Phragmites australis. Environ. Pollut., 131, 409^4-15.

194. Williams L.E., Mills R.F. (2005) Pm-ATPases an ancient family of transition metal pumps with diverse functions in plants. Trends in Plant Science, 10, 491-502.

195. Wintz H., Fox T., Wu Y.Y., Feng V., Chen W.Q., Chang H.S., Zhu T., Vulpe C. (2003) Expression profiles of Arabidopsis thaliana in mineral deficiencies reveal novel transporters involved in metal homeostasis. J. Biol. Chem., 278, 47644-47653.

196. Woiste K.E., Kieber J.J. (2000) A strong loss-of-function mutation in RANI results in constitutive activation of the ethylene response pathway as well as a rossete-lethal phenotype. Plant Cell, 12, 443-455.

197. Wong H.L., Sakamoto T., Kawasaki T., Umemura K., Shimamoto K. (2004) Down-regulation of metallothionein, a reactive oxygen scavenger, by the small GTPase OsRacl in rice. Plant Physiol., 135, 1447-1456.

198. Wu H., Li L., Du J., Yuan Y., Cheng X., Ling H.Q. (2005) Molecular and biochemical characterization of the Fe(III) chelate reductase gene family in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol., 46, 1505-1514.

199. Xiao W.L., Luo C.L., Chen Y.H., Shen Z.G., Li X.D. (2008) Bioaccumulation of Fleavy Metals by Wild Plants Growing on Copper Mine Spoils in China. Commiin. Soil Sci. Plant Anal., 39, 315-328.

200. Yang M.J., Yang X.E., Romheld V. (2002) Growth and nutrient composition of Elsholtzia splendens Nakai under copper toxicity. J. Plant Nutr., 25, 1359-1375.

201. Yruela I. (2009) Copper in plants: acquisition, transport and interactions. Funct. Plant Biol., 36, 409-430.

202. Zhang X.-H., Lin A.-J., Gao Y. L., Reid R.J., Wong M.-H., Zhu Y.-G. (2009). Arbuscular mycorrhizal colonization increases copper binding capacity of root cell walls of Oryza sativa L. and reduces copper uptake. Soil Biol. Biochem., 41, 930-937.

203. Zhigang A., Cuijie L., Yuangang Z., Yejie D., Wachter A., Gromes R., Rausch

204. T. (2006) Expression of BjMT2, a metallothionein 2 from Brassica juncea, increases copper and cadmium tolerance in Escherichia coli and Arabidopsis thaliana, but inhibits root elongation in Arabidopsis thaliana seedlings. J. Exp. Bot., 57, 3575-3582.

205. Zhou J., Goldsbrough P.B. (1994) Functional homologs of fungal metallothionein genes from Arabidopsis. Plant Cell, 6, 875- 884.

206. Zhou J., Goldsbrough P.B. (1995) Structure, organization and expression of the metallothionein gene family in Arabidopsis. Molecular General Genetics, 248, 318-328.

Информация о работе

Иванова, Елена Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.05

Диссертация

Токсическое действие меди и механизмы ее детоксикации растениями рапса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы