Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиологические и молекулярные ответные реакции растений рапса на воздействие солей меди и цинка
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации по теме "Физиологические и молекулярные ответные реакции растений рапса на воздействие солей меди и цинка"
На правах рукописи
/
РАДИОНОВ Никита Викторович
Физиологические и молекулярные ответные реакции растений рапса на воздействие солей меди и цинка
03 00 12 - физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
и ^
-«оьод
МОСКВА-2008
003168689
Работа выполнена в Лаборатории экспрессии генома растений Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ
доктор биологических наук Кузнецов Виктор Васильевич
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ
доктор биологических наук Носов Александр Владимирович
кандидат сельскохозяйственных наук,
профессор
Семенов Олег Григорьевич
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
Главный ботанический сад им Н В Цицина РАН
Защита состоится « 20 » мая 2008 года в \) часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002 210 01 Института физиологии растений им К А. Тимирязева РАН по адресу 127 276, Москва, ул Ботаническая, 35 Факс +7 (495) 977 80 18, E-mail ifr@ippras ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН
Автореферат разослан « апреля 2008 года
Ученый секретарь
Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук
МИ Азаркович
ВВЕДЕНИЕ
Одним из факторов, уменьшающих площадь земель, пригодных для нужд сельского хозяйства, является их загрязнение высокими концентрациями тяжелых металлов (ТМ) вследствие активной промышленной деятельности человека (Ильин, 1991, Schuetzenduebel et al, 2002) Медь и цинк являются эссенциальными элементами, т е необходимыми в небольших количествах для нормальной деятельности всех живых организмов, однако их высокие концентрации негативно влияют на растения
Различные виды растений обладают разной устойчивостью к действию ТМ Это обеспечивается функционированием специализированных механизмов на различных уровнях организации Основная задача всех этих механизмов -изоляция токсичных концентраций металлов от метаболически активных компартментов клетки Глубокое понимание функционирования подобных механизмов будет способствовать расширению сферы применения растений для решения проблемы загрязнения почв ТМ
Использование растений с целью восстановления загрязненных тяжелыми металлами почв называется фиторемедиацией (Chaney et al, 1997) Главным ее недостатком является относительно небольшая биомасса большинства растений гипераккумуляторов и низкая скорость роста Поэтому особый интерес представляет изучение таких видов растений как, например, рапс, которые способны формировать значительную биомассу и накапливать в больших концентрациях ТМ
Трансгенные растения представляют собой удобную модель для фундаментальной науки Введение в геном быстрорастущих высокопродуктивных культур фрагментов генома растений гипераккумуляторов посредством методов молекулярной биологии позволит глубже проникнуть в суть механизмов, лежащих в основе адаптационного процесса (Brown et al, 1995)
В данной работе объектом агробактериальной трансформации был выбран рапс (Brassica napus L, сорт Вестар), благодаря хорошим
регенерационным свойствам и оптимизированной процедуре трансформации данного сорта В качестве целевого был использован ген риса (ОвМуЪ4), кодирующий транс-фактор МУВ Известно, что продукт данного гена увеличивает устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды, в том числе и к ТМ (Уапшш е1 а1, 2004, Майапа е1 а1,2005)
Цель и задачи исследования.
Цель диссертационной работы заключалась в изучении повреждающего действия на растения рапса сорта Вестар солей меди и цинка, в оценке роли некоторых генов системы защиты от их избытка и получении трансгенных растений этого сорта, несущих ген транс-фактора МУВ4, способный обеспечить повышение устойчивости растений к этим ТМ
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи
1 Установить диапазон концентраций солей меди и цинка, в пределах которых возможно прорастание семян и рост проростков рапса,
2 Оценить степень ингибирования тяжелыми металлами роста и накопления биомассы молодых растений рапса,
3 Изучить аккумуляцию ТМ в листьях рапса и выявить существенные звенья физиологических процессов, подверженных их негативному действию,
4 Изучить регуляцию экспрессии генов некоторых мембранных транспортеров и фермента синтеза фитохелатинов под действием ТМ,
5 Получить и проанализировать трансгенные растения рапса, содержащие ген транс-фактора риса ОзМуЬ4, продукт которого способен увеличивать устойчивость растений к окислительному стрессу и, как результат, к негативному воздействию ТМ
Научная новизна.
Примененный комплексный подход позволил не только оценить устойчивость рапса к действию ТМ по основным физиологическим показателям, но и проанализировать на уровне экспрессии генов участие отдельных звеньев клеточных механизмов в детоксикации ионов металлов
Практическая значимость.
Рапс (Brassica napus L), выбранный в данной работе в качестве объекта, является культурой универсального назначения Это один из главных источников сырья для производства пищевого растительного масла, жмыхов, шротов, муки и зеленой массы для кормов, а рапсовое масло - важный резерв производства биотоплива
Апробация результатов работы.
Основные положения работы доложены на Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), на III Съезде Общества биотехнологов России им ЮА Овчинникова (Москва, 2005), на VI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2005), на Международной конференции «Современная физиология растений от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007)
Публикаоии. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных
работ
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц и 36 рисунков Список цитируемых литературных источников включает 216 наименований
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объект исследований
В качестве объекта исследований был выбран рапс (Brassica napus L, сорт канадской селекции Вестар Исследования проводили на проростках и 4-х недельных растениях, выращенных на водной культуре В качестве питательной среды испотьзовали среду Хогланда - Снайдерс (Третьяков с соавт, 1990)
Измерение физиологических параметров
Всхожесть семян рапса и рост корня проростков под влиянием тяжелых металлов оценивали на 3-й и 4-й день воздействия Измерение свежей и сухой биомассы растений и отдельных органов - листьев, стеблей, побегов и корней -проводили стандартными общепринятыми методами (Пустовой и др, 1995) Осмотический потенциал клеточного сока листьев рапса измеряли на осмометре Osmomat 030 фирмы «Gonotac» (США) Перекисное окисление липидов определяли по методу Heath и Parker (1968), а содержание хлорофилла - по методу Шлыка (1971) Содержание свободного пролина определяли с помощью кислого нингидринового реактива по методу Bates et al (1973) Определение содержания меди и цинка в тканях растений проводили по методу Голубкиной (1995)
Молекулярные методы анализа были проведены, главным образом, в соответствии с руководством Маниатис и др (1984) Реакцию обратной транскрипции проводили, как указано в руководстве фирмы Fermentas После синтеза кДНК проводили ПЦР с подобранными праймерами - ZIP, ZAT 1, ZAT1(2), PCS Полученные фотографии обрабатывали на компьютере с помощью программы Adobe Photoshop 7,0 (фирма «Adobe», США) Интенсивность пятен оценивалась с использованием программы ID Scan Version 1 3 (фирма «CSP Inc», США) Представленные данные выражены в относительных единицах - процентах активности (экспрессии гена) опытных образцов на фоне контроля, который принимали за 100%
Трансформацию рапса проводили методом совместного культивирования эксплантов рапса и почвенной агробактерии Agrobacterium tumefaciense (штамм AGL0) Для получения трансгенных растений использовали 2 генетические конструкции - COR15Myb4 и pGAMyb4 (Vannim et al, 2004) В обеих конструкциях целевым является ген риса OsMyb4, кодирующий MYB транс-фактор
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние ТМ на прорастание семян и рост корня проростков рапса
Было обнаружено, что C11SO4 не оказывает ингибирующего действия на прорастание семян рапса до концентрации 150 мкМ Рост корня на 3 сутки тормозится только при воздействии 150 мкМ меди, а на 4-е сутки наблюдалось ингибирование роста корня проростков на 40 и 70 % при 100 и 150 мкМ сернокислой меди, соответственно
Влияние цинка на прорастание проявляется, начиная с концентрации 1,5 мМ Более заметное негативное действие ZnS04 оказывает на рост корня молодых растений Достоверный ингибирующий эффект проявлялся при концентрации 500 мкМ, достигая 90% ингибирования роста корня при 1000 мкМ ZnS04
Таким образом, на стадии прорастания и начального роста рапс показал высокую устойчивость к солям меди и, особенно, цинка Влияние ТМ на рост и накопленне биомассы растений рапса
CuS04 в концентрации 50-150 мкМ тормозила накопление биомассы в среднем на 40-60% (Рис 1)
7,00 6,00 -5,00
1
4,00 -
S
ё 3,00 -
2,00 -1,00 -0,00 -
о
5
время воздействия, дни
10
Рис 1 Влияние солей тяжелых металлов на биомассу, 1 - контроль, 2 -ZnS04 500 мкМ, 3 - ZnS04 1000 мкМ, 4 - ZnS04 1500 мкМ, 5 - CuS04 50 мкМ, 6 - CuS04 100 мкМ, 7 - CuS04 150 мкМ
При этом со временем ингибирующий эффект высоких концентраций усиливался Несмотря на то, что концентрация ZnS04 в этих опытах превосходила концентрацию C11SO4 в 10 раз, ингибирующий эффект цинка на накопление биомассы был значительно менее выражен Не более чем на 1/3 снизилась биомасса растений рапса даже при концентрации цинка 1500 мкМ
При оценке действия ТМ на рост отдельных органов (листьев и корней) оказалось, что эффект C11SO4 был значительно сильнее, чем эффект ZnS04 биомасса листьев под влиянием меди увеличилась всего в 2-5 раз, тогда как за тот же период времени под воздействием в 10 раз больших концентраций ZnS04 биомасса листьев увеличилась в 6-9 раз Масса листьев контрольных растений увеличилась за тот же период в 14 раз Особенно сильно различалось действие цинка и меди на рост корневой системы При концентрации цинка 1500 мкМ биомасса корней за 10 дней опыта увеличилась в 3 раза, тогда как в контроле - в 5 раз При действии CuS04 прирост биомассы корня был практически полностью подавлен
Таким образом, молено заключить, что чувствительность к меди молодых растений рапса гораздо выше, чем проростков Разница в отрицательном влиянии цинка на проростки и молодые растения значительно меньше, чем у меди Ингибирующее действие цинка на накопление биомассы молодых растений проявлялось с концентрации 500 мкМ, а избыточные концентрации (до 5 мМ) полностью останавливали рост листьев Проведенный анализ позволил остановиться в дальнейших экспериментах на использовании солей меди в диапазоне концентраций 50-150 мкМ, а цинка на порядок выше -500-1500 мкМ
Аккумуляция ТМ в листьях растений рапса
Было обнаружено, что в норме растения рапса сорта Вестар содержат от 22 до 35 мкг меди в грамме сухих тканей листа При добавлении в питательную среду соли меди в концентрации 50-150 мкМ даже после 10 дней не наблюдалось существенного накопления меди в листьях - максимальное значение превышало контрольный показатель в 4,5 раза (Табл 1)
Таблица 1 Содержание меди в листьях рапса под влиянием различных концентраций Си504, мкг металла/ г сухого веса
Вариант 5 дней 10 дней
контроль 22 3±2 3 34 2±3 5
Си 50 мкМ 25 1±2 8 59 9±4 1
Си 100 мкМ 44 3±4 7 101 4±5 3
Си 150 мкМ 97 8±5 5 159 6±9 7
После 5 дней действия цинка в концентрации 2500 мкМ его содержание в опытных образцах превышало контрольные значения в 10 раз, а при концентрации 5 ООО мкМ - более чем в 30 раз (рис 2) Через 10 дней воздействия содержание цинка в опытных вариантах продолжало увеличиваться После 15 дней воздействия сульфата цинка в концентрации 2500 мкМ содержание цинка в листьях рапса превышало контроль в 32 раза, а
Рис 2 Содержание цинка в листьях рапса под действием сульфата цинка, 1 -Zn 5000 мкМ, 2-Zn 2500 мкМ, 3 - контроль, 4 - без 2п
В концентрациях, токсический эффект которых был сходен с токсическим эффектом меди, цинк накапливался в значительно больших количествах При чрезвычайно высоких концентрациях цинка (5 мМ),
превышающих уровень в питательной среде в 15 000 раз, рапс мог аккумулировать в тканях листьев до 7 ООО мкг / г, что приближает растения рапса к растениям-гипераккумуляторам тяжелых металлов Влияние меди и цинка на оводненность листьев рапса
96
76 -
74 Н-,-,---,-
С 5 10 15
время воздействия, дни
Рис 3 Оводненность листьев рапса при влиянии раствора сульфата меди, 1 - №С1100 мМ, 2 - Контроль, 3 - Си 50 мкМ, 4 - Си 25 мкМ, 5 - Си 100 мкМ
Как показывают результаты, представленные на рис 3, медь вызывает сильное изменение водного статуса рапса в концентрации 100 мкМ, а при концентрации 200 мкМ эффект меди становится летальным уже на 7-9 день
Цинк, как менее токсичный для растений элемент обнаруживает действие в концентрациях, превышающих концентрации меди в 10-25 раз Высокие концентрации - от 2500 мкМ - заметно уменьшают оводненность на 10й день (до 88% против 93% у контрольных растений), а концентрация 5000 мкМ близка к летальной и сказывается уже на 5й день (рис 4) Умеренное засоление (100 мМ хлорида натрия) не оказывает заметного влияния на водный статус растения, даже при условии длительной инкубации
96
94 -
92
£ 90 -
£ 88
о
о 86
X
К 84
о
я 82
о с 80
о 78
76 -
74
-~>т 5
5 10
время воздействия, дни
15
Рис. 4. Оводненность листьев рапса при воздействии сульфата цинка; 1 - №С1 100 мМ, 2 - Контроль, 3 - Ъп 1000 мкМ, 4 - гп 2500 мкМ, 5 -Ъъ 5000 мкМ.
Влияние меди и цинка на осмотический потенциал
При действии 1000 и 2500 мкМ цинка на растения рапса осмотический потенциал снизился в среднем соответственно на 30 и 50% по отношению к контрольным растениям (Рис. 5).
5 дней
10 дней
0,00 -
я -0,20 -|
Ц -0,40 -!
| -0,60 -Я
В -0,80 4
У '
н
2 -1,00
| "1,20 -и
Г -1,40
2 -1'в0 и
о -1,80 -2,00
время воздействия, дни
Рис. 5. Влияние ТМ на осмотический потенциал; 1 - Контроль, 2 - Zn
1000 мкМ, 3 - гп 2500 мкМ, 4 - гп 5000 мкМ.
Цинк в концентрации 5000 мкМ через 5 дней снижал потенциал на 77 %, а после 10 дней растения находились в таком состоянии, что определить осмотический потенциал не представлялось возможным.
Снижение осмотического потенциала при воздействии использованных концентраций меди и цинка могло происходить из-за повышения концентрации осмотически активных веществ за счет уменьшения объема клеток. Об этом свидетельствуют приведенные данные о снижении оводненности тканей листа. Не исключено, однако, что активная осморегуляция происходила также благодаря поступлению или синтезу осмотически активных веществ (низкомолекулярных неорганических ионов или органических соединений). Изменение в содержании свободного пролина под действием ТМ
5 10 15
время воздействия, дни
Рис. 6. Содержание свободного пролина в листьях рапса при действии солей меди; 1 - Контроль, 2 - №С1100 мМ, 3 - Си 100 мкМ, 4 - Си 200 мкМ.
Под действием меди в концентрации 100 мкМ в течение всего эксперимента содержание пролина в листьях рапса превышало контрольные значения в 25 - 30 раз (Рис. 6).
Под влиянием меди в концентрации 200 мкМ через 5 дней содержание пролина в листьях растений достигало 315 мкмол / г сух.массы. Однако более длительное воздействие этой концентрации меди вызвало гибель растений.
В отличие от меди, меньшая из использованных концентраций цинка (1000 мкМ) в течение 5 и 10 дней достоверно не изменяла содержание пролина (Рис. 7), однако после 15 дней количество пролина увеличивалось и превышало контроль в 5 раз.
5 10 15
время воздействия, дни
Рис. 7. Содержание свободного пролина в листьях рапса при действии солей цинка; 1 - Контроль, 2 - №01 100 мМ, 3 - 1000 мкМ, 4 - Ъа 2500 мкМ, 5 - гп 5000 мкМ.
Более четкое стрессорное воздействие на растения рапса оказывал цинк в концентрации 2500 мкМ, при которой на 1 Ой день уровень пролина превышал его содержание в контроле в 17 раз, а при концентрации 2п804 5000 мкМ - в 25 раз. Однако при действии этой концентрации цинка растения рапса погибали на 12й день.
Способность растений аккумулировать неорганические ионы и синтезировать совместимые осмолиты в ответ на действие ТМ может
рассматриваться в качестве одного из важных критериев их высокого адаптивного потенциала.
Влияние ТМ на перекисное окисление липидов
Перекисное окисление ненасыщенных липидов в биологических мембранах является заметным симптомом окислительного стресса у растений (Yamamoto et.al, 2001). При действии на растения сульфата меди в концентрации 50-150 мкМ в течение 5 дней уровень МДА увеличивался в среднем в 5-9 раз (Рис. 8), а при более длительном воздействии окислительный стресс, оцениваемый количеством МДА, усиливался. Максимальное накопление МДА наблюдалось при 10-дневном воздействии меди в концентрации 150 мкМ.
Рис. 8. Влияние солей меди на перекисное окисление липидов; 1 -Контроль, 2 - Си 50 мкМ, 3 - Си 100 мкМ, 4 - Си 150 мкМ.
В другой серии опытов было показано, что недостаток цинка не вызывает повышение содержания МДА в листьях рапса, повышенные концентрации цинка (1000-2500 мкМ) заметно усиливают процесс перекисного окисления липидов биологических мембран. (Рис. 9).
2,5
с 2
4 ¿1,5
д и
«?
4) а
£ 2 1 Н
Я и
I
и ч 3 0,5
0 -
2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
яШ
10
время воздействия, дни
Рис. 9. Влияние солей цинка на перекисное окисление липидов;
1 - Контроль, 500 мкМ, 3 - Ъ\ 1000 мкМ, 4 - 1п 1500 мкМ, 5 - Ъп 2500 мкМ, 6 - без 7л\.
Таким образом, можно констатировать, что установлена сильная активация перекисного окисления липидов при действии солей меди и цинка. При этом, сравнимый по интенсивности эффект ТМ был достигнут при концентрации цинка в 10 раз более высокой, чем меди, что указывает на меньший токсический эффект солей цинка для рапса. Влияние ТМ на содержание хлорофилла
Цинк и медь, являясь эссенциальными элементами, в повышенных концентрациях вызывают разрушение фотосинтетического аппарата и, тем самым, ингибируют процесс фотосинтеза. Под влиянием меди, особенно в концентрациях, превышающих 100 мкМ, происходит уменьшение содержания хлорофиллов а и в в листьях рапса (Табл. 2) Наиболее яркое отрицательное действие меди наблюдается на уровне хлорофилла в.
Сернокислый цинк также, как и медь, оказывает негативное влияние на хлорофилл. В среднем содержание хлорофилла в опытных вариантах после 5 дней действия сульфата цинка в концентрациях 500-1500 мкМ было на 60%
ниже контрольного варианта При этом данный эффект со временем только усиливался
Таблица 2 Содержание хлорофилла в листьях рапса под влиянием солей цинка и меди в течение 5 дней, мг / г свеж массы
Вариант Хлорофилл а Хлорофилл Ъ Хл. а+Ъ Хл. а/Ъ
Контроль 0,55±0,06 0,20±0,01 0,75 2,IS
Си 50 мкМ 0,44±0,08 0,12±0,02 0,56 3,66
Си 100 мкМ 0,40±0,03 0,14±0,02 0,54 2,86
Си 150 мкМ 0,31±0,06 0,07±0,01 0,38 4,42
Zn 500 мкМ 0,22±0,03 0,06±0,02 0,28 3,66
Zn 1000 мкМ 0,20±0,03 0,07±0,02 0,27 2,85
Zn 1500 мкМ 0,17±0,04 0,05±0,008 0,22 3,40
6e3Zn 0,48±0,04 0,22±0,03 0,70 2,18
При выращивании рапса в отсутствии цинка общий уровень хлорофилла оказался на 7-14% ниже, чем у растений, выращенных в обычных условиях
Как и в случае окислительного стресса, вызванного внесением ТМ (по накоплению МДА), сходный по интенсивности негативный эффект солей меди и цинка возникал при концентрациях цинка в 10 раз превышающих концентрацию меди
Влияние цинка на экспрессию генов системы его детоксикации
В данной части работы сделана попытка охарактеризовать на уровне экспрессии генов систему детоксикации ионов тяжелых металлов Была исследована экспрессия 4 генов ZIP 10 (продукт - плазматический транспортер ионов), 2 гена ZAT (белок расположен в тонопласте) и PCS (его продукт -фермент, локализованный в цитозоле, осуществляет синтез в клетке фитохелатинов)
При избытке соли цинка в среде не происходило активации гена транспортера ZIP 10, локализованного в плазматической мембране (рис 10 А,Б)
350
5 S
» с.
О ~
с. (J
ж %
1 2 3 1 2 3 1 2 3
ч ^
исследованные гены
Б.
Рис. 10. Экспрессия генов ZA Tl, ZA Т1 (2), ZIP и PCS после 5-дневной (А) и 10-дневной (Б) обработки растений рапса цинком; 1 - Zn 500 мкМ, 2 - Zn 1000 мкМ, 3 - Zn 2500 мкМ, 4 - Zn 5000 мкМ.
Вероятно, первой реакцией растения в ответ на избыток ТМ является ограничение поступления ионов цинка внутрь клетки. Однако действие только данного механизма явно недостаточно. Следующим звеном в сложной цепи процессов является активация гена PCS (рис. 10 А). Цель такой активации может заключаться в связывании в цитозоле избытка цинка. В данном варианте опыта обнаружено, что оба гена тонопластных транспортеров, особенно ZAT1,
активируются в ответ на избыток соли цинка в среде Известно, что активное функционирование транспортеров в вакзюлярной мембране - основа детоксикации избыточных концентраций ионов внутри клетки (Hall, 2002)
При более длительном воздействии цинка происходит снижение активности экспрессии гена PCS и отсутствие дальнейшей активации обеих форм гена ZAT после 10 дней воздействия избытка цинка (рис 10 Б), что, возможно, отражает недостаточность исследованных нами отдельных элементов системы защиты на клеточном уровне от повышенных концентраций ТМ
В условиях недостатка цинка в питательном растворе наблюдалась 10 кратная активация экспрессии гена транспортера плазматической мембраны ZIP (Табл 3) Напротив, экспрессия тонопластных транспортеров цинка в листьях растений, выросших при недостатке цинка, была понижена В корнях экспрессия этих генов достоверно не отличалась от контроля Экспрессия PCS гена в отсутствии цинка была подавлена в корнях на 90% Однако особенно сильно повлиял недостаток цинка на содержание в корнях мРНК гена транспортера плазмалеммы ZIP - уровень его экспрессии был активирован в 80 раз
Таблица 3 Экспрессия генов ZAT1, ZAT1(2), ZIP и PCS в условиях недостатка цинка
вариант ZAT1 ZAT1(2) ZIP PCS
контроль 100 100 100 100
лист 32 ±4 69 ±4 1069±146 21±4
корень 86 ± 7 91 ±8 8196 ±740 10±3
Перенос растений в условия с резко повышенной концентрацией цинка изменяет картину экспрессии исследуемых генов Уже через 24 часа экспрессия гена ZIP 10 понижается не только по отношению к его уровню при недостатке цинка в среде, но и по отношению к контрольным значениям Наоборот, активность гена PCS резко повысилась в листьях Гены транспортеров,
локализованных в тонопласте - ZAT1 и ZAT1(2) - экспрессируются примерно на уровне контроля как в корнях, так и в листьях (Табл 4)
Таблица 4 Экспрессия генов ZAT1, ZAT1 (2), ZIP и PCS в условиях резкого повышения концентрации цинка до 1000 мкМ (Б)
вариант ZAT1 ZAT1(2) ZIP PCS
контроль 100 100 100 100
лист 112 ± 10 105 ±9 28 ±4 1075 ±46
корень 110 ± 8 118 ±24 13 ±2 16± 1
В дальнейшем было бы исключительно важно изучить влияние цинка не только на содержание индивидуальных мРНК, но и на содержание кодируемых ими белков, что может значительно углубить понимание механизма детоксикации тяжелых металлов в растениях
Одним из последствий негативного действия меди и цинка в повышенных концентрациях на растения является активация окислительного стресса Активные формы кислорода, образующиеся в клетке под действием ТМ, повреждают биологические мембраны, нарушают физиологические процессы (фотосинтез, дыхание, рост) Получение трансгенных растений с повышенной устойчивостью к возникающему окислительному стрессу (как неизбежному спутнику всех видов стресса) представляет собой перспективный научный подход для изучения механизмов адаптации растений к неблагоприятным факторам, в том числе и к действию ТМ В связи с этим была проведена работа по получению трансгенных растений рапса с повышенной экспрессией гена транс-фактора риса ОзМуЪ4 способного увеличивать устойчивость данных растений к неблагоприятным факторам, в частности, к действию тяжелых металлов в высоких концентрациях Получение и анализ трансгенных растений рапса
Трансформация рапса осуществлялась с использованием метода совместной культивации эксплантов (семядольных листьев) и агробактерий, нанесенных газоном на поверхность агаризованной среды в чашке Петри Нами
было проведено 7 трансформаций, в которых использовали около 3000 эксплантов. В конечном итоге было получено 450 регенерантов с учетом того, что трансформация осуществлялась двумя конструкциями. Из этих регенерантов около 130 оказалось жизнеспособными, при этом 96 были получены после трансформации конструкцией СОЯ15МуЬ4 и 34 после трансформации конструкциейрСАМуЬ4.
После первичного отбора регенерантов на канамицине, из их листьев была выделена ДНК. С помощью специфичных прайм еров проверялось присутствие как целевого (МуЬ4), так и селективного (прИГ) генов. Некоторые примеры наличия 0$МуЪ4 гена в геноме рапса после трансформации представлены на рисунке 11.
Рис. 11. Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных при использовании праймеров Myb. «М» - маркер молекулярных весов (1Kb), «К+» - положительный контроль, «К-» - отрицательный контроль, COR 10, COR 3, pGA 7 - линии трансформированных растений. Продукт ПЦР размером 427 пар нуклеотидов.
Результаты анализа части растений на наличие в геноме встраиваемого селективного гена nptll изображены на рисунке 12. Из всех трансгенных линий, несущих ген МуЪ4 под контролем промотора сог15, для дальнейшей работы была выбрана линия 10. С трансгенного растения линии 10 было получено около 600 семян. Из 40 семян были выращены растения, из листьев которых выделена ДНК и проведена полимеразная цепная реакция с использованием праймеров на целевой МуЪ4 и селективный ген nptll. Из 40 проанализированных растений первого поколения в 11 были обнаружены встроенные Myb4 и nptll гены.
к- К • м Ii-'-' !».»• 1 ПК1 < с.окш с:о» ti cum: рсдт p<;ix
■........ ::....... ... . ■ ............... .....:: .: ' ШШШ • ' •• IIB
• :: :. . : . . . ..... .... .
428 ».и.
Рис. 12. Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных при использовании праймеров Km. «М» - маркер молекулярных весов (1Kb), «К+» -положительный контроль, «К-» - отрицательный контроль, COR 9, COR 10, COR 11, COR 12, pGA 5, pGA 6, pGA 7, pGA8 - линии трансформированных растений. Продукт ПЦР размером 428 пар нуклеотдов.
Дальнейшая работа будет посвящена оценке влияния оверэкспрессии гена МуЪ4 на устойчивость трансгенных растений к ТМ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе была сделана попытка оценить токсичность солей меди и цинка для растений рапса сорта Вестар и приступить к изучению механизмов адаптации рапса к действию повышенных концентраций тяжелых металлов.
Как показали проведенные эксперименты, медь представляет собой гораздо более токсичный химический элемент, чем цинк. Сернокислая медь проявляет негативное действие на многочисленные исследованные физиологические параметры при значениях концентраций в среднем в 10 раз меньших, нежели концентрации цинка, оказывающих сходное ингибирующее действие.
Растения рапса накапливали медь в надземных органах лишь в ограниченных количествах. Напротив, накопление цинка происходило весьма активно. В отдельных экспериментах с сульфатом цинка растения рапса аккумулировали в листьях до 7 мг цинка / г сухой массы листа, что приближает рапс к гипераккумуляторам.
Токсичность исследованных ТМ проявляется в изменении водного статуса растений, в окислительном стрессе, выражающемся в усилении перекисного окисления липидов и деградации хлорофилла
При действии ТМ на растения большое значение в процессах адаптации к стрессорным условиям имеет регуляция осмотического потенциала в клетках растений Снижение осмотического потенциала при воздействии меди и цинка могло происходить из-за повышения концентрации осмотически активных веществ за счет уменьшения объема клеток Об этом свидетельствует уменьшение оводненности тканей в листьях Не исключено, однако, что активная осморегуляция происходила также благодаря поступлению или синтезу осмотически активных веществ На этот механизм указывают данные о повышении содержания свободного пролина в клетках растений под действием избытка ТМ в среде
В работе изучено влияние ТМ на экспрессию гена фермента синтеза фитохелатинов и некоторых мембранных транспортеров ионов металлов Оказалось, что клеточные механизмы детоксикации избытка ионов направлены на сохранение базового уровня экспрессии гена ZIP, кодирующего плазматический транспортер ионов ТМ Повышение поступления ионов цинка внутрь клетки ведет к пропорциональному увеличению уровня экспрессии гена, кодирующего фермент синтеза хелаторов ионов (PCS), а также генов транспортеров тонопласта (ZAT), определяющих секвестеризацию избытка ионов в вакуоли
В ответ на недостаток цинка в среде наблюдается резкая активация гена ZIP, особенно в корнях При этом снижается уровень экспрессии гена PCS При недостаточном количестве цинка гены тонопластных транспортеров (ZAT) обнаруживают тенденцию к снижению экспрессии, что также отражает отсутствие необходимости компартментации ионов в вакуоли При переносе растений, выращенных на питательной среде без цинка, в условия с его избытком, наблюдается сильное подавление уровня экспрессии гена ZIP на фоне активации гена PCS
Таким образом, в условиях стресса (избытка цинка в среде) обнаруживается сложная и скоординированная регуляция экспрессии генов рапса, отвечающих за поступление и связывание ионов ТМ
Поскольку соли меди и цинка вызывают у растений окислительный стресс, то нами были получены трансгенные растения рапса, несущие ген транс-фактора риса OsMyb4, который предотвращает негативный эффект окислительного стресса и, таким образом, может повысить устойчивость растений рапса к действию данных ТМ В дальнейшем будет изучено влияние повышенной экспрессии OsMyb4 гена на степень устойчивости трансгенных растений к неблагоприятным факторам среды, прежде всего, повышенным концентрациям тяжелых металлов
ВЫВОДЫ
1 Для растений рапса установлена значительно более высокая токсичность сернокислой меди в сравнении с сернокислым цинком при действии этих ТМ на прорастание семян, рост проростков и молодых растений
2 Растения рапса накапливают относительно небольшие количества меди в надземных органах, при этом способны аккумулировать в листьях до 7,5 мг цинка на 1 г сухой массы, что приближает рапс к группе растений-гипераккумулятсров
3 Токсический эффект солей меди и цинка проявляется в нарушении водного статуса листьев рапса и в активации окислительного стресса
4 В процессе адаптации к избытку ТМ существенная роль принадлежит регуляции осмотического потенциала и аккумуляции в клетках листьев рапса свободного пролина - совместимого осмолита и антиоксиданта
5 У рапса клеточные механизмы детоксикации избытка цинка основаны на сбалансированной активации генов фитохелатинсинтазы (PCS) и транспортеров тонопласта (ZAT1 и ZAT1(2)) при сохранении базового уровня экспрессии гена транспортера плазмалеммы (ZIP)
6 Ответом растений на недостаток цинка является резкая активация экспрессии гена плазматического транспортера (ZIP) при снижении экспрессии генов вакуолярных транспортеров (ZAT1 и ZAT1(2)) При резком повышении содержания цинка в среде подавляется экспрессия гена транспортера плазмалеммы (ZIP) и активируется ген фитохелатинсинтазы (PCS), что ограничивает проникновение ионов цинка в клетку и обеспечивает связывание их избытка в цитозоле
7 Получены и проанализированы трансгенные растения рапса, содержащие ген транс-фактора риса (OsMyb4), способного повышать устойчивость растений к ТМ, прежде всего, за счет снижения негативного эффекта на растения окислительного стресса
Список работ по материалам диссертации
1 Радионов Н В , Королева М А, Холда О А, Кузнецов В В , Данилова С А Повышение активности фермента супероксиддисмутазы в трансгенных растениях ячменя (Hordeum vulgare L), содержащих ген Fe-СОД из Arabidopsis thaliana II VI Международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» Пущино, 2005, с 359-360
2 Данилова С А, Радионов Н В , Холда О А, Белозерова Н, С , Кузнецов В В Особенности применения селективного гена неомицинфосфотрансферазы II (npt II) для отбора трансгенных растений ячменя // Материалы III съезда Общества биотехнологов России им ЮА Овчинникова Москва, 2005, с 106107
3 Данилова С А, Демиденко А В , Радионов Н В, Кузнецов В В Повышение устойчивости кукурузы (Zea mays L) к окислительному стрессу за счет введения гена Fe-СОД из Arabidopsis thaliana И Сборник тезисов «Международная конференция Современная физиология растений от молекул до экосистем» Сыктывкар, 2007, с 182-183
4 Радионов Н В , Вагун И В , Кислова У JI, Юдин А В , Холодова В П , Кузнецов Вл В Устойчивость рапса к действию высоких концентраций солей
меди и цинка // Международная конференция «Современная физиология растений от молекул до экосистем» Сыктывкар, 2007, с 335-337
5 Радионов Н В , Вагун И В , Паскарел Н К, Кислова У Л, Ралдугина Г Н, Маттана М, Ваннини К , Кузнецов Вл В Трансформация рапса и табака геном транс-фактора (ОъМуЪ4) с целью получения трансгенных растений, устойчивых к неблагоприятным факторам // Международная конференция «Современная физиология растений от молекул до экосистем» Сыктывкар, 2007, с 337-339
6 Радионов Н В , Волков К С, Холодова В П Сравнительный анализ устойчивости растений рапса к повышенным концентрациям меди и цинка // Вестник РУДН, 2007, №4, с 21-30
Подписано в печать 15 04 2008 Печать трафаретная
Заказ № 275 Тираж 50 экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Радионов, Никита Викторович
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Приспособления растений к высоким концентрациям тяжелых металлов
1.1.1. Биологическая роль меди и цинка в растениях
1.1.2. Влияние высоких концентраций тяжелых металлов на растения
1.1.3. Клеточные механизмы детоксикации тяжелых металлов
1.1.3.1. Микориза
1.1.3.2. Клеточная стенка и экссудаты корня
1.1.3.3. Плазматическая мембрана
1.1.3.4. Белки теплового шока
1.1.3.5. Фитохелатины
1.1.3.6. Органические и аминокислоты
1.1.3.7. Металлотионеины
1.1.3.8. Вакуолярная компартментация
1.1.4. Характеристика семейств транспортеров металлов растений
1.1.4.1. АТФазы тяжелых металлов: СРх-АТФазы
1.1.4.2. ABC транспортеры
1.1.4.3. Nramp
1.1.4.4. CDF
1.1.4.5. ZIP
1.1.4.6. Катион/Н антипортеры
1.1.4.7. CTR
1.1.4.8. Другие предполагаемые транспортеры металлов 3О
1.2. Транскрипционные факторы
1.2.1. Общая характеристика
1.2.1.1. Определение
1.2.1.2. Функционирование
1.2.1.3. Механизмы действия
1.2.1.4. Строение
1.2.2. MYB-факторы в растениях
1.3. Трансгенные растения 40 1.3.1. Методы получения трансгенных растений
1.3.1.1. Методы прямого переноса генов
1.3 Л.2. Метод трансформации растений с помощью ^ агробактерий
1.3.2. Основные направления использования трансгенных растений
ГЛАВА 2.ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объект исследований
2.2. Выращивание растений рапса в водной культуре
2.2.1. Питательный раствор. Состав и способ приготовления
2.2.2. Посев
2.2.3. Пересадка
2.3. Условия проведения опытов
2.4. Измерение всхожести семян
2.5. Измерение длины корня
2.6. Измерение оводненности листьев рапса
2.7. Измерение биомассы
2.8. Измерение площади листа
2.9. Удержание воды
2.10. Определение осмотического потенциала
2.11. Определение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ)
2.12. Определение содержания хлорофилла
2.13. Определение содержания свободного пролина
2.14. Определение содержания ионов металлов в ткани растений
2.15. Выделение тотальной ДНК
2.16. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 60 2.16.1. Подбор праймеров для полимеразной цепной реакции
2.17. Электрофорез в агарозном геле
2.18. Выделение тотальной растительной РНК с помощью триозола
2.19. Электрофорез РНК в агарозном геле
2.20. Обратная транскрипция 65 2.20.1. Обработка результатов ПЦР после обратной транскрипции
2.21. Трансформация рапса
2.21.1. Приготовление компетентных клеток агробактерий
2.21.2. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК
2.21.3. Выращивание бактерий на агаризованной LB среде
2.21.4. Агробактериальная трансформация рапса
2.22. Характеристика конструкций COR15МуЬ4 и pGAMyb
Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиологические и молекулярные ответные реакции растений рапса на воздействие солей меди и цинка"
XX век с полным правом можно считать временем небывалого технологического прорыва в истории человечества. Научно-технический прогресс позволил человеку подчинить своей воле и своим целям множество природных явлений. Машины стали играть определяющую роль в жизни простого человека. Однако бурный рост промышленности не прошел незамеченным для окружающей среды. Вклад антропогенной составляющей в негативном влиянии на природные экосистемы сейчас неизмеримо выше, чем 100 и даже 50 лет назад. Одним из факторов, уменьшающих площадь земель, пригодных для нужд сельского хозяйства, является их загрязнение высокими концентрациями тяжелых металлов (ТМ) вследствие активной промышленной деятельности человека (Ильин, 1991; Dan et al., 1999; Lombi et al., 2001; Schuetzenduebel et al., 2002).
Термин "тяжелые металлы" связан с высокой, относительной атомной массой. Эта характеристика обычно отождествляется с представлением о высокой токсичности. Одним из признаков, которые позволяют относить металлы к тяжелым, является их плотность. Согласно современным представлениям, к ТМ отнесены элементы, плотность которых более 5 г/см . Если исходить из этого показателя, тяжелыми следует считать 43 из 84 металлов Периодической системы элементов. Число же опасных загрязнителей, если учитывать токсичность, стойкость и способность накапливаться во внешней среде, а также масштабы распространения указанных металлов, значительно меньше (Ильин, 1991).
Прежде всего, представляют интерес те металлы, которые наиболее широко и в значительных объемах используются в производственной деятельности и в результате накопления во внешней среде представляют серьезную опасность для живых организмов. К ним относят - свинец, ртуть, кадмий, цинк, висмут, кобальт, никель, медь, олово, сурьму, ванадий, марганец, хром, молибден и мышьяк (Кабата-Пендиас А., Пендиас X., 1989).
Естественное (фоновое) содержание ТМ в незагрязненной атмосфере составляет тысячные и десятитысячные доли микрограмма на кубический метр и ниже. Такие уровни в современных условиях на сколько-нибудь обжитых территориях практически не наблюдается. Тем не менее, следует отметить, что существуют и естественные геохимические провинции, характеризующиеся изначально высоким содержанием некоторых ТМ, прежде всего - цинка, меди и никеля, поскольку данные металлы могут содержаться в относительно высоких количествах в почвообразующих породах (Важенина, 1983). Необходимо также упомянуть, что такие металлы как медь и цинк являются так называемыми эссенциальными элементами, т.е. необходимыми в небольших количествах для нормальной деятельности всех живых организмов.
Медь и цинк относятся к рассеянным химическим элементам, содержащимся в горных породах в небольших количествах. Так, по данным Виноградова (1962), содержание меди в земной коре в целом составляет 47 мг/кг, цинка — 83 мг/кг. Наиболее богаты солями меди и цинка осадочные горные породы - глины, суглинки, песчаники и пр. Одними из основных источников техногенного поступления меди и цинка в почвы являются предприятия черной и, особенно, цветной металлургии.
Валовое количество меди и цинка в почвах, загрязненных металлургическими предприятиями может достигать внушительных размеров. Например, Важенина (1983) сообщает, что в слое почвы 0 - 5 см вблизи металлургического предприятия обнаружено содержание цинка до 400 мг/кг, меди до 8500 мг/кг, а в почвах прилежащих к цинкоплавильному предприятию содержание цинка приближалось к 10 000 мг/кг. Примерно половина количества меди и цинка в пахотном горизонте представлена подвижной их фракцией, в подпахатной толще ее доля значительно меньше -17-19%. Из этого можно сделать вывод, что цинк и медь, попадая в почву в металлической форме и в форме оксидов, достаточно быстро приобретают высокую мобильность.
Различные виды растений обладают разной устойчивостью к действию ТМ! Некоторые обладают конститутивной устойчивостью к повышенным концентрациям ТМ и, благодаря этому, способны произрастать на контаминированных почвах. Подобные свойства обеспечиваются функционированием специализированных механизмов на различных уровнях организации, как клеточном, так и органном, тканевом и даже организменном. Основная задача всех этих механизмов - изоляция, тем или иным способом, токсичных концентраций металлов от метаболически активных компартментов клетки. Это может осуществляться либо компартментацией в менее активные части, либо, в отдельных случаях, препятствием поступлению катионов токсичных металлов в растение (связывание корневыми экссудатами, клеточной стенкой и пр.).
Глубокое понимание функционирования подобных механизмов будет способствовать расширению сферы применения растений в качестве альтернативного решения проблемы загрязнения-почв тяжелыми металлами. Таким образом, понимание биохимической и физиологической природы устойчивости растений к избытку тяжелых металлов в настоящее время является одним из приоритетных направлений экспериментальной физиологии растений.
Известно, что некоторые виды растений способны накапливать ТМ. Такие растения относят к классу аккумуляторов. Среди растений аккумуляторов выделяют особую группу — гипераккумуляторы, способную не только успешно расти на контаминированных тяжелыми металлами почвах, но при этом накапливать значительные количества ионов ТМ в надземных органах. Уровень накопления металла растением, который позволяет отнести тот или иной вид к гипераккумуляторам не является постоянной величиной, но зависит, прежде всего, от конкретного ТМ. Brooks et al (1977), впервые предложил термин гипераккумулятор применительно к растениям, накапливающим более 1000 мкг/г сухой массы Ni. Данный порог накопления различен для разных металлов, так, например, для кадмия он составляет 100 мкг/г, для меди 1000 мкг/г, а для цинка 10 ООО мкг/г (Baker and Brooks, 1989). Такие величины были предложены на основании данных о среднем содержании того или иного металла в надземной массе растений не гипераккумуляторов, и превышают таковое на один порядок (Salt and Kramer, 2000). Около 400 видов растений гипераккумуляторов были найдены в 45 различных семействах, но наибольшее их число относится к семейству Brassicaceae. Среди всех металлов первенство по количеству видов аккумуляторов принадлежит никелю, лишь 30 видов приходится на гипераккумуляторы Со, Си, Zn (Reeves and Baker, 1999).
Использование растений с целью1 восстановления загрязненных тяжелыми металлами почв называется фиторемедиацией (Chaney et al., 1997). Главным ее недостатком является относительно небольшая биомасса большинства растений гипераккумуляторов и низкая скорость их роста. Поэтому отдельный интерес представляет изучение таких видов растений, в которых соединяются 2 ключевых параметра - способность, накапливать ТМ в надземных органах в значительных концентрациях и способность формировать значительную биомассу. Исходя из этих обстоятельств, в качестве объекта исследований в данной работе был выбран рапс - Brassica napus L. Рапс относится к роду капуст (Brassica L.J, семейству капустных {Brassicaceae), как и большинство гипераккумуляторов. Рапс обладает мощной биологией и способен формировать большую надземную часть, в которой могут накапливаться ионы металлов.
В последние десятилетия все большее значение приобретает использование методов молекулярной биологии в классической физиологии растений. Одним из направлений нового подхода к решению задач, стоящих перед исследователями адаптационных механизмов и адаптационных процессов, протекающих в растениях при действии повышенных концентраций. ТМ, является создание трансгенных растений. Трансгенные растения представляют собой удобную исследовательскую модель для фундаментальной науки. Введение в геном быстрорастущих высокопродуктивных культур частей генома растений гипераккумуляторов посредством методов молекулярной биологии позволит глубже проникнуть в суть механизмов, лежащих в основе адаптационного процесса и, следовательно, плотнее приблизиться к решению данной проблемы (Brown et al., 1995). Широко применяется также использование в качестве объектов для трансформации классических модельных растений - арабидопсиса {Arabidopsis haliana L.J и табака (Nicotiana tabacam h.).
Использование трансгенных растений в качестве модели позволяет выявлять гены, функциональная активность которых влияет на устойчивость растений к неблагоприятным факторам. Благодаря усилению экспрессии, либо замолканию определенных генов у трансгенных растений можно оценивать их роль в структуре механизмов адаптации, их вклад в общую устойчивость растений, степень их участия в адаптационных процессах. Все сказанное выше позволяет надеяться, что трансгенные растения внесут определенный вклад в понимание сложной переплетенной сети механизмов адаптации растений к стрессорным факторам, а, следовательно, и сыграют роль в определении потенциальных звеньев оптимизации механизмов адаптации.
Данный подход, в свете совершенствования молекулярных методов в биологии, приобретает все большую актуальность. Точечное перенесение части свойств, характерных для растений гипераккумуляторов к их менее устойчивым коллегам, благодаря молекулярной биологии, позволяет создавать растения с уникальным набором характеристик. В данной области весь поток проводимых работ можно разделить на 2 большие группы. В одной из них в качестве целевых, встраиваемых в геном растения-реципиента, используются гены, напрямую участвующие в детоксикации ионов металлов (например, гены хелаторов ионов). В другой группе используют гены, продукты которых (т.н. транс-факторы) регулируют экспрессию большого числа генов, задействованных в ответах на стресс.
В представленной работе объектом агробактериальной трансформации был выбран рапс (Brassica napus L., сорт Вестар), благодаря хорошим регенерационным свойствам и оптимизированной процедуре трансформации данного сорта. В качестве целевого был использован ген риса (OsMyb4), кодирующий транс-фактор MYB.
Транскрипционные факторы в целом оказывают заметное влияние на жизнедеятельность растений. Они являют собой тонкий и точный механизм управления мириадами процессов, единовременно протекающих в растении. Семейство транскрипционных факторов MYB является самым крупным по составу среди всех известных на сегодняшний день у растений. Только у Arabidopsis идентифицировано 135 генов, относящихся к этому семейству (Hai et.al., 2007). Данное семейство влияет на многие процессы в клетках растений. Благодаря своей численности, тканевой специфичности экспрессии, возможности взаимодействия с другими транскрипционными факторами, дифференциальной экспрессии на разных стадиях развития растения, продукты МуЪ генов являются чрезвычайно интересными объектами для исследований. Получение и изучение трансгенных растений с оверэкспрессией МуЪ гена способно дополнить существующие данные о роли этого интересного семейства в клетках растений.
Из литературы известно, что белки данного семейства участвуют в ответах растения на неблагоприятные факторы (засоление, засуху, низкие темпаратуры и др.) (Vailleau F. et al, 2002., Abe H. et al., 2003., Denekamp M. et al., 2003., Nagaoka S. et al., 2003), влияют на синтез вторичных метаболитов (Borevitz J.O. et al., 2000;, Jin H. et al., 2000., Nesi N. et al., 2001., Baudry A. et al.,-2004), контролируют клеточный морфогенез (Lee M.M. et al., 1999, 2001., Higginson T. et al., 2003), регулируют формирование меристем, развитие цветков и семян (Penfield S. et al., 2001., Schmitz G. et al., 2002., Shin B. et al., 2002., Steiner-Lange S. et al., 2003), контролируют клеточный цикл (Ito M. et al., 2001., Araki S. et al., 2004), а также участвуют в путях передачи сигнала в ответ на действие гормонов и света (Gocal G.F. et al., 2001., Seo H.S. et al., 2003., Newman L. J. Et al., 2004). На примере Arabidopsis показано, что высокий уровень экспрессии гена OsMyb4 увеличивает устойчивость растений к низким положительным, а также отрицательным температурам (Vannini С. et al., 2004). В другой работе показано, что оверэкспрессия гена, использованного в нашей работе для трансформации рапса, обеспечивает не только устойчивость к низкотемпературному стрессу, но также и к засухе. Обнаружено, что у трансгенных растений уровень мРНК пролинсинтазы и пролиндегидрогеназы был соответственно выше и ниже контрольных значений. MYB4 объединяет активацию множества компонентов системы ответов на стресс (Mattana et.al., 2005).
Цель и задачи исследования.
Цель диссертационной работы заключалась в том, чтобы установить степень повреждающего действия на растения рапса (.Brassica napus L.) сорта Вестар повышенных концентраций солей меди и цинка, оценить роль некоторых генов системы защиты от их избытка и получить трансгенные растения этого сорта, несущие ген транс-фактора MYB4, способный обеспечить повышение устойчивости к этим ТМ.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1. Установить диапазон концентраций солей меди и цинка, в пределах которых возможно прорастание семян и рост проростков рапса;
2. Оценить степень ингибирования тяжелыми металлами роста и накопления биомассы молодых растений рапса;
3. Выявить существенные звенья физиологических процессов, подверженных негативному действию ТМ;
4. Из числа основных механизмов устойчивости растений к ТМ проверить на уровне экспрессии генов роль в реализации устойчивости некоторых мембранных транспортеров и фермента синтеза фитохелатинов;
5. Получить и проанализировать трансгенные растения рапса, содержащие ген транс-фактора риса OsMyb4, продукт которого способен увеличивать устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды.
Научная новизна.
Примененный в данной работе комплексный подход позволил не только оценить устойчивость рапса к действию повышенных концентраций ТМ по основным физиологическим показателям, но также и проанализировать на уровне экспрессии генов участие отдельных звеньев клеточных механизмов в детоксикации ионов металлов.
Практическая значимость.
Рапс {Brassica napus L.), выбранный в данной работе в качестве объекта, является культурой универсального назначения. Это один из главных источников сырья для производства пищевого растительного масла, жмыхов, шротов, муки и зеленой массы для кормов, а рапсовое масло — важный резерв производства биотоплива. Исследование механизмов адаптации такой ценной сельскохозяйственной культуры представляет собой актуальную проблему не только фундаментальной, науки, но и прикладной физиологии растений.
Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Радионов, Никита Викторович
ВЫВОДЫ
1. Для растений рапса установлена значительно более высокая токсичность сернокислой меди в сравнении, с сернокислым цинком при действии этих ТМ на прорастание семян, на рост проростков и молодых растений.
2. Растения рапса накапливают относительно небольшие количества меди в. надземных органах, при этом способны аккумулировать в листьях до 7,5 мг цинка на 1 г сухой массы, что приближает рапс к группе растений-гипераккумуляторов.
3'. Токсический, эффект солей меди и цинка проявляется в нарушении водного статуса листьев рапса и в активации окислительного стресса.
4. В процессе адаптации к избытку ТМ существенная роль принадлежит регуляции осмотического потенциала и аккумуляции в клетках листьев рапса свободного пролина — совместимого осмолита и антиоксиданта.
5. У рапса клеточные механизмы детоксикации избытка цинка основаны на сбалансированной активации генов фитохелатинсинтазы (PCS) и транспортеров тонопласта (ZAT1 и ZAT1(2J) при сохранении базового уровня экспрессии гена транспортера плазмалеммы (ZIP).
6. Ответом растений на недостаток цинка является резкая активация экспрессии гена плазматического транспортера (ZIP) при снижении экспрессии генов вакуолярных транспортеров (ZAT1 и ZAT1(2)). При резком повышении содержания цинка в среде подавляется экспрессия гена транспортера плазмалеммы (ZIP) и активируется ген фитохелатинсинтазы (PCS), что ограничивает проникновение ионов цинка в клетку и обеспечивает связывание их избытка в цитозоле.
7. Получены и проанализированы трансгенные растения рапса, содержащие ген транс-фактора риса (OsMyb4), способного повышать устойчивость растений к ТМ, прежде всего, за счет снижения негативного эффекта на растения окислительного стресса.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Одним из негативных последствий деятельности человека является загрязнение почв, потенциально пригодных для- сельского хозяйства, тяжелыми металлами (ТМ). За последние годы роль данного абиотического фактора антропогенной природы заметно возросла. Существует несколько различных направлений решения обозначенной проблемы.
Традиционный путь - использование различных сортов с/х растений, устойчивых к повышенному содержанию ТМ в почве. Однако, как правило, различия в устойчивости сортов одного вида растений невелики. Значительно более высокой устойчивостью к ТМ обладают некоторые виды, не используемые в сельском хозяйстве. Среди них особенно устойчивы так называемые гипераккумуляторы. На сегодняшний день известно более 400' видов растений-гипераккумуляторов в 45 различных семействах, но наибольшее их число относится* к семейству Brassicaceae (Reeves and Baker, 1999). Растения-гипераккумуляторы способны не только успешно расти на контаминированных тяжелыми металлами почвах, но при этом накапливать у значительные количества ионов ТМ в надземных органах. Конститутивная устойчивость, ярко выраженная у подобных видов, сформировалась в зонах природного обогащения почв ТМ. Сравнительный анализ гипераккумуляторов с близкими, но менее устойчивыми видами представляет основу изучения механизмов устойчивости и путей формирования защитных механизмов в ходе онтогенетической адаптации. Очевидно, что способность растений произрастать на загрязненных почвах обеспечивается функционированием специализированных механизмов, основная цель которых - изоляция токсичных ионов металлов от основных физиологических путей клетки. Всестороннее изучение данных механизмов, понимание их сути может послужить основой получения сортов с/х растений, устойчивых к загрязнению почв ТМ.
Однако разрабатывается и альтернативная технология, основанная на ' использовании растений с целью очистки, восстановления и возвращения в с/х оборот загрязненных ТМ почв называется фиторемедиацией (Cha'ney et al., 1997). Основное место в этом процессе отводится видам растений-гипераккумуляторов, а именно, их способности концентрировать ТМ в надземной массе. Однако существенным недостатком растений-гипераккумуляторов, препятствующим успешному использованию их в решении проблемы контаминированных почв, является относительно небольшая биомасса и низкая скорость роста этих растений. Поэтому специальный интерес представляет изучение видов растений, сочетающих в себе как способность накапливать значительные количества ТМ в надземных органах, так и способность формировать значительную биомассу. Одним из возможных кандидатов на эту роль может служить представитель семейства Brassicaceae — рапс (.Brassica napus L.J. Рапс является ценным культурным растением, которое используется человеком уже более 4 ООО лет. Рапс — культура универсального назначения. Он используется в пищевой, мыловаренной, парфюмерной, полиграфической, лакокрасочной, химической промышленности и др., является ценной кормовой культурой. Высока и фитосанитарная роль рапса в оздоровлении почвы. Масло рапса представляет собой важный резерв производства биотоплива (Пыльнев В.В. с соавт, 2005). Всестороннее изучение данного объекта, характеристика его устойчивости к неблагоприятным факторам, представляют собой актуальную проблему прикладной науки. Повышение устойчивости рапса к стрессорным факторам, увеличение всхожести семян, повышение урожайности, изменение химического состава рапсового масла в сторону повышения его ценности, усиление устойчивости к болезням и вредителям — основные прикладные направления фундаментальной науки при изучении рапса.
В ряде исследований было изучено действие высоких концентраций кадмия, никеля, цинка, меди, свинца на растения рапса (Mishra and Singh, 2000, Baryla et.al., 2001, Youssef et.al., 2005, Xiong and Wang, 2005, Crist et. al., 2004, Gasic and Korban, 2007, Herrero et.al., 2003, Nouairi et. al., 2006, Muthukumar et.al., 2007). В данной работе была сделана попытка оценить токсичность солей меди и цинка для растений рапса сорта Были заложены основы изучения механизмов адаптации растений рапса к; действию повышенных концентраций тяжелых металлов.
Как показали проведенные эксперименты, медь представляет собой гораздо более токсичный химический элемент, нежели цинк. Сернокислая-медь проявляет негативное действие на многочисленные исследованные физиологические параметры при значениях концентраций в среднем в 10 раз меньших, нежели концентрации цинка, оказывающих: сходное ингибирующее действие. Более высокая токсичность меди по сравнению? с: цинком выявлялась как при изучении прорастания семян рапса, так и при росте проростков и молодых растений.
При оценке степени влияния: ТМ на растения одним из показателей является способность растений накапливать ионы данных металлов в-надземных, либо . подземных органах. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что растения рапса не накапливают в своих; надземных органах медь. Максимальное содержание меди в листьях рапса» при ее избытке во внешней среде не превосходило уровень контрольных растений более чем в 2 раза. Совершенно иная картина наблюдалась в опытах с цинком. В отдельных экспериментах растения рапса аккумулировали в листьях до 7 мг цинка в 1 г сухой массы листа. При этом максимальная концентрация цинка в опытах достигала 5 мМ. Если следовать классификации, предложенной Baker and Brooks (1989), в которой; к растениям-гипераккумуляторам цинка можно отнести те, которые способны; накапливать 10 ООО мкг металла на 1 г сухой массы, то по этому показателю рапс приближается к данной группе растений.
Токсичность исследованных ТМ проявляется в изменении водного'^ статуса, как у отдельных органов, так и на уровне целого растения. Сильнее на нарушение водного статуса в клетках влияет медь,, нежели цинк. Еще одним явлением, через которое проявляется токсическое действие меди и цинка, является вызываемый ими окислительный стресс. Повышенное образование активных форм кислорода (АФК), характерное при окислительном стрессе, проявляется в. усилении перекисного окисления липидов и деградации хлорофилла.
При подобном действии повышенных концентраций ТМ на растения большое значение в процессах адаптации к стрессорным условиям имеет регуляция осмотического потенциала в клетках растений. Как известно, осмотический потенциал связан прямой зависимостью с концентрацией' растворенного вещества — с увеличением этой концентрации осмотический потенциал становится все более отрицательной величиной (Кузнецов, Дмитриева, 2006). При высокой концентрации ионов металлов в среде, когда-водный потенциал вне клетки ниже, чем внутри, клетке необходимо-понизить свой водный потенциал до уровня, который бы не позволял воде выходить из клетки по градиенту. Снижение осмотического потенциала при воздействии использованных концентраций меди и цинка могло происходить из-за повышения концентрации осмотически активных веществ за счет уменьшения объема клеток. Об этом свидетельствует уменьшение оводненности тканей в листьях. Не исключено, однако, что активная осморегуляция происходила также благодаря поступлению или синтезу осмотически активных веществ (низкомолекулярных неорганических ионов или органических соединений). На этот механизм указывают данные о повышении содержания свободного пролина в клетках растений под действием избытка ТМ в среде, причем количество пролина находилось в прямой зависимости с интенсивностью и продолжительностью воздействия^ стрессорного фактора.
Увеличением содержания пролина (а также свободных аминокислот, бетаинов и сахароспиртов) в цитозоле клетка снимает вопрос возможного нарушения осмотического равновесия между двумя основными компартментами клетки — вакуолью и цитоплазмой при аккумуляции1 в вакуоли неогранических ионов (Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И., 1999)
Изучение1 различных физиологических параметров при исследовании общей устойчивости растений, механизмов адаптации на уровне органов, тканей, либо целого растения представляет собой важную часть в работе. Однако современные молекулярные методы позволяют глубже заглянуть в сложную систему отношений и взаимосвязей внутри клетки. Благодаря достижениям молекулярной биологии появилась возможность рассмотреть непосредственное участие различных генов, а также их продуктов' в механизмах устойчивости и адаптации растений к неблагоприятным факторам различной природы. Как известно, регуляция синтеза бесконечного множества ферментов, катализирующих мириады протекающих в клетке реакций может осуществляться на нескольких уровнях: транскрипционном, посттранскрипционном и на уровне трансляции (Глик Б., Пастернак Дж, 2002). Одним из наиболее эффективных способов регуляции является зависимое изменение уровня экспрессии генов, то есть содержания мРНК генов в клетках.
В данной работе была сделана попытка проверить на уровне' экспрессии генов роль в реализации устойчивости ферментов синтеза' фитохелатинов и некоторых мембранных транспортеров ионов металлов. Для реализации поставленной задачи базе данных NCBI были найдены последовательности генома рапса, гомологичные по нуклеотидной и сходные по белковой последовательности с генами Arabidopsis. Продукт одного гена (ZIP) представлял собой транспортер цинка, локализованный в. плазматической мембране и выполняющий функции переноса ионов данного эссенциального элемента внутрь клетки. Другой ген (ZAT) кодировал белок, расположенный в вакуолярной мембране с функцией переноса ионов цинка из метаболически активного цитозоля внутрь вакуоли. Третий ген (PCS) кодировал фермент синтеза фитохелатинов, расположенный в цитоплазме. Таким образом, была изучена экспрессия генов в различных условиях доступности цинка, характеризующих путь ионов из внешней среды, внутрь клетки — от плазматическиой мембраны, сквозь цитоплазматическое пространство в вакуоль.
Оказалось, что при действии избыточных концентраций цинка в среде в течение длительного периода клеточные механизмы детоксикации избытка ионов, неизбежно поступающих из окружающей среды в клетку, направлены на сохранение базового уровня экспрессии гена ZIP, кодирующего плазматический транспортер ионов данного ТМ. Очевидно, что в условиях избыточного снабжения клеток цинком активации его транспортеров на клеточной мембране не наблюдается, так же, как не наблюдается и резкого снижения уровня его экспрессии. В плазматической мембране существует множество неспецифических транспортеров, каналов и пор, посредством которых, элементы, в том числе и металлы различной валентности, способны проникать внутрь клетки, минуя запреты, наложенные специфическими переносчиками. При этом наблюдалась сбалансированная активация генов фитохелатинсинтазы (PCS) и вакуолярных транспортеров цинка (.ZAT). Полученные данные укладываются в картину, полученную при рассмотрении их функциональных обязанностей. Повышение поступления ионов цинка внутрь клетки ведет к пропорциональному увеличению уровня экспрессии генов, кодирующих хелаторы ионов (PCS), а также генов транспортеров тонопласта, определяющих секвестеризацию избытка ионов в вакуоли. Отличительным моментом является функциональное разделение двух генов вакуолярных транспортеров - ген ZAT1 активируется только при действии высоких концентраций ZnS04 (2500, 5000 мкМ), тогда как экспрессия гена ZATI(2) выражена уже под влиянием сернокислого цинка в концентрациях 500 и 1000 мкМ.
При более длительном воздействии повышенных концентраций цинка на растения (10 дней), общая картина экспрессии исследуемых генов немного-изменяется — наблюдается снижение активности гена PCS, а также не происходит дальнейшего увеличения экспрессии генов тонопластных транспортеров, тогда как активность гена ZIP достоверно не отличается от уровня контрольных растений. Вероятно, это свидетельствует об известной ограниченности исследуемых механизмов в детоксикации избыточного количества ионов цинка. Очевидно, что данные гены не единственные, участвующие в подобных сложных реакциях. Они являются частью сложной системы и до определенной степени эффективны.
В ответ на недостаток цинка в среде наблюдается резкая активация гена ZIP, особенно в корнях. И это неудивительно, поскольку растение нуждается в поглощении тех следовых количеств, которые в любом случае присутствуют в окружающей среде. Также логично снижается уровень экспрессии гена PCS, так как в отсутствии* субстратов хелаторы не выполняют свою функцию. При недостаточном количестве цинка гены тонопластных транспортеров' (ZAТ) обнаруживают тенденцию к снижению экспрессии, что также отражает отсутствие необходимости компартментации ионов в вакуоли.
При резкой смене условий доступности цинка, а именно при переносе растений, выращенных на питательной среде без цинка в условия с его избыточным содержанием, наблюдается сильное подавление уровня экспрессии гена ZIP на фоне активации гена PCS. Данные изменения позволяют оперативно ограничить проникновение избытка ионов цинка внутрь клетки, а в случае их высокого содержания в цитозоле — обеспечить хелатирование и ограничение реакционной способности для ограждения важных клеточных механизмов и реакций от их негативного влияния.
Таким образом, становится очевидным, что в условиях стресса (избытка цинка в среде) обнаруживается сложная и скоординированная регуляция экспрессии, генов рапса, отвечающих за поступление и связывание ионов ТМ.
Применение методов молекулярной биологии при исследовании механизмов адаптации растений к неблагоприятным внешним факторам не исчерпывается рассмотрением активности различных генов, участвующих в подобных механизмах, либо отвечающих за увеличение устойчивости растений. Другим важным и перспективным направлением представляется использование методов переноса чужеродных генов в клетки реципиента и дальнейшее встраивание их в геном. Получение и, что особенно важно, применение трансгенных растений должно ограничиваться на сегодняшний день рамками фундаментальной науки. Трансгенные растения представляют собой уникальную модельную систему для изучения влияния отдельных элементов сложной многокомпонентной сети механизмов устойчивости и адаптации растений к стрессорным условиям. Закрепление за растениями, не относящимися к группе гипераккумуляторов, специфических свойств, изменяющих их физиологию настолько, что они становятся способны произрастать на почвах, содержание металлов в которых не позволяет использовать их в сельском хозяйстве, является перспективным^ направлением молекулярной биологии и классической физиологии растений.
В данной работе была сделана попытка получить трансгенные растения рапса с целью изучения^ тех изменений, которые неизбежно будут вызваны внедрением в его геном интересующей конструкции. В качестве целевого гена, используемого в трансформации рапса с помощью агробактерий, послужил ген риса (OsMyb4\ кодирующий транскрипционный фактор MYB, играющий важную роль в транскрипционном контроле экспрессии генов у высших растений. Основными функциями представителей семейства транс-факторов Myb в клетках являются контроль формы клетки (Oppenheimer D.G. et al.,1991), участие в путях передачи сигнала салициловой кислоты (Raffaele S. et al., 2006), АБК, гиббереллинов и жасмоновой кислоты (Lee M.W. et al., 2001), участие в ответах растения на неблагоприятные факторы (Feng С. et al., 2004, Cominelli Е. et al., 2005), участие в метаболизме фенилпропаноидов (Cocciolone S.M. et al., 2001, Goicoechea M. et al., 2005) и др. Продукт введенного гена риса (OsMyb4) увеличивает устойчивость растений к неблагоприятным факторам (к низким температурам и засухе (Vannini С. et al., 2004). Поскольку показано, что оверэкспрессия данного гена снижает последствия негативных эффектов окислительного стресса, возникающего при неблагоприятных факторах среды, в том числе и при влиянии солей тяжелых металлов, можно было ожидать, что трансгенные растения рапса, экспрессирующие чужеродный ген МуЪ4 способны проявлять повышенную устойчивость к действию солей меди и цинка.
Успешность трансформации определялась сочетанием нескольких факторов, играющих ключевую роль в агробактериальной трансформации. Использованный в качестве объекта сорт рапса (Вестар, канадской селекции) обладает ярко выраженными регенерационными свойствами и тотипотентностью клеток, что обеспечивает успех трансформации на одном из самых сложных и лимитирующих этапов — образование каллуса и-формирование из клеток каллуса одиночных трансгенных растений. Большое влияние на эти процессы оказывает также соотношение экзогенных фитогормонов - кинетина, НУК и 2,4-Д. Общий успех трансформации был достигнут благодаря тому, что процесс трансформации рапса был оптимизирован Ралдугиной Г.Н. в Лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Института Физиологии Растений им. К.А. Тимирязева.
В результате проведенной работы были получены трансгенные растения рапса. Наличие встраиваемого фрагмента генетической конструкции в геноме трансформированных растений было доказано с использованием метода полимеразной цепной реакции. Трансгенные растения тестировались с помощью специфических праймеров по присутствию в геноме двух чужеродных генов — целевого гена OsMyb4 и селективного гена ntpll. По данному признаку была получена линия трансгенного рапса, которая легла в основу дальнейшей работы. Также был изучен характер наследования встроенных генов на первом семенном поколении (Fi) - из 40 проанализированных семян первого поколения трансгенной линии рапса наличие искомых генетических последовательностей показали 11.
В планах дальнейшей работы - изучение особенностей влияния повышенной экспрессии целевого гена OsMyb4 на степень устойчивости трансгенных растений к неблагоприятным факторам среды, прежде всего, повышенным концентрациям тяжелых металлов. С точки зрения молекулярной биологии интересен характер наследования встроенных генов, расщепление признаков в последующих поколениях и стабильность наследования.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Радионов, Никита Викторович, Москва
1. Вавилов П.П., Гриценко В.В., Кузнецов B.C., Третьяков Н.Н., 1986 Растениеводство. М: Агропромиздат., 512 с.
2. Важенина Е.А., 1983 Химические и минералогические исследования почв в окрестностях металлургических предприятий. Бюл. Почв, ин-та им. В.В.Докучаева., 35: 32-36.
3. Виноградов А.П., 1962 Среднее содержание химических элементов в главных типах изверженных горных пород земной коры. Геохимия., 7: 555-571.
4. Глик Б., Пастернак Дж, 2002 Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 589 с.
5. Голубкина Н.А., 1995 Флуорометрический метод определения селена. Журнал аналитической химии., 50: 492-497.
6. Гуляев Г.В., Гужов Ю.Л., 1987 Селекция и семеноводство полевых культур. М: Агропромиздат., 447 с.
7. Доспехов Б А. Методика полевого опыта. М. Агропромизздат, 1985 -351с.
8. Ильин В.Б., 1991 Тяжелые металлы в системе почва растение. Новосибирск. Изд. Наука., 150 с.
9. Кабата-Пендиас А., Пендиас X., 1989 Микроэлементы в почвах и растениях. М: Мир, 312 с.
10. Калинкина Л.Г., Наумова Т.Г., 1993 Роль фото дыхания в накоплении свободного пролина в клетках Chlorella Stigmatophora при засолении. Физиол. растений., 40: 577-583.
11. П.Кузнецов Вл. В., Шевякова Н. И., 1999 Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция. Физиол. растений., 46: 305-320.
12. Кузнецов Вл.В., Куликов А.М, Митрохин И.А., Цыдендамбаев В.Д., 2004 Генетически модифицированные организмы и биологическая безопасность. Федеральный вестник экологического права., № 4, 64 с.
13. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г.А., 2006 Физиология растений. М: Высш. шк., 742 с.
14. Максимович А.Е., 1968 Химия сахарной свеклы в первый год жизни. Физиология сельскохозяйственных растений. М.: МГУ. 7: 366-375.
15. Маниатис Т., 1984 Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование; М: Мир, 480 с.
16. Мохаммед A.M., Ралдугина Г.Н., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В., 2006 Аккумуляция осмолитов растениями различных генотипов рапса при хлоридном засолении. Физиология растений., 53: 732-738.
17. Пустовой1 И.В., Филин В.И., Корольков А.В., 1995 Практикум по. агрохимии. М.: Колос. 336 с.
18. Пыльнев В.В., Коновалв Ю.Б., Хупацария Т.И., 2005 Частная селекция полевых культур. М: КолосС., 552 с.
19. Третьяков Н.Н., Карнаухова Т.В., Паничкин JI.A., 1990 Практикум по физиологии растений. М.: Агропромиздат., 271 с.
20. Шлык А.А., 1971 Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев. Биохимические методы в физиологии растений. М: Наука. С.154-170.
21. Abe Н., Urao Т., Ito Т., Seki М., Shinozaki К., Yamaguchi-Shinozaki К., 2003 Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and. AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell., 15: 63—78.
22. Araki S., Ito M., Soyano Т., Nishihama R., Machida Y., 2004 Mitotic cyclins stimulate the activity of c-Myb-like factors for transactivation of G2/M phase-specific genes in tobacco. Biol Chem.J., 279: 32979-88.
23. Arazi T, Sunkar R, Kaplan B, Fromm H., 1999 A tobacco plasma membrane calmodulin-binding transporter confers Ni tolerance and Pb hypersensitivity in transgenic plants. The Plant Journal., 20: 171-182.
24. Arnesano F, Banci L, Bertini I, Ciofi-Baffoni S, Molteni E, Huffman DL, O'Halloran TV., 2002 Metallochaperones and metal-transporting ATPases: a comparative analysis of sequences and structures. Genome Research., 12: 255-271.
25. Assun9ao AGL, Costa Martins PDA, De Folter S, Vooijs R, Schat H, Aarts MGM., 2001 Elevated expression of metal transporter genes in three accessions of the metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. Plant, Cell and Environment., 24: 217—226.
26. Axelsen KB, Palmgren MG., 2001 Inventory of the superfamily of P-type ion pumps in Arabidopsis. Plant Physiology., 126: 696—706.
27. Baker A.J.M., Brooks R.R., 1989 Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metal elements A review of their distribution, ecology and phytochemistry. Biorecovery., 1: 81-126.
28. Baryla A., Carrier P., Franck F., Coulomb C., Sahut C., Havaux M., 2001 Leaf chlorosis in oilseed rape plants (Brassica napus) grown on cadmium-polluted soil: causes and consequences for photosynthesis and-growth: Planta., 212 (5-6): 696-709.
29. Bates L.S., Waldren R.P. and Teare I.D., 1973 Rapid determination of free praline for water-stress studies. Plant and Soil., 39: 205-207.
30. Baudry A., Heim M.A., Dubreucq В., Caboche M., Weisshaar В., Lepiniec L., 2004 TT2, TT8, and TTG1 synergistically specify the expression of BANYULS and proanthocyanidin biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Plant J., 39: 366-80.
31. Blaudez D., Botton В., Chalot M., 2000 Cadmium uptake and subcellular compartmentation in the ectomycorrhizal fungus Paxillus involutus. Microbiology., 146: 1109-1117.
32. Borevitz J.O., Xia Y., Blount J., Dixon R.A., Lamb C., 2000 Activation tagging identifies a conserved MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis. Plant Cell, 12: 2383-2394.
33. Bovet L, Eggmann T, Meylan-Bettex M, Polier J, Kammer P, .Marin E, Feller U, Martinoia E., 2003 Transcript levels of AtMRPs after cadmium treatment: induction of AtMRP3. Plant, Cell and Environment., 26: 371— 381.
34. Bowler C., Slooten L., Vandenbranden S., De Rycke R., Botterman J., Sybesma C., Van Montagu M., Inze D., 1991 Manganese superoxide dismutase can reduce cellular damage mediated by oxygen radicals in transgenic plants. EMBO J., 10: 1723-1732.
35. Boyd, R.S., 2004 Ecology of metal hyperaccumulation. New Phytologist., 162: 563-567.
36. Braun E.L., Grotewold E., 1999 Newly discovered plant c-Myb-like genes rewrite the evolution of the plant Myb gene family. Plant Physiol, 121: 2124.
37. Brooks, R.R., 1977 Copper and cobalt uptake be Haumaniastrum species. Plant Soil, 48: 541-544.
38. Brown MH, Paulsen IT, Skurray RA., 1999* The multidrug efflux protein NorM is a prototype of a new family of transporters. Molecular Microbiology., 31: 393-395.
39. Brown, S.L., Chaney R.L., Angle J.S., Baker A.J.M., 1995 Zinc and cadmium uptake by hyperaccumulator Thlaspi caerulescens and metal tolerant Silene vulgaris grown on sludge-amended soils. Environ. Sci. Technol., 29: 1581-1585.
40. Chaney R.L., Malik M., Li Y.M., Brown S.L., Brewer E.P., Angle J.S., Baker A.J.M., 1997 Phytoremediation of Soil Metals. Current Opinions in Biotechnology., 8: 279-284.
41. Cheng J., Bolyard M.G., Saxena R.C., Sticklen M.B., 1992 Production of insect resistant potato by genetic transformation with a endotoxin from Bacillus thuringiensis var. kurstaki. Plant Sci., 81: 83-91.
42. Clemens S., 2001 Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis. Planta., 212: 475-486.
43. Clijsters H., VanAssche F., 1985 Inhibition of photosynthesis by heavy metals. Photosynth. Res. 7: 31-40.
44. Cobbett CS., 2000 Phytochelatin- biosynthesis and function in heavy-metal detoxification. Current Opinion in Plant Biology., 3: 211—216.
45. Cocciolone S.M., Chopra S., Flint-Garcia S.A., McMullen M.D., Peterson Т., 2001 Tissue-specific patterns of a maize Myb transcription factor are epigenetically regulated. Plant J., 27(5): 467-478.
46. Comai L., Faciotti D., Hiatt W.R., Thompson G., Rose R.E., Stalker D.M., 1985 Expression in plants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosate. Nature., 317: 741-744.
47. Connolly EL, Fett JP, Guerinot ML., 2002 Expression of the IRT1 metal transporter is controlled by metals at the levels of transcript and protein accumulation. The Plant Cell., 14: 1347-1357.
48. Crist R.H., Martin J.R., Crist D.L.R., 2004 Ion-exchange aspecs of toxic metal uptake by Indian mustard. Int. J. of Phytoremediation., 6 (1): 85-94.
49. Curie С, Panaviene Z, Loulergue C, Dellaporta SL, Briat J-F, Walker EL., 2001 Maize yellow stripe 1 encodes a membrane protein directly, involved in Fe(III) uptake. Nature., 409: 346-349.
50. Dan Т., Raj S.K., SaxenaP.K., 1999 Physiology of Heavy Metal Uptake and Tolerance in Plants. Agro's Rev. Plant Physiol. (India)., 1: 195-213.
51. Davies TGE, Coleman JOD., 2000 The Arabidopsis thaliana ATP-binding cassette proteins: an emerging superfamily. Plant, Cell and Environment., 23:431-443.
52. Day A.G., Bejarano E.R., Buck K.W., Burrel M., Lichtenstein C.P., 1991 Expression of an antisense viral gene in transgenic tobacco confers resistance to the DNA virus tomato golden mosaic virus. Proc.Natl.Acad.Sci. USA., 88: 6721-6725.
53. De DN., 2000 Plant cell vacuoles. Collingwood, Australia: CSIRO Publishing.57.de Miranda JR, Thomas MA, Thurman DA, Tomsett AB., 1989 Metalliothionein genes from the flowering plant Mimulus guttatus. FEBS Letters., 260: 277-280.
54. Dekker J., Duke S.O., 1995 Herbicide-resistant field crops. Adv.Agron., 54: 69-116.
55. Delhaize E, Kataoka T, Hebb DM, White RG, Ryan RR, 2003 Genes encoding proteins of the cation diffusion facilitator family that confer manganese tolerance. The Plant Cell., 15:1131-1142.
56. Denekamp M., Smeekens S.C., 2003 Integration of wounding and osmotic stress signals determines the expression of the AtMYB102 transcription factor gene. Plant Physiol., 132: 1415-1423.
57. DiCristina M.D., Sessa G., Dolan L., Linstead P., Baima> S., Ruberti I., Morelli G., 1996 The Arabidopsis Athb-10 (GLABRA2) is an HD-Zip protein required for regulation of root hair development. Plant J., 10: 393— 402.
58. Dietz K-J., Baier M., Kramer U., 1999 Free radicals and reactive oxygen species as mediators of heavy metal toxicity in plants. Berlin: Springer-Verlag, 73-97.
59. Dunagan S.C., Gilmore M.S., Varecamp J.C., 2007 Effects of mercury on visible/near-infrared reflectance spectra of mustard spinach plants (Brassica rapaPl). Environ Pollut. 148 (1): 301-3 lk
60. Ebbs S.D., Kochian L.V., 1997 Toxicity of zinc and copper to Brassica species: implications for phytoremediation. J. Environ. Qual., 26: 776-781.
61. Eide DL, 1998 The molecular biology of metal ion transport in Saccharomyces cerevisiae: Annual Review of Nutrition., 18: 441-469.
62. Ellis D.R., Lypez-Millon A.F., Grusak M.A., 2003 Metal Physiology and Accumulation in a Medicago truncatula Mutant Exhibiting an Elevated Requirement for Zinc. New Phytologist., 158: 207 — 218.
63. Ernst WHO., Verkleij JAC., Schat H., 1992 Metal tolerance in plants. Acta Botanica Neerlandica., 41: 229-248.
64. Falco S.C., Guida Т., Locke M., Mauvais J., Sanders C., Ward R.T., Webber P., 1995 Transgenic canola and soybean seeds with increased lysine. BioTechnology., 13: 577-582.
65. Feng C., Andreasson E., 2004 Arabidopsis MYB68 in development and responses to environmental cues. Plant Science., 167: 1099-1107.
66. Fiedler U., Conrad U., 1995 High-level production and long-term storage of engineered antibodies in transgenic tobacco seeds. BioTechnology., 13: 1090-1093.
67. Flocco C.G., Lindblom S.D., Smits E.A., 2004 Overexpression of enzymes involved in glutathione synthesis enchances tolerance to organic pollutants in Brassica juncea. Int. J. Phytoremediation., 6 (4): 289-304.
68. Frerot H., Petit C., Lefebvre C., Gruber W., Collin C., Escarre L., 2002 Zinc and Cadmium Accumulation in Controlled Crosses Between Metallicolous and Nonmetallicolous of Thlaspi caerulescens. New Phytologist., 157: 643648.
69. Fusco N, Micheletto L, Dal Corso G, Borgato L, Furini A., 2005 Identification of cadmium-regulated genes by cDNA-AFLP in the heavy metal accumulator Brassica juncea L. J Exp Bot., 56(421):3017-3027.
70. Gasic K., Korban S.S., 2007 Expression of Arabidopsis phytochelatin synthase in Indian mustard (Brassica juncea) plants enchances tolerance for Cd and Zn. Planta., 225 (5): 1277-1285.
71. Gaxiola RA, Fink GR, Hirschi KD., 2002 Genetic manipulation of vacuolar proton pumps and transporters. Plant Physiology., 129: 967-973.
72. Gocal G.F., Sheldon C.C., Gubler F., Moritz Т., Bagnall D.J., MacMillan C.P., Li S.F., Parish R.W., Dennis E.S., Weigel D., King R.W., 2001 GAMYB-like genes, flowering, and gibberellin signaling in Arabidopsis. Plant Physiol., 1270: 1682-1693.
73. Goldsbrough P., 2000 Metal tolerance in plants: the role of phytochelatins and metallothioneins. CRC Press LLC: 221-233.
74. Grispen V.M., Nelissen H.J., Verkleij J.A., 2006 Phytoextraction with Brassica napus L.: a tool for sustainable management of heavy metal contaminated soils. Environ Pollut., 144(l):77-83.
75. Grison R, Grezes-Besset В., Schneider M., Lucante N., Olsen L., Leguay J-J., Toppan A., 1996 Field tolerance to fungal pathogens of Brassica napus constitutively expressing a chimeric chitinase gene. Nat.Biotechnol., 14: 643-646.
76. Grotz N., Fox Т., Connolly E., Park W., Guerinot M.L., Eide D., 1998 Identification of a family of zinc transporter genes from Arabidopsis that respond to zinc deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA., 95: 7220-7224.
77. Guerinot ML., 2000 The ZIP family of metal transporters. Biochimica et Biophysica Acta., 1465: 190-198.
78. Gunshin H, Mackenzie B, Berger UV, Gunshin Y, Romero MF, Boron WE, Nussberger S, Gollan JL, Hediger MA., 1997 Cloning and characterization of a mammalian proton-coupled metal-ion transporter. Nature., 388: 482— 488.
79. Ha SB, Smith AP, Howden R, Dietrich WM, Bugg S, O'Connell MJ, Goldsbrough PB, Cobbett CS., 1999 Phytochelatin synthase genes from Arabidopsis and the yeast Schizosaccharomyces pombe. The Plant Cell., 11: 1153-1163.
80. Haag-Kerwer A, Schafer HJ, Heiss S, Walter C, Rausch Т., 1999 Cadmium exposure in Brassica juncea causes a decline in transpiration rate and leaf expansion without effect on photosynthesis. Journal of Experimental Botany., 50: 1827-1835.
81. Hai Du, Zhang Li, Liu Lei, Tang Xiao-Fong, Yang Wen-Jie, Wu Yan-Ming, Huang Yu-Bi, Tang Yi-Xiong, 2007 Biochemical and Molecular Characterization of the Plant MYB Transcription Factors Family. Plant Phys., 152:465-474.
82. Hall J.L. and Williams L.E., 2003 Transition metal transporters in plants. Journal of Experimental Botany., 54: 2601-2613.
83. Hall J.L., 2002 Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance. Journal of Exp. Botany., 53: 1-11.
84. Hartley J., Cairney JWG., Meharg AA., 1997 Do ectomycorhizal fungi exhibit adaptive tolerance to potentially toxic metals in the environment? Plant and Soil., 189: 303-319.
85. Heath R.L., Packer L., 1968 Photoperoxidation in isolated chloroplasts. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch. Biochem. Biophysics., 125: 189-198.
86. Herrero E.M., Lopez-Gonzalves A., Ruiz M.A., Lucas-Garia J.A., Barbas C., 2003 Uptake and distribution of zinc, cadmium, lead and copper in
87. Brassica napus and Helianthus annus grown in contaminated soils. Int. J. Phytoremediation., 5 (2): 153-167.
88. Higginson Т., Li S.F., Parish R.W., 2003 AtMYB103 regulates tapetum and trichome development in Arabidopsis thaliana. Plant J., 35: 177-192.
89. Hirschi K, 2001 Vacuolar H7Ca2+ transport: who's directing the traffic? Trends in Plant Science., 6: 100-104.
90. Hirschi KD, Zhen RG, Cunningham KW, Rea PA, Fink GR., 1996 CAXI, an H7Ca2+ antiporter from Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA., 93: 8782-8786.
91. Huang L, Gitschier J., 1997 A novel gene involved in zinc transport is deficient in the lethal milk mouse. Nature Genetics., 17: 292.
92. Hutterman A., Arduini I., Godbold DL., 1999 Heavy metal stress in plants: from molecules to ecosystems. Berlin: Springer-Verlag, 253-272.
93. Inglesia-Turino S., Febrero A., Jauregui O., Caldelas C., Araus J.L., Bort J., 2006 Detection and quantification of unbound phytochelatin 2 in plant extracts of Brassica napus grown with different levels of mercury. Plant Physiol., 142 (2): 742-749.
94. Ito M., Araki S., Matsunaga S., Itoh Т., Nishihama R., Machida Y., Doonan J.H., Watanabe A., 2001 G2/M phase-specific transcription during the plant cell cycle is mediated by c-Myb-Like transcription factors. Plant Cell., 13: 1891-1905.
95. Jentschke G., Godbold DL., 2000 Metal toxicity and ectomycorhizas. Physiologia Plantarum., 109: 107-116.
96. Jin H., Cominelli E., Bailey P., Parr A., Mehrtens F., Jones J., Tonelli C., Weisshaar В., Martin C. 2000 Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV protecting sunscreens in Arabidopsis.£M8(? J., 19:6150-6161.
97. Jin H., Martin C., 1999 Multifunctionality and diversity within the plant MYB-gene family. Plant Mol Biol., 41(5): 577-585.
98. Kaldorf M., Kuhn AJ., Schroder WH, Hildebrandt U., Bothe H., 1999 Selective element deposits in maize colonized by a heavy metal tolerance conferring arbuscular mycorrhizal fungus. Journal of Plant Phys., 154: 718728.
99. Kampfenkel K, Kushnir S, Babiychuk E, Inze D, Van Montagu M., 1995 Molecular characterization of a putative Arabidopsis thaliana copper transporter and its yeast homologue. Journal of Biological Chemistry., 270: 28479-28486.
100. Kohler C, Merkle T, Neuhaus G., 1999 Characterization of a novel gene family of putative cyclic nucleotide- and calmodulin-regulated ion channels in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal., 18: 97-104.
101. Krantz H., Scholtz K., Weisshaar В., 2000 C-Myb oncogene-like genes encoding three Myb repeats occur in all major plant lineages. Plant J. Jan., 21(2): 231-235.
102. Kramer U, Cotter-Howells JD, Charnock JM, Baker AJM, Smith JAC., 1996 Free histidine as a metal chelator in plants that accumulate nickel. Nature., 379: 635-638.
103. Klempnauer K-H., Gonda T.J., Bishop J.M., 1982 Nucleotide sequence of the retroviral leukemia gene v-Myb and its cellular progenitor c-Myb: the architecture of a transduced oncogene. Cell, 31: 453-463.
104. Lasat M.M., 2002 Phytoextraction of toxic metals: A review of biological mechanisms. J. Environ. Qual., 31: 109-120.
105. Lee M.M., Schiefelbein J., 2001 Developmental^ distinct MYB genes encode functionally equivalent proteins in Arabidopsis. Development, 128: 1539-1546.
106. Lee M.W., Qi M., Yang Y., 2001 A novel jasmonic acid-inducible rice myb gene associates with fungal infection and host cell death. Mol Plant Microbe Interact., 14(4): 527-535.
107. Lee M.M., Schiefelbein J., 1999 WEREWOLF, a MYBrelated protein in Arabidopsis, is a position-dependent regulator of epidermal cell patterning. Cell., 99: 473-483.
108. Lewis S, Donkin ME, Depledge MH., 2001 Hsp70 expression in Enteromorpha intestinalis (Chlorophyta) exposed to environmental stressors. Aquatic Toxicology., 51: 277-291.
109. Lewis S, Handy RD, Cordi B, Billinghurst Z, Depledge MH., 1999 Stress proteins (HSPs): methods of detection and their use as an environmental biomarker. Ecotoxicology., 8:351-368.
110. Lin Y., Schiefelbein J., 2001 Embryonic control of epidermal cell patterning in the root and hypocotyl of Arabidopsis. Development., 128: 3697-3705.
111. Lipsick J.S., 1996 One billion years of Myb. Oncogene., 13: 223-235.
112. Lombi E., Zhao F.J., Dunham S.J., McGrath S.P., 2001 Phytoremediation of Heavy Metal-Contaminated Soils: Natural Hyperaccumulation Versus Chemically Enhanced Phytoextraction. J. Environ.Qual., 30: 1919-1926.
113. Luo C., Shen Z., Li X., Baker A. J., 2006 The role of root damage in the chelate-enhanced accumulation of lead by Indian mustard plants.^//?? J Phytoremediation .,8(4):323-37.
114. Maeshima M., 2001 Tonoplast transporters: organization and function. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology., 52: 469497.
115. Marscher H., 1995 Mineral nutrition of higher plants. 2nd edn London: Academic Press.
116. Martin C., Paz-Ares J., 1997 MYB transcription factors in plants. Trends Genet., 13(2): 67-73.
117. Martin K. J., 1991 The interactions of transcription factors and their adaptors, coactivators and accessory proteins. BioAssays., 13: 499-503.
118. Martinoia E, Klein M, Geisler M, Bovet L, Forestier C, Kolukisaoglu U, Miiller-Rober B, Schulz В., 2002 Multifunctionality of plant ABC transporters—more than just detoxifiers. Planta., 214: 345-355.
119. Maser P, Thomine S, Schroeder JL, 2001 Phylogenetic relationships within cation transporter families of Arabidopsis. Plant Physiology., 126: 1646-1667.
120. Mattana M., Bizzi E., Consonni R., Locatelli F., Vannini C., Provera S., orragio I., 2005 Overexpression of OsMyb4 enhances compatible soute accumulation and increases stress tolerance of Arbidopsis thaliana. PhysiologiaPantarum., 125: 212-223.
121. Mills RF, Krijger GC, Baccarini PJ, Hall JL, Williams LE., 2003 Functional expression of AtHMA4, a Рш-type ATPase in the Zn/Co/Cd/Pb subclass. The Plant Journal., 35: 164-175.
122. Minglin L, Yuxiu Z, Tuanyao C., 2005 Identification of genes up-regulated in response to Cd exposure in Brassica juncea L. Gene., 363:151158.
123. Mishra S.N., Singh D.B., 2000 Accumulation of leaf and cadmium in upper parts of mustard (Brassica juncea) seedlings in response to putrescine. Indian J. Exp. Biol, 38 (8): 814-818.
124. Morita Y, Kataoka A, Shiota S, Mizushima T, Tsuchiya Т., 2000 NorM of Vibrio parahaemolyticus is an Na+-driven multidrug efflux pump. Journal of Bacteriology., 182: 6694-6697.
125. Moyano E., Martinez-Garcia J.F., Martin C., 1996 Apparent redundancy in myb gene function provides gearing for the control of flavonoid biosynthesis in antirrhinum flowers. Plant Cell., 8(9): 1519-1532.
126. Murashige Т., Skoog F.A., 1962 Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: 473-482.
127. Muthukumar В., Yakubov В., Salt D.E., 2007 Transcriptional activation and localization of expression of Brassica juncea putative metal transport protein BjMTPl. BMC Plant Biology., 7: 32-44.
128. Nagaoka S., Takano Т., 2003 Salt tolerance-related protein STObinds to a Myb transcription factor homologue and confers salt tolerance in Arabidopsis. JExpBot., 54: 2231-2237.
129. Nelson N., 1999 Metal ion transporters and homeostasis. EMBO Journal., 18:4361-4371.
130. Nesi N., Jond C., Debeaujon I., Caboche M., Lepiniec L., 2001 The Arabidopsis TT2 gene encodes an R2R3 MYB domain protein that acts as a key determinant for proanthocyanidin accumulation in developing seed. Plant Cell., 13:2099-2114.
131. Neumann D, Nieden UZ, Lichtenberger O, Leopold I., 1995. How does Armeria maritima tolerate high heavy metal concentrations? Journal of Plant Physiology., 146: 704-717.
132. Newman L. J., Perazza D.E., Juda L., Campbell M.M., 2004 Involvement of the R2R3- MYB, AtMYB61, in the ectopic lignification and dark-photomorphogenic components of the det3 mutant phenotype. Plant J., 37: 239-50.
133. Nouairi I., Ammar W.B., Youssef N.B., Daoud D.M., Ghorbal M., Zarrouk M., 2006 Comparative study of cadmium effects on membrane lipidcomposition of Brassica juncea and Brassica napus leaves. Plant Science., 170:511-519.
134. Oppenheimer D.G., Herman P.L., Sivakumaran S., Esch J., Marks M.D., 1991 A myb gene required for leaf trichome differentiation in Arabidopsis is expressed in stipules. Cell., 67: 483-493.
135. Ortiz DF, Kreppel L, Speiser DM, Scheel G, McDonald G, Ow DW., 1992 Heavy metal tolerance in the fission yeast requires an ATP-binding cassette-type vacuolar membrane transporter. EMBO Journal., 11: 3491— 3499.
136. Palmgren MG, Harper JF., 1999 Pumping with P-type ATPases. Journal of Experimental Botany., 50: 883—893.
137. Palmgren MG, Axelsen КВ., 1998 Evolution of P-type ATPases. Biochimica et Biophysica Acta., 1365: 37-45.
138. Palmiter R.D., Findley S.D., 1995 Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc .EMBO Jour., 14: 639-649.
139. Paz-Ares J., Ghosal D., Wienand U., Peterson P., Saedler H., 1987 The regulatory cl locus of Zea mays encodes a protein with homology to Myb oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators. EMBO J., 6: 3553-3558.
140. Paulsen IT, Saier Jr MH., 1997 A novel family of ubiquitous heavy metal ion transport proteins. Journal of Membrane Biology., 156: 99—103.
141. Pence N. S., Larsen P.B., Ebbs S.D., Letham D.L.D., Lasat M.M., Garvin D:F., Eide D., Kochian L.V., 2000 The Molecular Physiology of Heavy Metal Transport in the Zn/Cd Hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. Proc.Natl.Adad.Sci.USA., 97: 4956-4960'.
142. Penfield S., Meissner R.C., Shoue D.A., Carpita N.C., Bevan M.W., 2001 MYB61 is required for mucilage deposition and extrusion in the Arabidopsis seed coat. Plant Cell., 13: 2777-2791.
143. Persans MW, Yan, X, Patnoe J-MML, Kramer U, Salt DE., 1999 Molecular dissection of the role of histidine in nickel hyperaccumulation in-Thlaspi goesingense. Plant Physiology., 121:1117—1126.
144. Prasad MNV., 1999 Metallothioneins and metal binding complexes in plants. In: Prasad MNV, Hagemeyer J, eds. Heavy metal stress in plants: from molecules to ecosystems. Berlin: Springer-Verlag: 51—72.
145. Quinn J.P., 1990 Evolving strategies for the genetic engineering of herbicide resistance in plants. Biotechnol.Adv., 8: 321-333.
146. Raffaele S., Rivas S., 2006 An essential role for salicylic acid in AtMYB30- mediated controls of the hypersensitive cell death program in Arabidopsis. FEBSLetters., 580: 3498-3504.
147. Rauser WE., 1999 Structure and function of metal chelators produced by plants—the case for organic acids, amino acids, phytin and metallothioneins. Cell Biochemistry and Biophysics., 31: 19-48.
148. Raven J.A., Evans M., Korb R.E., 1999 The role of trace metals in photosynthetic electron transport in Oo-evolving organisms. Photosynth. Res., 60: 111-149.
149. Rea PA, Li Z-S, Lu Y-P, Drozdowicz, YM., 1998 From vacuolar GS-X pumps to multispecific ABC transporters. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology., 49: 727—760.
150. Reeves R.D., Baker A.J.M., 2000 Metal-accumulating plants. In: Raskin I., Ens ley, B.D. Phytoremediation of Toxic Metals. John Wiley and Sons Inc., New York, P.231-246.
151. Robinson NJ, Tommey AM, Kuske C, Jackson PJ., 1993 Plant metallothioneins. Biochemical Journal., 295: 1-10.
152. Rogers EE, Guerinot ML., 2002 FRD3, a member of the multidrug and toxin efflux family, controls iron deficiency responses in Arabidopsis. The Plant Cell., 14: 1787-1799.
153. Ros R.O.C., Cooke D.T., Burden R.S., James C.S., 1990 Effects of the herbicide MCPA and the heavy metals, cadmium and nickel on the lipids composition./, of Exp. Botany., 41: 457-462.
154. Rout G.R., Das P., 2003 Effect of metal toxicity on plant growth and metabolism: I. Zinc. Agronomie., 23: 3-11.
155. Salt D.E., Kramer U., 2000'Mechanisms of metal hyperaccumulation-in plants. In: Raskin I, Ens ley В (eds) Phytoremediation of Toxic Metals. John Wiley and Sons Inc., New York, P.231-246.
156. Salt DE, Rauser WE., 1995 MgATP-dependent transport of phytochelatins across the tonoplast of oat roots. Plant, Physiology., 107: 1293-1301.
157. Salt DE, Wagner GJ., 1993 Cadmium transport across tonoplast. of vesicles from oat roots. Evidence for a Cd2+/H? antiport activity. Journal of Biological Chemistry., 268: 12297-1230.
158. Sancenon V, Puig S, Mira, H, Thiele DJ, Penarrubia L., 2003 Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology., 51: 577—587.
159. Sandmann G and Boger P., 1980 Copper-mediated Lipid Peroxidation Processess in Photosynthetic Membranes. Plant Phys., 66: 797-800.
160. Schachtman DP, Kumar R, Schroeder JI, Marsh EL., 1997 Molecular and functional characterization of a novel low-affinity cation transporter (LCT1) in higher plants. Proceedings of the National Academy of Sciences,1. USA., 94: 11079-11084.
161. Schmitz G., Tillmann E., Carriero F., Fiore C., Theres K., 2002 The tomato, Blind gene encodes a MYB transcription factor that controls the formation of lateral meristems. Proc Natl Acad Sci USA., 99: 1064-1069.
162. Schuetzenduebel A., Polle A., 2002 Plant Responses to Abiotic Stresses: Heavy Metal-Induced Oxidative Stress and Protection by Mycorrhization. J.Exptl.Bot., 53: 1351-1365.
163. Schuurink RC, Shartzer SF, Fath A, Jones RL., 1998 Characterization of a calmodulin-binding transporter from the plasma membrane of barley aleurone. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA., 95: 1944-1949.
164. Seo H.S., Yang J.Y., Ishikawa M., Bolle C., Ballesteros M.L., Chua N.H., 2003 LAF1 ubiquitination by COP1 controls photomorphogenesis and is stimulated by SPA1. Nature., 424: 995-999.
165. Serrano R., 1989 Structure and function of plasma membrane ATPase. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular, Biology., 40: 61— 94.
166. Shaul O, Hilgemann DW, de-Almeida-Engler J, Van Montagu M, Inze D, Galili G., 1999 Cloning and characterization of a novel Mg^/H"1" exchanger.EMBO Journal., 18: 3973-3980.
167. Shier W.T., 1994 Metals as toxins in plants, J. Toxicol.-Toxin Rev., 13:205-216.
168. Shin В., Choi G., Yi H., Yang S., Cho I., Kim J., Lee S., Paek N.C., Kim J.H., Song P.S., Choi G., 2002 AtMYB21, a gene encoding a flower-specific transcription factor, is regulated by COP1. Plant J., 30: 23-32.
169. Silver S., 1996 Bacterial resistance to toxic metal ions a review. Gene., 179:9-19.
170. Singh P.K., Tewary R.K., 2003 Cadmium toxicity induced changes in plant water relations and oxidative metabolism of Brassica juncea L. plants. J. Environ. Biol., 24 (1): 107-112.
171. Smith J.G., Walzem R.L., German J.B., 1993 Liposomes as agents of DNA transfer. Biochim Biophys Acta., 1154(3-4): 327-340
172. Steffens JC., 1990 The heavy metal-binding peptides of plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology., 41: 553-575.
173. Steiner-Lange S., Unte U.S., Eckstein L., Yang C., Wilson Z.A., Schmelzer E., Dekker K., Saedler H., 2003 Disruption of Arabidopsis thaliana MYB26 results in male sterility due to non-dehiscent anthers. Plant J„ 34:519-528.
174. Stracke R., Werber M., Weisshaar В., 2001 The R2R3 gene family in Arabidopsis thaliana. Curr Opin Plant Biol., 4: 447-456.
175. Supek F, Supekova L, Nelson H, Nelson N., 1997 Function of metal1 ion homeostasis in the cell division cycle, mitochondrial protein processing, sensitivity to mycobacterial infection and brain function. Journal of Experimental Biology., 200: 321—330.
176. Tam PCF., 1995 Heavy metal tolerance by ectomycorrhizal fungi and metal amelioration by Pisolithus tinctorius. Mycorrhiza., 5: 181-187.
177. Tomos A.D., Leigh R.A., Shaw C.A., Wyn Jones R.G., 1984 A Comparison of methods for measuring turgor pressures and osmotic pressures of cells of red beet storage tissue. J. Exp. Bot., 35: 1675.
178. Theodoulou FL., 2000 Plant ABC transporters. Biochimica et BiophysicaActa., 1465:79-103.
179. Tseng TS, Tzeng SS, Yeh CH, Chang FC, Chen YM, Lin CY., 1993 The heat-shock response in rice seedlings—isolation and expression of cDNAs that encode class-I low-molecular-weight heat-shock proteins. Plant and Cell Physiology., 34: 165-168.
180. Van Assche F., Clijsters H., 1986 Inhibition of photosynthesis in Phaseolus vulgaris by treatment with toxic concentration of zinc: effect on ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase. J. Plant Physiol., 125: 355-360.
181. Van Ho A, Ward DM, Kaplan J., 2002 Transition metal transport in yeast. Annual Review of Microbiology., 56: 237-261.
182. Vatamaniuk OK, Mari S, Lu Y-P, Rea PA., 1999 AtPCSl, a phytochelatin synthase from Arabidopsis: isolation and in vitro reconstitution. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA., 96: 7110-7115.
183. Vert G, Grotz N, Dedaldechamp F, Gaymard F, Guerinot ML, Briat J-F, Curie C., 2002 IRT1, an Arabidopsis transporter essential for iron uptake from the soil and for plant growth. The Plant Cell., 14: 1223-1233.
184. Wada Т., Tachibana Т., Shimura Y., Okada K., 1997 Epidermal cell differentiation in Arabidopsis determined by a Myb homolog, CPC. Science., 211: 1113-1116.
185. Wainwright S.J., Woolhouse H.W., 1977 Some physiological aspects of copper and zinc tolerance in Agrostis tenuis. Journal of Exp. Botany., 28: 1029-1036.
186. Weissenhorn I., Leyval C., Belgy G., Bethelin J., 1995 Arbuscular mycorrhizal contribution to heavy metal uptake by maize in pot culture with contaminated soil. Mycorrhiza., 5: 245-251.
187. Weston K., 1998 Myb proteins in life death and differenciation. Curr Opin Genet. 8: 76-81.
188. White PJ, Bowen HC, Demidchik V, Nichols C, Davies JM., 2002 Genes for calcium-permeable channels in the plasma membrane of plant root cells. Biochimica et Biophysica Acta., 1564: 299-309.
189. Williams LE, Pittman Ж, Hall JL., 2000 Emerging mechanisms for heavy metal transport in plants. Biochimica et Biophysica Acta., 1465: 104126.
190. Williams S., Friedrich L., Dincher S., Carozzi N, Kessman H., Ward E., Ryals J., 1992 Chemical regulation of Bacillus thuringiensis endotoxin expression in transgenic plants. BioTechnology., 10: 540-543.
191. Wollgiehn R, Neumann D., 1999 Metal stress response and tolerance of cultured cells from Silene vulgaris and Lycopersicon peruvianum: role of heat stress proteins. Journal of Plant Physiology., 154: 547—553.
192. Yamamoto Y., Kobayashi Y., Matsumoto H., 2001 Lipid Perixidation Is an Early Symptom Triggered by Aluminium, But Not the Primary Cause of Elongation Inhibition in Pea Roots. Plant Phys., 125: 199-208.
193. Xiong Z.T., Wang H., 2005 Copper toxicity and bioaccumulation in Chinese cabbage (Brassicapekinensis Rupr.). Environ. Toxicol., 20 (2): 188194.
194. Xiong Z.T., Li Y.H., Xu В., 2002 Nutrition influence on copper accumulation by Brassica pekinensis Rupr. Exotoxicol Environ. Saf, 53 (2): 200-205.
195. Youssef N., Nouairi I., Temime S., Taamalli W., Zarrouk M., Ghorbal M.H., Daoud D., 2005 Cadmium effects on lipid metabolism of rape (Brassica napus L.). C.R. Biol., 328 (8): 745-757.
196. Yruela I., 2005 Copper in plants. Braz. J. Plant Physiol., 17: 145-156.
197. Zhou J, Goldsbrough PB., 1994 Functional homologs of fungal metallothionein genes from Arabidopsis. The Plant Cell., 6: 875-884.
198. Zhu Q., Maher E.A., Masoud S., Dixon R.A., Lamb C.J., 1994 Enhanced protection against fungal attack by constitutive co-expression of chitinase and glucanase genes in transgenic tobacco. BioTechnology., 12: 807-812.
199. Zhulidov D. A., Robards R. D., Zhulidov A. V., Zhulidova О. V., Markelov D. A., Rusanov V. A., Headley J. V., 2002 Zinc Accumulation by Slime Mold Fuligo septica (L.). J. Environ. Qual., 31: 1038-1042.
200. Благодарю директора Института Владимра Васильевича Кузнецова за внимание и интерес, проявленные к данной работе на всем протяжении ее осуществления.
201. Огромную роль в моей жизни сыграли мои школьные учителя биологии и химии — Татьяна Михайловна Ибрагимова и Валентина Ильинична Кожемякова. Своей любовью к естественным наукам я обязан именно этим людям, добрым, терпеливым, мудрым и родным. Спасибо.
202. Признателен всем сотрудникам лаборатории Экспрессии генома за помощь, терпение и понимание, а также сотрудникам лабораторииL
203. Отдельно хочется признаться в любви всем моим друзьям, составляющим зачительную часть моей жизни Олегу, Владимиру и Егору (а теперь еще и их женам и детям), а также Алексею, Ксении и Вике с которыми, как я смею надеяться, судьба свела меня не случайно.
204. Низкий мой поклон Вам всем, дорогие мои.!
-
Радионов, Никита Викторович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.12
- Адаптация трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) со встроенным геном транс-фактора Osmyb4 риса к тяжелым металлам
- Влияние микроэлементов на урожайность и качество семян ярового рапса в условиях Центрального Черноземья
- Научные основы технологии возделывания и интенсификации производства ярового рапса на семена и кормовые цели в условиях Центрально-Черноземной зоны Российской Федерации
- Продукционный процесс и фиторемедиационный потенциал сортов рапса на загрязненных тяжелыми металлами почвах
- Токсическое действие меди и механизмы ее детоксикации растениями рапса
