Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойтва и регуляция активности фосфодистераз циклических нуклеотидов из мозга человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойтва и регуляция активности фосфодистераз циклических нуклеотидов из мозга человека"

РГ6 од

МОСКОВСКИМ ГОСУДАРСТВЕННИК УНИВЕРСИТЕТ им.М.В-Ломпносова Б!ШОП?ЧЕСКШ йАЙУЛЪТЕГ

На ершах рукописи

НВДБНЯШ МАРИНА ВАЛЕРЬЕВНА

УДК 577.152.3

СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ШЯОДИЗСЗЕЙЗ ЦИКЛИЧЕСКИХ НУКЛЕ0ГВД03 ИЗ ШЗГА ЧЕГОВЕК&.

03,00.04 - блохгмяя

А г V о р о ф е р а т диссертация на соискание ученой стопеяи кандидата йгадоппеских наук

МОСКВА - 13УЭ

/

FaSOTS вглтсышзна в Пройлвжой Научно-ксс -адогс гельетсой лгйор. тории "Xsshh фзргзетов" кафэдры СисоргвшлескиЗ хияи Еяологяче ксгэ факувьтага «осксвютго ГосудьротЕЗЕкэго УшЕ-эрсите ей . И. В. Лоншэаоса.

Научшгй руководитель - члои-корр; спсндзнг РАН,

доотор ihm*™ е сетк наук, профэссор ' Е.С.С5ЕЗЕРИК

Сфщиальшв оппонанты - доктор биологических наук,

профзсоор . Н.Б.ГУСЕВ - кандидат Сиологлчэских неук .

К. А .ГРИНННШЖ!

Ведущая оргашзоиия - НИК Бвтгадацтосссй йаии PAäüI

Зпцета диссэртащт состоится " " (jt'j&ihj/di*_ipng г.

в /^ 00ч&глй пе заседиза Ca6i5K!.!ma2jxi2aaaoT-j Ученого Соваз Д 074.51.01. при Всероссийском Научном Цаатре мол9:<ул'кряой дйб! ностаки и ¿ачеъия Ю Р8 со адрзеу: II3I49» йосява, (йгча^эроша&спг бульвар, Д.8., ННЙЩГ Ю PÖ.

С /sscosprsiffreS коазэ огншкйцемьзя з .сго'ллогеко Есоросс«нйлетг Яалнсго ISsospa шлекуляряой дийгвосжеин а лэчвтня HS РФ.

ЛЕТорзфзраг разослан "20" ОЮ&^Л? 1Э93 г.

Учений секретарь Gösers

кандидат бнодогзгсаекгх каук '¿Cif^ В.Б.Ох-раднсвз

/

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность яроОлв?«ы. Содержание в клетке а«£Р к осш3 - вторичных мессандверов, регулирующих многие внутртслвточтт процессы, зависит от соотношения скоростей их синтеза и деградации. На сегодняшний дань едзпствокным известным фэрлентом, гидролизуигим 3',5*-циклические вуклеотлды (Ш) до 5'-монофосфатов, является фосфодаэстврзза (ФДЭ). Несмотря на то, что всестороннее исследование этого ?еруепта ведется уже более 30 лет, не ясвн многие аспекта его ра гулят щи. Во жсгом это связано с существованием £>ДЭ как совокупности иногзства форм, отличакцихся хго логзкизации в клетке, сродству к суЗгтрату, физикс-хзаическим, квиетическим, регулятор-енм и другкм свойствам. На основании квталатдчесзах и регуляторнкх свойств формант подразделяют на несколько основнпх типов ^гайа, •Июирвоп, 1984; Веа»/о, 1988), среди которых Са -яаяьмодулш (КМ)--ективируемт (тш I) и оакр-стимулируожэ (тип П) ОДЭ. Фермента этих типов гадролизуют оАИР а оСШ>. Атшвоать ЕЩЭ тала I возрастает в присутствии ионов Са2+ и Са2+-связнвзщего Салка КМ. Скорость гидролиза олкр, катализируемого ФДЭ типа II, увеличивается . под действием кикромэлярнчх концентрация сЩ£Р.

Несмотря на многочисленные сведения о ФДЭ из шага млекопитающих, систематического изучения каталитических и рогуляторннх свойств этого фермента из мозгв человека практически не проводилось. Мевду тем такоэ исслэдовэнио особенно 'илуальъ-о в силу сле-дуюцих причин. Во-пэрзах, при более слонесЗ (по сргннезяю с друга-731 млекопитесдами) функциональной организации козга человека моеяо ожидать, что 4ДЗ обладает рядом особенностей. Во-вторых, формант ил мозга человека является реальной или потекцишъзой шяпонью действия ряда психотропных лекарств и детальное изучеЕке его свойств

представляет интерес с медицинской точки зрения. Для поучения полного предстшдашя о йункцтгонзровгнж! ФДЭ мозга чэхоьэкг дэла-сооСразно ьервояачалькоо изучение свойств к седой из форт« фзрмэнта.

3 связи с вышесказанным цель» данного кослодоваяия бнло жжение регулюорзшс свойств различиях фора фогфэдаэстеразн ЦК из растшршой фракция иозга человека.

3 соответствии с этой сйяузй целья бяп: гостаздэны следтсдлэ основные задач«:

1.Разделить Форш ФДЭ, дрясугствунись в расгаорикой фракции мозга человека.

2.Изучать КЕЕЗЕЕческиг свойства различных фор* <5ДЗ.

3.Кссладавать нзкотарцэ еозг-экепи мэханиз;^ рэгуледии ахтиз-ностз различных фор< ФДЗ как природшзш, так и ксхусстБвлэши модуляторами аптявностн.

Езучная новизна работ. Предложена ортгичальнзя методика разделения форч ©ДЭ рэстворгиой фрзшщи мозга талсаэ.сз. "олучэна форма фэрменТЕ с кесзвестажк раиео рэгул;лорЕЬ&т свойствам. хоторуи

Ох

ектЕвируит как сСНР, га:: и ионы Са . Мз/чзни ;':ата.чнтячес:<е9 свойства и м&ханизна рэх-улгарз акткгкостн форм да асаамз Са2+ к 15-1, а тают м5хензз?.ы ;:нга£>Ерущэго действия га зтп форсы ряда лекарственных препаратов, среда которш етйролбытжки, аятидазлрэссанга и прогквоопухолэвые ссодяекют. Обнарзтгглго взщэстео - китропирази-дал, - избирательно взазаздсйствугдаа только с однггл из двух ЦЯ-свкзнвапдкх участков молекула еет-стн^мруежй ©ДЗ.

ГТрактячэскоэ значение работа. Получешне б работа дзшшэ углубляют представдвЕмЛ о ьяогообразип (¿«эда ©дэ з рвстиоричой фраэтгйи мозга человэка. Сьедзкия о формах фзр^зяты и ¡.;эхенЕз:,;с>х их регуляции у точняюг и расширят' прадлокенпую рале в хласгащшицжо <5ДЭ.

РвзреСотвякал оригинальная мэтодкка разделения форм ФДЗ может быть использована в онзикодотаческих лабораториям при заделешта фэризн-та зга козга. Исследование механизмов хзггаОирукдаго действия на фэрсэпт ряда соедаыектТ, пршваяэшгх в медицинской практике, р&с-шгркет представление о спектре их фэр.»акологическо1 активности, что сладу?г учлтьзать при лроведвнии кздг-кешнтозаий терапии.

Лггрсиагиш раСэтк. Результаты диссертацногшся работы били доло-шен на X Всэсокзясй конференции, по биохймии нерэной системы (г. Горький, 1937 г.), на 15 и X Об'единеншл: Скягаачуквх биохимических обществ СССР-ГДР (г.йэна, 1937 г. и г.Теихент, 1389 г.), вэ VI Всесоюзном Симпозиуме "Роль циклических нуклеотадов и в торгаши посредников в регуляшпг фэрментативных реакций (г.Петрозаводск, 1938 г.). на кокЗэрэнцпях молодых ученых и специалистов Казахского государственного унивррсттета ям. С.М.Кирова и Красноярского Медицинского института (г.Аиа-Ата, 1988 т. и г.Красноярск, 1388 г.), Еа 7 ВсесоззЕой койаренции, посвященной ЗО-леткю со дня рождения Х.С.Коктоянца (г.Москве, 1930 г.).

Публикасрн. По тема диссертации слуЗличовзно 13 научных работ.

03'ом и структура диссертация. Дассвртецкошая работа изложена на 234 машношсвых страницах, содержит 40 ртсугосов, 16 таблиц и состоит из введения, обзора литература, описания материалов к катодов исследования, излогевия гголученвш: результатов и их обсувдэ-ния, бнводов г списка шнуруемой литература (403 источников).

Г.ЕТОДЙ кссадоЕАШя

Активность ОДЭ определяли йо катоду Иютрвса, ¿рр1епэп, 1971 с применением кзчзных [8-%]оКШ>. Помимо общепринята: аАсолютдах

единиц акгиЕвссга (ютлэль/мян х кг), скорость ферментативной реакций (V) шразда в относителыж единицах активности (о.е.а.) -- % х [80]{кй5)/Ь(мн) х "V (мкл), где % - процент гидролиза субстрата, Б0 - накааьЕья концентрация субстрата, ь - врзыя ферментативной реакции, ч - об*ем растЕора ФДЭ, добавлпе?.:ого в лзкуйзцЕСН-ну» смесь. Лрг гэстрознпзт графиков исхголы'Ойклп усреднвннкз вз.пн-чизн активности 5£3, определенные иг трех и бола 5 параллельных лз-мереяяй. Разлог вэлгдин но прзвыаая 55?.

Поскольку ряд процессов, гатрягиасмрос Фагмеят, могсао охарактеризовать лига в рамках мзогспарЕкэтрвческоЗ сястеки, точноэ определение ведгтан некоторых констант стадо нозмояно Jшшь с использованием конпЕзтарного моделирования. Исишше значения констант ыстиващш (к ), Езгибкровашм (Т^) и стспокк актетащга (и) расата-тквали в пры&агенги суперпозкцш двух процессов: актьвахуп и полного конкурентного гттгСировчкгя 4у>£Э. В работе хгоедставягш таза® алгоритм других программ, используемых для расчета кинетических параметров: ^ К±, т^.

РЕЗУЛЬТАТЫ У. ЕС ОЗСКЗСЁНИ*

I. Вцца ленке ЗДЗ.

После гсжгЕЛпзащи козга и цэнтрифугирозалия го.^огонага (22С00 , отастку растворат-гой фракции прово.^ыи з две хрс,\»а-тографаческйз ста.пян: с испольгсзанкек гидрофобной (фэаил-сэферо-зы) к зн^оЕсайглэнЕой (ПКАЕ) сиол. В последнем случае ирикэнялк КЩЦСОЮЯУВ ХрЗИйТОГр&фЯВ высокого давления (ЗХВД).

СДЗ алягрустея с фэкпл-сефарозы одвзм сшваетрятасл пиком. При

использовании в качестве суострвта оак? активность фермента суммарной фракции увьличнваэтся под действием Са2+ (в 3,4 рсза), комплекса Свг+-КМ ш 4,1 раза), осн? (гз 2,1 рззв). Отсутствие сущо-ственннх различий в степени активации фэрмэнта ионами Са и кокп-лзксом Са е 81согоеного КМ свидетельствует о яаичак в злвате с фэвкл-сефарозы эвдогеБНого КМ. В то за время активация фррмента нова'.и Са в присутствии эндогенного КМ я циклическим СИР прэдпо-лагает налптаэ в суммарной фракции фэргкитов по крайней кэрэ двух типов: Са2+-КМ-акгиВпруемой (Са2+~КЫ-ФДЭ) (тип I) и оскр-стикули-руэией (тип II) «ВДЗ.

ЭЛИЦИЯ <ВдЗ с колонки ШДгорао Со1итп ТЗК ЦЕАК-ЗЭ« (21,5x150 мм) осуществляли лееэйвым градиентом НаС1 (0,1-0,5 м). При использовании в качества субстрата олир к свИР горошо различии три пика активности ФДЭ, обозначаннме нами как форма ФДО 1а, ФДЗ то, ОДЭ 1Г (рис.1).

ГисЛ.Прсфш» влкеш СДЭ лиавйвуч градиентом РзС1 с колонки так ВЕАЕ-ЗБЯ (21,5x150 т). Субстрат: 5 икМ (I) и 5 нпМ оСМР (2). Активеость фэрмэнта мзмзряли в присутствии 0,2 кМ ЭГТА.

ФДЭ ia и ФДЭ 16 проявляет? свойства Са2+-КЫ-активирувмого фермента, поскольку скорость гвдролкза оАЕР и оЗйр возрастает в при-

24.

сутствии комплекса Се -КМ, es измэняется при . добавлений в среду ионоз Сз2\ а оСЛР иягисирув? гидролиз аА» (табл.1).

Таблица I.

Влияние модуляторов на активность трех форм ФДЭ, алхзировэншх с колонки Ultropao Oolumn TSZ DKAE-3S??.

Субстрат оСИР (5 1ЖМ) оЛНР (5 МКЫ)

(¿одуллторы Са2+ С32+ Са2+ Са2+ ЭГГА Са2+

активЕоста КМ КМ оШ? хы

Г еСЫР

ФДЭ ia 1.0 2,4 1,0 5,5 0,50 -

ФДЭ 16 1.0 2.7 1,0 4,7 0,44 -

ФДЭ II 3.0 1.0 3,3 3,3 9,0 9,0

В качестве конгролл использовали ввлачин? ekikeeoctw ВДЭ в присутствии 0,2 ыМ SfTJ. принимала.ое разной единице. Нснцектрашзг модуляторов: Ca2* - 50 мкЦ; КМ - I tec.'i; cG'JP - 5

По рагулягоргпйл свойствам 3>ДЭ II сзкэственнс отли^аэтся от ФДЭ 1а и 5>ДЗ 16. Скорость гидролиза <Ш£Р етсй формой фзрмэнта узв-личзшаэтся б нвнпутсткм ийкромол^ркта кощентрацзй сан? и ионов

о .

Ca , причем дсСазявняе экзогенного Kfi к© усиливает г ян а^фзйтов

(табл.1). Отсутствуч ададтнвнссги дэйотвия ионов Сгй+ к с (Ж? б

концентрацию:, шгьса^.п; акгсвецаа ФДЭ II (5 гай

р.

оОИР и 50 Ca .), с?д™>?аяьстзуб'1- о дшойаой рзгусздки этой Зорка фарланта (тзбл.1). Зтсг= ЗНЕ0Д па дтез радеет тглгэ отсутствие Са2+-заЕИСЕЖ1й а^леащсЕ <5ДЗ II прг использовании в пачгсггэ субстрата 5 ккМ oGMP. Лрк данной кснцавтрадш cGKP, яадядщггося (по степени активаагш) основным регуляторам, фермент ткыностьв акта-

вирован и его дополнительной стимуляции Са2+ комплексом Са2ч-КЫ не происходит.

Таким образом, применение ьысокоз{фэкгазной яидкостной хроматографии па ечловосЗуэннсй смоле deas позволило гняветь в растворимой фракции монга человека 3 форш фермента, отдичвкщиося по фя-зико-хикиеским и рэгуляторным свойствам: Са2+-КМ-ФДЭ (ФДЭ ia и ФДЭ 16) и фзртент, активность которого увеляччвэетст в присутствий гакромоляршх концентраций сою» иди чонов Са2+ (йдэ и). эти форш ВДЗ стали прэдоотом дпльвейэаго, более детального изучения.

2.Кг;зе;'Ичэскяа и регуляторзне свойства Сз2+-1Ж—1ДЗ из рветво-рамой фракции мозга чоловека (ФДЭ 1а и ©53 16).

ОДЗ is и 36 различается на только но £аэш:о-2Киическим, но и кинетическим свойствам, наиболее существенным из которых является

__о.

механизм активации ганшвксем Са -км. Для субстрзтсз camp и с!3£Р в случае 4ДЭ 1а зта активация происходит с увеличением Увал без иа-тонэния к^, тогда как для (5ДЭ хб (субстрата оаи? и сЗИР) изменяются оба 1СЕНэгпческз2 параметра (табл.2).

Таблица 2.

Осзоаннв кавзэтгчэааго ггарекетры ФДЭ la и ФДЭ 1б.

Субстрат сА!£Г oGSP

Добавки эгм (0,8 КМ) Са (0,5 кМ) ЭЛА (0,2 КМ) (0,5 иН)

т (I ккМ) КМ (I мкЫ)

jlapaveTpK п> Y taz ** 'пазе ТГ »зх

(мкЫ) (o.e.a) (шл!) (о.е.а) (rati!) (о.е.а) (ияМ) (о.е.а.)

ФДЭ la 70 27 70 130 1,56 7,14 1,56 ¿0

ФДЭ 1и 154 S2 G7 133 18 20 II 53

Несмотря ка различия кинетически свойств ФДЭ 1а к ФДЭ 16, зти форш ферлегга относятся к талу Са2+-Ж-ФЛЗ, что подтьерадатгг такта результата зкспэртлавтоз с антагонистами к&льнодулзна (АКМ): щ-7, 'хрнфторгЕфаоипсй.! (МЛ) и тачшссяфзно«. Зти соединения ивги-бируот здутвфОЕвЯЕта Са^-КЫ активность ФДЭ ха г ОДЭ 1С до уровня базачьной, н<9 ашяя на последам.

3 отлична от ¿Ю,!, взаимодействующих с белком-активатором л

гэм сахам лрсхштстсуияс стамуляцга фераэетв, механизм ингибирую-

щего дэйствяя Ероко иссользуез:огс в медицине уятидепресеанта ш-

разидода и его ЕИроазалога на Са2+-КМ-ЗЯЗ существенно отличается.

Хотя пкразэдол к нктропяразвдол (НИ). подобно .4КМ пнгибируЕТ инду-2+

цкрозаняус Са -УЫ актавкссть фарместа, увзличенпе кслцонтршргй КМ на два наряда с 0,1 да 10. :л&5 лрлэсди? жль к дзте-трах кратному изайкзвизо для обоях ссэдлне'гяа (таол.З). Следовательно, оба вещества пе конг/ркруат с КМ зг участок связнвангя на мслэку.пе фермента и о форкантоа за КМ, что существенно отличает нсследуемш соедкненгя от .УМ. Поскольку I) ш:резидол и его штроана.лог прак-тичаска нз влккгт на базальнуз активность Са -яы-фдэ, 2) еягийк-роваяиэ индуцированной Са^-КМ акяЕзост!: неновое, 3) коэффициент Хаалв отличен от I, 4) с увеличением концентраций субстрата сея? в 6 раз вэлдчина 1С5С для обеж ссздгнэв^й увелгчигоется не бо^зе чем в 2,5 раса (тзйл.З), мо*ео исключить хоаауронтакй механизм пя-гкбнровгшяя фарганта гшразадолон к Щ но отношению к субстрату.

Такта образом, получэнзко денннэ сЕвдэтэлъстзуззт о гоашжвос-те аллостернческей регулятдгп Са -КМ-ФДЭ кз мосга челоЕэкя, не за-трагиващей наарямуз активного и КЫ-сзягкзакцэго цонтров фарглзнта, а такзв балка-активатора.

Таблица 3.

Действие пиразвдола и китропирвзидола ва Са2*-К&МЭДЭ.

Соединение Лиразидол Нитоопиразидол

Параметры 1С50(мкМ) 1С50(ккН>

Концентрация КМ*:

0,1 ККМ 355 2,0 105 1,4

1,0 ккМ 631 2,0 150 1.5

10,0 мкМ 555 2,4 219 1.6

Концентрация

субстрата cA!fPoa:

50 мкМ 398 2,0 138 1.0

100 мкМ 457 2,5 182 1.5

300 мкМ 537 3,0 330 2,0

Г) . f

Измерения активности клгслненс з присутствие 0,5 kSI Ca" . Субстрат - 5 мкМ ели?; - 0,5 ;.лМ КК. Даетые приведена для Са2+-КМ-ФДЭ об'вдяненной фракцяш ®ДЭ ia и ФДЭ Хб.

г.сонр-згвиамая, Са2+-акт2Енруемая ферта йэр&егга - ФДЭ II.

2.1.Де£ствие на фермент цяклпдсяш иуклэотидоз, кг ногжцхикзуе-шх аналогов, внтадопрзссакта пиразидола и его нэтрзнроззводного.

Б координатах Ла1шукзера -Бврка ФДЭ ц хзрэктеркзуэт линейная кияетжа гидролиза оАШ? и остр з диапазонам концентрация 2,5-500 ккН и 2,5-250, соотЕэтстзенно. Величина длп о£ЦР раина 100 мкЫ, а для oGirp - 30 мкЫ. Кикромолярнне концентрации оСНР увеличивает скорость гкдролпза оАМР в 7-14 раз, максимальная гкстзащтя фер-кэнта достигается при 2-5 мкм comp и с увэличешая копцантрадаи последнего сменяется кнггбкроваггае« фермента (р_:с.2, кривая I). С увеличением количества субстрата активация фзрг.гангз происходит при

НОСТЬ ФДЭ Н. CyOCTpST-oiü?: ФДЭ ii от концентрации суб-

5 мкМ (I), 100 мкЫ (2). страта оАЫР в двойных обрат-

ных координатах в отсутствие oGKP (I), в присутствии 5 мкм ogkp (2).

тех же концентрациях oGHP, но степень активации (К) падает (рис.2, кривая 2). Активация ФДЭ II циклическим см? происходит за счет уменьшения для оаыр со 100 мкМ в отсутствие активатора до 14 мкХ в присутствии 5 мкМ осш? (рис.3). Ка равна 0,1-0,3 мкЫ и существенно отличается от кт для oghp (табл.4), что сЕидотальствузт о гетерогенности связываицм: этот Ш участков.

Ранее для cGMP-стимулируеыых ФДЭ (тип II) Онла предложена двуцентровая модель связывания Щ с фэркэнтом (Egrie, siega!, 1977). В райках стой модели на молекуле ФДЭ существует один ката-

литический центр, гидролиз ушщй оли? и оОМР, и регуляторный оСМР-спощфгеный центр, взаимодействие осмр с которым приводит к активации гидролиза оакр. Поскольку ФДЭ II по своим свойствам существенно отличается от осыр-стиггулируеких (ВДЭ (прежде всего активаци-2+

ей ионами Са ), ки считали необходимым проверить правомочность двуцентровой модели для этой формы фэрмента.

Таблица 4.

Кинетические параметры фЦЭ п, полученные при гра£ическом и компьютерном моделировании. . -

Субстрат 5 мкЧ о¿а? 5 нкМ оСМР

ДобаЕки ЗГТА ЭГТА, овЫР ЭГТА

' Параметры, *» К1 «в Еа Н к®

опрбдэлепныэ сС-КР сАИР

графически 10С 35,0 14,0 0.1-0,3 7,0 30,0 13,0

по программа 37,5 35.2 15,2 0.09 19,9 17,4 12,9

Величины Кц,, X.., К„ приведены з даМ, и - рас.

О едином для оАУР и озк? каташтичэскок центре ФДЭ II свидетельствует конкурентное ьнгкСмроззтаэ гддролпза субстрата другими ЦИ (рис.4). Вэлкчинз К. г для обоих ЦН практически совпадают (габл.4.)

оЖР коеот активировать ВДЭ п, однако дазвый сффект наблюдается линь нри очень низких концентрациях субстрата оЗМР (0,1-0,2 ккЧ), в этих условиях максимальная активация фэриэнта достигается при 25-50 о АКР, а Ха равна 3,5 миМ. По-шдикому, подобно оСКР, цнсшческий ЖР взаимодействует с аллостеричэскск центром фермента, однако сродство сАНР к "с(?ДР-сцецафачяОй1у" центру значительно ниге. С:сор8е всего акхиведия ФДЭ и цйкшчвскю анр не имеет физи-

Рис.4. Зависимость активности ФДЭ II от концентрации ogmp (А) и сам? (Б) в координатах Диксона. Субстрат - ojkp (А):. 50 мкЫ (I), 100 мкМ (2), 250 мкЫ (3). Субстрат - cgm? (Б): 25 мкЫ (I). 50 ызМ (2), 100 >лкЫ (3). Активность форманта измеряли в присутствии 0,2 мм ЭТТА.

ологического значения из-за высокой ка и небольшой разницы в величинах ка и Кц для оамр .

Лэханизм взаимодействия циклических нуклеотидов с ФДЭ ii ук-ладаваэтся в расш двуцентровой модели сз.чвквянпя о аир и ogmp, предижешой дап.оОКР-стамулируемых ФДЭ из других тканой. Правомочность этой еодэле для ФДЭ ii подтверждают результаты исследований с ксшльзззанаем нвпздролизуегяп дабутирильных проЕЗБодынх оАЫР (o*itP(Bt)2) и сС-ИР (oCK?(3t)2), а такгэ шптро аналога пирази-дола.

oAK?(Bt)2 и oGHP(Btlg внзиваат ективацию гидролиза 5 ажИ с аир, скенягцуэся ингибирозепиэм ФДЭ II (рис.5)> что позволяет предположить взетмодэйс?зие аналогов ЦЯ с регуляторнык и актишам центрами на молекуле фермента (рис.5). При использовании в качест-

вв субстрата 5 мкМ оскр ФДЭ II находится-в активированном состоянии и дополнительного воздействия оСИР(В1)2 и санр(В1;)2 на регуля-торный цонгр на набладавтся, о чем свидетельствует отсутствие стимулирующего эффекта ДЕбутиркльянх производных на гидролиз обнр. Имеет место лищь конкурентнее янгабировавке ФДЭ II обоими аналогами (табл.5).

Таблица 5.

Кэкотсрые кинетические параметры ФДЭ II в присутствии различных модуляторов активности ферканта: ош>, о<ш>, оаыр(В1:)2 и осмр(в1;)2

Субстрат 5 икН о>1£? 5 мкЫ обНР

Нэршэгры К1/2 (»жМ) К. (ИСК) К1 (мкМ)

Модуляторы:

о СИР 0,39 35 -

оАИР - - 13

оСЫР(В1;)г 25 - 10

OlШP(Бt)г 925' - 1500

к1/2 ~ г-озцезтраци соединения, при которой достигается полумакси-мальнэя а:;тЕВ?гщя фэрмента.

Из внаэсказанного следует, что ЦН и кх производные взаимодзй-ствуиг нак с каталитическим, так и с регуляторнцм оСКР-сиэцифичнын центрами ФДЭ и. Поэтому особый интерес предстазляет поиск соединений, избирательно взвшядайствуицах с одазш из нуклвотид-связы-вапцих участков фэрлента. Татам веществом оказалось нитронроизвод-ное антидепрэссаита пиразцдола - НП.

Пиразидол и Щ ингибируят индуцированную о сир активацию ФДЭ II (субстрат 5 мкМ сАМР) (табл.5). Пиразидол не влияет на активность фермента в отсутствие обМ?, тогда как НП торлозит базальиув

Рис.5.Действие cGi£P(Bt)2 (Л) л oiltP(Bt)2 (Б) на активность ОДЭ IX. Субстрат - 5 мкЫ аШР. Активность фзрыанта измеряли в присутствии 0,2 Ш Э1ТА. * - активность в отсутствие аналогов.

активность при концентрациях свшв IDO мкЫ (табл.6). Иягибирухгцие фермент концентрации КП (75 и 250 лкМ) уменьшают степень активации ФДЭ II циклическим GMP, однако Ка остается практически неизменной (рис.6, табл.7). Последнее сввдэтельствует об отсутствии конкуренции ш и oGttP sa аллостеркческий оС-мр-спэцеХичшй центр фэрмэнта. Однако Ш конкурирует с субстратом ogítp за активный центр Звркента (рис. 7), примем величина Kí для НИ (70 мкЫ) сравнима со знслатая-ми К^ для о/НР л oGEP (табл.4), что подчеркивает достаточно ьпсо-

Таблица 6.

Действие пиразвдолБ и нитропиразвдола на йг.тиетость ©да II.

Пир?зедол Китроппрпсздал

ICgQ (ккМ) 1С50 (мкМ)

Э1ТА(С,2 мМ) - 1500

ЭГТА(0,2 Ш)

oGHP (5 мкМ) 1585 115

Субстрат - 5 ккМ оанр.

го

1.0

ЧГ-"

__ю 4.0

Рис.6.Действие осир на активность ФДЭ П. Субстрат - 5 мкЫ оАНР. Активность феркента измеряли в присутствии 0,2 мН ЭГТА (I); 0,2 Ш ЭГТА и 75 мкЫ НЕ (2); 0,2 мН ЭГТА И 250 МКМ Ш (3).

250 500 ИП,ЫФ

Рис.7.Зависимость активности ФДЭ II от концентрации НИ в. координатах Диксона. СуСстрат-оСКР: 10 мкМ (I); 50 мкМ (2); 100 мкМ (3); 500 мкМ (4).

Таблица 7.

Действие пиразвдола и нитропиразвдола на активность ФДЭ II.

Контроль Нптропиразидол Шгфазидол

- 75 мкН 250 мкМ 1,5 мМ 2,5 мМ

К„ (МКМ) 0,25 0,19 ■ 0,15 0,18 0,23

N (раз) 17,26 2,8 Г,7Э 2,84 0,96

Величины к к н рассчитаны по программа. Субстрат - 5 мкМ оаир.

куя эффективность действия етого соединения па фзрмент.

Таким образом, НИ конкурирует с субстратом за каталитический центр фэрчента и не взаимодействует с регуляторным отс-спецпфич-жм участком. В отличкз от своего кзпроаналога, избирательно инги-бирущэго ФДЭ II по конкурентному механизму, пиразидол действует на фермент аллостерически, не затрагивая регуляторннй ссн?-специ-

- 18 -

фичннй центр фермента (ка ~ оопб!) (табл.7).

Результаты кинетического анализа, проведенного с Щ, их негид-ролизуамнми аналогами, и нитропрогзводным пиразидола подтверждает существование на молекуле ФДЭ II двух отличных по структуре центров - каталитического, гидролизупцего оАМР и оСКР, и рэгуляторяо-го, оСМР-сшцифячного.

2.2 Регуляция фермента йенами Са2+. В экспериментах по сктивгции ФДЭ II конает Са2+ (табл.Г) фэр-мент получаки с добавлением ЗГТ/. на всех этапах очистки. Ука на первой хроматогргфичзскоЕ стадии такая методика позволяет полностью освободиться от несвязанного с ферментом КМ, поскольку в присутствии ЭГТА свободный ЮЛ не взаимодействует с фенил-сефэрозой. Однако щдэ II, газированная с веае-нрьо и не содержащая ггршесэй

о.

Са -КЫ-452Э (о чан свидетельствует отсутствие 8дцитиепссти дейст-

Ох О •

вия Са" -КМ и ойКР) (табл.1), активируется ионами Са в 1.5-3 раза в отсутствие экзогенного 1СМ (тэбл.1).

Для уточнения механизма данной активации аликвоту фракции ФДЗ II кипятили в течение 3 (при этом ФДЭ полностью тэряет гидролитическую активность, а терггостчЗильнкЗ Ш не ЕнактиБлргэтсп), послэ чего различные колячзства прокипяченого раствора добавляли в проСы, содеризп™-з Са^-КМ-ЩКЭ. При этом с увеличенном аликвотн

о ,

фракции ФДЭ II в присутствии ионов Са каблвдагтея постепэнкоа увел£леьле активности Сг2+-КУ-ФДЭ, доствтащее мв::игшьаого спа-ченкя, соответствующего активности фермента в присутствии насыщающих концентраций КМ (0,1 к I ккМ) (рис.8).

На основании полученных результатов цэжо пр&дпологгкть, что

о.

фракция йКЭ II содержит ассоциированную с ферментом Са -связывал)-

иую компоненту (возмснгю КМ или КМ-подоОныЕ бэлок), диссоциации

которой от фермента в присутствии ЭГТА в условиях эксперимента на

происходит. В денатуриругдах условиях (при нагревании) эта компо-

2+

нэнтз, по-злдимому, диссоциирует и мохет активировать Са -5Ш-ФДЭ.

Для уточнения гштотазн о Са2+-связывгпцей компоненте, исследовали действие АКМ ('.7-7, ТС5П, тзжкоифзна) ка активность £ДЭ XI и сравнивали их с влиянием этих соединений на Са -КМ-ФЦЭ. и-7 и ТШ ггУ'.^бируат иадуцировалнув Сг" -ХЫ активность Са -КМ-ФДЗ до уровня

ЗазальЕоЯ:, ке елияя па последнюю (при микроколярннх концентрациях)

2+

(рис.9,1,А). Та'сое Еигабгрованлэ типично для большинства Са -КМ-зависима ферментов и внзвано взаимодействием АКМ с белком-активатором, пропятствуозям стимуляции фэрмзнта. В случае ФДЭ II инги-бзровазис Оайь-ж;дувирояан::ог актичьости «-7 к ТФП происходят, по—видимому, созгрлепно по другому ;иха:жзму, т.к. оно но . ограничивается'уровнем о'азальной активности, происходит при боже внео-ких концентрациях АКМ и затрапшвзт пс:.ся.:о Со"т-1згдуцирова:шой, соггр-зщдуцй-роранйул и ?аголъкуя активности (ряс.эд.Б).

КнгиСкруи^за дэ^стз^е тамэкгагЗзла на ОДЭ II суцостванно отличается от яффзктоз тг-7 и ТФП, поскольку тамсксифак апгибярует

о ,

Са -;ядуцяроБаянуп активность бер^епта до уровш базалькой и при

исслэдуекнх концентрациях на влмязт на 1шдуциров«щуя ссш? и на

базальную актшзксста ФДЭ II (рлс.9,11,5).

Если дэйствна к-7 к ТФП на активность ФДЭ II лишь не опровер-

2+

газт модель, согласно которой ферлэнт имеет Са -езязываяцую

компоненту, то зфЗректи тамоксифена на эту форму ФДЭ подтверждает

зту модель. Влияние компоненты на активность Ф£Э II в присутствии

2+

ьэ наблюдается, поскольку з эпос условиях кп Са (тзбл.1), ни тачсксирек (рис.9,II,Б) не оказтеэвт, соответственно, зктивиру-

ШШ.

2 3 4

д

£ 7 ¿0 И &

„2+

Рис. 8. Гистограмма активности Со -КМ-ФДЭ в присутствии различных аликвот прскипячаной фракции ФДЭ II. Субстрат - 5 жИ оАМР. Контроль (1-5): активность Са2+-КЫ-СДЭ в присутствии 0,2 уИ ЭГТА (I); 0,2 мМ ЭГТА к 50 кгл црокипячэЕой фракции ФДЭ II (2); 0,5 Са2+ (3); 0,5 мМ С82+ и I ккМ экзогенного КМ (4); 0,5 кМ Са2+ и 0,1 мкК экзогенного КМ (5). 6-12: Активность Са2+-КМ-СДЭ в птаисутстваи 0,5 мМ Са и различных аликвот прокшячэноа фракции ФДЭ II: 2 мкя (в): 5 ккл (7); 10 МО (8); 15 ккл (9); 20 мкл (10); 40 мкл (II); 60 мкл (12).

пцего п ингибарущего ей>зктоз. в отсутствие сс-а? ионы Са активируют (табл.1), а тамокстХен ингибирует индуцированвуэ Са ак-

тавность 5йЭ II (рис.9,II,Б). Таким образом, наиболее вероятно,

2+ ^ что Са -связывалцей компонентой авлязтся № (или КМ-подобпый белок). Об этой свидетельствует такаю сходство зффэктов тгглоксифена на Са2+-КМ-ФДЭ и ФДЭ II (рис.9,И). Для обоих ферментов Са2+-внду-цирозаннзя активность гнгкСируется до уровня Зазальной. Однако в случав ФДЭ II этот аффект проявляется при белее высоких концентрациях соединения, что свидетельствует, по-видслому, о меньшей доступности та^оксв^эна к Са^-связыгашяй компоненте ФДЭ II, чем к

р <

свободному 1Ш, активирулцэму Сг -КМ-ФДЭ (рио.9,11).

На ОСПОВ85ЕИ полученных результатов предлокэна гипотетическая модель регуляции ВДЭ и.

5Л

2.5

У(аг.а.)

ш

2.5,

0.5

Ц(ае.а) 3

2

10 20 &ГГ?Ц

I

10 2.0 шю,

43 &£тама:-4 азеЦ,

оТит

40

^сдаейз, _____Ш

РЕс.Э.Дейстзкэ ГШ (I) и тамочекфэна (И) на активность Са^-КМ--ОДЭ (А) и одз и (5). Субстрат - 5 с АЛ?. Активность ФДЭ измеряли в присутствия 0,2 Ш 5ГГА (I); 0,5 Са2+ и 0,1 ккМ 1М (2, А); 0,5 Са2+ (2,В); 0,2 кМ ЗГТА и 5 ыкМ сС'ХР (з).* - активность «гда в отсугстЕИЭ Ж!. Зф^экты, оказнваэмаэ тг—7 и ТСД на активности Са2+-КМ-ФДЗ и ФДЗ II практически идентична, поэтому в автореферате приводятся данные только для 'ГСП.

Еинзтг^ческн? свойства ФДЗ II но гасгом идентичны свойствам

- -

самР-стимулируэмых ФДЭ, что позволяет отнести фермент к фосфодаэс-теразам ткш II (БхгаЛа, ТЬстрзоп, 1934), отмечая при зток в квче-стве его основной характерной особенности активацию ионами Са в отсутствий экзогенного КМ.

ВЬЕБОда

1. Разработана оригинальная методика выделения из растеэрмоЯ фракции мозга человека фосфодиэстервза 3' .б'-цгклическях куклестк-дов двух тшов: Са2+-калъмоду.пин-актизирувкай (тш I) и сС11Р-стп-мулируемой (тип II). Обнаружены дав форю фермента типа I, отличавшиеся по физико-химическим и кинетическим свойствам.

2. С помощью внтадэпроссанта пиразвдола и ого штропроязводао-го показана возможность аллостэриче ского ингибированая Са -КМ-нн-дуцированной активности фермента типа I, неконкурентного по отношение к белку-активатору.

3. Активность оСЫР-стимулируемой фосфодиэствразы ез ыосга человека (тип II) увеличивается нэ только под действием о31£Р, но и в

2+

прис7тств»и ионов Са . Аддитивности действия двух активаторов не нгСлвдается.

2-44. Активация овиР-стимудяруекгой фосфодвэстерази иокама Са

опосредуется Са2+-связнвгвдей компонентой фэрмента. Механизм регуляции фосфодиэстеразы типа и дезсяичэским смр укладывается в рамки двуцентрезой модели связывания циклических нукльотидов с фэрмен-том, ьредполагьгдеЁ наличие каталгтического и выгоксспэцяфичЕого к сам? рзгуллторнсго центров.

£. Обнаружено соэдащэняе - нгатопираалдол, - избирательное зза-и.одействувдее с каталитическим центром оир-стикулируеыой фэсфо-диэстврозы.

- 23 -

Матзр::алк диссертации спуолчксзгны в следущих работах:

I. Бобру скж И-Л., Кайсян С.У., Мурстова U.B., Баретова Л.А.,

о.

Сввврш E.G. Аллостеркческзг, рзгуляция актлскости Ca -кальмоду-лкн-зяэдкйкШ фосфодкэстеразы из мозга крупного рогатого скота. /'/Биохимия.-I9S7. -Ч. 52. -К8. -с. 1344-1352.

г.Щэйхия с.м.. Муратова М.З., Еш'рускин И.Д. Са2+-кальнодулта-зайиснлая фосфодиэстзраза мозга и соединения нафталиисульфамид-ного ряда. //Еоетник АН КазССР.-1987.-И6.-С.37-42.

3.Муракжа Ы.В., Ш^йхкн С.М., Еобрусюш К.Д. Действие нейро-лзптикое на активность Са2+-кальмодулинзаЕисзкой фосфэдизстерззы из мозга. //Тэз. докл. X Всесовзной конференции по биохимии нервной системы. ГорЫСЕй,- ТЭ37.-С.150.

4.Bohrue tcin I.B., Kuratova U.Y-, Kadyrzbanova A.E. , Shaikhin S.M. Regulation of enzymatio aotivity oi Ca^-nalreodulin-dependsnt Phosphodiesterase by oloio p.oid and phoaphatidylserine. //Abstracto oi the 9Joint SyHposivn oi the Biooliemioal Societies oi tiie GDP. and USSR.- Jaia, -19G7.-P.22-2j.

о.Иа&гш C.Ii., Муратова U.B., Балов A.A., Хропов D.B., Кулагин С.Б., БоСруоюш ".Д. Модуляция фармзнтативкой активности Са2+-кальмодулиЕ-зазясимой' гоэсс^одтаетарезв из мозга соединениями нефта-лпнсудьфамидвого ряда. //Бт-тохтаия.- I3S3.-Т.S3.-йъ.-О.I357-I3S4.

5.Муратова И.В., Кирээва H.H., Бвлоз A.A., Бобрускип К.Д. Се-глзйстЕо фосфодиэствраз из мозга человека. //Тез. докл. TL Всесоюзного симпозиума "Роль циклических нуклзотпдов и вторзчннх посредников в регуляции фэрзлтатишшс реегшдй". Петрозаводск, -1988. -С .82.

7 .Кадыркашза А.З., Мура топе М.Е, Регуляция активности фзефо-диэстеразы из мозга гзрними кислотами и фосфатидалсерином. //Таз. докл. конференции молодых ученых и специалистов Казахского госу--

дарственного университета ил.С.M.Кирова. Алма-Ата,-1988.-С. 144.

8. Бобруckkh И.Д., Муратове М.В., Ккреевз Н.К., Балов A.A., Северин Е.С. восфодязстераза 3' :5'-циклических иуклеотадоз из козга человека. //Виохикия.-IS89.-Т.54.-N3.-С.1499-1507.

9.Муратова Ы.Б., Кнроевв H.H., Взлез A.A., Боорускин К.Д. Еи-тоалазматическ8я фосфодкэстераза козга челозегса. //Тез. докл. X (»'единенного симпозиума Сиохи-агсеских обществ СССР-ГДР. Тагкеа^,-I989.-C.55.

10.Медведева М.Е., Бобрускип К.Д. оСКР-активируекая фосфодявс-тераза из мозга человека. //Тез. докл. v Всесоюзной конфзрзшеш, посвященной 90-летию со дня рсыдвпия академика АН Армянской ССР, чдан-коррсетондеЕта АН СССР Х.С.Коштоянца. Москва,-1990.-C.IS2.

Н.Бобрускнн К.Д., НэдЕадсЕа Ы.В., Северан Е.С. ойт-акясзяру-еная фосфодаэс1ераза кз мозга чбЛОЕека: кинетические и регулятор-ные свойства. //Б»гахтыя. -19ЭГ .-Г.56.-л'5.-С.3SS-I0I0.

12.Медведева М.Б., Федотова O.A., Швздов Е.К., Белов A.A., Ыедведэз А.Е., Вобрускин К.Д. ДейстЕие ентэдепрессшта шргзЕДога и его нптроаналога на oGHP-зазясимую фосфодаэствразу циклических пуклзотидоз растворимой фракции коры головного мозга человека. //Биохимия.-I993.-T.58.-N5.-C.783-797.

13. Медведева Ы.В., Еэлез A.A., Киреева H.H., Бобру скин И.Д. Се2+-калшодуялн-актЕЗируемая фэсфодизстераза циклических нуклео-тндов растворимой фракции мозга человека: кинетические свойстваs действие антвдзпрзссанта пиразцдола и его нптроаналога на фермент. //Виохикия.-1993.-Т.58.-HS.-С. 7S3-S03. .