Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сукцессия микроорганизимов при деструкции древесных остатков

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Сукцессия микроорганизимов при деструкции древесных остатков"

§

" ~ На правах рукописи

¿г С

ИМРАНОВА ЕЛЕНА ЛЬВОВНА

СУКЦЕССИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ДЕСТРУКЦИИ ДРЕВЕСНЫХ ОСТАТКОВ

03.00.16. - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

И

Иркутск - 1998

Работа выполнена в Институте водных и экологических проблем ДВО РАН г. Хабаровск

Научный руководитель: - доктор биологических наук, с.н.с.

Кондратьева Л.М.

Официальные оппоненты: - доктор биологический наук, с.н.с.

Крупская Л.Т. кандидат химических наук Новикова Л.Н.

Ведущая организация: Дальневосточный научно-исследовательский институт лесного хозяйства

Защита состоится " 26 " имУ/„?_ 1998г. в_часов на засе

дании диссертационнго совета Д 063.32.06 Иркутского государственного университет по адресу: г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Байкальский музей им. проф. Кожова \1Л (ауд. 219).

Почтовый адрес: 664003, г. Иркутск, ул. Ленина, 3, а/я 24, НИИ биологии пр

ИГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского государ ственного университета.

Автореферат разослан " 22 " _ 1998г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Купчинская Е.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема рационального использования природных есурсов тесно связана с задачей утилизации промышленных отходов. Отрасли про-[ышленности по химической переработке древесины (целлюлозно-бумажная, гидро-изная и др.) отличаются невысоким коэффициентом использования сырья и отно-ятся к наиболее агрессивным нарушителям экологического равновесия.

Общий годовой объем отходов от лесоперерабатывающих и лесохимиче-ких предприятий на Дальнем Востоке измеряется миллионами кубометров. Ос-ювная масса которых (кора, опилки, окорка, лигнин и пр.,) практически не ис-юльзуется, занимает большие территории, создает угрозу самовозгорания и загряз-!яя окружающую среду.

Лигнин, наряду с клетчаткой, составляет основную часть растительного мате-1иала. Хотя лигнин является химически стойким соединением, в естественных услови-х он достаточно хорошо подвергается микробиологической деградации, трансфор-шруется в гумусовые вещества и играет важную роль в балансе углерода на Земле.

Однако лигнин, преобразующийся в процессе химической переработки древе-ины на гидролизных, целлюлозных заводах и ЛПК, скапливается в отвалах, вызывая агрязнение окружающей среды (поверхностных и подземных вод, почв, воздушного ¡ассейна).

При трансформации органических остатков, в том числе и лигнинсодержащих убстратов, которая осуществляется не только в почвах, но и в любых скоплениях фганического вещества растительного происхождения, происходит сукцессия мик-юбных сообществ. К основным факторам, определяющим интенсивность деструкции ггносятся: химический состав и анатомическое строение растительных остатков, сте-1ень их увлажнения, температура и кислород.

Исследования закономерностей сукцессии микроорганизмов в процессе разло-кения древесных остатков и особенностей их преобразования раскрывают широкие шрспективы для управления процессами биотрансформации, с целью получения ор-анических удобрений и предотвращения загрязнения окружающей среды.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление )собенностей сукцессии микробного комплекса и доминирующих видов микроорга-шзмов, ответственных за разложение древесных остатков в естественных лесных шоценозах и лигнинсодержащих субстратов промышленного происхождения.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: - изучить изменения количественного и качественного состава микробного ком-тлекса от начальной стадии разложения древесных остатков до их полной деграда-Л1и или преобразования в гумусовые вещества;

- показать влияние температуры и источника азотного питания на сукцеса микробного комплекса и скорость преобразования компонентов древесины;

- определить характер изменения химического состава древесных субстратов п микробиологической ферментации;

- выделить микробные культуры, обладающие высокой активностью при разлоя нии основных компонентов древесины и создать на их основе "компостную зак! ску";

- установить влияние "компостной закваски" на ускорение процесса фермент ции древесных остатков.

Научная новизна работы.

Разработаны научные основы микробиологического компостирования расл тельных остатков различного происхождения (кора, гидролизный лигнин).

Впервые при рассмотрении особенностей формирования лесных почв испох зованы данные по микробной трансформации растительного опада и установле роль микроорганизмов деструкторов целлюлозо- и лигнинсодержащих субстратов,

Выявлены общие закономерности сукцессионного перераспределения микро ных ассоциаций при конверсии древесных остатков лесных экосистем и лигни содержащих субстратов антропогенного происхождения.

Создана искусственная ассоциация целлюлозо- и лигнинразрушающих ми роорганизмов с высокой ферментативной активностью ("компостная закваска обладающая полиферментным комплексом и высоким уровнем устойчивости экстремальным условиям компостируемых субстратов.

Практическая значимость работы.

Показаны пути утилизации отходов деревообрабатывающей и лесохимическ< промышленности для получения дополнительного источника органических удобрен! и улучшения экологического состояния природной среды.

Организовано полупромышленное производство лигнокомпоста для улучшен! качества почвенных грунтов тепличного комплекса совхоза Федоровой (Хабаровский край).

Разработаны рекомендации по получению лигнокомпоста из промышле ных отходов Хорского гидролизного завода (Хабаровский край).

Проведена апробация корокомпостов с целью повышения плодородия лугов глеевых почв мелиорированной системы Троицкого совхоза и лигнокомпостов - 1 луговой текстурно-дифференцированной почве ОПХ ДальНИИСХ.

Создана коллекция микроорганизмов-деструкторов лигнинсодержащих су стратов, которые могут быть рекомендованы в дальнейшей работе по биоделигниф кации древесины, в производстве древесного и лигнинового компостов.

Разработаны микробиологические и биохимические приемы диагноста: лесной подстилки, которые могут быть использованы как исходные данные для п

[едующего учета антропогенной нагрузки на лесные экосистемы и при планирова-ш лесовосстановительных работ.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на съездах ВОП 'ашкент, 1985; Новосибирск, 1989), на VII съезде Всесоюзного микробиологиче-;ого общества (Алма-Ата, 1985), на Всесоюзной научной конференции Ликроорганизмы в сельском хозяйстве" (Москва, 1986), на республиканской кон-гренции "Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйст-:нных культур" (Вильнюс, 1986), на Всесоюзном совещании "Микробиологическая ¡струкция органических остатков в биогеоценозе" (Москва, 1987), на Советско-майском симпозиуме "Геология и экология бассейна р. Амур" (Благовещенск, 1989), i 14-ом Международном конгрессе по почвенным наукам (Kyoto, 1990), на научной >нференции "Экологическое состояние и ресурсный потенциал естественного и ггропогенно-измененного почвенного покрова" (Владивосток, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ центральной и международной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти ¡ав, обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит 190 источни->в. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит 25 таблиц и 1 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основными объектами исследования служили микроорганизмы - деструкторы >евесных остатков. Для выделения микроорганизмов и приготовления компостов -.пользовали отходы Амурского целлюлознокартонного комбината (АЦКК) (кора, i, опилки), гидролизный лигнин Хорского гидролизного завода, птичий помет с екрасовской птицефабрики, лиственный опад смешанного березово-осинового леса реднего Приамурья, ил с очистных сооружений Хабаровского горводоканала.

Исследования деструкции древесных остатков и сукцессии микробных ассо-1аций в естественных условиях проводились в березово-осиновом лесу Средне-íypcKOñ низменности, на контрольной площадке с сомкнутым насаждением, со-оящим преимущественно из березы маньчжурской.

Выделение микроорганизмов - деструкторов из разлагающихся древесных ма-риалов и учет численности микроорганизмов проводили общепринятыми в почвен->й микробиологии методом посева на агаризованные питательные среды (Большой >актикум, 1962). Достоверность результатов учета на чашках Петри оценивали по 1итерию Стыодента. Прямой счет бактерий осуществляли методом Виноградского-)ида путем люминесцентного микроскопирования (Люмам-3) с использованием туорохрома актидина оранжевого (Trolldenier, 1977; Звягинцев и др., 1978).

Численность актиномицетов, находящихся в вегетирующем состоянии, опре-ляли по методу В.А. Крючкова (1973). Радиальную скорость роста различных видов

грибов или Кг-константу - методом Г.А. Кочкина и др. (1978). Грибы идентифицир вали по определителям М.А.Литвинова (1967), Л.Н. Егоровой (1986).

Выделение лигнолитических микроорганизмов и изучение их активности пр водили по методу Каваками (Ка\уакагш, 1975) в жидких средах, используя в качест] единственного источника углерода гидролизный лигнин и модельные соединен! лигнина (ванилин, сиринговая, ванилиновая, феруловая, вератровая кислоты, гваяко дегидродиванилин и др.), а также лигнин Класона, диоксанрастворимый лигнин, ли нин механического размола, которые выделяли по стандартным методике (Грушников, Елкина,1972) и гидролизный лигнин (ГЛ).

Оценку активности микроорганизмов проводили по степени разложения лиги на (уменьшение содержания углерода) и модельных соединений (интенсивность п глощения при длине волны 280 нм).

Для проведения опытов ГЛ нейтрализовали СаС03 до рН 5-6. После доба ления минерального питательного раствора в соотношении 1:1 в чашки Петри внос ли суспензию 3-х суточных культур лигнолитических микроорганизмов и культ вировапи 30 сут. при 28 °С.

Диоксан-лигнин (ДЛ), выделенный из ГД, в количестве 100 мг вносили в ко бу объемом 500 мл со 100 мл инокулята. Инкубирование проводили на качалке (2( об/мин.) при 28°С. Продукты деградации ДЛ выделяли из культуральной жидкое: экстракцией метилэтилкетоном, а после концентрирования метилировали диазомет ном. Метиловые эфиры выделенных веществ анализировали на газожидкостном хр матографе "Хром-5".

ИК-спектры снимали на приборе "Бресогс! 111-75" (Германия).

Молекулярную массу (М\у) ДЛ определяли методом гельхроматографии I стеклянной колонке размером 38 х 1,6 см, заполненой сефадексом С-150 (80-К меш). При определении концентрации ароматических соединений использовали к лонку 250 х 16 мм, заполненную сефадексом в-50 (60-80 меш).

Содержание карбоксильных (СООН) и фенольных (ОН) групп определяли г методу, изложенному в работе Г.Б. Елякова и др., 1973, одноатомных фенолов, пол: сахаридов, водорастворимых ароматических соединений - общепринятыми способам

Микробиологическое компостирование лигнинсодержащих субстратов осущ ствляли в лабораторных и полупромышленных условиях. В корокомпосты для ст; муляции развития микроорганизмов, нейтрализации кислотности и сбалансирован! смесей по питательным элементам добавляли мочевину и Са(Н2 РОД в лигнокомп сты - известь, мочевину, суперфосфат натрия. Во всех вариантах влажность доводит до 60% от полной влагоемкости. В лигнокомпост вносили "компостную закваску состоящую из целлюлозо- и лигнинразрушающих микроорганизмов. Содержаш общего углерода в компосгах и растительных остатках и их фракционный сост; определяли методом Ваксмана и Стивеиса в модификации Стивенса (1965), обще!

зота - по Кьельдалю, аммиачного - с реактивом Несслера, нитратного - фенолсерным |етодом, фосфор - фотоколометрически, калий на пламенном фотометре Аринушкина, 1970). Состав гумуса изучали по Тюрину в модификации !.В.Пономаревой и Т.А.Плотниковой (1980).

Для испытания полученных корокомпостов проводили вегетационные опыты с ельскохозяйственными культурами (соя, овес) и микрополевой опыт (участок сов-оза "Троицкий" Нанайского района Хабаровского края).

Биологическую активность почв после внесения компостов определяли по исленности различных групп микроорганизмов, активноси ферментов - инвертазы, ;егидрогеназы, уреазы, фосфатазы (Хазиев, 1976), по агрохимическим показателям ->Н, содержание аммиачного и нитратного азота, подвижных форм фосфора и калия Петербургский, 1968).

Вегетационно-полевой опыт с лигнокомпостами закладывали на луговой екстурно-дифференцированной почве ОПХ ДальНИИСХ под культурой овса сорта Союзник, класс 2". Степень влияния различных факторов на функционирование шкроорганизмов в корокомпостах определяли с помощью факторного анализа центроидный метод) (Окунь, 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разложение древесных материалов и их компонентов в природных условиях.

Микробиологическая и биохимическая дифференциация лесной подстил-:н. Лесная подстилка, благодаря своему строению, представляет собой готовую мо-[ель для изучения распределения микроорганизмов почвы в пространстве и во време-[и. В ней сосредоточены все группы микроорганизмов, которые связаны в единые (етритные пищевые цепи. Дифференциация подстилки по слоям отражает процесс [еградации растительных остатков и соответствует определенным стадиям сукцессии шкробных сообществ.

Биохимические исследования показали, что при переходе от верхнего слоя под-тилки к нижнему заметно снижается содержание углерода при постоянном количест-е азота. Убыль количества углерода с глубиной подстилки вызывается разложением емицеллюлозы, целлюлозы и лигнина, а также за счет фракций, экстрагируемых в танол-бензольном растворе. В то же время в опаде наблюдается возрастание концен-рации водорастворимых полисахаридов, редуцирующих Сахаров и белков, что является следствием гидролитической и синтезирующей деятельности почвенных микро-фганизмов.

Так как лигнин по сравнению с целлюлозным комплексом разлагается медлен-[ее, соотношение между указанными компонентами с глубиной подстилки увеличивайся. Вероятно, неразлагающиеся остатки лигнина при дальнейшей деградации пре-рашаются в гумусовые вещества, о чем свидетельствует возрастание количества

гумусовых и фульвокислотных фракций. В связи с уменьшением общей доли углеродных соединений при деструкции растительных остатков возрастает зольность от 8% в верхнем до 29% в нижнем слое подстилки.

Микробиологические исследования дают четкую картину дифференциации генетических слоев подстилки по групповой структуре микробного комплекса (рис.1).

При попадании свежих листьев, веток, травы в подстилку на них какое-то время сохраняется специфическое автохтонное грибное сообщество, но затем оно постепенно вытесняется типичными подстилочными сапротрофами.

Из-за особенностей климата в Приамурье, с резким понижением температур и началом формирования снежного покрова, процесс деструкции свежего опада резко

Рис.1. Динамика развития различных групп микроорганизмов в подстиля Слои: 1-верхний, 2-средний, 3-нижний.

замедляется и возобновляется в середине апреля. В этот период интенсивно развиваются быстро растущие плесневые грибы - первичные колонизаторы новых органических субстратов, способные потреблять легко подвижные углеводы.

Летом и осенью в верхнем слое, также как и в ферментативном (Aof) появляются активные гидролитики (p.Pénicillium, Trichoderma и др.), разлагающие целлюлозу. Встречаются и быстрорастущие сахаромицеты, которые в основном представлены р.Мусог. В нижнем горизонте подстилки (Аон) как и на поздней стадии разложения растительных остатков, доминируют грибы, отличающиеся низкой скоростью роста, но способные расщеплять ароматические соединения (ванилин, ванилиновая, вератро-вая, лротокатеховая кислоты, дегидродиванилил и др.).

Смена различных родов грибов по слоям подстилки идет путем обогащения каждого последующего слоя формами из вышележащего. Многие грибы, попадая из верхних слоев, могут находится в нижележащих в неактивном состоянии в виде спор и способны развиваться только при поступлении дополнительных органических веществ (Борисова, 1988).

Таким образом, сукцессионные изменения состава гифомицетов приурочены к разным фазам разложения подстилки и отражают степень минерализации органического вещества.

Известно, что основную функцию при деструкции опада в лесных биогеоценозах играют грибы, однако наличие бактерий в значительных количествах, позволяет говорить об активном участии бактериального компонента биоты в этих процессах. Так, бактерий, вырастающих на среде с органическим источником азота (МПА), в верхнем слое подстилки в начале вегетации значительно меньше, чем в нижних. К середине лета и к осени по мере поступления свежих растительных остатков численность микроорганизмов в этом слое увеличивается.

При учете бактерий, предпочитающих минеральные формы азота, различие между слоями выявляется более четко. Весной количество их в верхнем слое в 100 раз меньше, чем в нижних, а к осени, по мере усиления минерализации остатков, оно выравнивается по всей толщине подстилки.

Следует отметить, что если в поверхностном слое соотношение числа микроорганизмов, вырастающих на КАА и на МПА, в течение всего сезона не превышает 1, то в нижних горизонтах этот показатель весной составляет 4-11, а к осени, в период поступления опада, уменьшается до 1 и менее.

Численность спороносных бактерий во всей толще подстилки изменяется одинаково: резкий спад в середине лета и постепенный подъем к осени. В течение всего сезона сохраняется последовательное уменьшение числа бактериальных спор от верхнего слоя к нижнему.

Нами установлено, что численность олигонитрофильных микроорганизмов в

нижних слоях изменяется незначительно, а в поверхностном возрастает с наступле нием тепла и усилением минерализации растительного материала.

Плотность актиномицетного населения в верхнем слое подстилки оказалас сравнительно низкой, здесь доминировали 3 непигментированных вида из секци: Albus. С глубиной возрастала как плотность, так и видовое разнообразие актиномице тов. В нижних слоях встречаются в основном 7 пигментированных видов, принад лежащих к секции Cinereus.

Наиболее четкая дифференциация слоев подстилки обнаруживается при анапи зе структуры микробоценоза и определении количественного соотношения в них мик роорганизмов, учитываемых прямым счетом и методом посева на МПА. Это соот ношение, называемое коэффициентом учитываемое™ (К) отражает важную экологи ческую характеристику микробного сообщества и возрастает сверху вниз по подсти лочному слою, что свидетельствует о более зрелой стадии развития микробоценоза i нижних слоях подстилки (Кожевин и др., 1980). Подобная закономерность отмечает ся в нижних горизонтах в начале осени. В верхнем слое значение этого коэффициент: постепенно снижается от середины лета к осени, что указывает на омолаживани комплекса микроорганизмов в связи с поступлением новых растительных остатков.

Таким образом, установлено, что различные слои подстилки четко дифферен цируются по многим микробиологическим показателям: по характеру изменения чис ленности основных групп микроорганизмов, в особенности актиномицетов и споро носных бактерий, олигонитрофильных организмов, а также по соотношению микро организмов, вырастающих на КАА и МПА.

Деструкция остатков древесных растений. Анализ скорости деструкции ор ганических остатков различного химического состава показал, что наиболее быстр* разлагаются опад и кора деревьев, в которых, в отличие от опилок и лигнина, активж размножаются целлюлозоразлагающие актиномицеты и грибы. За 60 дней в летне осенние месяцы разлагается около 33% опада и 17% коры.

Опилки, состоящие в основном из волокон целлюлозы, пропитанные трудно разлагаемым лигнином, восками и смолами, разлагаются очень медленно. Числен ность целлюлозоразрушающих микроорганизмов незначительна, а актиномицеты ] миксобактерии почти отсутствуют. С другой стороны, в них в большом количеств' обнаруживаются бактерии, обладающие слабой активностью разрушения клетчатки Лигнин практически не разрушается, несмотря на присутствие лигнинразлагающи: грибов из p. Aspergillus и бактерий со слабой активностью деградации фенольны: соединений и гидролизного лигнина.

Выявлены общие закономерности сукцессии микроорганизмов при деструкцш лесного опада, коры, опилок, лигнина. При поступлении в подстилку органически: субстратов происходит быстрое заселение их пионерными организмами - неспоро носными аммонифицирующими бактериями. Под влиянием деятельности этих мик

оорганизмов протекает первая фаза разложения легкодоступных азотистых соедине-ий. Это приводит в дальнейшем к размножению бактерий, потребляющих минераль-ые формы азота, а в конечном итоге - к преимущественному развитию бацилл и ак-иномицетов, грибов, способных к глубокому преобразованию растительного мате-иала при участии многочисленных ферментов.

Особо следует отметить сукцессию почвенных грибов, так как большинство рибов отличается полифункциональностью, т.е. одни и те же виды могут осуществ-ять разнообразные процессы. В растительных остатках (опад, кора, опилки) в начале азложения, обнаружены два вида "сахаролитических" грибов, главным образом му-оровых, которые используют только простые углеводы, и один вид быстро растущих еллюлозоразлагающих почвенных грибов, таких как ТпсЬос1егта. которые могут раз-иваться параллельно с "сахарными" грибами. На 90-й день деструкции число видов величивалось до 9-10. Появились медленно растущие целлюлозолитические и игнинразлагающие грибы. При деструкции лигнина видовой состав грибов был остоянен.

Численность микроорганизмов, учитываемых методом посева, возрастала в ечении первого месяца сукцессии, но затем постепенно снижалась. Однако, общее исло бактерий, определяемых прямым микроскопированием, увеличивалось. Исходя з концепции П.А. Кожевина и Д.П. Звягинцева (1980) о "зрелости микробных сооб-1еств" и полученных данных следует, что быстрое формирование зрелого микробо-еноза отмечается при деструкции опада (К=180) и коры (К=135). Лигнин, как уже называлось выше, разлагается очень медленно, вследствие чего темпы перестройки [икробного комплекса и созревания микробного сообщества низкие.

Экспериментально доказано, что интенсивность деградации естественных омпонентов древесных растений (опад, кора) значительно выше, чем разложение нтропогенных органических отходов (опилки, лигнин); общие закономерности сук-ессионного распределения основных эколого-трофических групп микроорганизмов охраняются независимо от вида древесных остатков.

2. Деградация древесных материалов при компостировании.

Исходными материалами для приготовления корокомпостов служили отходы еллюлозно-картонного комбината. В коре исходное содержание углерода составля-о 43,74%, азота - 0,46 и фосфора - 0,36, а в иле соответственно 33,3, 1,60 и 0,65%. омпосты готовили смешиванием коры и активного ила в соотношении 1:1 и 1:3 (на :с абсолютно сухого вещества). Компостирование осуществляли при двух темпера-/рных режимах: 20-25 °С и 50-60 °С. Температуру и влажность поддерживали посто-;шо на протяжении опыта.

Групповой анализ комплекса микроорганизмов и статистическая обработка элученных данных методом факторного анализа показали, что характер сукцессии 1висит от температуры компостирования. Температура 20-25 °С более благоприят-

на для бактерий, учитываемых на МПА и КАА, и грибов. Повышение температурь оказывает влияние на рост актиномицетов и олигонитрофильных микроорганизмов От соотношения коры и ила в компосте зависит численность бактерий растущих ш МПА и КАА, грибов и споровых бактерий.

В начальный период компостирования при высокой температуре происходит перегруппировка и смена мезофильных организмов термофильными или термотолерантными организмами, что подтверждается значительным ростом численности баци лярного населения и актиномицетов (рис.2). Среди упомянутых организмов были выделены бактерии и актиномицеты, способные к разложению не только целлюлозы, не и некоторых модельных соединений лигнина, таких как ванилин и его производные.

При компостировании в условиях высокой температуры установлено увеличение численности олигонитрофильных бактерий, в особенности термофильных, посте-

□ Бактерии на МПА В Бактерии на КАА

□ Актиномицеты

□ Олигонитрофилы

□ Грибы О Бациллы

□ Термофильные бактерии

О Термофильные актиномицеты

Рис.2. Изменение численности различных физиологических групп микроорганизмов при компостировании отходов деревообработки (млн/г компоста); А - весовое соотношение кора/ил=1:1, Б - весовое соотношение кора/ил=1:3; 1 - исходное, 2 - через 210 сут. компостирование при 20-25°С, 3 - через 210 суток компостирование при 50-60 °С.

пенное сннжение численности микроскопических грибов и отсутствие их на 90-й день. В отличие от этого в мезофильных условиях компостирования число их несколько возрастает и на 90-150-й день выявляются в большом количестве грибы Aspergillus sedowii, A.niger, Pénicillium citreo-viride.

Благодаря деятельности микроорганизмов, принимающих участие в окислении органических остатков до углекислого газа, происходит уменьшение общего содержания углерода и возрастание относительного количества азота при компостировании. В соответствии с этим соотношение C/N снижается от 31-36 в исходном материале до 21-27 в готовом компосте. Кроме того в процессе созревания компоста отмечается тенденция к повышению содержания фракции гуминовых и снижению фульвокислот, в соответствии с этим увеличивается соотношение Сгк/Сфк от 1,24-1,41 до 2,5-2,97 (табл. 1).

Таблица 1

Химическая характеристика компостов, различного способа

приготовления, % от сухого веса

Варианты Общий Общий C/N Гуминовые Фульво- О Г1С /С фк

смеси азот углерод кислоты кислоты

исходная 1:1 1,13 41,8 36 3,89 2,76 1,41

1:3 1,37 42,6 31 3,62 2,91 1,24

конечная 1:1 1,52 39,1 26 4,33 2,43 1,78

1:3 1,80 37,0 21 3,81 2,46 1,55

(1:1)Т 1,38 37,7 27 3,85 1,54 2,50

(1:3)Т 1,71 36,5 21 4,43 1,49 , 2,97

Скорость созревания компоста зависит от большого числа факторов, из кото-эых можно выделить температуру, соотношение СЛЧ в субстрате, аэрацию, влажность, рН среды. Все эти параметры влияют на биохимические и физиологические ;войства всего микробного комплекса, активная деятельность которого приводит к деградации растительных остатков и к образованию зрелого компоста. Отсюда следует, что скорость созревания компоста можно увеличить, добавляя в компостируемую :месь микробные ассоциации, сформировавшиеся в процессе созревания корокомпо-гга. Введение таких культур в свежий энергетический и питательный субстрат приводит к активизации каждого из членов микробного сообщества и к быстрой трансформации всех компонентов растительного материала.

Независимо от температуры инкубации процесс стабилизации комплексов ме-юфильных микроорганизмов заканчивался через 14 дней вместо 30. При этом микроорганизмы быстрее адаптируются к органическим компонентам древесных остатков и

процесс разложения начинается сразу же после инокуляции, либо после непродолжительной (3-8 суток) лаг-фазы. Возрастание численности олигонитрофильных бактерий и коэффициента учитываемое™ (К от 330 до 570) свидетельствует о стабилизации микробоценоза, характерной для зрелого микробного сообщества.

3. Микробиологическая деструкция гидролизного лигнина

Одной из актуальных задач, стоящих перед практиками является сокращение сроков компостирования путем ускорения сукцессии микроорганизмов, принимающих участие в разложении лигнина. Инокуляция микробоценозом, сформировавшимся в процессе созревания лигнокомпоста не дала ожидаемого результата. Поэтому последующие исследования были направлены на поиск активных культур микроорганизмов с целью создания "компостной закваски".

Особенности структуры микробоценозов, участвующих в разложении лигнина. Выделение активных лигнолитических организмов проводили из накопительных культур содержащих модельные соединения лигнина путем высева на плотные питательные среды. Из 150 штаммов выделенных микроорганизмов были выявлены наиболее активные штаммы целлюлозо- и лигнинразрушающих грибов -Aspergillus niger, Aspergillus sydowii, Pénicillium citreo-viride, Pénicillium sp., Cephalosporium; актиномицетов - Actinomyces thermoviolaceus; бактерий - Bacillus subtilis, Bacillus cereus.

Экспериментально подобраны оптимальные условия для проявления максимальной лигнолитической активности: pH в интервале от 4,5 до 6, температура для грибов 30-35 °С, актиномицетов и бактерий - 35-40 °С, аэрация не влияла на скорость деструкции модельных соединений.

Большинство выделенных штаммов проявляют способность к разложению ванилина и феруловой кислоты. Два вида грибов Aspergillus sydowii и Asp. niger разлагали довольно широкий спектр модельных соедитений: ванилин, ванилиновая кислота, изованилин, дегидродиванилин, феруловая кислота, сиринговая кислота, вератровая кислота, протокатеховая кислота. За 20 дней культивирования Asp. niger разрушал 25,7% дегидрованилина, 22,3% феруловой и 16,7% ванилиновой кислот. При культивировании Asp. niger ванилин окисляется до ванилиновой кислоты с последующим образованием промежуточного продукта с максимум поглощения при 255 нм и 290 нм, который разлагался полностью на 8-е сутки. Скорость деградации ванилина культурой Asp. sydowii по сравнению с Asp. niger несколько ниже, полное разложение его происходит за 26 дней. По этому же пути идет деградация ванилина культурами Cephalosporium и Pénicillium citreo-viride.

Из компостируемой смеси на жидкой синтетической среде с сиринговой кислотой выделена смешанная культура грибов, состоящая из двух представителей рода Pénicillium, один из которых отнесен к виду P. citreo-viride. Второй штамм неиденти-фицирован, но обладает более высокой скоростью деградации сиринговой кислоты по

сравнению с P.citreo-viride. Разложение феруловой и ванилиновой кислот чистой культурой P.citreo-viride происходит на 15-й день. В то же время в смешанной культуре с Penicillium sp. такой же уровень деградации отмечается на 5-й день.

Выделенные из компоста спорообразующие бактерии Bacillus subtilis и Вас. cereus в чистой культуре не проявляли способность к деградации лигнина и модельных соединений лигнина. Однако, при совместном культивировании этих видов обнаруживается деградация многих соединений лигнина. Эти данные подтверждают высказывание ряда авторов (Burgess, Criffin, 1967; Mishta et al., 1979), что при смешанном культивировании скорость деградации значительно повышается и разложению могут подвергаться соединения лигнина, которые не утилизируются монокультурой.

Для ускорения процесса разложения гидролизного лигнина была использована искусственно созданная микробная ассоциация (Cephalosporium sp., Aspergillus niger, Asp.sydovvii, Penicillium citreo-viridae, Pen.sp., Phanerochaete chrysosporium). Эти мик-эоорганизмы, как показали наши исследования, не являются антагонистами по отношению друг к другу. Гидролизный лигннн(ГЛ) был подвергнут воздействию ассоциацией в течение одного месяца. Для сравнения использовали одну из наиболее активных культур - Cephallosporium sp.

Установлено, что при твердофазной ферментации, наиболее эффективное разложение ГЛ происходит под воздействием микробной ассоциации (табл. 2).

Таблица 2

Деградация гидролизного лигнина (% от воздушно-сухого веса)

Варианты опыта Лигнин Класона Диоксан-лигнин ДЛ) Целлюлоза

Контроль 71,6 6,0 23,2

Cephallosporium sp. 57,2 9,1 19,9

Ассоциация 28,1 11,3 11,9

Биодеградация ГЛ происходит с образованием как олигомерных, так и низкомолекулярных продуктов распада. Так, если средняя величина молекулярной массы }Л, выделенного из исходного ГЛ, колеблется от 20 до 30 тыс., то у ДЛ, выделенного 13 биологически разрушенного ГЛ, молекулярная масса уменьшается почти в 10 раз и юявляется дополнительное количество карбоксильных групп.

Дальнейшему исследованию был подвергнут ДЛ, выделенный из гидролизного [игнина. Он более доступен для микроорганизмов, поэтому быстрее и глубже подвер-ается разрушению. Гель-хроматограммы культуральной жидкости микроорганизмов с 1Л показали значительное снижение содержания фенольных водорастворимых продуктов распада со средней молекулярной массой 2-3 тыс. (рис.3).

Анализ ИК-спектров деградированного ДЛ свидетельствует о существенном вменении состояния химических связей и функциональных групп исходного ДЛ в езультате микробиологического воздействия. Резкое уменьшение интенсивности по-

лосы 1500 см 1 указывает на значительную деструкцию ароматического кольца, группы полос в области 1140-1275 см - на разрыв эфирных связей. Газожидкостн< хроматографией среди продуктов деградации ДЛ были обнаружены низкомолекуля ные жирные кислоты, такие как пальмитиновая, стеариновая, арахиновая и бег новая (рис.4). Кроме того, были идентифицированы ароматические (сиреневая, ан совая, вератровая) и дикарбоновые (адипиновая, янтарная) кислоты. Все эти вещее ва не относятся к группе токсичных для роста растений.

Д

0,8

0,5

0,1

Рис.3. Гель-

хроматограмма диоксан-лигнина (1200 им): 1-исходного, 2-при деградации монокультурой, 3-при деградации микробной ассоциацией.

мл

15

10

3 2

0,2

мм,тыс.

Относительная амплитуда

100

50 .

10

15

20

25

30

I, мин

Рис.4. Газожидкостная хроматограмма продуктов разложения диоксан-лигнн микробной ассоциацией: 1-янтарная, 2-адипиновая, 3-анисовая, 4-вератровая, иреневая кислоты;6,7,8,9,10-фракция жирных кислот,(С16,С,8,С2о,С22,С24) соответс венно.

Таким образом, микробиологическая деструкция ГЛ выбранной нами ассоциа-ией микроорганизмов происходит за счет разрыва эфирных связей, ароматического ольца лигнина и, вероятно, С-С связей. В результате деструкции ГЛ сначала накапли-аются фенольные олигомерные фракции, растворимые в диоксане, а затем последние одвергаются разложению до простых водорастворимых соединений. За счет реакции аскрытия бензольного кольца образуются нетоксичные для растений низкомолеку-ярные жирные, оксикарбоновые, дикарбоновые и ароматические кислоты. Разложе-ие гидролизного лигнина протекает последовательно и более эффективно под воз-гйствием микробной ассоциации, чем при участии одной из наиболее активных лиг-элитических культур.

Деградация лигнинсодержащнх органических остатков с применением омпостной закваски. Гидролизный лигнин, находясь еще в отвале, уже подвергает-I частичной микробиологической деструкции. Микробное сообщество в отвале гид-элизного лигнина относительно однородно. Лимитирующим фактором для быстрого

0 разложения является недостаток азота, на что указывает значительное количество шгонитрофилов. Недостаток азота может быть компенсирован добавками птичьего эмета, который содержит сложный комплекс микроорганизмов с доминиро-шием споровых термофильных бактерий. Для ускорения процесса разложения через

1 дней компостирования в варианты 1,2,3 вносили ассоциацию микроорганизмов компостную закваску") (табл.3).

Таблица 3

Состав смесей для компостирования ГЛ

Варианты Сокращенные добавки в г/кг лигнина.(вл. вес)

обозначения

помет мочевина суперфосфат натрия

Лигнин Лиг - - —

!.Лигнин+помет ЛигП 146,6 - -

1 .Л игнин+помет+Ы ЛигГШ 134,6 1,0 --

1. Лигнин + N + Р ЛигМР - 1 0 17,1

Результаты микробиологических исследований процессов ферментации смеси из дролизного лигнина и птичьего помета с добавлением минеральных удобрений для апансирования питательных компонентов показывают, что по мере разложения орфических остатков происходит постепенная смена микробных ассоциаций. Ха-етер сукцессионной перегруппировки комплекса микроорганизмов зависит от тем-ратурного режима компостирования.

Так, при 20-25 С после нейтрализации гидролизного лигнина, резко возрастает пичество аммонифицирующих бактерии. Небольшое количество спорообразующих

микроорганизмов и актиномицетов указывает на заторможенность процессов пре вращения трудногидролизуемых соединений.

На четвертый день компостирования при 50°С, происходит перестройка мик робного сообщества с преобладанием термофильных и спорообразующих микроорга низмов. По мере снижения температуры компостирования, возрастает численносп неспороносных аммонифицирующих бактерий и грибов. В этот период происходи разложение легкодоступных веществ (варианты ЛиП°, ЛигШ0). На что указывает даль нейшее повышение численности бактерий, потребляющих минеральный азот, а таю» бацилл, актиномицетов, обладающих более мощным ферментативным аппаратом.

Внесение азота стимулировало развитие микроорганизмов, усваивающих мине ральные формы азота (варианты ЛигГТ№ , ЛигЫР1°), в то время как уровень аммони фицирующих бактерий был очень низок, особенно в варианте ЛигЫП0, так как пр! нагревании происходило разложение мочевины с образованием аммиака.

Спад численности всех групп микроорганизмов в вариантах при 50°С прихо дится на 60 день компостирования с доминированием нескольких видов. Это, вероят но, связано с переходом к потреблению менее доступных органических соединений.

В вариантах Лиг, ЛигП в начале процесса компостирования доминировал! "сахаролитические" грибы с большой радиальной скоростью роста, к концу экспери мента их сменяют "гидролитики", разлагающие целлюлозу и лигнин. Неблагоприятж повлияли на грибную популяцию добавки минерального азота, количество грибов I этих вариантах было очень низким. В вариантах с внесением " компостной закваски грибы вытеснялись из сообщества.

Изучение состава микроорганизмов разрушающих клетчатку показало, что 01 существенно изменяется при разных условиях компостирования. Наибольшее коли чество целлюлозоразрушающих микроорганизмов отмечено в варианте ЛигП. На пер вой стадии разложения целлюлозы развивались актиномицеты и бактерии, затем и: сменяли грибы. Иная картина отмечена в вариантах при 50°С с низким содержание» азотных соединений, где доминировали в основном грибы. Наиболее интенсивно про цесс разложения целлюлозы протекает в вариантах ЛигГО0, ЛигГО°МЗ, ЛигПЫ, гд функцию в разложении целлюлозы выполняют актиномицеты. Внесение "закваски значительно ускоряет процесс разрушения клетчатки.

Установлено, что после четырех месяцев компостирования в вариантах -гидролизным лигнином без добавок и с добавлением птичьего помета снизилос содержание органического вещества и общего углерода, но увеличилось количеств! азота. Это привело к уменьшению отношения СЛЧ.

В процессе компостирования отмечено снижение количества гемицеллюлозы жиров, воска, смол, целлюлозы, лигнина и увеличение растворимых полисахаридов.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов установлено, чт< наиболее сбалансированные по основным питательным элементам оказались вариан

ы с добавками извести и птичьего помета.

4. Определение биологической ценности древесных компостов.

Наиболее важным моментов в приготовлении компостов является определение го зрелости. Для этого можно использовать ряд показателей: внешние признаки 1ерный или коричнево-черный цвет, отсутствие неприятного запаха, мягкая тексту-а); химические показатели (узкое соотношение C/N); биологические показатели доминирующие актиномицеты Actinomyces apingens и Act. thermoviolaceus, соотно-1ение микроорганизмов, учитываемых прямым счетом и методом посева на МПА ( К 400).

Пригодность компостов в качестве удобрений связана с наличием в них необ-одимых питательных веществ, и в значительной мере обусловлена отсутствием редных или токсичных соединений, которые могут образоваться при разложении мол, воска, лигнина и пр. Избыток аммиака также может оказывать токсическое оздействие, если использовать в качестве удобрения незрелый компост. Для пределения степени зрелости компоста был использован метод биопроб: по сте-ени прорастания семян различных растений (редис, укроп, петрушка, горох, бак-ажаны, морковь, салат, репа, капуста).

Следует отметить, что компостирование при разных температурных ус-овиях отразилось на их токсичности к растениям. Так через два месяца инкубации ри обычной температуре вытяжки из компостов подавляли всхожесть семян всех астений более чем на 20%. А при повышенной температуре происходит распад пи детоксикация многих вредных веществ, содержащихся в компостах.

Было установлено, что на токсичность лигнокомпоста существенное влияние казывают минеральные добавки. Так после четырех месяцев инкубации компост с инеральными добавками азота подавлял всхожесть семян. Это объясняется содержа-ием в компостах аммиачного (вариант ЛигЫР) и нитратного азота (вариант ЛигМРГ). ели в первых вариантах всхожесть не превышала 50%, то в варианте с "закваской" ыла более 72%.

Исследования по изучению влияния корокомпостов на плодородие лугово-1еевых почв проводили на мелиорированном участке совхоза "Троицкий". Схема ■тыта: I-контроль (без удобрений), 2-корокомпост (кора:ил) 1:3 и 1:1, 3-компост тонского производства (для сравнительной оценки). Установлено, что при внесении змпоста наблюдается значительное повышение активности некоторых ферментов, 1ких как инвертаза, пероксидаза, полифенолоксидаза и дегидрогеназа, ускоряются эоцессы аммонификации и нитрификации в почве, активизируются биохимические эоцессы, способствующие переходу органических соединений в легкогидролизуе-ые формы, которые в последующем подвергаются минерализации и становятся эступными для растений. Поэтому в полевом опыте получена ощутимая прибавка южая фитомассы разнотравья по сравнению с неудобренными делянками. Наилуч-

ший результат отмечен при внесении компоста, приготовленного из коры и ила в со отношении 1:1 (увеличение урожайности составило 63% к контролю). При внесенш компостов под сою, наиболее эффективным оказался компост, приготовленный и коры и ила в соотношении 1:3 (прибавка урожая 34%).

Исследования по изучению возможности применения компоста из гидролизно го лигнина для повышения продуктивности луговых текстурно-дифференцированны; почв проводили в ОПХ ДальНИИСХ вегетационно-полевым методом.

В качестве опытной культуры был выбран овес сорта "Союзник". Анализ уро жая показывает, что в сосудах с компостом и нейтрализованным лигнином урожа! биомассы и зерна получены близкие по величине, но значительно выше, чем н; контроле и при внесении одних минеральных удобрений.

Внесение лигнокомпоста приводит к изменению физико-химических свойст! почв и их гидролитической кислотности. Степень насыщенности обменного комплек са основаниями возрастает при использовании компоста до 83-89%. В вариантах < лигнином и лигнокомпостом содержание магния в обменном комплексе уменьшаете: к концу вегетации (до 8-12%). Вероятно, это происходит за счет адсорбции магния н поверхности лигнина, которая способствует увеличению численности водопрочны: агрегатов. Следовательно, сорбция магния лигнином из почвы при внесении в не лигнинового компоста может служить одним из объяснений увеличения водопрочно сти структуры почвы.

Если принять во внимание, что в условиях временно избыточного переувлаж нения луговых текстурно-дифференцированных почв, внесение лигнина снижает ост руктуренность пахотного слоя на 11,3% и не дает значительной прибавки урожая то оптимальным можно считать вариант с лигнокомпостом.

Таким образом, доказано, что в результате микробиологической ферментацш можно получить эффективное органическое удобрение пригодное для внесения по, сельскохозяйственные растения.

ВЫВОДЫ

1 .Установлено, что в процессе деструкции растительных субстратов различной происхождения сохраняются основные закономерности сукцессии микроорганизмов нарастание олиготрофностн, усложнение состава ассоциаций организмов и расшире ние субстратной специализации видов.

2. Скорость смены одних групп микроорганизмов другими зависит от струк турных компонентов древесных остатков. Интенсивность деградации естественны: компонентов древесных растений (опад, кора) значительно выше, чем разложени промышленных органических отходов (опилки, лигнин).

3. Доказано, что слои лесной подстилки четко дифференцируются по измене нию численности и таксономической структуре всех групп микроорганизмов, в осо

енности актиномицетов и спороносных бактерий, олигонитрофильных организмов, а 1кже по соотношению микроорганизмов, вырастающих на КАА и МПА.

4. С глубиной подстилочного слоя и по мере усиления деструкции лесно-э опада сужается отношение C/N, резко уменьшается содержание липидов, гмицеллюлозы, целлюлозы и белков, возрастают количество водорастворимых олисахаридов, а также сумма фракций гуминовых и фульвокислот.

5. Отмечено возрастание коэффициента учитываемости микроорганизмов в роцессе деструкции подстилки от верхнего слоя к нижнему в течение вегетационного ериода. Снижение значения этого коэффициента при поступлении свежих расти-гльных остатков в конце лета и начале осени свидетельствует об омолаживании мик-обного сообщества в подстилке.

6. Установлено, что в процессе компостирования древесных отходов сукцес-ия микробного комплекса отражает степень разложения органического вещества, [овышение температуры способствует ускорению деградации исходных органических статков. Общим показателем созревания компостов служит возрастание численно-ги актиномицетов, а также снижение соотношение C/N.

7. Процесс компостирования гидролизного лигнина значительно ускоряется ри добавлении компостной "закваски", и сопровождается уменьшением соотноше-ия C/N, накоплением гуминовых кислот и минеральных форм азота.

8. Доказано, что полученные компосты из коры и лигнина способствуют повы-1ению биологической активности почвы и, как следствие, повышают урожайность ельскохозяйственных культур.

Список работ, опубликованный по теме диссертации

1. Пименов Е.П., Имранова E.J1., Кириенко O.A., Чухлебова Л.М. Влияние ко-окомпостов на микробиологические процессы в почвах Приамурья // Матер. VII де-егатского съезда ВОП, Ташкент. 1985. - С.138.

2. Пименов Е.П., Имранова Е.Л. Изменение структуры комплекса микроорга-измов при созревании корокомпостов // Матер. VII съезда Всесоюзного микробиоло-ического общества, Алма-Ата, 1985.- т.6,- С.148.

3. Тен Хак Мун, Имранова Е.Л. Лигниндеградирующие микроорганизмы з древесных остатков // Матер. VII съезда Всесоюзного микробиологического »бщества, Алма-Ата., 1985,-т.б.-С.179.

4. Чухлебова Л.М., Имранова Е.Л. Влияние компоста на микробиологические роцессы и плодородие почвы // Микроорганизмы в сельском хозяйстве - Тез. докл. I Всесоюзной научной конференции, Москва, 23-25 декабря 1986,- С. 65-66.

5. Имранова Е.Л. Микробная сукцессия при разложении древесных остатков в очве // Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйствен-ых культур. - Матер, к секции республ. конф., Вильнюс, 1986,-С. 143.

6. Имранова Е.Л., Тен Хак Мун. Сукцессия микробного комплекса при разл< жении лесной подстилки в березовом лесу // Микробиологическая деструкция о| ганических остатков в биогеоценозе. - Тез. докл. всесозн. совещания., Москва, 1987 С. 46-47.

7. Тен Хак Мун, Пименов Е.П., Имранова Е.Л. Сукцессия микробных компле: сов при разложении древесных остатков // Микробиология. - 1988. - т.57, N3. - ( 472-475.

8. Тен Хак Мун, Имранова Е.Л. Деструкция древесных остатков в подстшн березняка (на примере Славянского стационара) // Почвообразовательные процессы Приамурье, Владивосток, 1989. - С. 55-60.

9. Тен Хак Мун, Имранова Е.Л. Микробиологическая и биохимическг дифференциация лесной подстилки // Известия Сибирского отделения АН СССР. 1989.-вып. 1.-С. 125-130.

10. Тен Хак Мун, Харитонова Г.В., Имранова Е.Л. Биопотенциальнг способность лигнина в тяжелых дифференцированных почвах долины р. Амур. Тез. докл. Советско-китайского симпозиума "Геология и экология бассейна р. Амур Благовещенск. 1989. - часть III. - С. 80-81.

11. Тен Хак Мун, Харитонова Г.В., Имранова Е.Л. Влияние компоста i гидролизного лигнина на физико-химические свойства луговой дифференцирование почвы и на урожайность растений // Тез. докл. VIII Всесоюзн. съезда почвоведо Новосибирск. 1989. - N 3 - С. 127.

12. Kh. Теп., Je. Imranova. Succession of Microbiol Complex during breakdown < litter and wood residue // Transactions of 14-th International Congress of Soil Sciens Kyoto Japan. - 1990. - vol 3. - p. 365-366.

13. Харитонова Г.В., Завальшок H.M., Имранова Е.Л. Применение лигнина ai повышения продуктивности луговых текстурно-дифференцированных почв Пр1 амурья // Агрохимия. - 1997. - N6.-С. 1-7.

14. Имранова Е.Л. Разложение древесных материалов и их компонентов природных условиях // Экологическое состояние и ресурсный потенциал естес венного и антропогенно-измененного почвенного покрова. - Матер, к регнонал] ной научн. конф., Владивосток, 1998. - С.