Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное состояние лимфоидных органов лабораторных крыс при длительном поступлении соединения кремния с питьевой водой

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное состояние лимфоидных органов лабораторных крыс при длительном поступлении соединения кремния с питьевой водой"

На правах рукописи

ТО

ГОРДОВА ВАЛЕНТИНА СЕРГЕЕВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНОВ ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПОСТУПЛЕНИИ СОЕДИНЕНИЯ КРЕМНИЯ С ПИТЬЕВОЙ ВОДОЙ

03.03.04. - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

4 ГЛ 2014

005556239

Чебоксары - 2014

005556239

Работа выполнена на кафедрах ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»: медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии; цитологии, эмбриологии, гистологии; патофизиологии, патологической анатомии с клинической патологической анатомией и судебной медицины

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Сергеева Валентина Ефремовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой гистологии, эмбриологии, цитологии, ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Ерофеева Людмила Михайловна

доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии, ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации Диндяев Сергей Валерьевич

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России»

Защита состоится «25» декабря 2014 г. в 13-00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.117.01 в ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» по адресу: 430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская. 68,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» по адресу: 430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

Объявление о защите и автореферат диссертации размещены на официальном сайте Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарёва www.mrsu.ru и интернет-сайте ВАК http://vak2.ed.gov.ru Автореферат разослан « уУ» 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Владимир Павлович Балашов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Кремний содержится во всех тканях и органах растений, животных и человека (Матыченков В. В., 2008; Голохваст К. С., 2010; Currie Н. A. et al., 2007; Maehira F. et al., 2008). В животном организме он входит в состав гликозами-ногликанов, принимает участие в формировании костной ткани (Мансурова JI. А. и соавт., 2009; Kim М. Н. et al., 2009; Macdonald Н. М. et al., 2012).

Соединения кремния не являются биологически инертными. Вопросы, связанные с поступлением в организм кремния в его различных соединениях и формах, остаются актуальными в мировой науке. Интерес ученых разных стран, касающийся действия соединений кремния на организм, в том числе и на иммунную систему, возрос за последние годы. Многочисленные витральные исследования показывают, что соединения кремния действуют на макрофага, пролиферацию Т-лимфоцитов, вызывают апоптоз дендритных клеток, влияют на синтез интерлейкинов клетками иммунной системы (Smalley D. et al., 1998; Migliaccio С. et al., 2005; Brown J. M. et al., 2007; Winter M. et al., 2011). Опыты на животных представлены интратрахеальным, внутривенным, алиментарным (пищевые добавки) поступлением в организм диоксида кремния (Сапожников С. П. и соавт., 2013).

Изучение действия кремния на организм человека связано с ретроспективными исследованиями больных силикозом легких, носителей силиконовых им-плантатов и страдающих аутоиммунными заболеваниями (Авцын А. П. и соавт., 1991; Teuber S. S. et al., 1995; Ojo-Amaize E. A., et al., 1996). Независимо от способа поступления в организм, диоксид кремния, асбест, силикон и наночастицы кремния способны оказывать сходное выраженное воздействие на звенья иммунной системы, вплоть до участия в патогенезе аутоиммунных заболеваний (Murakami S. et al., 2009; Speck-Hernandez С. A., Montoya-Ortiz G., 2012).

Согласно нормам физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации (Методические рекомендации. MP 2.3.1.2432-08), суточное потребление кремния человеком составляет 30-50 мг в сутки, однако, биодоступность соединений кремния при этом не учитывается. Некоторое количество биодоступной ортокремниевой кислоты образуется при контакте с водой и биологическими жидкостями диоксида кремния, считающегося нерастворимым (Jurkic L. М. et al., 2013). Диоксид кремния входит в состав зубной пасты, декоративной косметики, присутствует в пищевых добавках как разрыхлитель, входит в состав антацидных препаратов (Николаев В. Г. и соавт., 2005; Ердакова В. П., 2007; Акулович А. В. и соавт., 2011; Powell J. J. et al., 2007).

Источником ортокремниевой кислоты (H4Si04), главной формы биодоступного кремния для человека и животных, выступают, в основном, растворимые соединения кремниевых кислот. Превращение силикатов природных вод, в частности, метасиликата натрия, в биодоступную ортокремниевую кислоту происходит под действием соляной кислоты желудка (Jurkic L. М. et al., 2013).

С питьевой водой может поступать от 50 до 80 процентов от суточной потребности, в зависимости от его содержания в природных источниках, которое может превышать 70 мг/л (Сапожников С. П., 2001; .Г^ёаоЬзт^ И.., 2007; 1л е! а!., 2010). Содержание силикатов в питьевой воде в Российской Федерации регламентировано 10 мг/л в пересчете на кремний (ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02).

Имеются исследования, подтверждающие связь концентрации водорастворимых соединений кремния в водно-пищевых рационах жителей различных биогеохимических провинций с возникновением дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта, изменениями иммунного статуса, включая формирование аутоиммунных заболеваний (Сапожников С. П., 2001; Сусликов В. Л. и соавт., 2009; Толмачева Н. В., 2011; Ефейкина Н. Б. и соавт., 2012, 2013; 1ипш1а Б. К., 2011).

Показано, что под воздействием соединений кремния, поступающего с питьевой водой, происходит морфологическая перестройка и перераспределение биогенных аминов в главном органе иммунитета - тимусе (Дьячкова И. М., 2011; Сергеева В. Е. и соавт., 2013).

Однако, имеющихся литературных данных недостаточно для того, чтобы восполнить пробел в исследованиях, посвященных кремнию, и утверждать, что при поступлении в организм соединений кремния с питьевой водой морфо-функциональные изменения носят системный характер и происходят не только в тимусе, но и в других органах иммунной системы. В связи с этим, вполне обоснован поиск морфологического субстрата адаптационных реакций на поступление водорастворимых соединений кремния со стороны центрального и периферических лимфоидных органов.

Цель работы — изучение морфо-физиологического состояния лимфоидных органов (тимуса, селезенки, пейеровых бляшек) лабораторных крыс при длительном поступлении в организм соединения кремния с питьевой водой.

Задачи исследования:

1. Изучить микроморфологические изменения тимуса, селезенки, пейеровых бляшек у лабораторных крыс при длительном поступлении соединения кремния с питьевой водой в концентрации 10 мг/л в пересчете на кремний.

2. Исследовать гистаминсодержащие структуры изучаемых лимфоидных органов в моделируемых условиях эксперимента.

3. Определить состояние тучноклеточной популяции в изучаемых лимфоидных органах.

4. Изучить воздействие водного кремния на состояние популяций клеток, имеющих моноцитарно-макрофагальное происхождение (1Ьа-1-позитивных), в структурах тимуса, селезенки, пейеровых бляшек.

5. Исследовать воздействие водного кремния на состояние популяций антигенпредставляющих (МНС-П-позитивных) клеток в изучаемых лимфоидных органах.

6. Оценить пролиферативную активность в герминативных зонах лимфоидных узелков селезенки и пейеровых бляшек при поступлении кремния с питьевой водой.

Научная новизна

Впервые при комплексном исследовании показаны микроморфологические особенности тимуса, селезенки и пейеровых бляшек у лабораторных крыс при длительном поступлении в организм соединения кремния с питьевой водой.

Проведена оценка изменения обеспеченности гистаминсодержащих структур изучаемых лимфоидных органов в моделируемых условиях эксперимента.

Получены новые научные данные, отражающие количественные и качественные изменения тучных, антигенпредставляющих клеток (МНС-И позитивных клеток) и моноцитарно-макрофагальных (Iba-1 позитивных) клеток тимуса, селезенки и пейеровых бляшек исследуемых животных при воздействии на организм кремния, поступающего с питьевой водой.

Впервые с помощью маркеров пролиферации PCNA и Ki-67 показаны про-лиферативные изменения в герминативных центрах пейеровых бляшек при длительном поступлении кремния с питьевой водой.

Теоретическая и практическая значимость работы

Научные положения и выводы диссертационного исследования в значительной степени расширяют представления о возможных механизмах иммуно-модулирующего действия кремния, в течение длительного времени поступающего ad libitum с питьевой водой, и дополняют современные данные о состоянии структурно-функционального статуса лимфоидных органов (тимуса, селезенки, пейеровых бляшек) лабораторных животных при адаптации к хроническим воздействиям.

Результаты и практические рекомендации диссертации применяются в учебном процессе и могут быть использованы при написании учебных пособий по клеточной биологии, цитологии, гистологии, общей иммунологии, а также в профилактической медицине.

Реализация результатов исследований

Научные разработки и положения диссертационного исследования используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова», в работе БУ «Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики», БУ «Чебоксарская районная больница Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики». Рационализаторское предложение № 1171 «Способ описания морфологического и функционального состояния тучноклеточной популяции в гистологических препаратах», выданное 9 сентября 2013 г. Гордовой В. С., применяется в работе научного студенческого кружка кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии Чувашского государственного университета им. И. Н. Ульянова.

Степень достоверности и апробация результатов

В литературном обзоре подвергнуто критическому анализу большое количество источников. Выбранная модель хронического поступления соединения кремния в организм с питьевой водой соответствует поставленной цели диссертационного исследования. Фактический экспериментальный материал получен на сертифицированном оборудовании. Примененные иммуногистохимические маркеры широко используются для оценки морфо-функционального состояния лимфоидных органов. Адекватно выбранные современные методы исследования с использованием методов параметрической и непараметрической статистики с последующей обработкой полученных данных обеспечивают достоверность результатов проведенных экспериментов.

Основные научные положения, выводы и результаты работы доложены и обсуждены на: Международном конгрессе «Современные методы диагностики и лечения аллергии, астмы и иммунодефицитов» (Тбилиси, Грузия, 23-26 сентября 1999 г.); Всероссийской конференции с международным участием «Морфология в теории и практике», посвященной 90-летию со дня рождения профессора Д. С. Гордон (Чебоксары, 14 ноября 2012 г.); XIX Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммуннореабилитации (ОАЭ, Дубай, 11—15 октября 2013 г.); Международной научной школе «Наука и инновации - 2013» ISS «SI-2013» (Йошкар-Ола, 7-12 июля 2013 г.); Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Современные проблемы естественнонаучных исследований» (Чебоксары, 2012, 2013, 2014 гг.); IV Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Россия, Санкт-Петербург, 18—21 июня, 2013 г.) и расширенном заседании кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова» (Чебоксарь1, 23 мая 2014 г.).

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Структурно-функциональные особенности лимфоидных органов лабораторных крыс при поступлении в организм соединения кремния с питьевой водой заключаются в изменении строения долек тимуса, абсолютном и относительном увеличении площадей герминативных центров лимфоидных узелков селезенки и пейеровых бляшек.

2. Происходят количественные и качественные изменения популяции антигенпрезентирующих клеток при участии гистамина в селезенке и лимфоидных узелках пейеровых бляшек, что отражает процессы пролиферации в морфо-функциональных зонах, ответственных за формирование пула антигенспецифических лимфоцитов при поступлении с питьевой водой кремния.

Публикации

Основные положения диссертационной работы отражены в 14 опубликованных работах, из них 4 - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, входящих в перечень, определенный ВАК Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Диссертационный материал изложен на 164 страницах компьютерного исполнения и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственного исследования, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы, списка сокращений, списка иллюстративного материала. В работе представлено 14 таблиц и 29 рисунков, из которых 24 - микрофотографии. Список литературы содержит 167 отечественных и 128 иностранных источников.

Личное участие автора

Автором самостоятельно собрана и подвергнута анализу научная литература для написания литературного обзора и обсуждения результатов исследований. При непосредственном участии автора проводилась формулировка задач исследования, выбор иммуногистохимических маркеров, планирование эксперимента, проведение экспериментов с животными с последующим выделением лимфоидных органов (тимуса, селезенки, пейеровых бляшек), приготовление криостатных срезов с постановкой реакции по методу Кросса, заливка органов в парафин с приготовлением препаратов, окрашенных гематоксилином-эозином и толуидиновым синим по методу Унна. Фотографирование полученных препаратов с последующей морфометрией, статистической обработкой с применением методов параметрической и непараметрической статистики, интерпретация результатов экспериментов, написание текстов научных статей по полученным данным осуществлялось лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в 2009—2014 гг. в научных лабораториях кафедр ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова»: медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии; цитологии, эмбриологии, гистологии; патофизиологии, патологической анатомии с клинической патологической анатомией и судебной медицины согласно государственному плану по теме «Гистохимия биогенных аминов в морфо-функциональном состоянии органов и тканей в норме и эксперименте (№ 0120.0851887 от 10 сентября 2008 г.)».

2.1. Материал исследования. Объектом исследования являлись вилочко-вая железа, селезенка и пейеровы бляшки 60 белых нелинейных беспородных

крыс-самцов одного возраста и одинаковой массы (150-200 г), содержавшихся в обычных условиях вивария.

Животные были разделены на 2 группы. Первая (контрольная) группа - 30 крыс, получавших ad libitum питьевую воду, соответствующую требованиям ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02. Вторая - 30 крыс, получавших ad libitum питьевую воду, соответствующую требованиям ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02 с добавлением метасиликата натрия в концентрации 10 мг/л в пересчете на кремний. Ежедневно в течение двух месяцев опытные животные получали с питьевой водой в среднем 0,4-0,6 мг/кг кремния. Свободный доступ к питьевой воде был обусловлен моделированием поступления кремния в естественных условиях с питьевой водой. Выбор метасиликата натрия девя-тиводного для изменения концентрации кремния в питьевой воде был обусловлен его растворимостью и опытом использования другими исследователями (Сапожников С. П., 2001, Дьячкова И. М., 2011).

Выведение животных из эксперимента проводилось путем декапитации. Извлекались тимус, селезенка, пейеровы бляшки подвздошной кишки. Часть каждого органа шла на заморозку, часть фиксировали в 10% нейтральном формалине для последующей заливки в парафин. Все действия, предусматривавшие контакты с экспериментальными животными, осуществлялись согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ №755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР) (Каркищенко Н. Н., 2004) и в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.13.1986 г.

Депарафинированные срезы обрабатывались общими морфологическими и иммуногистохимическими методами.

2. 2. Методы исследования

1. Люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста (Cross, Ewen, Rost, 1971) применялся для выявления гистаминсодержащих структур лимфоидных органов.

2. Метод цитоспектрофлуориметрии использовался для идентификации и количественного выражения уровня гистамина в тканевых структурах лимфоидных органов (Карнаухов В. Н., 1978).

3. Окраска полихромным толуидиновым синим по методу Унна (Артишев-ский А. А. и соавт., 1999) применялась для контроля состояния тканевых муко-полисахаридов и гепарина в тучных клетках лимфоидных органов.

4. Иммуногистохимический метод непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием антител к кальций связывающим адапторным молекулам (Iba-1) был использован для выявления клеток, имеющих моноцитарно-макрофагалыюе происхождение (Smorodchenko A. et al., 2007).

5. Иммуногистохимический метод непрямого ИФА с использованием антител к белкам главного комплекса гистосовместимости второго класса (MHC-II) применялся для выявления антигенпредставляющих клеток лимфоидных органов (Sarilova I. L. et al., 2008).

6. Люминесцентно-иммуногистохимический метод непрямого ИФА с использованием антител к белку PCNA применялся для выявления клеток, содержащих циклин А, функционирующий в S-фазе клеточного цикла как кофактор ДНК-полимеразы, в герминативных зонах лимфоидных узелков селезенки и пейеровых бляшек лабораторных крыс.

7. Иммуногистохимический метод непрямого ИФА с использованием антител к белку Ki-67 применялся для выявления пролиферативных процессов в герминативных зонах лимфоидных узелков селезенки и пейеровых бляшек лабораторных крыс.

При анализе экспрессии маркеров пролиферации (Ki-67, PCNA), подсчетом не менее чем в 10 полях зрения при иммерсионном (х900) увеличении, определяли индекс пролиферативной активности клеток для каждого маркера по формуле: I = N / N1 х 100% , где N - количество позитивных ядер в поле зрения, N1 - общее количество ядер в поле зрения (Тищенко Д. В. и соавт., 2012).

Положительным контролем специфичности иммуногистохимических реакций на маркеры пролиферации служили ткани, рекомендованные производителями антител, отрицательным контролем являлись неиммунизированные срезы. Часть исследования, включающая иммуногистохимические методы непрямого иммуноферментного анализа, была проведена в лаборатории на базе пато-логоанатомического отделения ГАУЗ «Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения республики Татарстан».

8. Окраска гематоксилином и эозином применялась для общегистологической характеристики структур лимфоидных органов и проведения морфометри-ческого анализа (Луппа X., 1980).

9. Морфометрический анализ включал измерение размеров коркового и мозгового веществ долек тимуса, в лимфоидных узелках селезенки измерялись площади герминативных центров, маргинальной и мантийной зон, в лимфоидных узелках пейеровых бляшках измеряли высоту и длину узелков, ширину межузелковых зон, площадь герминативных центров. Измерение проводилось после фотографирования препаратов при увеличении объектива 4 и окуляра 10.

Количество тучных клеток в тимусе и селезенке подсчитывалось в каждом препарате на поле зрения при иммерсионном увеличении в 30-50 полях зрения, количество Iba-1-позитивных клеток, МНС-П-позитивных клеток в лимфоидных органах подсчитывалось при увеличении объектива 40 и окуляра 10 светового микроскопа МИКМЕД-5

Определение размеров клеточных структур проводилось после фотографирования препаратов при увеличении объектива 40 или 90 и окуляра 10 с использованием светового микроскопа МИКМЕД-5.

Линейные морфометрические измерения площадей клеток и структур, а также количественная оценка активности мембранных и цитоплазматических иммупогистохимических реакций выполнены с применением демо-версии программы «Sigma Scan Pro 5.0» (Дьячкова И. М., 2011; Москвичев Е. В., 2013).

10. Статистический анализ полученных цифровых данных проводился с помощью программы Microsoft Office Excel. Рассчитывалось среднее арифме-

тическое значение площадей структурно-функциональных зон лимфоидных органов, количества тучных клеток, Iba-1-позитивных клеток, MHC-II-позитивных клеток, а также среднее арифметическое значение интенсивности люминесценции гистамина как по каждому животному, так и в группе.

Средние величины (М) приводятся в тексте со стандартной ошибкой среднего значения (m).

При статистической обработке данных анализ различий между исследованной группой и контрольной группой экспериментальных животных проводили проверку вариационных рядов на нормальность распределения. В случае, когда гипотеза о нормальности распределения отвергалась, использовали непараметрический критерии Манна—Уитни. В остальных случаях для оценки статистической значимости различий средних величин (р < 0,05) t-критерий Стыо-дента рассчитывался с помощью программы Microsoft Office Excel через статистические методы ТТЕСТ, при установке хвосты = 2 (использовалось двустороннее распределение), тип = 3 (для неравных отклонений). Для оценки различий между качественными признаками и относительными величинами использовался z-критерий (Медик В. А. и соавт., 2000).

11. Корреляционный анализ проводился для установления взаимосвязей между показателями интенсивности светопропускания цитоплазматической мембраны, цитоплазмы и площадью клеток в Iba-1-позитивных и MHC-II-позитивных структурах изучаемых органов. Положительный коэффициент корреляции означает одновременное возрастание средних значений в исследуемой паре, отрицательный - снижение средних значений в одном члене пары при возрастании в другом (Медик В. А. и соавт., 2000).

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Структурно-функциональное состояние тимуса лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой

В дольках тимуса лабораторных крыс при поступлении с питьевой водой кремния наблюдается изменение морфологии тимусной дольки (Рисунок 1).

WÊÊÊÊÊIIKsÊÊÊim

Рисунок 1. Дольки тимуса лабораторных крыс. Окраска гематоксилин-эозином. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 4. Ок. 10. А - тимус животного контрольной группы. Б - тимус животного, получавшего кремний с питьевой водой. 1 - мозговое вещество долек тимуса.

У животных опытной группы наблюдалось увеличение числа долек с фрагментарным расположением мозгового вещества (70,3% против 47,8% в контрольной группе (р < 0,05).

Происходит незначительное изменение общей площади долек за счет увеличения в 1,3 раза (р < 0,05) соотношения площади коркового к площади мозгового вещества в дольках тимуса.

Характеристика макрофагов тимуса представлена в таблице 1.

Таблица 1

Iba-1-позитивные клетки тимуса лабораторных крыс

Морфо-функциональные зоны долек тимуса Показатели Контрольная группа Опытная группа

Корковое вещество долек тимуса Площадь клеток, мкм 77,31±7,46 76,03±4,4

ИСП мембраны, у.е. 105,50 ±1,29 90,58±1,14*

ИСП цитоплазмы, у.е. 113,74±1,89 114,91±1,37

Граница между корковым и мозговым веществом долек тимуса Площадь клеток, мкм" 88,37±4,37 123,79±8,48*

ИСП мембраны, у.е. 94,23±0,68 90,56 ±1,12**

ИСП цитоплазмы, у.е. 124,64±0,99 125,21±1,53

* — различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,001 ** - различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,05

Наблюдается исчезновение положительно направленной корреляционной связи слабой силы (г=0,41 для контрольной группы, г=0,04 для опытной группы) между интенсивностью светопропускания в мембране и в цитоплазме 1Ьа-1-позитивных клеток на границе между корковым и мозговым веществом.

Антигенпрезентирующие (МНС-И-позитивные) клетки располагаются в дольках тимуса животных контрольной группы виде четкой линии, отграничивающей корковое вещество долек от мозгового. У животных опытной группы количество МНС-Н-позитивных клеток на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса увеличивается в 1,3 раза на 100 мкм длины границы между корковым и мозговым веществом долек тимуса (р < 0,05), средняя площадь МНС-П-позитивных клеток тимуса составила 30,23±2,13 мкм" для контрольной группы и 35,58±1,94 мкм2 для опытной (р < 0,05).

В препаратах тимуса животных обеих групп, обработанных по методу Кросса, выявляются следующие гранулосодержащие люминесцирующие структуры: клетки на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса; клетки, прилежащие к корковым перегородкам; клетки коркового вещества. Наблюдается тенденция к относительному увеличению интенсивности люминесценции гистамина во всех группах люминесцирующих клеток тимуса у животных опытной группы а также, в большей степени, в микроокружении этих

структур, однако различия с контрольной группой не являются статистически значимыми.

Тучные клетки тимуса крыс адаптируются к поступлению с питьевой водой кремния изменением тинкториальных свойств и других своих качественных характеристик, представленных в таблице 2.

Таблица 2

Характеристики тучных клеток (М±щ)

Показатели Контрольная группа Опытная группа

Количество клеток в поле зрения, шт 2,32±0,19 2,19±0,21

Площадь клеток, мкм2 72,83±1,63 67,86±2,05**

Ортохромные клетки, % 14,6 13,7

Метахроматичные Р1,% 25,92 10,8*

Метахроматичные р2. % 36,2 31,6

Метахроматичные р3| % 23,3 43,9*

Клетки с рыхлым расположением гранул, % 19,3 47,5*

Дегранулированные, с нарушением целостности мембраны, клетки, % 9,4 21,0**

* — различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,001 ** - различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,05

3.2. Структурно-функциональное состояние селезенки лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой

При окраске срезов селезенки гематоксилином-эозином в органах контрольных и опытных животных, выявляется белая и красная пульпа. Красная пульпа представлена скоплениями клеточных элементов крови, ретикулярными волокнами и резидентными макрофагами. Белая пульпа представлена совокупностью лимфатических узелков на разных стадиях развития, которые отличаются между собой размерами, формой, наличием центра размножения различной степени выраженности (Рисунок 2).

Рисунок.2. Белая пульпа селезенки лабораторных крыс. Окр. гематоксилин-эозином. Микроскоп МИКМЕД-1. 06.20. Ок. 10. А - контроль; Б - опыт.

Визуальная картина полностью подтвердилась морфометрическими данными (Таблица 3).

Таблица 3

Морфометрические показатели вторичных лимфоидных узелков селезенки лабораторных крыс (М±т)

Площадь структур Контрольная группа Опытная группа

Герминативным центр, мкм 23407,19±1672,50 29323,71±2312,92*

. . 2 Мантииная зона, мкм 74711,86±4926,84 70502,90±4787,01*

Маргинальная зона, мм2 0,14±0,01 0,14±0,01

Общая площадь узелка, мм" 0,24±0,02 0,23±0,01

* - различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,05

В селезенке животных обеих групп Iba-1-позитивные клетки можно наблюдать в белой пульпе, маргинальной зоне белой пульпы, в красной пульпе (Таблица 4).

Таблица 4

Сравнительная характеристика Iba-1-позитивных клеток селезенки

Зоны селезенки Показатели Контрольная группа Опытная группа

Маргинальная зона Площадь клеток, мкм" 73,45±2,38 62,01±1,8*

ИСП мембраны, у.е. 102,81±0,79 102,29±0,99

ИСП цитоплазмы, у.е. 124,00±0,92 121,99±1,02

Красная пульпа Площадь клеток, мкм2 83,86±2,45 74,74±2,64**

ИСП мембраны, у.е. 95,37±0,73 93,02±0,85**

ИСП цитоплазмы, у.е. 130,43±0,07 126,36±1,22**

* - различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,001 ** - различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,05

Сравнение признаков (размеры, интенсивность светопропускания мембраны и цитоплазмы) МНС-П-позитивных клеток лимфоидных узелков не обнаруживает различий между контрольной и опытной группами. Количество МНС-И-позитивных клеток на один узелок составляет для контрольной группы 51,08±4,80 клеток, а для опытной - 95,53±8,09 клеток (р < 0,001).

В препаратах селезенки животных обеих групп, обработанных по методу Кросса, различаются следующие гранулосодержащие люминесцирующие структуры: клетки, располагающиеся внутри лимфоидных узелков, клетки си-нусоидов белой пульпы, клетки красной пульпы.

Соотношение интенсивности люминесценции гистамина между микроокружением гистаминсодержащих структур селезенки и этими структурами у контрольных и опытных животных, выраженное в процентах, составило

34,40±3,12% и 46,29±2,49% соответственно (р < 0,05) для клеток лимфоидного узелка, 53,21±4,42% и 61,76±3,18% соответственно для клеток синусоидов белой пульпы, 46,94±2,93% и 58,65±2,11% соответственно для клеток красной пульпы (р < 0,001).

Количество тучных клеток составило 1-2 клетки в 40 полях зрения для 20% крыс контрольной группы, а для 60% крыс опытной группы оно составило в среднем 1 клетку на 10 полей зрения при увеличении х400. У остальных животных тучных клеток в селезенке, окрашенной по методу Унна, нами не найдено. Иммерсионное увеличение показало, что тучные клетки селезенки животных обеих групп метахроматичны.

Индекс пролиферации для метода, выявляющего маркер РСЫА, составил для контрольной группы животных - 78,54±2,22%, для опытной - 74,13±1,68%. Индекс пролиферации для метода, выявляющего маркер Ю-67, составил для контрольной группы животных 10,15±0,08%, для опытной - 10,98±0,07%.

3.3. Структурно-функциональное состояние нейеровых бляшек лабораторных крыс при поступлении соединения кремния

с питьевой водой

Макропрепараты пейеровых бляшек животных контрольной и опытной групп существенно отличаются друг от друга. В увеличенных, более выпуклых, пейеровых бляшках животных опытной группы, напоминающих тутовые ягоды, четко видны отдельные лимфоидные узелки.

Окраска подслизистых агрегированных лимфоидных узелков тонкого кишечника гематоксилином-эозином позволила различить лимфоидные узелки с выраженными герминативными центрами, имеющими более светлую окраску (Рисунок 3).

Рисунок 3. Лимфоидные узелки пейеровых бляшек. Окр. гематоксилин-эозином и альциановым синим. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 4. Ок. 10. А - животное контрольной группы. Б - животное опытной группы.

Визуальные изменения полностью подтверждаются морфометрическими данными (Таблица 5).

Таблица 5

Морфометрические показатели лимфоидных узелков пейеровых бляшек

(М±ш)

Морфометрические показатели Контрольная группа Опытная группа

Высота лимфоидного узелка, мкм 598,26±13,02 738,06±26,38*

Длина лимфоидного узелка, мкм 814,93 ±15,85 932,46±27,05*

Площадь герминативного центра, мм2 0,14±0,01 0,21±0,01*

* - различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,001

В таблице 6 приведены признаки антигенпрезентирующих клеток, по которым нами обнаружены различия между контрольной и опытной группами.

Таблица 6

Характеристика МНС-П-позитивных клеток пейеровых бляшек (М±т)

Морфо-функциональная зона Показатели Контрольная группа Опытная группа

Герминативный центр лимфоидного узелка Площадь клеток, мкм 19,11 ±0,7 19,96±0,87

Количество клеток в поле зрения, шт 2,43±0,16 12,87±0,60*

Межузелковая зона Площадь клеток, мкм2 17,98±0,99 25,69±0,98*

Количество клеток в поле зрения, шт 25,00±1,24 38,6±3,33**

* — различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,001

** — различия с контрольной группой статистически значимы, р < 0,05

У крыс, получавших питьевую воду с добавлением кремния, в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек увеличивается количество Iba-1-позитивных клеток в поле зрения (24,17±0,03 шт. и 17,71±0,32 шт. для опытной и контрольной групп соответственно, (р < 0,001) при уменьшении их средней площади (173,27±16,57 мкм2 и 222,80±16,87 мкм2 для опытной и контрольной групп соответственно, р < 0,05) и изменении интенсивности све-топропускания в их цитоплазме (137,90±1,59 у. е. и 143,06±1,89 у. е. для опытной и контрольной групп соответственно (р < 0,05).

В пейеровых бляшках лабораторных крыс обеих групп, обработанных по методу Кросса, различимы следующие люминесцирующие структуры: гранулярные клетки герминативных центров лимфоидных узелков, клетки лимфатических синусов, клетки межузелковой зоны.

Наблюдается существенное увеличение интенсивности люминесценции гистамина в клетках межузелковых (Т-зависимых) зон (16,02±1,82 у. е. против 10,37±0,58 у. е., р < 0,05) и их микроокружении (8,22±0,52 у. е. против 4,94±0,21 у. е., р < 0,05) для животных опытной группы, в этой же зоне наблюдается увеличение соотношения интенсивности люминесценции гистамина между микроокружением гистаминсодержащих клеток и самими клетками (в контрольной группе 0,46±0,03, в опытной группе 0,52±0,02 (р < 0,05).

Индекс пролиферации для метода, выявляющего маркер PCNA, составил для контрольной группы животных - 81,56±2,09%, для опытной - 88,29±0,08% (р < 0,05). Индекс пролиферации для метода, выявляющего маркер Ki-67, составил для контрольной группы животных 21,20±0,02%, для опытной — 28,31±0,11% (р< 0,05).

Таким образом, реакция иммунокомпетентных клеток на поступление с питьевой водой соединения кремния зависит как от их происхождения (клетки моноцитарно-макрофагалыюго звена пейеровых бляшек и селезенки реагируют сходным образом), так и от их принадлежности к различным морфо-функциональным зонам лимфоидных органов. Кроме того, повышение интенсивности люминесценции гистамина в микроокружении всех гистаминсодержащих структур в тимусе, селезенке и пейеровых бляшках позволяет предполагать, что гистамин является одним из ключевых звеньев в реакции адаптации лимфоидных органов к поступлению водорастворимых соединений кремния.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены морфо-физиологические особенности тимуса, селезенки и пейеровых бляшек лабораторных крыс при длительном поступлении в организм соединения кремния с питьевой водой ad libitum в концентрации 10 мг/л, сопровождающиеся количественными и качественными изменениями гистаминсодержащих, тучных, антигенпредставляющих и Iba-1-позитивных клеток.

2. В дольках тимуса лабораторных крыс происходит морфологическая перестройка с участием гистаминсодержащих клеток; увеличение размеров Iba-1-позитивных и МНС-П-позитивных клеток на границе коркового и мозгового вещества (в 1,4 раза (р < 0,001) ив 1,2 раза (р < 0,05) соответственно) при длительном поступлении с питьевой водой соединения кремния.

3. В моделируемых экспериментальных условиях в селезенке лабораторных животных наблюдается увеличение в 1,25 раза (р < 0,05) площадей герминативных центров лимфоидных узелков с возрастанием в них количества МНС-И-позитивных клеток и усилением люминесценции гистамина в люминесци-рующих гранулярных клетках лимфоидных узелков и их микроокружении. В маргинальной зоне белой пульпы и красной пульпе селезенки наблюдается уменьшение средних размеров моноцитарно-макрофагальных клеток.

4. Выявлено повышение индекса пролиферативной активности в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек, увеличение в 1,5 раза (р < 0,001) площадей герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых

бляшек с возрастанием в них количества как Iba-1-позитивных клеток, параллельно с уменьшением их размеров, так и МНС-П-позитивных клеток при поступлении кремния с питьевой водой в организм лабораторных крыс. При этом в межузелковой зоне отмечено увеличение количества и размеров МНС-И-позитивных клеток (в 1,5 (р < 0,05) и в 1,4 раза (р < 0,001) соответственно), что сопровождается значительным повышением уровня люминесценции гистамина в гистаминсодержащих клетках и их микроокружении.

5. Тучные клетки тимуса лабораторных крыс адаптируются к поступлению с питьевой водой кремния как изменением внутреннего расположения гранул и созревания кислых гликозаминогликанов в них, так и усилением дегрануляции с нарушением целостности цитоплазматической мембраны.

6. Количественные и качественные изменения антигенпрезентирующих клеток в изучаемых лимфоидных органах свидетельствуют об изменении их активности в зонах, ответственных за формирование пула антигенспецифических лимфоцитов под воздействием соединения кремния, поступающего с питьевой водой.

5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Беляева (Гордова), В. С. Люминесцентная морфология бпоаминов тимуса в условиях иммуносупрессии / Д. С. Гордон, В. Е. Сергеева, С. А. Ястребова, Л. Ю. Ильина, В. С. Беляева (Гордова), О. В. Серова // International Journal on Immunorehabilitation. -1999.-№ 4.- С. 81.

2. Гордова, В. С. Роль соединений кремния в развитии аутоиммунных процессов / С. П. Сапожников, В. С. Гордова // Микроэлементы в медицине. -2013.-N3.-С. 3-13.

3. Гордова, В. С. Нейромедиаторы лимфоидных органов (функциональная морфология) // Здравоохранение Чувашии. - 2013— № 4. - С. 92-96.

4. Гордова, В. С. Гистаминсодержащие структуры лимфоидных органов лабораторных крыс при длительном поступлении кремния с питьевой водой /

B. С. Гордова, В. Е. Сергеева, П. Б. Карышев // Материалы Международной научной школы «Наука и инновации - 2013» ISS «SI-2013» 7-12 июля 2013 г., Йошкар-Ола. - 2013. - С.159-164.

5. Гордова, В. С. Влияние соединения кремния на лимфоидные органы и пристеночную микрофлору кишечника лабораторных животных / Н. Б. Ефей-кина, В. С. Гордова, И. М. Дьячкова, А. С. Семенова // Современные проблемы естественнонаучных исследований: сборник научных статей Чуваш, гос. пед. ун-т; под ред. Ю. Ю. Пыльчиковой. - Чебоксары : Чуваш, гос. пед. ун-т, 2013. -

C. 68-70.

6. Гордова, В. С. Гистаминсодежащие структуры вторичных лимфоидных органов крыс при длительном поступлении кремния с питьевой водой / В. Е. Сергеева, В. С. Гордова, Л. А. Басова // Современные проблемы естественнонаучных исследований: сборник научных статей Чуваш, гос. пед. ун-т; под ред. Ю.Ю. Пыльчиковой. - Чебоксары : Чуваш, гос. пед. ун-т, 2013. - С. 65-67.

7. Гордова, В. С. Воздействие водного кремния на морфологию периферической иммунной системы / С. П. Сапожников, П. Б. Карышев, В. С. Гордова, Д. А. Шумалкина, Н. А. Андреева // Современные проблемы естественнонаучных исследований: сборник научных статей Чуваш, гос. пед. ун-т; под ред. Ю.Ю. Пыльчиковой. - Чебоксары : Чуваш, гос. пед. ун-т, 2013. - С. 71-73.

8. Гордова, В. С. Изучение влияния длительного поступления метасиликата натрия с питьевой водой на лимфоидные органы и пристеночную микрофлору кишечника лабораторных животных / А. С. Семенова, В. С. Гордова, Н. Б. Ефейкина // Человек. Гражданин. Ученый: сб. тр. регион, фестиваля студ. и молодежи (Чуваш, гос. ун-т им. И.Н. Ульянова, 3-7 декабря 2012 г.) - Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2013. - С. 138-139.

9. Гордова, В. С. Основы биосилификации (обзор литературы) / В. С. Гордова, С. П. Сапожников, В. Е. Сергеева, П. Б. Карышев // Вестник Чувашского университета. - 2013. - №3. - С. 401-409.

10. Гордова, В. С. К вопросу о характеристике тучноклеточной популяции при перераспределении гистамина в лимфоидных органах лабораторных животных / В. С. Гордова, О. А. Шатских, Т. Л. Смирнова, Е. М. Лузи-кова и др. // Аллергология и иммунология. - 2013. - Том 14, № 3. - С. 191.

11. Гордова, В. С. Гистамин, кремний и лимфоидные органы / В. С. Гордова,

B. Е. Сергеева // IV Международный симпозиум «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» 18-21 июня 2013 г., тезисы докладов, Санкт-Петербург, 2013. - С. 167-168.

12. Гордова, В. С. Характеристика тучных клеток селезенки лабораторных крыс при поступлении кремния с питьевой водой / Сборник научных трудов молодых ученых и специалистов. - Чебоксары : Изд-во Чуваш, ун-та, 2013. -

C. 7-11.

13. Гордова, В. С. Морфологические изменения пейеровых бляшек лабораторных крыс при поступлении кремния с питьевой водой / Л. А. Басова, В. С. Гордова // Актуальные вопросы медицинской науки: сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященной памяти академика М.И. Перельмана. - Ярославль : ООО Из-дательско-полиграфический комплекс «Индиго», 2014. - С. 43-44.

14. Гордова, В. С. Антпгеннрезентирующие клетки лимфоидных органов // В. С. Гордова, И. М. Дьячкова // Вестник Чувашского университета. -2014. - № 2. - С. 417-424.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИСП — интенсивность светопропускания;

ГЬа-1 — кальций связывающий белок; иммуногистохимический маркер клеток моноцитарно-макрофагального происхождения;

МНС-П — главный комплекс гистосовместимости второго класса.

Подписано в печать 15.10.2014 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 799.

Отпечатано с готового оригинал-макета заказчика

в типографии Чувашского госуниверситета. 428015, г. Чебоксары, Московский проспект, 15.