Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация и распределение симбиотических бактерий в эмбрионах и клетках яичника дрозофил

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация и распределение симбиотических бактерий в эмбрионах и клетках яичника дрозофил"

На правах рукописи

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СИМБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ В ЭМБРИОНАХ И КЛЕТКАХ ЯИЧНИКА ДРОЗОФИЛ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2005

Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Киселёва Елена Владимировна Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических

наук Высоцкая Людмила Васильевна Новосибирский государственный университет, Новосибирск

кандидат биологических наук Блинов Александр Геннадьевич Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт систематика и экология животных СО

РАН, Новосибирск

Защита диссертации состоится " 2005 г. на утреннем

заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д - 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (3832)33-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «ЩммфА^ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного . _^

совета, доктор биологических наук ——Ц^Т^^^-АЩ. I руздев

л^? гз ^

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы. В последние десятилетия существенное внимание уделяется анализу функциональной роли симбиотических бактерий в эукариотических клетках. На основе знаний об особенностях взаимодействия симбионта и хозяина становиться возможным построение биоинженерных моделей для изучения внутриклеточных процессов.

Среди симбиотических бактерий особое место занимает внутриклеточный симбионт насекомых и нематод бактерии рода Wolbachia (кл. Риккетсия), которые были открыты в 1936 году. Исследования последних лет показали, что эти бактерии широко распространены среди насекомых (до 20% видов) (Werren, 1997; McGraw, O'Neill, 1999). Генетические исследования показали, что данные бактерии способны изменять репродуктивные функции хозяина, вызывая цитоплазматическую несовместимость, партеногенез и феминизацию (O'Neill и др., 1992; Stouthamer и др., 1999; Hurst, Jiggins, 2002). Исследования особенностей поведения и функций Wolbachia являются в настоящее время очень актуальными, поскольку изучение механизмов симбиоза позволит посредством бактерий влиять на популяции хозяина, среди которых встречаются, как вредители сельского хозяйства, так и патогенные для животных и человека организмы (Hoffmann и др., 1986).

Одним из наиболее удобных объектов для изучения взаимодействия Wolbachia - хозяин являются дрозофилы, поскольку благодаря генетическим и цитологическим исследованиям этого насекомого накоплено огромное количество данных. Поэтому изучение разнообразия симбиотических бактерий в клетках и эмбрионах дрозофилы может обеспечить исследовать механизмы симбиоза. Используя высокоразрешающую технику, как просвечивающий электронный микроскоп открывается возможность определить особенности распределения симбиотических бактерий в клетках хозяина, исследовать тесное взаимодействие бактерий и компартментов клеток хозяина, оценить влияние бактерий на популяцию насекомых, а также выявить необычные формы симбиоза.

Целью данной работы было исследование структурной организации и распределения симбиотических бактерий в эмбрионах и клетках яичника дрозофилы. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распределение бактерий на разных стадиях раннего эмбриогенеза трех видов (шести линий) дрозофил.

2. Выявить особенности структурной организации симбионтов в цитоплазме эмбрионов и клеток яичника трех видов (шести линий) дрозофил.

3. Изучить влияние антибиотиков на выживаемость симбионтов в клетках разных линий дрозофил.

4. Определить влияние бактерий на выживаемость эмбрионов шести линий дрозофил. Оценить уровень цитоплазматической несовместимости при скрещиваниях разных линий дрозофил зараженных симбионтами.

5. Исследовать возможные структурно-функциональные взаимодействия между симбионтами и внутриклеточными компартментами ранних эмбрионов и клеток яичника дрозофилы.

Научная новизна и практическая ценность работы. В представленной работе проведен сравнительных анализ структурной организации бактерий Wolbachia штаммов wMel, wRi, которые были идентифицированы в лабораторных видах Drosophila simulons (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly). С помощью флуоресцентной и электронной микроскопии описаны особенности распределения симбиотических бактерий в эмбрионах и клетках яичника дрозофил. При изучении шести лабораторных линий дрозофил, впервые выявлена и морфологически описана новая форма бактериоподобных структур, имеющих не свойственную какому либо из типов бактерий структуру и выявленных в клетках дрозофил. Установлено, что необычная бактериальная форма устойчива к действию тетрациклина и не оказывает влияние на репродуктивные функции хозяина. На ультраструктурном уровне продемонстрировали структурно-функциональные взаимодействия симбионта с внутриклеточными компартментами дрозофилы, что создает основу для будущих детальных исследований механизмов взаимного влияния симбионта и хозяина в подобных системах симбиоза.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Съезд ВОГИС, Москва, Россия, 2004; The Third Wolbachia conference Бризбан, Австралия, 2004. Результаты были представлены на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в феврале 2002г. и феврале 2005г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (131 ссылки) и приложение с рисунками (24 рисунка), таблицей и двумя диаграммами, изложена на 117 страницах машинописного текста.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В данной работе использовались следующие линии мух: Drosophila simulans (U) предоставлена доктором Т. Карром (Университет Чикаго, США). Drosophila melanogaster (линии Canton SI, Canton S2, Curly) получены из коллекции лаборатории генетики популяций (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия). Виды Drosophila simulans (R) и Drosophila virilis - были получены из коллекции Института биологии развития, Москва, Россия. Для проверки устойчивости бактерий к антибиотикам использовали тетрациклин, который обладает бактериологическим действием на бактерии р. Wolbachia. Мухи содержались на стандартном корме с добавлением антибиотика до конечной концентрации 0,05%. (Hoffinann и др., 1986).

Для получения ранних эмбрионов 200-300 дрозофил в возрасте 2-5 дней помещали в коллектор со стандартным кормом, с поверхности корма собирались ранние эмбрионы.

Ранние эмбрионы фиксировали для исследования с помощью флуоресцентного микроскопа модификацией методов (Warn и др., 1986; Karr и др., 1986). Фиксированные эмбрионы обрабатывали красителем Hoechst 33342. Ранние эмбрионы и выделенные яйцевые камеры фиксировали для электронно-микроскопического анализа опубликованным методом (Дудкина Н.В. и др., 2004; Воронин Д.А. и др., 2004) Фиксированные эмбрионы и яичники обезвоживали и заключали в эпоновую смолу (Ероп 812). Затем получали полутонкие срезы (0,5 мкм), после окрашивания срезы анализировали под световым микроскопом для выбора участка будущих ультратонких срезов. Ультратонкие срезы толщиной 50-80 нм получали с помощью алмазного ножа на ультрамикротоме, и контрастировали стандартным методом.

Для анализа нуклеотидных последовательностей выделяли ДНК из эмбрионов или яичников протеиназным методом (O'Neill и др., 1992). В работе использовались следующие комбинации пар праймеров: wsp 8IF (5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3') и wsp 691R (5'-AAA A ATT А AACGCTACTCCA-3'). В ПЦР данные праймеры способны амплифицировать фрагменты ДНК гена wsp Wolbachia (Braig и др., 1998) и 16S рРНК 76F (5'-TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT-3') и 1012R (5'-GAATAGGTATGATTTT CATGT-3') (O'Neill и др., 1992). Для секвенирования фрагментов ДНК гена wsp использовали метод Сенгера.

Уровень цитоплазматической несовместимости подсчетом выживших эмбрионов после скрещивание мух с разной степенью зараженности. В эксперименте использовали 20 пар. Морфометрический анализ относительного количества бактериальных форм в цитоплазме эмбрионов дрозофилы на разных стадиях раннего эмбриогенеза проводили согласно ранее описанному методу (Христолюбова и др., 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Распределение эндосимбионтов на разных стадиях раннего эмбриогенеза в эмбрионах D. simulans (U) и D. melanogaster (Canton SI и Curly) по данным световой микроскопии.

Флуоресцентная окраска эмбрионов дрозофилы, с использованием красителя Hoechst, показала, что в линиях D. simulans (U) и D. melanogaster (Canton SI и Curly) расположение флуоресцентной метки в местах локализации бактерий совпадает с распределением делящихся ядер по эмбриону, и идентично у трех исследованных линиях. Изучение распределения бактерий на разных стадиях раннего эмбриогенеза мух линий D. melanogaster (Canton SI и Curly), D. simulans (U) показало, что до 9-й стадии развития симбионты и ядра располагаются преимущественно в центре эмбриона. В то же время до 9 стадии эмбриогенеза дрозофилы, бактерии дополнительно присутствовали и на периферии эмбриона, вблизи поверхности цитоплазматической мембраны. Далее делящиеся ядра мигрировали на периферию эмбриона вместе с бактериями, локализованными вблизи ядер (рис. 1).

Рисунок 1. Схема распределения ДНК позитивных сигналов на разных стадиях эмбриогенеза, построенная по данным флуоресцентной микроскопии

1-9 СТАДИИ • -Ядро, •-бактерия

9-13 СТАДИИ

Исследование распределения

бактерий на разных стадиях митоза в эмбрионах как D. melanogaster (Canton SI и Curly), так и D. simulans (U) показало, что в интерфазе они локализуются диффузно вблизи ядер, образуя небольшие скопления. В профазе митоза бактерии образуют крупные кластеры, располагающиеся диаметрально противоположно вокруг ядер и лишь отдельные бактерии наблюдаются в других участках вблизи ядер (рис. 2).

На стадии метафазы кластеры бактерии локализуются преимущественно вблизи полюсов деления, образуя шапочки вблизи центриолей. На стадиях анафазы и ранней телофазы происходит расхождение хромосом к полюсам деления ядер, при этом бактерии сохраняют локализацию у полюсов веретена деления вблизи центриолей. На стадии ранней и поздней интерфазы бактерии вновь локализуются диффузно вокруг ядер.

2. Электронно-микроскопический анализ структурной организации и распределения симбиотических бактерий в ранних эмбрионах дрозофилы

При электронно-микроскопическом исследовании эмбрионов линий D simulans (U) и D. melanogaster (Canton SI, Curly) было установлено, что на стадии синцитиальной бластодермы в цитоплазме эмбрионов присутствуют бактерии морфологически идентичные, описанным ранее бактериям р Wolbachia, которые имеют сферическую (~1 ц) или палочковидную (-0,25 х 1,5ц) форму. Бактерии окружены, как правило, тремя мембранами, в состав которых входят две собственных мембранных оболочки, а также дополнительная наружная мембрана. В бактериальном матриксе выявляют большое количество рибосом, а также расправленные нити ДНК и компактный хроматин (рис. ЗА, Б). Следует отметить, бактерии образуют кластеры и способны к делению в исследованных линиях дрозофил (рис. 3).

Рисунок 2. Схема распределения бактерий на разных стадиях митоза в ранних эмбрионах дрозофил. По данным флуоресцентной микроскопии.

Интерфаэа Профаза

M ET А« A3 А ТЕЛОФАЗА

Рисунок 3. Ультраструктурная организация симбиотических бактерий в ранних эмбрионах D. simulons (U), D melanogaster (Canton SI, Curly). A - Скопление

бактерий, Б - тонкое строение бактерий, В - деление симбионтов. Масштаб 0,2 мкм.

Электронно-микроскопический анализ распределения бактерий на разных стадиях эмбриогенеза подтверждает и дополняет данные, полученные используя флуоресцентный метод (рис 1, 2). Симбиотические бактерии, идентичные Wolbachia, имеют сходное распределение в цитоплазме разных линий дрозофилы: D. simulons (U) и D melanogaster (Canton SI, Curly). Ha разных стадиях митоза бактерии распределяются так же, как показано при анализе распределения бактерий на световом уровне. Дополнительно было установлено, что бактерии Wolbachia располагаются вблизи микротрубочек хозяина. С помощью электронного микроскопа было изучено распределение симбионтов, морфологически идентичных Wolbachia на разных стадиях раннего эмбриогенезе мух линий D. simulons (U) и D melanogaster (Canton SI, Curly). Дополнительно к полученным данным, подтверждающим результаты распределения бактерий с использованием методов флуоресцентной микроскопии, была показана локализация бактерий на 14 стадии раннего эмбриогенеза. Было установлено, что к моменту начала гаструляции (14 стадия) бактерии из эмбриона практически исчезают, в то время как в полярных (генеративных) клетках они выявляются в достаточном количестве, так, по-видимому, бактерии передаются в последующие поколения.

3. Необычная форма бактериоподобных организмов (второй тип симбионтов), выявленных в эмбрионах

Детальные электронно-микроскопические исследования цитоплазмы эмбрионов, установили, что эмбрионы D. melanogaster (Canton SI) содержат помимо бактерий с типичной для Wolbachia морфологией (тип 1), уникальную бактериоподобную форму (тип 2), количество которых на эмбрион было значительно меньше, чем типичных Wolbachia.

Сравнительное исследование тонкой структуры ранних эмбрионов шести лабораторных линий дрозофил, используемых в данной работе показал, что три линии, включающие D. simulons (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly), содержат оба типа симбиотических бактериальных форм, а в остальных видах

мух: D. simulons (R), D. melanogaster (Canton S2) и y D. virilis выявляются только бактериальные формы 2-го типа (таблица 1).

Рисунок 4. Ультраструктурная организация бактериоподобных структур в ранних эмбрионах дрозофил. А , Б - тонкое строение бактериальных форм второго типа, стрелками указаны матрикс (А) и измененная бактериальная оболочка (Б), В -делящаяся форма структур второго типа; Г - эукариотические рибосомы локализованные на мембране, окружающую бактериоподобную структуру; Д, Е -наружная мембрана бактериальных форм продолжается в мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭПР). Масштаб 0,2 мкм.

Необычная бактериальная форма, выявленная в цитоплазме ранних эмбрионов дрозофилы существенно отличается по структурной организации от грамм-отрицательных бактерий, являющимися типичными симбионтами насекомых. У этой бактериальной формы (условно обозначенных нами, как второй тип бактерий) отсутствует трехслойная оболочка, присущая симбиотическим бактериям, вместо которой по периметру выявляется слой электронно-плотного материала толщиной до 20 нм (рис. 4А, Б). Матрикс бактерий имеет более однородную, чем у 1¥о1ЬасЫа, консистенцию. Хроматин располагается в центре этих структур и может иметь разную плотность упаковки. В ходе наших исследований впервые были обнаружены делящиеся формы 2-го типа бактерий. Наиболее отличительной особенностью данных форм является то, что наружная мембрана, окружающая бактериоподобную структуру, сходна по морфологии с мембраной эндоплазматического ретикулума (ЭПР), поскольку на ее поверхности локализуются рибосомы хозяина, а также в некоторых случаях наружная мембранная оболочка непосредственно продолжается в ЭПР (рис. 4). Согласно данным электронно-микроскопического анализа локализации бактериальных форм было показано,

что бактериальные формы второго типа распределены по всей цитоплазме, в отличие от бактерий первого типа, которые располагаются преимущественно вблизи делящихся ядер.

4. Сравнительный морфометрический анализ количества бактерий в ранних эмбрионах различных линий дрозофил

Для изучения динамики бактерий в процессе раннего эмбриогенеза дрозофилы, в работе был проведен морфометрический анализ относительного количества бактерий первого и второго типов в цитоплазме эмбрионов, следующих вилах дрозофилы: D. simulons (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly), D. simulons (R), D. melanogaster (Canton S2) и y D. virilis. Было показано, что цитоплазма эмбрионов линии D. simulons (U) характеризуется наибольшей плотностью бактерий, которая составляла 65120 бактерий на цитоплазму эмбриона. Количество типичных бактериальных форм в линиях D. melanogaster (Canton SI и Curly) было сходным и составляло от 31128 до 39031 бактерий, что в 1,9 раз меньше, чем было определено в цитоплазме эмбрионов D. simulons (U). Наряду с высокой плотностью бактерий идентичных Wolbachia, обнаруженных в цитоплазме эмбрионов линий D. simulons (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly), наблюдалось сильно сниженное (около 4 раз относительно первого типа бактерий) количество бактериальных форм второго типа этой линии.

4.1 Анализ численности бактерий на разных стадиях раннего развития эмбрионов разных линий дрозофил

Чтобы оценить динамику численности симбиотических бактерий в процессе раннего эмбриогенеза мух линий D. simulons (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly), D. simulons (R), D. melanogaster (Canton S2) количество бактерий было подсчитано на различных стадиях эмбриогенеза, который был разбит на три периода: ранние стадии (от момента оплодотворения до 9 стадии); поздние стадии (10-13 стадии); и 14 стадия, на которой начинают формироваться клеточные перегородки между ядрами. Данные, представленные на диаграмме 1, демонстрируют схожую динамику численности бактерий первого типа (идентичных Wolbachia) на разных стадиях развития эмбрионов линий D simulons (U), D melanogaster (Canton SI и Curly). На ранних стадиях эмбриогенеза численность бактерий проявляет тенденцию к увеличению, пик которого был зарегистрирован на стадиях 1012. Разница в численности бактерий первого типа между начальными стадиями (1-8) эмбриогенеза и 10-12 стадиями одинакова у линий D. simulons (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly) и составляла примерно 2,5 раза. К 14 стадии раннего эмбриогенеза (начало формирования клеток) было зарегистрировано уменьшение численности бактерий первого типа.

120000

zl

x2 x3

Диаграмма 1.

Количество бактерий

цитоплазме ранних эмбрионов дрозофил на разных стадиях эмбриогенеза. Белые

Wolbachia

в

столбцы обозначают количество бактерий в цитоплазме эмбрионах линии D. simulons (U); штрихованные столбцы - в цитоплазме эмбрионов линии D. melanogaster (Canton SI); серые столбцы - в цитоплазме эмбрионов линии D melanogaster (Curly). * - Достоверность отличий равна 0,99 между количеством бактерий первого типа в эмбрионах D. simulons (U) и количеством бактерий во всех остальных линиях на разных стадиях эмбриогенеза, xl, х2, хЗ - Достоверность отличий равна 0,99 между количеством бактерий первого типа в эмбрионах линий D. simulons (U) (xl), D. melanogaster (Canton SI) (x2) и D melanogaster (Curly) (хЗ) на 1-8 стадиях эмбриогенеза и количеством бактерий в цитоплазме эмбрионов на 9-13 стадиях эмбриогенеза, yl, у2, уЗ - Достоверность отличий равна 0,99 между количеством бактерий первого типа в эмбрионах D simulons (U) (yl) D. melanogaster (Canton SI) (y2) и D. melanogaster (Curly) (уЗ) на 9-13 стадиях эмбриогенеза и количеством бактерий в цитоплазме эмбрионов на 14 стадии эмбриогенеза, zl - Достоверность отличий равна 0,99 между количеством бактерий первого типа в эмбрионах D. simulons (U) на 14 стадии эмбриогенеза и количеством бактерий в цитоплазме эмбрионов на 1-8 стадиях эмбриогенеза.

Данная динамика позволяет предположить, что бактерии первого типа в течение раннего развития активно размножаются, а на стадии предгаструляции начинают удаляться из цитоплазмы эмбрионов разных линий дрозофил. При изучении численности бакгериоподобных структур второго типа в цитоплазме эмбрионов линий D. simulons (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly), D. melanogaster (Canton S2), D. virilis, D. simulons (R) на разных стадиях развития не было выявлено достоверных отличий.

5. Ультраструктурная организация и распределение Wolbachia в оогенезе дрозофилы

Каждый из двух яичников дрозофилы представляет собой группу объединённых общей эпителиальной оболочкой яйцевых трубочек, в которых происходит оогенез (Koch и др., 1967; Литвинова, 1977). Для электронно-микроскопического анализа нами были изучены следующие типы клеток яичника на последних стадиях развития. 1. Фолликулярные клетки, имеющие

ядро округлой формы, составляющие эпителиальную оболочку яичника. 2. Питающие клетки: клетки вителлария, дифференцированные на 15 питающих клеток, идентифицируемых по лопастному ядру и обилию липидных капель в цитоплазме. 3 Ооцит, содержащий большое количество желточных гранул в цитоплазме и находящийся на стадии метафазы первого деления мейоза.

Бакгериоподобные формы первого типа, идентичные по морфологии бактериям Wolbachia были обнаружены в цитоплазме всех типов клеток яичников исследованных линий дрозофил. Бактерии первого типа в яичниках D. melanogaster имеют такую же морфологию, как и аналогичные бактерии в ранних эмбрионах. Присутствие бактериальных форм второго типа было обнаружено только при исследовании поздних этапов оогенеза. На стадии 15 клеток бактерии второго типа выявлялись преимущественно в оопите, а в питающих и фолликулярных клетках яичника не было обнаружено бактериальных форм второго типа.

6. Определение видовой принадлежности симбиотических бактерий, выявленных в ооцитах и ранних эмбрионах дрозофилы

Для определения видовой принадлежности бактерий, морфологически идентичных Wolbachia, присутствующих в D. simulons (U) и D. melanogaster (Canton SI и Curly), был проведен ПЦР-анализ тотальной ДНК эмбрионов и яичников, с использованием РГо/ЬасЛ/а-специфичных праймеров к ДНК гена 16S рРНК а также праймеров, специфичных к ДНК гена wsp (поверхностного белка Wolbachia) с последующим секвенированием продуктов амплификации. Результаты нуклеотидного анализа амплифицированных фрагметов ДНК гена wsp (размером около бООпн) были сравнены с данными из международной базы последовательностей ДНК. Установлено, что D. simulons (U) содержит Wolbachia, штамм wRi. В линиях Canton SI и Curly - Wolbachia, штамм wMel.

7. Степень устойчивости симбиотических бактерий, присутствующих в цитоплазме эмбрионов и ооцитов дрозофилы, к антибиотикам

Исходя из того, что тетрациклиновая обработка дрозофил удаляет типичные Wolbachia (1-й тип бактерий) из цитоплазмы клеток хозяина, было проведено исследование влияния данного антибиотика на бактериоподобные формы первого и второго типов, выявленные в линиях D. melanogaster. В цитоплазме ранних эмбрионов первого поколения мух линий Curly и Canton SI, обработанных тетерациклином, бактерии wMel исчезают. В противоположность этому, бактериподобные формы второго типа выявлялись в цитоплазме эмбрионов первого поколения во всех исследованных в данном эксперименте линиях. Электронно-микроскопические исследования яичников линий CurlyT и Canton S2T показали, что бактерии второго типа не исчезают из цитоплазмы ооцитов после обработки мух тетрациклином. Полученные данные позволяют предположить что две бактериальные формы отличаются на генетическом уровне.

8. Жизнеспособность инфицированных бактериями эмбрионов. Уровень цитоплазматической несовместимости при скрещивании линий дрозофил, зараженных разными типами эндосимбиотических бактерий

Проведенный нами статистический анализ выживаемости эмбрионов показал, что большинство исследуемых линий дрозофил сохраняет высокую выживаемость эмбрионов, несмотря на присутствие разного типа бактерий в их цитоплазме. Стоит отметить, что только в линии И 51ти1апз (Ц), которая характеризуется большей плотностью бактерий штамма наблюдалось уменьшение выживаемости мух по сравнению с остальными линиями.

типы бактерий % выживаемости эмбрионов

линии 1 тип 2 тип

D. simulans (U) + + 41

D melanogaster (Canton SI) + + 83

D. melanogaster (Curly) + + 72

D. melanogaster (Canton S2) - -г 80

D. simulans (A) - + 75

D. virilis - + 75

Таблица 1. Сравнительный анализ присутствия бактерий первого и второго типов в эмбрионах исследуемых линий и определение выживаемости эмбрионов в различных условиях 1 тип - типичные бактерии Wolhachia, 2 тип - новая бактериальная форма.

Следующей задачей было выяснить, влияет ли присутствие бактерий на выживаемость потомства при скрещиваниях мух. При этом были учтены следующие критерии: присутствие одного или двух типов бактерий в цитоплазме клеток дрозофилы; внутрилинейное скрещивание нативных особей и особей, живших на корме с тетрациклином. Для экспериментов были выбраны следующие пары линий: 1. D. melanogaster (Canton SI) х D. melanogaster (Canton S2): линия Canton SI содержит бактерии двух типов, линия Canton S2 - бактерии второго типа. 2. D. melanogaster (Curly) х D. melanogaster (CurlyT): линия Curly содержит оба типа бактерий, a CurlyT -бактерии второго типа. Результаты скрещиваний в случае первой пары показали, что выживаемость резко падает (до 14%) если в скрещивание берутся самец D. melanogaster (Canton SI) и самка D. melanogaster (Canton S2). В то время как при реципрокном скрещивании отличия смертности отложенных эмбрионов по сравнению с контролями не были выявлены. Данный результат свидетельствует о проявлении описанного ранее для бактерий p. Wolbachia феномена цитоплазматической несовместимости вызванного штаммом wMel. При втором типе скрещиваний D. melanogaster (Curly) х D. melanogaster (CurlyT) использовалась одна и та же линия, только

часть мух была изолирована и содержалась на корме с тетрациклином, что позволило удалить из цитоплазмы клеток этой линии бактерии \vMel. В данном случае были получены идентичные результаты, как и в случае с первой парой.

9. Особенности морфологии симбиотических бактерий и их взаимодействие с внутриклеточными компартментами в клетках яичников и эмбрионов дрозофилы

Для выяснения структурно-функциональных связей между эндосимбионтами и хозяином, проводилось электронно-микроскопическое исследование особенностей строения бактерий и взаимоотношений с основными цитоплазматическими компартментами клеток яичников и эмбрионов дрозофил, включающими эндоплазматический ретикулум, митохондрии и желточные гранулы.

В цитоплазме эмбрионов Ь. .чти1аю (V) были обнаружены структуры, похожие на бактериальные споры, диаметра от 100 до 300 нм с гомогенным матриксом и окружены многослойной мембранной оболочкой (рис 5). При ультраструктурном изучении эмбрионов всех исследованных линий дрозофил

мы не обнаружили бактерий, способных формировать споры.

.......... * ~ ~ - ------- ----- - - ------- ------

Рисунок 5. Формирование споро-подобных структур (стрелки) бактериями штамма wRi в линии D. simulans (U). А-В - стадии отделения споры от бактерии в цитоплазму эмбриона. Масштаб - 0,2 мкм.

Установлено, что типичные Wolbachia (1-й тип бактерий), присутствующие в видах D. simulans (U) и D. melanogaster часто формируют вакуолеподобные структуры, которые отходят от наружной мембраны бактерий в цитоплазму эмбрионов дрозофил. Полученные данные дают основание предполагать наличие определенной секреторной функции для Wolbachia в организме хозяина.

Электронно-микроскопический анализ эмбрионов и яичников дрозофил показал, что оба типа выявленных симбиотических бактерий проявляют тесное взаимодействие с мембранами шероховатого эндоплазматического ретикулума (ЭПР). Следует отметить, что близкое расположение бактерий первого типа к мембранам шероховатого ЭПР выявляется не только в эмбрионах, но и в ооцитах видов D. simulans (U) и D. melanogaster.

Одной из наиболее интересных отличительных особенностей симбиотических бактерий, как первого, так и второго типа является, их частый контакт с митохондриями. Следует отметить, что в области контакта бактериальных форм второго типа и митохондрий иногда наблюдаются деформация оболочек бактерий (рис. 6).

Рисунок 6. Контакт (стрелки) бактерий 1 типа (а), 2 типа (б) и митохондрии в цитоплазме эмбрионов D. simulons (U) и D. melanogaster. W - Wolbachia, M -митохондрия Б - бактерии 2 типа. Масштаб - 0,2 мкм

Было также выявлено близкое расположение бактерий 1-го типа и желточных гранул. Показано, что наружная мембрана бактерий сливается с мембраной желточной вакуоли, и бактерия попадает во внутрь пространства вакуоли. При изучении бактероподобных структур, как первого, так и второго типа не было обнаружено контактов с аппаратом Гольджи и другими внутриклеточными органеллами в эмбрионах и клетках яичника у всех исследуемых линий дрозофилы.

ОБСУЖДЕНИЕ

1. Возможные причины специфического распределения симбиотических бактерий в цитоплазме эмбрионов дрозофилы

В результате ряда исследований симбиотических бактерий Wolbachia (первый тип) с использованием флуоресцентной микроскопии было продемонстрировано распределения их вокруг митотически делящихся ядер в ранних эмбрионах дрозофилы (Callaini и др., 1994). Сходное распределение этих бактерий наблюдалось нами в ранних эмбрионах трех исследованных линиях дрозофил (D. simulons (U), D. melanogaster (Canton SI, Curly)) на уровне световой и электронной микроскопии. В работе Калланйни с соавторами было высказано предположение, что, этот процесс обусловлен взаимодействием астральных микротрубочек хозяина и наружной оболочки бактерии. Электронно-микроскопические исследования, выполненые нами, а

также другими авторами выявили тесное взаимодействие Wolbachia и микротрубочек хозяина (Callaini et al., 1994). Эти данные подтверждают, что динамика симбионтов в цитоплазме эмбрионов обусловлена взаимодействием их наружной мембраны и астральных микротрубочек хозяина.

2. Функциональная роль наружной мембраны симбиотических бактерий и сходство структурной организации симбиотических бактерий в различных линиях дрозофил

Проведенный электронно-микроскопический анализ эмбрионов и клеток яичника дрозофил позволил сравнить структурную организацию бактерий р. Wolbachia в трех линиях дрозофил (D. simulons (U), D. melanogaster (Canton SI, Curly)). Было установлено, что морфология этих бактерий сходна у всех исследованных линий дрозофил и характерна для грам-отрицательных видов, и идентична строению типичных Wolbachia, выявляемых в цитоплазме эмбрионов других линий дрозофил, половых клеток комаров {Culex), а также в нервной ткани некоторых видов Равноногих (Armadillidium vulgare) (Rigaud et al., 2001). Характерной особенностью симбионтов является наличие дополнительной наружной мембраны, которую бактерии приобретают в процессе попадания в клетку хозяина. В отличие от симбионтов Wolbachia, подавляющее большинство паразитических, внутриклеточных микроорганизмов не окружены или временно окружены дополнительной наружной мембраной. Например, такие бактерии как представители группы Coxiella (семейство Legionellaceae), попадая в клетку, оказываются окруженными дополнительной мембраной, но вскоре они элиминируются из фагосомы в цитоплазму, после чего они размножаются, и проявляют патогенные свойства. Следует отметить, что внутриклеточные бактерии (Toxoplasma gondu, Micobacterium, Chlamidia, Legionella pneonophila, Chlorella), окруженные дополнительной наружной мембраной оказывают патогенный эффект на эукариотическую клетку (Higuchi-dos-Santos et al., 2005). Эти бактерии способны доставлять на поверхность наружной мембраны липополисахариды, которые препятствуют слиянию симбиосом со структурами фагосомального аппарата и патогены для клеток хозяина.

2.1 Уникальная бактериоподобная структура в цитоплазме клеток хозяина.

В результате электронно-микроскопических исследований в цитоплазме эмбрионов и ооцитов дрозофилы впервые выявлена необычная бактериоподобная форма (второй тип симбионтов) с уникальной морфологией. Согласно электронно-микроскопическим данным можно предполагать, что эта форма относиться к микроорганизмам, о чем свидетельствуют факторы, которые обычно детерминируются при описании бактериальных форм и были выявлены нами в работе: во-первых, разная плотность матрикса внутри этих структур; во-вторых, наличие делящихся форм и в-третьих, активное взаимодействие этих предполагаемых микроорганизмов с органелами и компартментами эукариотической клетки. Характерной особенностью бактериоподобных форм является их

расположение внутри мембран ЭПР. Следует отметить, что паразитические бактерии рода Brucella, выявляемые в эукаритических клетках млекопитающих, также локализуются внутри ЭПР, что обеспечивает им защиту от воздействия фагосом клетки хозяина. В отличие от новой бактериальной формы, выявленной нами в эмбрионах и ооцитах дрозофилы, бактерии р. Brucella сохраняют свою морфологию внутри цистерн ЭПР.

3. Взаимодействие бактериоподобных форм и цитоплазматических компартментов хозяина, как основа структурно-функциональных взаимодействий симбионт/хозяин. Адаптационные изменения симбионтов в процессе их жизнедеятельности внутри клеток хозяина

О функциональной активности симбиотических бактерий и их успешной адаптации к существованию внутри организма хозяина, свидетельствуют обычно следующие морфологические данные: деление, секреция и их активное взаимодействие бактерий с различными компартментами клеток хозяина. Результаты наших исследований показали, что типичные Wolbachia проявляют все перечисленные признаки, поскольку они активно делятся и выделяют секреторные пузырьки в цитоплазму дрозофилы. Электронно-микроскопические исследования бактериоподобной формы второго типа свидетельствует об их сниженной активности, по сравнению с активностью бактерий первого типа.

Одним из наиболее актуальных вопросов является вопрос о том, каким образом секритируют симбионты в клетку хозяина, и какова природа этого секрета. Недавно были выявлены гомологичные гены, ответственные за формирование системы секреции у патогенных бактерий (Agrobacterium tumefaciens, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, Brucella suis, Legionella pneumophila и Rickettsia prowazekii (Kim и др., 1994), у симбиотических бактерий Wolbachia (Masui и др., 2000). Можно предположить, что зарегистрированное нами формирование бактериями первого типа вакуолео-подобных структур связано с секрецией. Полученные нами данные о том, что Wolbachia тесно контактируют с мембранами шероховатого ЭПР в эмбрионах и, особенно, в клетках яичника дрозофилы в период вителлогенеза, согласуются с наблюдениями других авторов (Popov и др., 1998) и могут служить дополнительным свидетельством активных взаимодействий симбионта и хозяина. Согласно электронно-микроскопическим исследованиям, наружная мембрана как 1-го (аналогичная плазматической мембране), так и 2-го типа (аналогичная шероховатому ЭПР) бактериальных форм, обнаруженных в цитоплазме эмбрионов дрозофилы может тесно контактировать с наружной мембраной митохондрий, что дает основание предполагать существование возможной функциональной связи между ними. В пользу этого свидетельствуют недавно опубликованные данные о том, что Wolbachia может оказывать влияние на мтДНК, вызывая повышенную частоту вариаций в некоторых зараженных видах огненных муравьев (Dewayne и др., 2003).

Влияние Wolbachia на репродуктивные функции хозяина широко представлено в ряде обзоров (Werren, 1997; Hurst, Jiggins, 2000). На сегодняшний день показано, что цитоплазматическая несовместимость, регистрируемая при скрещивании самцов зараженных Wolbachia с незараженными самками, сопровождается разной степенью гибели потомства на ранних стадиях эмбриогенеза. Нами показано, что штамм wMel, который был найден в линиях D. melanogaster вызывает около 85-90% несовместимость при подобных скрещиваниях. Существует ряд гипотез, объясняющих цитоплазматическую несовместимость тем, что бактерии влияют на процессы компактизации-декомпактизации хроматина отцовских и материнских хромосом. Это сопровождается с асинхронностью поведения генетического материала в течение первых делений зиготы, что, вероятно, приводит к потере хромосом одного из родителей и, как следствие, к гибели потомства у дрозофил. В наших экспериментах не было возможным определить, вызывает ли бактериальная форма второго типа цитоплазматическую несовместимость, поскольку мы не обнаружили такую линию дрозофил которая не содержала симбиотических бактерий. Тем не менее наши исследования показали, что бактерии второго типа не влияют на уровень ЦН, которая была вызвана типичными Wolbachia (штамм wMel). Можно предположить, что существенные изменения морфологии клеточной оболочки и вероятно, ее состава у бактерий второго типа не вызывают проявление ЦН.

Проведенные нами исследования позволили впервые выявить способность Wolbachia (штамм wRi) в линии D. simulons (U) формировать спороподобные структуры. Образование спор, представляющих неактивную форму бактерий, как феномен адаптации бактерий к лимитирующим условиям их существования внутри клетки хозяина, встречается как у патогенных, так и у непатогенных эубактерий. Следует отметить, что одной из особенностей бактерий (штамм wRi) выявленных нами и другими авторами в ранних эмбрионах D. simulons является большая их численность в цитоплазме эмбрионов этой линии дрозофилы по сравнению с другими (Dudkina и др., 2004). Можно предполагать, что большая плотность бактерий в эмбрионах этой линии послужило причиной появление у этих бактерий свойства формировать споры, что позволило, возможно, бактериям переживать лимитирующие условия среды. Способность Wolbachia формировать споры была продемонстрирована ранее только для W. popcorn (штамм wMelPop). При этом в линии, содержащей этот штамм, также был отмечен высокий уровень пролиферации бактерий (Min, Benzer, 1997).

Морфология бактериоподобных форм второго типа демонстрирует более глубокую адаптацию данных микроорганизмов. Более того, данные бактерии приобрели устойчивость к действию тетрациклина. Этот антибиотик нарушает, как известно, биосинтез белка и известно, что у бактерий, проявляющих устойчивость к тетрациклину, обнаруживается фермент, способный изменять свойства бактериальной оболочки. Возможно, что в

процессе адаптации второго типа бактерий к существованию внутри ЭПР изменилась их морфология и выработался подобный механизм устойчивости к этому антибиотику. Хотя не исключено, что эти бактерии будут чувствительны к другим типам антибиотикам.

Выводы.

1. Установлено с помощью флуоресцентной и электронной микроскопии, а также молекулярно-биологических методов, в шести лабораторных линиях трех видов дрозофил присутствие двух бактериоподобных форм (первый и второй типы симбионтов).

2. Показано, что первый тип симбионтов относится к роду Wolbachia (штаммов wRi и wMel). Симбиотические бактерии в процессе раннего эмбриогенеза локализуются преимущественно вблизи ядер эмбриона. В интерфазе митоза бактерии распределяется случайно вокруг ядер, а на стадиях метафазы, анафазы и ранней телофазы образуют агрегаты вблизи полюсов веретена деления. Предполагается, что такое распределение обусловлено взаимодействием наружной мембраны бактерий с астральными микротрубочками и актиновыми филламентами в клетках хозяина.

3. Установлено, что в ранних эмбрионах и клетках яичника линий D. simulons (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly), бактерии Wolbachia (штаммы wRi и wMel) имеют типичную для симбионтов морфологию, окружены дополнительной наружной мембраной и активно делятся.

4. Впервые обнаружено, что Wolbachia (штамм wRi) обладают способностью формировать спороподобные структуры в цитоплазме эмбрионах линии D. simulons (U). Продемонстрированы последовательные стадии формирования этих структур и их отделение от Wolbachia.

5. При сравнительном ультраструктурном исследовании шести линий трех видов дрозофил установлено, что второй тип бактериоподобных структур локализуется внутри цистерн эндоплазматического ретикулума (ЭПР), характеризуется наличием аморфной оболочки и небольшим количеством рибосом в матриксе и могут присутствовать вместе с Wolabchia или без них в цитоплазме эмбрионов и ооцитов дрозофил.

6. Показано, что бактериоподобные структуры, как первого (Wolbachia), так и второго типа демонстрируют тесные взаимодействия с различными цитоплазматическими компонентами эмбрионов и ооцитов дрозофилы, включающими ЭПР, митохондрии, желточные гранулы. Кроме того, бактерии первого типа могут формировать секреторные вакуоли в цитоплазме эмбрионов D. simulons (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly). Выявленные особенности взаимодействия симбионтов с цитоплазматическими компанентами в клетках дрозофилы свидетельствуют о функциональной активности Wolbachia в процессе их сосуществования с организмом дрозофилы.

Список публикаций по теме диссертации

1. Дудкииа Н.В., Воронин Д.А., Киселева Е.В. Структурная организация и распределение симбиотических бактерий Wolbachia в ранних эмбрионах и яичников Drosophila melanogaster и D. simulons. Цитология (2004), Т. 46, № 3, С. 208-220.

2. Воронин Д.А., Дудкина Н.В., Киселева Е.В. Новая форма симбиотических бактерий Wolbachia, обнаруженная внутри эндоплазматического ретикулума ранних эмбрионов Drosophila melanogaster. Доклады Академии наук (2004), Т. 396, № 4, С. 564-567.

3. Воронив Д.А., Шарипов Р.Н., Захаров И.К., Киселёва Е.В. Исследование ультраструктуры и распределения симбиотических бактерий в эмбрионах Drosophila. Съезд ВОГИС, Россия, Москва, 5-12 июня 2004. Т. 1 С. 422.

4. Denis A. Voronin, Ruslan Sharipov, Elena Kiseleva, A new form of Wolbachia obtained in early Drosophila embryo. The 3rd International Wolbachia Conference, Australia, Heron Isl„ 21-26 august 2004.

5. Воронин Д.А., Киселева Е.В. Молекулярно-генетический и электронномикроскопический анализ локализации эндосимбиотических бактерий в эмбрионах дрозофилы. Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Беларусь, Минск, 24-26 ноября 2004. С. 325.

Подписано к печати 6.10.2005 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. л. 0,7 Тираж 100. Заказ №125

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10.

»19&27

РНБ Русский фонд

2006-4 17357

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воронин, Денис Александрович

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1. Эндосимбионты - прокариоты, адаптированные к жизни внутри клеток хозяина.

1.1. Особенности морфологии бактериальной клетки.

1.2. Рост и способы размножения бактерий.

1.3. Покоящиеся формы бактерий.

2. Wolbachia - внутриклеточные симбионты Arthropods и Nemathods.

2.1. Филогения Wolbachia и структурно-функциональные особенности их генома.

2.2. Структурная организация Wolbachia.

2.3. Репродуктивные модификации, вызываемые Wolbachia в организме хозяина.

Цитоплазматическая несовместимость.

Партеногенез.

Феминизация и «гибель самцов».

3. Дрозофила - удобный объект для изучения распределения структуры и функции симбиотических бактерий Wolbachia в клетках хозяина.

3.1. Ранний эмбриогенез и этапы синцитиального развития эмбрионов дрозофилы.

3.2. Оогенез у дрозофилы.

3.3. Особенности поведения Wolbachia в раннем эмбриогенезе у дрозофилы. Распределение Wolbachia на разных стадиях клеточного цикла.

3.4. Влияние Wolbachia на развитие дрозофилы.

4. Возможная функциональная роль эндосимбионтов.

4.1. Внутриклеточный симбиоз про- и эукариот, как модель для изучения возможного происхождения эукариотических органелл.

Глава II. Материалы и методы.

2.1. Характеристика использованных в работе лабораторных линий дрозофилы.

2.2. Получение ранних эмбрионов дрозофилы.

2.3. Фиксация эмбрионов для флуоресцентно-микроскопических исследований.

2.4. Фиксация и заливка эмбрионов дрозофилы для ультраструктурного анализа.

2.5. Фиксация и заливка яичников для электронной микроскопии.

2.6. Получение, окрашивание и исследование полутонких и ультратонких срезов.

2.7. Выделение геномной ДНК.

2.8. Условия полимеразной цепной реакции.

2.9. Электрофорез ДНК в агарозных гелях.

2.10. Выделение ДНК из агарозных гелей.

2.11. Клонирование фрагментов ДНК в плазмиду pBluescript, определение последовательности фрагментов ДНК.

2.12. Определение выживаемости линий дрозофилы.

2.12.1. Тест на выявление уровня цитоплазматической несовместимости (ЦН).

2.13. Морфометрический анализ относительного количества бактериальных форм в цитоплазме ранних эмбрионов дрозофилы.

Глава III. Результаты.

3.1. Динамика Wolbachia в ранних эмбрионах дрозофилы.

3.1.1. Распределение эндосимбионтов на разных стадиях раннего эмбриогенеза и в процессе клеточного цикла в эмбрионах видов D. simulans (U) и D. melanogaster (Canton S1 и Curly) по данным световой микроскопии.

3.2. Электронно-микроскопический анализ структурной организации и распределения симбиотических бактерий в ранних эмбрионах дрозофилы.

3.3. Необычная форма бактериоподобных организмов (второй тип симбионтов), выявленных в эмбрионах и ооцитах дрозофилы.

3.4. Сравнительный морфометрический анализ количества бактерий в ранних эмбрионах различных линий дрозофилы.

3.4.1. Анализ численности бактерий на разных стадиях раннего развития эмбрионов разных линий дрозофилы.

3.5. Ультраструктурная организация и распределение Wolbachia в оогенезе дрозофилы.

3.6. Определение видовой принадлежности симбиотических бактерий, выявленных в ооцитах и ранних эмбрионах дрозофилы.

3.7. Степень устойчивости симбиотических бактерий, присутствующих в цитоплазме эмбрионов и ооцитов дрозофилы, к антибиотикам.

3.8. Жизнеспособность инфицированных бактериями эмбрионов. Уровень цитоплазматической несовместимости при скрещивании линий дрозофилы, зараженных разными типами эндосимбиотических бактерий.

3.9. Новые свойства симбиотических бактерий и их взаимодействие с внутриклеточными компартментами клеток яичника и эмбрионов дрозофилы.

Глава IV. Обсуждение.

4.1. Возможные причины специфического распределения симбиотических бактерий в цитоплазме эмбрионов дрозофилы.

4.2. Функциональная роль наружной мембраны симбиотических бактерий и сходство структурной организации симбиотических бактерий в различных линиях дрозофилы.

4.2.1. Нетипичная бактериальная форма эндосимбионтов и возможные пути ее появления в клетках дрозофилы.

4.3. Взаимодействие бактериальных форм и цитоплазматических компартментов хозяина, как основа функциональных взаимодействий симбионт/хозяин.

4.4. Адаптационные изменения симбиотических бактерий в процессе их жизнедеятельности внутри клеггок хозяина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная организация и распределение симбиотических бактерий в эмбрионах и клетках яичника дрозофил"

Актуальность проблемы

В последние десятилетия существенное внимание уделяется анализу функциональной роли симбиотических бактерий эукариотических клеток. Благодаря исследованию механизмов симбиоза были открыты возможности переноса генетического материала в клетки высших растений, что позволило получить модифицированные сорта с новыми свойствами. На основе знаний об особенностях взаимодействия симбионта и хозяина становится возможным построение биоинженерных моделей для изучения внутриклеточных процессов. Среди симбиотических бактерий особое место занимает внутриклеточный симбионт насекомых и нематод бактерии рода Wolbachia (кл. Риккетсия), который был открыт в 1936 году. Исследования последних лет показали, что эти бактерии широко распространены среди насекомых (до 20% видов) (Werren, 1997; McGraw, O'Neill, 1999). На сегодняшний день уже полностью расшифрованы и частично описаны геномы некоторых штаммов Wolbachia (Riegler et al., 2005). Генетические исследования показали, что данные бактерии способны изменять репродуктивные функции хозяина, вызывая такие патологии, как цитоплазматическая несовместимость, партеногенез и феминизация (O'Neill, Karr, 1990; Stouthamer et al., 1993; Stouthamer, et al., 1999; Hurst, Jiggins, 2000; Zchori-Fein, et al, 2001). Исследования особенностей поведения и функций Wolbachia являются, в настоящее время очень актуальными, поскольку изучение механизмов симбиоза позволит исследователям в будущем посредством бактерий влиять на популяции хозяина, среди которых встречаются как вредители сельского хозяйства, так и патогенные для животных и человека организмы (Hoffmann et al., 1986). Так, например, было показано, что элиминация Wolbachia из организма нематод приводит к потере этими организмами патогенных свойств (Hoerauf et al., 1999; Dedeine et al., 2001). Таким образом, влияя на симбиотические бактерии Wolbachia, можно найти способы защиты людей и животных от болезней, вызываемых организмами хозяев (Bordenstein, Werren, 2000; Dedeine et al., 2001; Kennedy, 2002).

Одним из наиболее удобных объектов для изучения взаимодействия Wolbachia -хозяин являются дрозофилы, поскольку благодаря генетическим и цитологическим исследованиям о биологии этих насекомых накоплено огромное количество данных. Поэтому изучение разнообразия симбиотических бактерий в клетках и эмбрионах дрозофилы может обеспечить получение новых данных (Литвинова, 1977; Foe, Alberts, 1983). Цитологические исследования взаимодействия бактерий и эукариотических клеток позволят также дополнить исследования о механизмах симбиоза. Багодаря использованию такой высокоразрешающей техники, как просвечивающий электронный микроскоп, в сочетании с молекулярно-биологическими методами открывается возможность определить особенности распределения симбиотических бактерий в клетках хозяина и оценить структурные изменения в клетках симбионта и хозяина. Ультраструктурные исследования взаимодействий симбионт-хозяин, позволят также получить сведения, которые, возможно, прольют свет на симбиотическую теорию происхождения эукариотических органелл (Dyall et al., 2004).

В связи с выше изложенным, целью данной работы являлось исследование локализации и структурной организации симбиотических бактерий в эмбрионах и клетках яичника дрозофилы.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распределение бактерий на разных стадиях раннего эмбриогенезаугрех видов (шести линий) дрозофил.

2. Выявить особенности структурной организации симбионтов в цитоплазме эмбрионов и клеток яичника^ трех видов (шести линий) дрозофил.

3. Изучить влияние антибиотиков на выживаемость симбионтов в клетках разных линий дрозофил.

4. Определить влияние бактерий на выживаемость эмбрионов шести линий дрозофил. Оценить уровень цитоплазматической несовместимости при скрещиваниях разных линий дрозофил, зараженных симбионтами.

5. Исследовать возможные структурно-функциональные взаимодействия между симбионтами и внутриклеточными компартментами ранних эмбрионов и клеток яичника дрозофилы.

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе проведен сравнительных анализ структурной организации бактерий Wolbachia штаммов wMel, wRi, которые были идентифицированы в лабораторных линиях Drosophila simulans (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly). С помощью флуоресцентной и электронной микроскопии исследованы особенности распределения симбиотических бактерий в эмбрионах и клетках яичника дрозофил. При изучении шести лабораторных линий дрозофил впервые выявлена и морфологически описана форма симбиотических бактерий, имеющая структуру не свойственную какому-либо типу бактерий, присутствующих в клетках дрозофилы. Установлено, что необычная бактериальная форма устойчива к действию антибиотика тетрациклина и не оказывает влияние на репродуктивные функции хозяина. На ультраструктурном уровне продемонстрировали структурно-функциональные взаимодействия симбионта с внутриклеточными компартментами дрозофилы, что создает основу для будущих детальных исследований механизмов взаимного влияния симбионта и хозяина в подобных системах симбиоза.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Съезд ВОГИС, Москва, Россия, 2004; Третья международная конференция, посвященная биологии Wolbachia (the Third Wolbachia Conference) Бризбан, Австралия, 2004; Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Беларусь, Минск, 2004.

Результаты работы были представлены на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в феврале 2002г. и феврале 2005г.

Список публикаций по теме диссертации

1. Дудкина Н.В., Воронин Д.А., Киселева Е.В. Структурная организация и распределение симбиотических бактерий Wolbachia в ранних эмбрионах и яичников Drosophila melanogaster и D. simulans. Цитология (2004), Т. 46, JV° 3, С. 208-220.

2. Воронин Д.А., Дудкина Н.В., Киселева Е.В. Новая форма симбиотических бактерий Wolbachia, обнаруженная внутри эндоплазматического ретикулума ранних эмбрионов Drosophila melanogaster. Доклады Академии наук (2004), Т. 396, №4, С. 564-567.

3. Воронин Д.А., Шарипов Р.Н., Захаров И.К., Киселёва Е.В. Исследование ультраструктуры и распределения симбиотических бактерий в эмбрионах Drosophila. Съезд ВОГИС, Россия, Москва, 5-12 июня 2004. Т. 1 С. 422.

4. Denis A. Voronin, Ruslan Sharipov, Elena Kiseleva, A new form of Wolbachia obtained in early Drosophila embryo. The 3rd International Wolbachia Conference, Australia, Heron Isl., 21-26 august 2004.

5. Воронин Д.А., Киселева E.B. Молекулярно-генетический и электронномикроскопический анализ локализации эндосимбиотических бактерий в эмбрионах дрозофилы. Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Беларусь, Минск, 24-26 ноября 2004. С. 325.

Список используемых сокращений

АТФ - аденозин трифосфорная кислота

ЖГ - желточная гранула мтДНК - митохондриальная ДНК п.н. - пар нуклеотидов

ПМ - плазматическая мембрана

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЦН - цитоплазматическая несовместимость

ЭМ - электронная микроскопия

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Воронин, Денис Александрович

Выводы.

1. Установлено с помощью флуоресцентной и электронной микроскопии, а также молекулярно-биологических методов, в шести лабораторных линиях трех видах дрозофил присутствие двух бактерпоподобнах форм (первый и второй типы симбионтов).

2. Показано, что первый тип симбионтов относиться к роду Wolbachia (штаммов wRi и wMel). Симбиотические бактерии в процессе раннего эмбриогенеза локализуются преимущественно вблизи ядер эмбриона. В интерфазе митоза бактерии распределяется случайно вокруг ядер, а на стадиях метафазы, анафазы и ранней телофэзы образуют агрегаты вблизи полюсов веретена деления. Предполагается, что такое распределение обусловлено взаимодействием наружной мембраны бактерий с астральными микротрубочками и актиновыми филламентами в клетках хозяина.

3. Установлено, что в ранних э\'брионах и клетках яичника линий D. simulons (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly), бактерии Wolbachia (штаммы wRi и wMel) имеют типичную для симбионтов морфологию, окружены дополнительной наружной мембраной и активно делятся.

4. Впервые обнаружено, что Wolbachia (штамм wRi) обладают способностью формировать спороподобньте структуры в цитоплазме эмбрионах линии D. simulant (U). Продемонстрированы последовательные стадии формирования этих структур и их отделение от Wolbachia.

При сравнительном ульграетруктурном исследовании шести линий трех видов дрозофил установлено, что второй тип бактериоподобных структур локализуется внутри цистерн эндоплазматического ретикулума (ЭПР), характеризуется наличием аморфной оболочки и небольшим количеством рибосом в матриксе и могут присутствовать вместе с Wolabchia или без них в цитоплазме эмбрионов и ооцитов дрозофил.

Показано, что бактериоподобные структуры, как первого (Wolbachia), так и второго типа демонстрируют тесные взаимодействия с различными цитоплазматическими компонентами эмбрионов и ооцитов дрозофилы, включающими ЭПР, митохондрии, желточные гранулы. Кроме того, бактерии первого типа могут формировать секреторные вакуоли в цитоплазме эмбрионов D. simulans (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly). Выявленные особенности взаимодействия симбионтов с цитоплазматическими компанентами в клетках дрозофилы свидетельствуют о функциональной активности Wolbachia в процессе их сосуществования с организмом дрозофилы.

Заключение.

Одним из основных направлений в области исследования симбиотических организмов является изучение их структурной организации и динамических взаимоотношений с организмом хозяина. В настоящей работе проведена оценка разнообразия симбиотических бактерий и изучены их структурно-функциональные свойства в цитоплазме эмбрионов и клеток яичника шести лабораторных линий трех видов дрозофил. С использованием различных подходов установлено существование двух типов симбиотических организмов в эмбрионах и клетках яичника дрозофил. С помощью молекулярно-биологических методов продемонстрировано, что первый тип бактерий относится к роду Wolhachia. Цитологический анализ особенностей поведения бактерий Wolbachia в цитоплазме эмбрионов дрозофил на уровне световой микроскопии позволил продемонстрировать специфическую динамику бактерий на разных стадиях митоза и раннего развития эмбрионов. По данным электронной микроскопии, такая динамика обеспечивается тесным взаимодействием Wolbachia с микротрубочками клетки хозяина. Совокупность полученных данных позволила предположить, что динамика бактерий штаммов wRi и wMel, выявленных в цитоплазме эмбрионов линий D. simulam (U). D. mclanogaster (Canton SI и Curly), обусловлена взаимодействием бактерий с различными компонентами (микротрубочками и актиновыми филаментами) цитоскелета хозяина. Ультраструктурный анализ бактерий первого типа показал, что они имеют типичную морфологию грам-отрицательных симбиотических бактерий, а их количество в течение раннего эмбриогенеза может варьировать, уменьшаясь к 14-ой стадии развития. Одним из существенных результатов является демонстрация возможности Wolbachia формировать споры, секреторные везикулы, а также их взаимодействие с различными органеллами клетки хозяина. Эти данные свидетельствуют об активном функционировании бактерий внутри организма хозяина и их адаптации к существованию в цитоплазме эмбрионов н клеток яичника дрозофил.

Кроме того, в представленной работе впервые выявлена и описана нетипичная бактериоподобная форма симбионтов (второй тип) дрозофил, наблюдаемых нами во всех исследованных линиях. Второй тип бактериоподобных форм, обнаруженный внутри цистерн ЭПР нитоплазмы эмбрионов и ооцитов дрозофилы, имеет аморфную клеточную оболочку. Кроме того, этот тип микроорганизмов устойчив к тетрациклину и не влияет на уровень цитоплазматической несовместимости, вызванной Wolbachia. Ввиду небольшого количества этих бактерий в цитоплазме клеток дрозофил, проведенный молекулярно-биологический анализ не позволил нам точно определить видовую принадлежность необычной бактериально формы. Тем не менее, выявленный второй тип симбиотических бактерий может представлять пример глубокой адаптации микроорганизмов к жизнедеятельности внутри организма хозяина и открывает широкие возможности, как для сравнительного изучения взаимодействия разных типов симбионтов с организмом хозяина, так и для изучения теории симбиотического происхождения органелл эукариотических органел (митохондрий и хлоропластов).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воронин, Денис Александрович, Новосибирск

1. Васильева JI.B. Биологическая статистика. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 2000. 123 с.

2. Воронин Д.А., Дудкина Н.В., Киселева Е.В. Новая форма симбиотических бактерий Wolbachia, обнаруженная внутри эндоплазматического ретикулума ранних эмбрионов Drosophila melanogastcr II Доклады Академии наук. 2004. Т.396, № 4. С.564-567.

3. Громов Б.В. Бактерии внутриклеточные симбионты животных // Успехи микробиологии. 1978. Т.13. С.50-71.

4. Громов Б.В. Эндоцитобионты клеток животных // Соровский образовательный журнал. Биология. 1998. № 2. С.73-78.

5. Гусев М.В., Минеева J1.A. Микробиология. Москва: Изд-во Московского Ун-та, 1985.376 с.

6. Дудкина Н.В. Воронин Д.А., Киселева Е.В. Структурная организация и распределение симбиотических бактерий Wolbachia в ранних эмбрионах и яичников Drosophila melanogastcr и D. simulans II Цитология. 2004. Т.46, № 3. С.208-220.

7. Карпов С.А. Строение клетки протистов. Санкт-Петербург, 2001. 383 с.

8. Киселёва Е.В., Кулыба Н.П., Семешина A.B., Овчинникова Л.П., Христолюбова Н.Б., Козлов A.B. Иммунноэлектронно микроскопический анализ структурной организации нуклеоида цианобактерии Anacystis nidulans II Цитология. 1989. Т.80, № 9. С. 1005-1008.

9. Краткий определитель бактерий Берги / под ред. Дж. Хоулса. Москва: Мир, 1980.495 с.

10. Ю.Литвинова Е.М. Биология размножения дрозофилы // Проблемы генетики в исследованиях на дрозофиле, под ред. Хвостовой В.В., Корочкина Л.И., Голубовского М.Д. Новосибирск: Наука, 1977. 277 с.

11. П.Лихошвай Е.В., Киселёва Е.В. Укладка ДНК в нуклеоиде прокариот. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1985. 36 с.

12. Маргелис Л. Роль симбиоза в эволюции клетки: Пер. с англ., под ред. Б.М. Медникова. Москва: Мир, 1983. 352 с.

13. Харченко Е.П., Уровни организации прокариотического нуклеоида и эукариотической хромосомы // Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 1980. Т. 16. С.8-18.

14. Шлегель Г. Общая микробиология. Москва: Москва, 1972. 476 с.

15. Andersson S.G., Eriksson A.S., Naslund А.К., Andersen M.S., Kurland C.G. The Rickettsia prowazehii genome: a random sequence analysis // Microb. Сотр. Genomics. 1996. V.l (4). P.293-315.

16. Arenas G.N., Staskevich A.S., Aballay A., Mayorga L.S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages // Infect. Immun. 2000. V.68. P.4255-4263.

17. Baldo L., Lo N., Werren J.H. Mosaic Nature of the Wolbachia Surface Protein // J. Bacteriology. 2005. V.187. P.5406-5418.

18. Bandara A.B., Sriranganathan N., Schurig G.G., Boyle S.M. Carboxyl-Terminal Protease Regulates Brucella suis Morphology in Culture and Persistence in Macrophages and Mice // J. Bacteriology. 2005. V.187 (16). ?.Ы(Л-5115.

19. Barak I., Ricca F. Cutting S. From fundamental studies of sporulation to applied spore research // Molecular Microbiology. 2005. V.55 (2). P.330-338.

20. Binnington K.C., Hoffmann A.A. Wolbachia-Yike organisms and cytoplasmic incompatibility in Drosophila simulans /7 J. Invert. Pathol. 1989. V.54. P.344-352.

21. Bonicontro A., Risuleo G. Structural studies of E. coli ribosomes by spectroscopic techniques: A specialized review ." Spectrochimica Acta A, 2005. in press (в печати).

22. Bordenstein S.R., Werren J.H. Do Wolbachia influence fecundity in Nasonia vitripennis'l II Heredity. 2000. V.S4. P.54-62.

23. Bordenstein S.R., Werren, J.H. Effects of A and В Wolbachia and host genotype on interspecies cytoplasmic incompatibility in Nasonia И Genetics. 1998. V.148. P. 1833-1844.

24. Bouchon D„ Rigaud T., Juchault P. Evidens for widespread Wolbachia infection in isopod crustaceans: molecular identification and host féminisation // Proc. R. Soc. Lond. 1998. V.265. P.1081-1090.

25. Boyle L., O'Neill S., Robertson H., Karr T. Intraspecific horizontal transfer of Wolbachia in Drosophila II Reprint series. 1993. V.260. P.1796-1799.

26. Braig H.R., Zhou W., Dobson S.L., O'Neill S.L. Cloning and characterization of a gene encoding the major surface protein of the bacterial endosymbiont Wolbachia pipientis II J. Bacteriol. 1998. V.180, No.9. P.2373-2378.

27. Cal!aini G., Riparbelli M.G., Dallai R. The distribution of cytoplasmic bacteria in the early Drosophila embryo is mediated by astral microtubules // J. Cell Sci. 1994. V.107. P.673—682.

28. Cavalier-Smith T. Chloroplast evolution: secondary symbiogenesis and multiple losses // Curr. Biol. 2002. V.22, No. 12(2). P.R62-64.

29. Cavalier-Smith T. The neomuran origin of archaebacteria, the negibacterial root of the universal tree and bacterial megaclassification // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V.52 (1). P.7-76.

30. Cavalier-Smith T. The phagotrophic origin of eukaryotes and phylogenetic classification of Protozoa H Int. J. Syit. Evol. Microbiol. 2002. 52(2). P.297-354.

31. Celli J., de Chastellier C., Franchini D.M., Pizarro-Cerda J., Moreno E., Gorvel J.P. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum I I J. Exp. Med. 2003. V.198. P.545-556.

32. Clark M.E., Veneti Z., Bourtzis K., Karr T.L. The distribution and proliferation of the intracellular bacteria Wolbachia during spermatogenesis in Drosophila // Mechanisms of Development. 2002. V.l 11. P.3-15.

33. Crespigny F.E., Wedell N. Can cytoplasmic incompatibility inducing Wolbachia promote the evolution of mate preferences? //' J. Evol. Biol. 2005. V.l 8. P.967-977.

34. Dedeine F., Vavre F., Fleury F., Loppin B., Hochberg M., Bouletreau M. Removing symbiotic Wolbacliia bacteria specifically inhibits oogenesis in parasitic wasp // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001. V.98. Issue 11. P.6247-6252.

35. Dyall S.D., Brown M.T., Johnson P.J. Ancient invasions: from endosymbionts to organelles // Science. 2004. V.304. P.253-257.

36. Emelyanov VV. Rickettsiaceae, rickettsia-like endosymbionts, and the origin of mitochondria// Biosci. Rep. 2001. V.21. P. 1-17.

37. Errington J., Daniel R., Scheffers D. Cytokinesis in Bacteria // Microbiology Molecular Biology Reviews. 2003. V.67. P.52-65.

38. Foe V., Alberts B. Studies of nuclear and cytoplasmic behavior during the five mitotic cycles that preceed gastrulation in Drosophila embryogenesis // J. Cell Sei. 1983. V.61.P.31-70.

39. Gil R. Latorre A., Mova A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics // Environ. Microbiol. 2004. V.6. P.l 109-1122.

40. Glover D.M., Raff J., Karr T.L., O'Neill S.L., Lin H., Wolfner M.F. Parasites in Drosophila embryos // Nature. 1990. V.348. P.l 17.

41. Graf J., Ruby E. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria// Microbiology. 1998. V.95. Issue4. P. 1818-1822.

42. Greub G., Raoult D. Mcrpholcgy of Legionella pneumophila according to their location within Hartmanella vermiformis II Re?. Microbiol. 2003. V.154. P.619-621.

43. Haferkamp I., Esser S.S., Linke. N., Urbany C., Collingro A., Wagner M., Horn M., Neuhaus H.E. A candidate NAD1 transporter in an intracellular bacterial symbiont related to Chlamydiae // Nature. 2004. V.432. P.622-625.

44. Henkle-Duhrsen K., Eckelt V., Wildenburg G., Blaxter M., Walter R. Gene structure, activity and localisation of a catalase from intracellular bacteria in Onchocerca volvulus II Molecular and Biochemical Parasitology. 1998. V.96. P.69-81.

45. Hinrichs W., Kisker C., Duvel M., Muller A., Tovar K., Hillen W., Saenger, W. Structure of the Tet repressor-tetracycline complex and regulation of antibiotic resistance//Science. 1994. V.264. P.418-420.

46. Hoffmann A.A., Hercus M., Dagher H. Population dynamics of the Wolbachia infection causing cytoplasmic incompatibility in Drosophila melanogaster II Genetics. 1998. V. 148. P.221-231.

47. Hoffmann A.A., Turelli M., Simmons G.M. Unidirectional incompatibility between populations of Drosophila simulans II Evolution. 1986. V.40. P.692-701.

48. Hurst G.D.D., Johnson A., Schulenburg H., Fuyama Y. Male-killing Wolbachia in Drosophila: a temperature-sensitive trait with a threshold bacterial density // Genetics. 2000. V.156. P.669-709.

49. Hurst G.D.D., Jiggins F.M. Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications // Emerging Infectious Diseases. 2000. V.6. P.329-336.

50. Iturbe-Ormaetxe L, Burke G.R., Riegler M., O'Neill S.L. Distribution, Expression, and Motif Variability of Ankyrin Domain Genes in Wolbachia pipientis. II J. Bacteriology. 2005. V.187 (15). P.5136-5145.

51. James A.C., Ballard J.W.O. Mitochondrial genotype affects fitness in Drosophila simulans II Genetics. 2003. V. 164. P. 187-194.

52. Karr T.L. Giant steps sideways // Current Biology. 1994. V. 4, No.6. P.537-540.

53. Karr T.L., Alberts B.M. Organization of the cytosceleton in early Drosophila embryos//J. Cell Biol. 1986. V.102. P. 1494-1509.

54. Karr T.L., Yang W., Feder M.E. Overcoming cytoplasmic incompatibility in Drosophila II Proc. R. Soc. Lond. B. 1998. V.265. P.391-395.

55. Katoh K, Ichikawa H., Ishikawa I. Electron microscopic visualization of actin filaments in the early embryo of Drosophila melanogaster: the use of phalloidin and tropomyosin // J. Electron. Microsc. (Tokyo). 1991. V.40. P.70-75.

56. Kennedy D. Good news on a tropical disease // Science. 2002. V.296. P.1365.

57. Kim K.J., Na Y.E., Jeon K.W. Bacterial endosymbiont-derived lipopolysaccharides and a protein on symbiosome membranes in newly infected amoebae and their roles in lysosome-symbiosome fusion // Infect. Immun. 1994. V.62. P.65-71.

58. Koch E., Smith P., King R. The division and differentiation of Drosophila cystocytes // J. Morph. 1967. V.121. P.55-70.

59. Koga R., Tsuchida T., Fukatsu T. Changing partners in an obligate symbiosis: a facultative endosymbiont can compensate for loss of the essential endosymbiont Buchnera in an aphid // Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2003. V.270. P.2543-2550.

60. Kose H., Karr T.L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody // Mech. Dev. 1995. V.51. P.275-288.

61. Krell P.J., Beveridge T.J. The structure of bacteria and molecular biology of viruses // International Review of Cytology. 1987. Suppl. 17. P. 15-49.

62. Lassy C.W., Karr T.L. Cytological analysis of fertilisation and early embrionic development in incompatible crosses of Drosophila simulans 11 Mechanisms of Development. 1996. V.57. P.47-58.

63. Laubach C.A. Studies on aerobic spore-bearing nonpathogenic bacteria part ii spore-bearing bacteria in dust // J. Bacteriology. 1916. V.I. P.493-533.

64. Lory S. Secretion of proteins and assembly of bacterial surface organelles: shared pathways of extracellular protein targeting // Curr. Opin. Microbiol. 1998. V.l. P.27-35.

65. Maldonado R., Jimene J., Casedesus J. Changes of ploidy during the Azotobacter vinelandii growth cycle //J. Bacteriology. 1994. V. 176 (13). P.3911-3919.

66. Margulis L., Bermudes D. Symbiosis as a mechanism of evolution: status of cell symbiosis theory// Symbiosis. 1985. V.l. P.101-124.

67. Martin G., Sorokine O., Moniatte M., Bulet P., Hetru C., Dorsselaer A.V. The structure of a glycosilated protein hormone responsible for sex determination in the isopod, Annadillidium vulgare H Europ. J. Biochemistry. 1999. V.262. P.727-736.

68. Martin W., Schnarrenberger C. The evolution of the Calvin cycle from prokaryotic to eukaryotic chromosomes: a case study of functional redundancy in ancient pathways through endosymbiosis // Curr. Genet. 1997. V.32 (1). P. 1-18.

69. Martinez J., Martinez L., Rosenblueth M., Silva J., Martinez-Romero E. How are gene sequence analyses modifying bacterial taxonomy? The case of Klebsiella // International Microbiology. 2004. V.7. P.261-268.

70. Masui S., Sasaki T., Ishikawa H. Genes for the type IV secretion system in an intracellular symbiont, Wolbachia, a causative agent of various sexual alterations in arthropods //J. Bacteriology. 2C00. V.l 82. P.6529-6531.

71. McGraw E.A., O'Neill S.L. Evolution of Wolbachia pipientis transmission dynamics in insects //Trends Microbiol. 1999. V.7. P.297-302.

72. McGraw E.A., Merritt D.J., Droller J.N., O'Neill S.L. Wolbachia-mediated sperm modification is dependent on the host genotype in Drosophila II Proc. R. Soc. Lond. 2001. V.268. P.2565-2570.

73. Min K.T., Benzer S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P. 10792-10796.

74. Montenegro H., Solferini V.N., Klaczko L.B., Hurst G.D.D. Male-killing Spiroplasma naturally infecting Drosophila melanogaster II Insect Molecular Biology. 2005. V.l4 (3). P.281-287.

75. Montgomery M., McFall-Ngai M. Bacterial symbionts induce host organ morphogenesis during early postembrionic development of the squid Euprimna scotopes II Development. 1994. V.120. P.1719-1729.

76. Mylona P., Pawlovvski K., Bisseling T. Symbiotic nitrogen fixation // Plant Cell. 1995. V.7. P.869 885.

77. Neyrolles O., Brenner C., Prevost M.C., Blanchard A. Identification of two glycosylated components of Mycoplasma penetrans: a surface-exposed capsular polysaccharide and a glycolipid fraction // Microbiology. 1998. V.144 (5). P. 12471255.

78. Nierzwicki-Bauer S.A., Balkwill D.L., Steven S.E. Heterocyst differentiation in the cyanobacterium mastigocladus laminosust // J. Bacteriology. 1984. V.157 (2). P.514-525.

79. O'Neill S.L., Giordano R., Colbert A.M.E., Karr T.L., Robertson H.M. 16S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. V.89. P.2699-2702.

80. O'Neill S., Karr T. Bidirectional incompatibility between conspecific populations of Drosophila simulans II Reproduction from Nature. 1990. V.348. P. 178-180.

81. Oh H.W., Kim M.G., Shin S.W., Bae K.S., Ahn Y.J., Park H.Y. Ultrastructural and molecular identification of a IVolbachia endosymbiont in a spider, Nephila clavata II Insect Mol. Biol. 2000. V.9. P.539-543.

82. Pizarro-Cerda J., Meresse S., Parton R. Brucella abortus transits through the autophagic pathway and replicates in the endoplasmatic reticulum of nonprofessional phagocytes 11 Infect. Immun. 1998. V.66. P.5711-5724.

83. Pollack J.D., Li Q., Pearl D.K. Taxonomic utility of a phylogenetic analysis of phosphoglycerate kinase proteins of Archaea, Bacteria, and Eukaryota: Insights by Bayesian analyses // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2005. V.35. P.420-430.

84. Popov V.L., Han V.C., Chen S.M., Dumler J.S., Feng H.M., Andreadis T.G., Tesh R.B., Walker D.H. Ultrastructural differentiation of the genogroups in the genius Ehrlichia II J. Med. Microbiol. 1998. V.47. V.235-251.

85. Richier S., Furla P., Plantivaux A., Merle P.L., Allemand D. Symbiosis-induced adaptation to oxidative stress // J. Exp. Biol. 2005. V.208. P.277-285.

86. Riegler M., Sidhu M., Miller \V., O'Neill S. L. Evidence for a global Wolbachia replacement in Drosaphila melanogcister 11 Curr. Biology. 2005. V.l 5. P. 1428-1433.

87. Rigaud T., Pennings P.S., Juehault P. Wolbachia bacteria effects after experimental interspecific transfers in terrestrial isopods // J. Invertebrate Pathology. 2001. V.77. P.251-257.

88. Shoemaker D.D., Keller Ci., Ross K.G. Effects of Wolbachia on mtDNA variation in two fire ant species // Mol. Ecol. 2003. V.l2. P. 1757-1771.

89. Slesarev A.I., Belova G.I., Kozyavkin S.A., Lake J.A. Evidence for an early prokaryotic origin of histones H2A and H4 prior to the emergence of eukaryotes // Nucleic Acids Res. 1998. V.l5, No.26 (2). P.427-430.

90. Snook R., Cleland S., Wolfner M., Karr T. Offsetting effects of Wolbachia infection and heat-shock on sperm production in Drosophila simulans: analyses of fecundity, fertility and accessory gland proteins // Genetics. 2000. V.l55. P. 167-178.

91. Stephenson K., Lewis R.J. Molecular insights into the initiation of sporulation in Gram-positive bacteria: new technologies for an old phenomenon // FEMS Microbiology Reviews. 2005. V.29. P.281-301.

92. Stouthamer R., Breeuwer J., Hurst G. IVolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction // Annu. Rev. Microbiol. 1999. V.53. P.71-102.

93. Stouthamer R., Breeuwer J.A.J., Luck R.F., Werren J.H. Molecular identification of microorganisms associated with parthenogenesis // Nature. 1993. V.361. P.66-68.

94. Swanson M.S., Isberg R.R. Identification of Legionella pneumophila mutants that have aberrant intracellular fates // Infection and Immunity. 1996. V.64, No 7. P.2585-2594.

95. Takemura M. Poxviruses and the origin of the eukaryotic nucleus // J. Mol. Evol. 2001. V.52 (5). P.419-425.

96. Telschow A., Yamamurn N., Werrsn J.H. Bidirectional cytoplasmic incompatibility and the stable coexistence of two IVolbachia strains in parapatric host populations // J. Theoretical Biology. 2005. V.235. P.265-274.

97. Terasaki M., Runft L., Ftend A.R. Changes in organization of the endoplasmic reticulum during Xenopus oocyte maturation and activation 11 Mol. Biol. Cell. 2001. V.12. P.l 103-1116.

98. Tram U., Sullivan W. Role of delayed nuclear envelope breakdown and mitosis in Wolbachia-induced cytoplasmic incompatibility // Science. 2002. V.296. P.l 124-1126.

99. Turelli M., Hoffmann A. Microbe induced cytoplasmic incompatibility as a mechanism for introducing transgenes into arthropod populations // Insect Molecular Biology. 1999. V.8. P. 243-255.

100. Varshavsky A.J., Bakayev V.V., Nedospasov S.A., Georgiev G.P. On the structure of eucaryotic, procaryotic and viral chromatin // Cold. Spr. Harb. Symp. 1978. V.17.P.457-473.

101. Vavre F„ Fleury F., Lepetit D„ Fouillet P., Boulletreau M. Phylogenetic evidence for horizontal transmission of Wolbachia in host-parasitoid associations // Mol. Biol. Evol. 1999. V.16. P.1711-1723.

102. Vavre F., Girin C., Bouletreau M. Phylogenetic status of a fecundity-enhancing Wolbachia that does not induce thelytoky in Trichogramma // Insect Molecular Biology. 1999. V.8. P. 67-72.

103. Vyshnyakov A., Rautian M., Lebedeva N. Possible new intranuclear symbionts of Paramecium caudatum II Protistology. 2001. V.2. P.63-67.

104. Warn R.M. The cytosceleton of the early Drosophila embryo // J. Cell Sci. Suppl. 1986. V.5. P.311-328.

105. Werren J.H. Biology of Wolbachia II Annu. Rev. Entomol. 1997. V.42. P.587-609.

106. West S.A., Cook G.M. Werren J.H., Godfray H.C.J. Wolbachia in two insect host-parasitoid communities 11 Molecular ecology. 1998. V.7. P. 1457-1465.

107. Whittenbury R., Dow C.S. Morphogenesis and differentiation in rhodomicrobium vannielii and other budding and prosthecate bacteria // Bacteriowgical R^vizws. 1977. V.41 (2). P.754-808.

108. Williams B., Hirt R., Lucocq J., Embley T. A mitochondrial remnant in the microsporidian Trachipleistnphora ho minis II Nature. 2002. V.418. P.865-869.

109. Wolken W.A.M., Tramper J., Werf M. What can spores do for us? // Trends in Biotechnology. 2003. V.21 (8). P.338-345.

110. Wright J.D., Sjostrand F.S., Portaro J.K., Barr A.R. The ultrastructure of the rickettsia-like microorganism Wolbachia pipientis and associated virus-like bodies in the mosquito Culex pipiens // J. Ultrastruct. Res. 1978. V.63. P.79-85.

111. Zchori-Fein E., Roush R.T., Rosen D. Distribution of parthenogenesis-inducing symbionts in ovaries and eggs of Aphytis (Hymenoptera: Aphelinidae) // Curr. Microbiol. 1998. V.36. P. 1-8.

112. Zelmer A., Krusch S., Koschinski A., Rohde M., Repp H., Chakraborty T., Weiss S. Functional transfer cf eukarvotic expression plasmids to mammalian cells by Listeria monocytogenes: a mechanistic approach // J. Gene Med. 2005. V.7. P. 1097-1112.

113. Zhou W., Rousset F., O'Neill S.L. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strain? using vusp-gene sequences // Proc. R. Soc. Lond. 1998. V.265. P.509-515.