Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стохастическая модель мотора F1-АТФазы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Стохастическая модель мотора F1-АТФазы"

На правах рукописи

Погребная Александра Францевна

Стохастическая модель мотора Р1-АТФазы

специальность 03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре общей физики и волновых процессов физического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор физико-математических наук, профессор Романовский Ю. М.

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук, А. А. Полежаев

доктор физико-математических наук, профессор К. В. Шайтан

Ведущая организация

Институт биофизики клетки РАН

ЯП/Со

/■Г*5

Защита состоится « К Диссертационного

университете имени М В Ломоносова по адрес) 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет кафедра биофизики, аудитория «новая»

_ 2005 года в ' ' часов па заседании

совета Д 501 001 96 при Московском государственном

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического о факультета МГУ им MB Ломоносова

Автореферат разослан 2005 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 501 001 96 при МГУ

им М В Ломоносова

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации

Молекулярные моторы - общепринятый термин для группы белков, совершающих движение благодаря превращению химической энергии гидролиза в механическую энергию. Если еще тридцать лет назад концепция и термин «белок-машина», введенные в работах ЛА Блюменфельда, Ю.И.Хургина, Д.С.Чернавского и С.Э.Шноля, вызывали разнообразные возражения, то сейчас о молекулярных машинах можно прочитать не только в специальной литературе, но и в массовых периодических изданиях. В последние годы, не только были открыты многие белковые моторы, но и предпринимаются попытки их использования для манипуляций с отдельными молекулами в нанобиотехнологиях. Существуют два больших класса моторов: линейные и вращающиеся моторы. К линейным моторам относятся кинезин («шагающий с ноги на ногу» вдоль микротубулина), миозин (при взаимодействии с актином обеспечивает сокращение мышечных волокон), РНК полимераза и т.д. Примерами вращающих моторов являются: флагелярные моторы (в бактериальных клетках) и фермент АТФсинтаза ^^0-АТФаза, вращающийся во время синтеза/гидролиза молекул АТФ). Все молекулярные моторы, так или иначе, используют энергию синтеза/гидролиза нуклеотидов (АТФ) либо разницу электрохимического потенциала на цитоплазматической мембране. В настоящее время усилиями сотен исследователей достоверно показано, что ферментативная молекула F0F1-АТФсинтаза - молекулярный мотор, использующий оба типа энергии. Он синтезирует АТФ (аденозинтрифосфорной кислоты) из АДФ (аденозиндифосфорной кислоты) и неорганического фосфата в комплексе F1 ^ АТФаза) за счет протонов проходящих через комплекс F0, встроенный в энергопреобразующую мембрану митохондрий, хлоропластов и бактерий. И наоборот: работая в обратном направлении, он гидролизирует АТФ в АДФ и неорганический фосфат - Рр вырабатывая энергию и перекачивая протоны.

К настоящему времени доказано, что не только гидролиз АТФ может происходить в изолированном фрагменте - F1 -АТФазе, но и синтез АТФ. F1-АТФаза работает как мотор, внутри которого вращается у субъединица по центру статора -состоящего из трех идентичных копий ар субъединиц. Вращение инициируется

з

конформационными изменениями 3(а р) субъединиц Такой результат, доведенный до уровня «наглядности», получен в тонких биохимических и биофизических экспериментах с применением методов рентгеноструктурного анализа и оптики с использованием лазеров и видеотехники

Не менее важную роль в осмысливании работы такого мотора сыграло математическое моделирование К настоящему времени предложены уравнения динамики ротора (у- субъединицы) При этом силовые поля вводятся из общих феноменологических представлений С другой стороны прилагаются усилия для построения полной модели F0F1-АТФ-синтазы Более того, сделаны первые попытки для проведения такого моделирование методами молекулярной динамики в которых учитываются движения более чем 30000 атомов F0 F1-АТФ-синтазы и молекул АТФ. АДФ, Р1 Даже использование современных компьютеров в этом случае позволяют проследить собьп ия лишь на протяжении сотен пс, чего совершенно недостаточно, так как характерные времена конформационных переходов составляют миллисекунды Кроме того, анализ результатов и точности их получения в такой глобальной модели является сам по себе чрезвычайно сложной задачей

Безусловно, такое моделирование будет резутьтативным и эффективным, если будет проводиться наряду с моделированием более простых систем с небольшим числом выделенных «существенных» степеней свободы Такие степени свободы всегда имеются как в технических устройствах так и в молекулярных машинах Именно поэтому такие конструкции и называются машинами Настоящая работа лежит в русле исследований, в которых строятся модели, отражающие изменения существенных переменных Влияние других атомов учитывается введением суммарных потенциалов взаимодействия и тепловых шумов

Цели и задачи диссертационной работы.

Основной целью работы является построение и анализ модели стохастической динамики F1-АТФазы в режиме гидролиза и синтеза АТФ При постановке задачи предполагалось, что проведенные исследования позволят

• Построить замкнутую систему кинетических уравнений, описывающих химические процессы (посадки субстрата, выхода продуктов реакции а также химическую реакцию гидролиза/синтеза) в активных центрах

реакцию гидролиза/синтеза в активных центрах фермента с направленным вращением ротора (у субъединицы).

• Получить количественные характеристики и закономерности поведения мотора в зависимости от экспериментально устанавливаемых параметров.

Для решения поставленных задач необходимо было построить модельные потенциалы, описывающие взаимодействие между ротором и статором молекулярного мотора. Для определения функций, определяющих вращение ротора, была проведена серия вычислений, в которых оценивалась энергия электростатического взаимодействия гидролизированых атомов молекул субстратов и продуктов с заряженными и поляризованными аминокислотными остатками каталитических центров Р1-АТФазы во всех конформациях фермент-субстратного комплекса. Подробно исследованы режимы вращения мотора в зависимости от различных экспериментально определяемых параметров.

Научная новизна работы.

1. Оценена энергия электростатического взаимодействия в фермент-субстратном комплексе Б1-АТФазы на различных этапах каталитического цикла в известных устойчивых конформациях фермент-субстратного комплекса. Показано, что изменение электростатической энергии адекватно описывает процессы, происходящие в фермент-субстратном Б1-АТФазы комплексе во время каталитического цикла гидролиза АТФ.

2. На основании расчета электростатических взаимодействий в фермент-субстратном комплексе определены форма и количественные характеристики предложенных потенциалов взаимодействия между каталитическими субъединицами и ротором молекулярного мотора. Данные потенциалы позволяют описать направленное движение ротора в результате гидролиза АТФ и наоборот описать синтез АТФ в результате направленного движения ротора под действием момента внешней силы.

3. Разработана замкнутая модель мотора Б1-АТФазы, в которой учитываются как существенные динамические переменные, так и переменные, описывающие химическую кинетику. На основе исследования данной модели определены

статистические характеристики динамики мотора и кинетика химических превращений в широком временном диапазоне (до нескольких минут) (тогда как молекулярная динамика позволяет пока это делать лишь на временах порядка сотен пс)

Научная и практическая ценность работы определяется возможностью

• Проследить стохастическую динамику работы АТФазы в «иммобилизованном» режиме

• Осмыслить качественно и количественно работу отдельных элементов совершенной конструкции молекулярного мотора - важнейшего нанотехнологического объекта, возникшего в результате биологической эволюции

• Модель может помочь в выборе стратегии и определении параметров соответствующих биофизических экспериментов

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на семи международных конференциях Saratov Fall Meeting 2002 Optical Technologies in Biophysics and Medicine IV (Saratov, Russia, October 1-4, 2002), 10-я Международная конференция «Математика Компьютер Образование» (Пущино, 20-25 января 2003г), International Workshop «Stochastic dynamics of complex systems» (Berlin September 2003), Complex Dynamics, Fluctuations, Chaos and Fractals in Biomedical Photonics (San-Jose, California USA, 24-29 January, 2004), III СЪЕЗД БИОФИЗИКОВ РОССИИ (Воронеж, 24-29 июня 2004 г), 1st International Workshop on Noise in Condensed Matter and Complex Systems (Citta' del Mare - Terrasini (Palermo) -26-29 July 2004), 12-я Международная конференция «Математика Компьютер Образование» (Пущино, 17-22 января 2005г)

Публикации: по материалам диссертации опубликовано семь работ, из них одна в реферируемом журнале, две в сборниках трудов и четыре в тезисах конференций

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка публикаций автора и списка цитируемой литературы. Общий объем работы составляет 115 страницы машинописного текста, включая 40 рисунков и 3 таблицы. Библиография содержит 115 наименований.

Краткое содержание работы

Во введении дано обоснование актуальности темы диссертации и ее практической значимости, сформулированы цель работы, ее научная новизна и приведены положения, выносимые на защиту. Кратко изложено содержание диссертации по главам.

Первая глава является литературным обзором и содержит разносторонний анализ различных публикаций, на основании которых ставятся и обосновываются цели настоящей работы. Для обоснования и выбора параметров модели РгАТФазы как молекулярного мотора проанализированы и сопоставлены следующие группы данных:

а) геометрическое строение всех ее субъединиц в различных конформациях и распределение электрических зарядов аминокислотных остатков и пептидных групп на основе рентгеноструктурного анализа и совокупности биохимических сведений;

б) проанализированы опыты по непосредственному наблюдению вращения мотора оптическими методами;

в) критически проанализированы созданные ранее математические модели.

РгАТФазы - часть АТФсинтазного комплекса, синтезирующего АТФ за счет энергии разности электрохимического потенциала, вырабатываемого на энергопреобразуюшей мембране митохондрий и хлоропластов. Этот комплекс состоит из гексамера, образованного из шести субъединиц ((ар)3 комплекс) и центральной у субъединицы. Каталитические центры синтеза/гидролиза АТФ расположены в субъединицах (3. Три каталитических центра РгАТРазы имеют разное сродство к нуклеотидам, что обусловлено различной конформацией белковых субъединиц, формирующих эти каталитические центры (рис.1).

конформация Д конформация Д конформация Д

Рис.1. Схематическое изображение в и у субъединиц (по данным рентгеноструктурного анализа) в трех различных конформациях и их схематические предствления, в, - субъединица связанная с М^ТР (плотно закрытая конформация), в, - субъединица со свободным каталитическим центром (открытая конформация); Д - субъединица связанная с М^АОР в каталатическом центре (промежуточная конформация).

Р1-АТФаза - фермент, в котором катализ (синтез/гидролиз АТФ) сопровождается конформационными изменениями в трех каталитических субъединицах, что в свою очередь приводит к вращению центральной субъединицы (ротора). Вращение шагобразное (три шага на один оборот). Каждый 120° шаг состоит из двух маленьких на 80°-90° и 40°-30° Эффективность преобразования химической энергии в механическую близка к 100%.

Несмотря на довольно таки большое количество экспериментальных и теоретических работ до сих пор не построена простая и наглядная модель, связывающая статистический характер химических процессов (посадки субстратов, химической реакции в карманах выхода продуктов реакции) и детерминированное механическое движение ротора

во второй главе получены количественных характеристики потенциалов взаимодействия между статором и ротором молекулярного мотора, приводящих к направленному вращению ротора в режиме гидролиза АТФ Для этого бьпа оценена энергия электростатического взаимодействия гидролизированых атомов молекул субстрата (Mg2+ATP4-) и продуктов реакции гидролиза (Mg2+ADP3- и Р12-) с заряженными и поляризованными аминокислотными остатками каталитических

центров F1-АТФазы во всех устойчивых конформациях фермент-субстратного комплекса. В расчетах использовано приближение точечных зарядов, расположенных в геометрических центрах соответствующих атомов. Т.е. энергию Е фермент-субстратного комплекса определяли по формуле

где Qi обозначает электрический заряд атома «i-ой молекулы субстрата, qk -электрический заряд на «к»-том атоме заряженного аминокислотного остатка, N -число заряженных атомов молекулы белка, М - число заряженных атомов субстратов (АТР4-, АДФ3-, НРОз2- and Mg2+) связанных с каталитическими центрами фермента, R: (i = l,... М) И rt (k=l,... N) - координаты атомов субстрата и

фермента, соответственно. В формуле (1) величина е1П - эффективная диэлектрическая проницаемость, которая является параметром модели. Известно, что внутри белков эффективная диэлектрическая проницаемость может меняться в очень широких пределах. К сожалению, определить значения ея в различных точках внутри молекулы Fj-АТРазы в настоящее время не представляется возможным. Поэтому рассчитанные нами значения энергии, показанные на соответствующих диаграммах, приведены в условных единицах.

Координаты атомов Fj-АТРазы митохондрии сердца быка, соответствующие структурам, описанным в работах, были получены из Брукхэвенского банка данных (Brookhaven Protein Data Bank).

В расчетах предполагалось, что полностью ионизированными являются аминокислотные остатки лизина, аргинина, аспартата, глютамата и гистидина. Для аминокислотных остатков лизина точечный заряд qLy = +1 был сосредоточен на атоме азота аминогруппы. Для аминокислотных остатков аргинина рассматривались заряды qArg = +0,5, расположенные на двух концевых атомах азота. В случае гистидинов одинаковые заряды qHls = +0,5 были приписаны каждому азоту в имидазольного кольца. Для карбоксильных групп глютамата и аспартата одинаковые заряды q = -0,5 были распределены между двумя атомами кислорода. В тех случаях, когда для используемой в нашей работе структуры было известно

Е = -.

* "I J-1 frfrl-K,-л,| -1| b'ift\rk

(W) 1 " 11 (»«)

(1)

расположение молекул воды во внутренних полостях белковой глобулы, мы также учитывали взаимодействие заряженных аминокислотных остатков и молекул субстратов и продуктов, расположенных в активных центрах фермента, с зарядами локализованными на молекулах воды Атому кислорода в молекуле воды приписывали заряд = -0,6, на атомах водорода были локализованы заряды дн = +0,3

В каждом состоянии фермент-субстратного комплекса, рассматриваемом в настоящей работе, один каталитический центр всегда находится в конформации Д, другой центр - в конформации в, а третий центр - в конформации ве

Ключевые стадии каталитического цикла, на которых производились расчеты электростатической энергии, соответствующие трех-центровой модели работы АТФазы представлены на рис 2

Рис. 2 Схема «трехцентрового» механизма гидролиза АТФ Первый этап (1) -связывание АТФ с «открытым» АЦ, (2В) - гидролиз АТФ в закрытой конформации, (2А) - изменение конформаций (/?,->/?, Д-»/?, Р: -> 0е), (ЗВ) изменение конформаций (/?/-> Д Д ), (ЗА) - гидролиз АТФ в в,

конформации, (4) - выход фосфата, (5) - выход АДФ

-1-1—//—I-,-_,-1-,—

0 1 2 3 4 5 6 7

Состояние фермент субстратного комплекса

Рис.3. Диаграмма энергетических уровней, рассчитанная для каталитического цикла гидролиза АТФ Б1-АТФазой

На Рис 3 представлена одна из полученных и анализируемых диаграмм Результаты расчетов свидетельствуют о том что энергетически выгодный процесс связывания MgATP с каталитическим центром, находящимся в «открытой» конформации, является энергетически выгодным процессом и инициирует изменение конформации данной каталитической субъединицы (переход Ре —>Д),

что является причиной поворота субъединицы у Выход фосфата после гидролиза АТФ также является энергетически выгодным процессом Выход же АДФ является энергоакцепторным процессом Данные расчеты позволили оценить относительные изменений энергии во время различных каталитических событий (посадки субстрата, непосредственно реакции гидролиза, выхода продуктов реакции) Получены следующие соотношения между энергией выделяющейся при связывании АТФ с активным центром (РА11 ) и энергией выделяющейся при выходе неорганического фосфата (ЕР),а также между энергией требуемой для выхода АДФ

из активного центра

Результаты главы использовались нами при конструировании эффективного силового потенциала для движения ротора молекулярного мотора Б1-АТФазы (у субъединицы)

Основной целью третьей главы являлось построение достаточно простой модели описывающей движение у субъединицы внутри гексамера (ар)з в режиме гидролиза АТФ. Данная модель учитывает основные качественные особенности движения ротора мотора РгАТФаэы:

• шаговость вращения ротора молекулярного мотора (три шага на полный оборот);

• при определенных условиях (концентрация субстратов, нагрузка) в каждом шаге становятся различимы два «подшага» - 30°-40° и 90°-80°. продолжительность пауз определяется условиями проведения эксперимента (концентрация субстрата, величина нагрузки);

• зависимость скорости вращения от концентрации субстрата носит гиперболический характер (закон Михаэлиса-Ментен);

• направление вращения зависит от направления катализируемой реакции (синтеза или гидролиза).

• В модели также решается вопрос, почему эффективность преобразования энергии в данном моторе столь высока (100%).

При построении модели полагали, что механический цикл (конформационные изменения каталитических субъединиц) тесно связан с химическим циклом (посадка субстрата в активный центр, химическая реакция гидролиза синтеза АТФ, выход продуктов реакции из активного центра). Об этом свидетельствует высокая эффективность преобразования данным мотором химической энергии в механическую работу.

Так как существенные конформационные изменения во время каталитического цикла происходят только в каталитических р субъединица, а а субъединицы меняются слабо, в модели учитывается только взаимодействие рзу комплекса. В каждом устойчивом конформационном состоянии фермента у субъединица контактирует с двумя из трех каталитических р. Изменение формы одной из этих двух р приводит к возникновению вращающего момента и повороту у. Если же будет поворачиваться у субъединица (под действием внешней силы), то

неизбежно будет изменять конформацию двух р субъединиц. Таким образом, ориентация у субъединицы однозначно определяет конформацию двух из трех катлитических субъединиц Третья каталитическая субъединица может принимать любые конформации что не приведет к изменению ориентации ротора

Уравнение, описывающее движение в деформационных потенциалах имеет

вцд

где в- задает угловое положение у субъетиницы, % - коэффициент вязкого трения и принимает значения порядка 10-7 Нмс Инерционным членом в уравнении (1) пренебрегли из-за его малости

силовой потенциал, являющийся аддитивной суммой силовых потенциалов, создаваемых каждой из трех каталитических субъединиц р находящимися в положениях 0 ~90°,в, 210°,9,-330° /(1) - момент вращения создаваемый силами

стохастической природы, обусловленными тепловыми флуктуациями Шум мы считаем белым

Изменение деформационного потенциала создаваемого каталитическими центрами, в общем случае определяется присутствием в кармане того или иного субстратного комплекса в нем, т е

где - определяют наличие или отсутствие

того или иного субстрата в активном центре, а

определяют потенциалы, возникающие при присутствии субстрата соответствующего индексу потенциала (рис 4) Предположив, что выход Р, происходит сразу после гидролиза, мы упростили запись для потенциала

(2)

V {в-в)- уА1еУА1Н{в-ву У^ [в-в)

(За)

Уравнение (1) дополняет система кинетических уравнений для вероятности заселенностей активных центров субстратом, которые однозначно определят вероятности ^АТР(0, у^рМ в выражении (3а).

- номер каталитической субъединицы

где уравнение (4) описывает динамику изменения вероятности заполнения активных центров у/тем или иным субстратом (АТФ или АДФ), причем, учитывая, что

карман может быть заселен только одной молекулой субстрата, на вероятности наложены ограничения:

8(в-в), Я(в-в)- функция описывающие «открытость» и «реакционную способность» активных центров в зависимости от положения у субъединицы (см. рис.3.2); константа к, - задает скорость посадки субстрата в полностью

открытый центр; плтв и плвг - концентрации АТФ и АДФ во внешней среде; т-Щ-авр) - среднее время выхода АТФ (АДФ) из АЦ и задается выражением:

1

■-Л

■ЛГЦ-Л11Г)

ехр

Г АТЦЛОР)/

1-ЛТЦ-ЛОР)

где - скорость выхода продуктов реакции из полностью открытого АЦ;

- определяют скорость гидролиза и синтеза АТФ в полностью закрытом

центре;. В уравнении (4) первое и четвертое слагаемые описывают посадку и уход субстрата из активно центра, скорость такого процесса ограничивается

конформацией в субъединицы. Второй и третий члены описывают реакции гидролиза и синтеза в закрытом центре Область конформационных состояний, определяемых координатой в1 при которых протекает реакция, ограничивается

функцией Щв-в) .

Таким образом, мы получили замкнутую систему уравнений (2)-(4), описывающую динамику работы мотора. Полученная система уравнений позволяет нам полностью описать динамику работы всего мотора.

Рис4 VíTe{9-в) - деформационный потенциал для АЦ содержащего молекулу А'ГФ, VADtiP(6-e) -деформационный потенциал для ЛЦ содержащего АДФ и Р„ Ул№(0~0:) -деформационный потенциал для АЦ для АДФ, S(6-6) «открытость АЦ», R{9-0) - функция

описывающая реакционную

способность АЦ. Рисунок соответствует у субъединице повернутой на 90° (#=90°)

При численном решении системы (2)-(4). мы полагали, что в начальном состоянии реакционные центры свободны от субстратов. Во всех расчетах

^7Р=4х106с'М-', ^--0.5, к tDF = —■ При

к*АТРПАТР nATf ^*АТР ^*ЛТРПАТР ПЛТР

моделировании процесса гидролиза полагали концентрацию АДФ во внешней среде равной нулю.

Уравнения (2) решалось численно, простой разностной схемой. Для моделирования шумового воздействия теплового резервуара на вращение центральной субъединицы на каждом шаге по времени (At = 0.001 - 0.1ms), генерировалось случайное число с гауссовским распределением. В уравнении (4) левые части апроксимировались разностью и далее решение уравнений разбивалось на несколько этапов, т.е. использовался метод разбиения по «физическим» факторам. На первом шаге At/2 производился расчет вероятности выхода/посадки

субстрата из/в активного центра, а на втором шаге, производился учет химической реакции внутри каталитического центра Определяя начальные вероятности V Ате^лир) 1-о' мы рассчитываем значения вероятностей на следующем шаге

У атр(аЩ I 41/2 И ^аЩавр) г а' по этим значениям вероятностей определялось состояние активного центра (заселенность его тем или иным субстратом) В случае

случайное число с равномерным законом распределения на интервале [0,1], активный центр считался заселенным

субстратом, т е ^АТР{АОР),1-^АТР{АОР) ,-*)<-1 (коэффициенты в выражении 3),

в противном случае у/Ащлор^ д 2(^атр(аор) д -® На следующем этапе по

заданному состоянию мотора (те по значениям ) определялся

потенциал (За) и решалось уравнение Ланжевена (2) На следующем шаге по времени последовательность операций повторялась Таким образом, на базе кинетических уравнений, мы могли моделировать поведение отдельного мотора (одной «реализации») Для получения средних характеристик (например, скорости химических реакций осуществляемых каталитическими комплексами), проводилось моделирование ансамбля моторов, т.е. усреднение по множеству отдельных реализаций

На рис 5а представлены отдельные реализации вращения мотора при различных концентрациях АТФ Во вращении, в зависимости от концентрации, различаются 3 режима вращения преобладание пауз связанных с ожиданием посадки АТФ - АТФ-паузы (при низких концентрациях АТФ), преобладание пауз связанных с ожиданием выхода АДФ - АДФ-паузы (высокие концентрации АТФ) и при промежуточных концентрациях длительность АДФ-пауз и АТФ-пауз примерно одинакова

В работе также исследуется зависимость средней скорости вращения мотора от концентрации АТФ и от величины нагрузки (рис 5б) (коэффициента вязкого трения)

с

0,0 0,1 0,2 0.3 0,4 0,5

время, с

0,01 0,1 1

концентрация АТФ, [мМ]

а)

б)

Рис.5, а) зависимость угла поворота ротора от времени при различных концентрациях АТФ, концентрация указана возле каждой реализации в мМ; б) зависимость угловой скорости ротора от концентрации АТФ при различных значениях коэффициента трения: (а) 0,3*10-21Нмс; (б) 0,5* 10-21 Нмс; (в) - 1 * 10-21Нмс; (г) -2*10-21Нмс; (д).

Таким образом, в этой главе сформулирована и проанализирована достаточно простая модель, которая адекватно описывает движение центральной у субъединицы в силовом поле, образованном субъединицами комплекса (ар)з, при участии шума теплового резервуара. Выбранные нами силовые потенциалы опираются на полученные во второй главе оценки энергии связи субстратов и продуктов ЛТФазной реакции с активным центром. Проведенные в рамках модели расчеты показали, что модель и качественно и количественно описывает известные экспериментальные данные по гидролизу АТФ.

В четвертой главе рассмотрен синтез АТФ сопряженный с вращением ротора молекулярного мотора, под действием постоянного момента внешней силы. Анализ проводится в рамках сформулированной в третьей главе самосогласованной стохастической модели молекулярного мотора F1-АТФазы. В этом разделе представлены результаты численного моделирования синтеза АТФ. К настоящему времени, к сожалению, синтез АТФ изолированным ферментом F1-АТАФазой экспериментально не изучен. Но способность катализировать синтез АТФ изолированным иммобилизованным ферментом F1-АТАФазой к данному моменту экспериментально доказана.

В режиме синтеза АТФ под действием внешнего момента внешней силы изогнутая у субъединица вращается внутри комплекса (ар)з и является причиной

конформационных изменений в каталитических субъединицах. у субъединица сгибает подвижную часть каталитической субъединицы при повороте на 30 , сближая реагенты (АДФ и Р„) в АЦ и тем самым, создавая условия для синтеза АТФ, и полностью раскрывает каталитическую субъединицу при повороте на 90°, давая возможность выйти синтезированной АТФ. В модели в явном виде не учитываются процессы, связанные с посадкой/выходом неорганического фосфата, предполагается, что он всегда присутствует в нужном месте в нужный момент. Посадка же АДФ в АЦ открытой Р субъединицы - энергетически выгодный процесс и приводит к «призакрытию» каталитической субъединицы (переход ).

Затем, поворачиваясь под действием внешнего вращающего момента на 30°, у субъединица переводит каталитическую р субъединицу из конформации Д в конформацию (рис.3.3). После поворота на 30° находящиеся в АЦ реагенты (АДФ и Р|) сближаются, и становится возможна реакция синтеза АТФ. Во время этого же поворота другой своей стороной у субъединица «раскрывает» (переход )

предыдущую субъединицу, содержащую в своем АЦ синтезированную АТФ. Дальнейший поворот ротора (90°) заставляет раскрываться КЦ, давая возможность выйти синтезируемой молекуле АТФ. Таким образом, за поворот у субъединицы на 120° происходит сближение реагентов, реакция синтеза и открытие каталитического центра. Мы предполагаем, что в режиме синтеза происходят все те же конформационные изменения, что и при гидролизе АТФ, но в обратном порядке: Д—>Д—>Д—>Д. Посадка АДФ, синтез АТФ из АДФ и выход АТФ являются случайными событиями и характеризуются средними временами. Если посадка АДФ в АЦ не произошла, то потенциал, для движения ротора будет плоским. В этом случае вся внешняя энергия расходуется на вращение вала. Если же посадка АДФ произошла, то внешняя энергия затрачивается и на вращение вала и на синтез АТФ, т.е. ротор двигается в потенциале представленном на рис.3 (справа на лево).

Проводимые численно расчеты показали, что представленная в третьей главе модель позволяет описать синтез АТФ без введения дополнительных предположений или изменений в уравнения и используемые нами потенциалы. В работе исследована динамика вращения ротора в зависимости от условий, которые

могут быть проконтролированы в эксперименте - концентрации АТФ и величины внешнего вращающего момента

Рис 6а зависимость средней скорости вращения и средней скорости синтеза АТФ от концентрации АДФ Момент внешней силы

Вращающий момент, возникающий из-за конформационных переходов в Р

дУ(в)

субъединицах

дв

= 0 1667£, Тггра

Рис 6б зависимость скорости вращения и скорости синтеза АТФ от величины внешнего вращающего момента Рш Концентрация АДФ в окружающей среде равна 1мМ

Рис 7а Зависимость угла ориентации Рис 7б эффективность синтеза АТФ от ротора (6) от времени при различных величины момента внешней силы величинах внешнего вращающего Концентрация АДФ в окружающей среде момента 0,28 (а), 0,24 (б), 0,2 (в) и 0,18 равна 1мМ (г) Концентрация АДФ равна 1 мМ

Получены следующие результаты численного моделирования синтеза АТФ

1 Зависимость скорости синтеза от концентрации АДФ выходит на насыщение (рис 6а) эффективная константа Михаэлиса-Ментен Кя « 80 - %мкМ при используемых нами кинетических параметрах фермента (константы скоростей посадки/выхода субстратов, а также скорости синтеза/гидролиза АТФ) и при исследованных величинах внешнего вращающего момента

2 Скорость вращения линейно растет с ростом момента внешней силы при всех концентрациях АДФ (рис 6б) Скорость синтеза сростом момента внешней силы растет, выходит на насыщение и при больших уменьшается Интервал

значений, при которых эффективность работы фермента остается высокой с ростом концентрации АДФ ( ) незначительно расширяется

3 Динамика вращения определяется соотношением между внешними параметрами которые определяют характерные времена в системе -среднее время поворота под действием внешнего вращающего момента с учетом синтеза АТФ и без учета синтеза (гг и г*"') и среднее время посадки АДФ в АЦ

В зависимости от соотношения этих параметров

_ „ дУ(0)

а) при малых но г„(Т - большое) вращение вала шаговое с паузами

дв

обусловленными ожиданием посадки АДФ в каталитический центр ( большое), с ростом концентрации АДФ длительность пауз уменьшается,

б) при (при этом ) в системе наблюдаются повороты на

120° без синтеза АТФ, эффективность работы фермента падает (рис 7а, б)

Заключение

В диссертационной работе представлена модель фермента Б1-АТРазы как молекулярного устройства использующего энергию гидролиза АТФ для совершения механической работы (вращения вала), а также способного использовать механическую энергию для синтеза АТФ. Представленная самосогласованная модель связывает стохастические события посадки и выхода лигандов из активных центров, а также их взаимные превращения в активных центрах с детерминированным вращением ротора мотора. В отличие от существующих дискретных моделей, описывающих вращение ротора как переходы между конечным числом возможных устойчивых состояний фермента, представленная модель рассматривает движение ротора в непрерывном потенциале, что существенно расширяет ее возможности. Модельный потенциал может быть модифицирован с учетом новых экспериментальных данных по взаимодействию между рогором и статором мотора и данных расчетов молекулярной динамики и квантовой механики без внесения поправок в модельные уравнения. Разработанная модель может быть использована как часть (или блок) в полной модели Б0Б1-АТРсинтазы. Так как все параметры в уравнениях могут быть измерены или проконтролированы экспериментально, представленная модель полезна при разработке тактики экскрементов по изучению работы этого уникального молекулярного мотора, а также при создании на его основе нанотехнологических устройств.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1 На основании диаграммы электростатических взаимодействий субстратов и продуктов реакции с Р1-АТРазой получены следующие соотношения между энергией выделяющейся при связывании АТФ с активным центром (,&£Л1Г) и энергией выделяющейся при выходе неорганического фосфата ( ), а также между энергией требуемой для выхода АДФ из активного центра ( )

2 Разработана самосогласованная система уравнений, связывающая статистические события посадки и выхода лигандов из АЦ, а также их взаимные превращения в АЦ с детерминированным вращением ротора мотора, которая адекватно описывает стохастическую динамику молекулярного мотора в режиме гидролиза АТФ Данная модель позволяет рассчитать в реальном времени как реализации этих процессов для отдельных ферментов, так и усредненные характеристики, рассчитанные для всего ансамбля молекул

3 Данная модель позволяет смоделировать синтез АТФ сопряженный с вращением ротора под действием момента внешней силы Численные расчеты показали что

а) зависимость скорости вращения от момента внешней силы линейна при любых концентрациях АДФ,

б) в зависимости скорости синтеза АТФ от момента внешней силы существует максимум,

в) интервал значений, при которых эффективность работы фермента остается высокой с ростом концентрации АДФ расширяется

Благодарности.

Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю Ю М Романовскому Автор благодарит А.Н. Тихонова за плодотворное сотрудничество и А. В. Воронова за стимулирующие дискуссии, критические замечания и обсуждение результатов Кроме того, благодарю всех сотрудников лаборатории математической биофизики кафедры ОФиВП физического факультета МГУ за поддержку благожетательное отношение и помощь

Список публикаций по теме диссертации

1 A F Pogrebnaya, Y. M. Romanovsky, A. N. Tikhonov, Electrostatic interactions in

catalytic centers ofF, ATPasell Proceedings SPIE v 5068, pp 27-35 2003

2 A. H. Т ихонов, А. Ф. Погребная, Ю. М. Романовский, Электростатические

взаимодействия в каталитических, центрах Fj-АТРазы// Биофизика, 48(6), с 1052-1070,2003

3 A.F. Pogrebnaya Yu.M. Romanovsk) AN Tikhonov Stochastic model ofmolecular

motor of ATPasell Complex Dynamics Fluctuations, Chaos and I ractals in Biomedical Photonics, Proceedings SPIL v 5330 pp 120-131 2004

4 Y.M. Romanovsky, A. F. Pogrebnaya A N Tikhonov, Mathematical Model of Fj-

ATPase Molecular Motor// Palermo Itah 26-29 July 2004, Book of Abstracts, p 12

5 А. Ф. Погребная Ю. М. Романовский, А Н Тихонов, Стохастическая динамика

молекулярного мотора F-АТФазы/? III Съезд Биофизиков РОССИИ, Воронеж 2004, сборник тезисов, с 85-86

6 А. Ф. Погребная, Ю. М. Романовский, А. Н. Тихонов, Эчектростатические

взаимодействия в каталитических центрах F-АТРазыП Математика компьютер, образование'2003 20-25 января, 2003, сборник тезисов с 226-227

7 А. Ф. Погребная Стохастическая модель молекулярного мотора F-АТФазы

синтез АТФ// Математика компьютер образование'2005, 17-22 января, 2005 сборник тезисов, с 208

О-г,

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. ^

Подписано к печати 03.03.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ л.1,5. Тираж 100 экз. Заказ 096 Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

752

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Погребная, Александра Францевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Общие сведения о ферменте (литературный обзор)

1.1. Энергетические ресурсы клетки.

1.2. Общая характеристика Б^о-АТРсинтазы.

1.3. Пространственное строение АТРсинтазы.

1.4. Каталитические центры РрАТФазы

1.5. Каталитический цикл. Двух- и трех- центровый механизм катализа.

1.6. Структурные перестройки РрАТРазы (вращение ротора).

1.7. Теоретические модели мотора БрАТФазы.

Выводы.

Глава 2. Электростатические взаимодействия в каталитических центрах Е,-АТРазы

2.1. Вычисление энергии фермент-субстратного комплекса.

2.2. Конформационные состояния фермент-субстратного комплекса.

2.3. Результаты расчетов и их обсуждение.

2.4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Глава 3. Стохастическая модель молекулярного мотора ЕрАТФазы

3.1. Потенциалы взаимодействия ротора и статора молекулярного мотора.

3.2. Основные уравнения.

3.3. Численное решение уравнений.

3.4. Результаты численного моделирования работы мотора по вращению нагрузки.

Выводы.

Глава 4. Синтез АТФ Г^АТАФазой в стохастической модели

4.1. Последовательность событий в режиме синтеза АТФ.

4.2. Основные уравнения.

4.3. Результаты численного моделирования синтеза АТФ под действием постоянного внешнего вращающего момента.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стохастическая модель мотора F1-АТФазы"

Молекулярные моторы - общепринятый термин для группы белков, совершающих движение благодаря превращению химической энергии синтеза/гидролиза в механическую энергию. Если еще тридцать лет назад концепция и термин «белок-машина», введенные в работах Л.А. Блюменфельда, Ю.И.Хургина, Д.С.Чернавского и С.Э.Шноля [1-4], вызывали разнообразные возражения, то сейчас о молекулярных машинах можно прочитать не только в специальной литературе, но и в массовых периодических изданиях. В последние годы, не только были открыты многие белковые моторы, но и предпринимаются попытки их использования для манипуляций с отдельными молекулами в нанобиотехнологиях. Существуют два больших класса моторов: линейные и вращающиеся моторы. К линейным моторам относятся кинезин («шагающий с ноги на ногу» вдоль микротубулина), миозин (при взаимодействии с актином обеспечивает сокращение мышечных волокон), РНК полимераза и т.д. Высказываются гипотезы о возможной роли солитоноподобных возмущений в линейных моторах и строятся соответствующие модели [5-10]. Примерами вращающих моторов являются: флагелярные моторы (в бактериальных клетках) и фермент АТФсинтаза (Р^о-АТФаза, вращающийся во время синтеза/гидролиза молекул АТФ). Все молекулярные моторы, так или иначе, используют энергию синтеза/гидролиза нуклеотидов (АТФ) либо разницу электрохимического потенциала на цитоплазматической мембране. В настоящее время показано, что ферментативная молекула РоРгАТФсинтаза - молекулярный мотор, использующий оба типа движущих сил [11,18,19]. АТФ (аденозинтрифосфорная кислота) синтезируется из АДФ (аденозиндифосфорной кислоты) и Pi (неорганического фосфата) в комплексе (РрАТФаза) за счет протонов проходящих через комплекс Р0, встроенный в энергопреобразующую мембрану митохондрий, хлоропластов и бактерий. И наоборот: работая в обратном направлении, он гидролизирует АТФ в АДФ и неорганический фосфат - Pj , вырабатывая энергию и перекачивая протоны.

К настоящему времени доказано, что в изолированном фрагменте - Рр АТФазе не только гидролиз АТФ может происходить, но и синтез АТФ. При этом РрАТФаза работает как мотор, внутри которого вращается у субъединица по центру статора - состоящего из трех идентичных копий ар субъединиц. Вращение инициируется конформационными изменениями 3(ар) субъединиц. Такой результат, доведенный до уровня «наглядности» получен в тонких биохимических и биофизических экспериментах с применением методов рентгеноструктурного анализа и оптики с использованием лазеров и видеотехники.

Не менее важную роль в осмысливании работы такого мотора сыграло математическое моделирование. К настоящему времени предложены уравнения динамики ротора (7 субъединицы). При этом силовые поля вводятся из общих феноменологических представлений. С другой стороны прилагаются усилия для построения полной модели РоРрАТФсинтазы. Более того, сделаны первые попытки для проведения такого моделирование методами молекулярной динамики, в которых учитываются движения более чем 30000 атомов РрАТФазы и молекул АТФ, АДФ, IV Даже использование современных компьютеров в этом случае позволяют проследить события лишь на протяжении сотен пс, чего совершенно недостаточно, так как характерные времена конформационных переходов составляют миллисекунды. Кроме того, анализ результатов и точности их получения в такой глобальной модели является сам по себе чрезвычайно сложной задачей.

Безусловно, такое моделирование будет результативным и эффективным, « если будет проводиться наряду с моделированием более простых систем с небольшим числом выделенных «существенных» степеней свободы. Такие степени свободы всегда имеются как в технических устройствах, так и молекулярных машинах. Именно поэтому такие конструкции и называются машинами. Настоящая работа лежит в русле исследований, в которых строятся модели, отражающие изменения существенных переменных. Влияние других атомов учитывается введением суммарных потенциалов взаимодействия и тепловых шумов. Цель работы

Главной целью работы является построение и анализ модели стохастической динамики БрАТФазы в режиме гидролиза и синтеза АТФ. При постановке задачи предполагалось, что проведенные исследования позволят:

• Построить замкнутую систему кинетических уравнений описывающих «химические» процессы посадки субстрата, выхода продуктов реакции, а также химическую реакцию гидролиза/синтеза в активных центрах фермента, которая решаясь совместно с динамическим уравнением, описывающим вращение ротора (у субъединицы) адекватно опишет известные экспериментальные свойства молекулярного мотора .

• Получить количественные характеристики и закономерности поведения мотора в зависимости от экспериментально устанавливаемых параметров.

Для решения поставленных задач были получены потенциалы взаимодействия между ротором и статором молекулярного мотора. Для определения функций, определяющих вращение ротора, была проведена серия вычислений, в которых оценивалась энергия электростатического взаимодействия гидролизированых атомов молекул субстратов и продуктов с заряженными и поляризованными аминокислотными остатками каталитических центров БрАТФазы во всех конформациях фермент-субстратного комплекса. А также подробно исследованы режимы вращения мотора в зависимости от различных экспериментально определяемых параметров. Научная новизна работы заключается в том, что в ней впервые:

1. Оценена энергия электростатического взаимодействия в фермент-субстратном комплексе РрАТФазы на различных этапах каталитического цикла в известных устойчивых конформациях фермент-субстратного комплекса. Показано, что изменение электростатической энергии качественно адекватно описывает процессы, происходящие в фермент-субстратном БрАТФазы комплексе во время каталитического цикла гидролиза АТФ.

2. На основании расчета электростатических взаимодействий в фермент-субстратном комплексе определены форма, и количественные характеристики предложенных потенциалов взаимодействия между каталитическими субъединидами и ротором молекулярного мотора. Данные потенциалы позволяют описать направленное движение ротора в результате гидролиза АТФ и наоборот описать синтез АТФ в результате направленного движения ротора под действием момента внешней силы.

3. Разработана самосогласованная модель мотора РгАТФазы, в которой учитываются как существенные динамические переменные, так и переменные, описывающие химическую кинетику. На основе исследования данной модели определены статистические характеристики динамики мотора и кинетика химических превращений практически на любых временах (тогда как молекулярная динамика позволяет это сделать лишь на временах порядка сотен пс).

Предложенная модель может быть использована как блок в общей модели Б ^о-АТФсинтазы.

Практическая значимость работы определяется возможностью проследить стохастическую динамику работы БрАТФазы в «иммобилизованном» режиме. Осмыслить качественно и количественно работу отдельных элементов совершенной конструкции молекулярного мотора - важнейшего нанотехнологического объекта, возникшего в результате биологической эволюции. Модель может помочь в выборе стратегии и определении параметров соответствующих биофизических экспериментов.

Защищаемые положения:

1. На основании диаграммы электростатических взаимодействий субстратов и продуктов реакции с БрАТРазой получены следующие соотношения между энергией выделяющейся при связывании АТФ с активным центром (АЕагр) и энергией выделяющейся при выходе неорганического фосфата (АЕР:), а также между энергией требуемой для выхода АДФ из активного центра д/^ АР

АЕЛ01>): ^¡2-«1.5, ^ЛР.« 3. д/г д/г

2. Предложенная самосогласованная система уравнений, описывающая вращение ротора в эффективном поле и вероятности заполнения трех каталитических центров субстратами и продуктами реакции, адекватно описывает стохастическую динамику молекулярного мотора в режиме, как гидролиза, так и синтеза АТФ: а) движение ротора в отдельной численной реализации в режиме гидролиза АТФ качественно повторяет экспериментально наблюдаемые характеристики движения маркера прикрепленного к нагрузке ротора изолированного иммобилизованного комплекса РрАТФазы; б) получаемые при усреднении по ансамблю моторов средние скорости вращения в режиме гидролиза АТФ по порядку величины совпадают с экспериментально наблюдаемыми; в) в режиме синтеза вращение шаговое - три шага на один полный оборот. Паузы обусловлены ожиданием посадки АДФ в каталитический центр и проявляются если среднее время посадки АДФ в АЦ и выхода АТФ из АЦ становится соизмеримо с временем поворота ротора на 120°; г) зависимость скорости синтеза от концентрации АДФ носит гиперболический характер, с эффективной константой Михаэлиса-Ментен достигает ста микромоль (для используемых констант скоростей посадки/выхода субстратов, а также скорости синтеза/гидролиза АТФ). 3. Зависимость скорости вращения от момента внешней силы линейна при любых концентрациях АДФ. В зависимости скорости синтеза АТФ от момента внешней силы Fexl существует максимум. Интервал значений, Fexl при которых эффективность работы фермента остается высокой с ростом концентрации АДФ расширяется.

Апробация работы:

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в трех статьях в отечественных и зарубежных изданиях [12-14] и две статьи находятся в печать. Докладывались на семи международных конференциях с опубликованием тезисов [15-17]: Saratov Fall Meeting 2002: Optical Technologies in Biophysics and Medicine IV (Saratov, Russia, October 1-4, 2002); 10-я Международная конференция «Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 20-25 января 2003г.); International Workshop «Stochastic dynamics of complex systems» (Berlin, September 2003); Complex Dynamics, Fluctuations, Chaos and Fractals in Biomedical Photonics (San-Jose, California USA, 24-29 January, 2004), III СЪЕЗД БИОФИЗИКОВ РОССИИ (Воронеж, 24-29 июня 2004 г.); Ist International Workshop on Noise in Condensed Matter and Complex Systems (Citta' del Mare - Terrasini (Palermo) 26-29 July 2004); 12-я Международная конференция «Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 17-22 января 2005г.).

Структура и объем работы:

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы. Полный объем работы 115 страниц, включая 40 рисунков и 3 таблицы. Библиография содержит 115 наименований, включая 3 публикаций автора.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Погребная, Александра Францевна

продуктов и молекул воды совместно с движением больших молекулярных кластеров. Так как все параметры в уравнениях могут быть измерены или проконтролированы экспериментально, представленная модель полезна при разработке тактики экскрементов по изучению работы этого уникального молекулярного мотора, а также при создании на его основе нанотехнологических устройств. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. На основании диаграммы электростатических взаимодействий субстратов и продуктов реакции с РгАТРазой получены следующие соотношения между энергией выделяющейся при связывании АТФ с активным центром ( АЕЛТР ) и энергией выделяющейся при выходе неорганического фосфата (АЕР), а также между энергией требуемой для выхода АДФ из активного центра дг д/^

АЕЛОР): ^£.«1.5,

ДГ АЕ

2. Разработана самосогласованная система уравнений, связывающая статистические события посадки и выхода лигандов из АЦ, а также их взаимные превращения в АЦ с детерминированным вращением ротора мотора, которая адекватно описывает стохастическую динамику молекулярного мотора в режиме гидролиза АТФ. Данная модель позволяет рассчитать в реальном времени как реализации этих процессов для отдельных ферментов, так и усредненные характеристики, рассчитанные для всего ансамбля молекул.

3. Данная модель позволяет смоделировать синтез АТФ сопряженный с вращением ротора под действием момента внешней силы. Численные расчеты показали что: а) зависимость скорости вращения от момента внешней силы линейна при любых концентрациях АДФ; б) в зависимости скорости синтеза АТФ от момента внешней силы Рех( существует максимум; в) интервал значений, Р^, при которых эффективность работы фермента остается высокой с ростом концентрации АДФ расширяется.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключение считаю своей приятной обязанностью выразить глубокую и искреннюю благодарность своему научному руководителю профессору Романовскому Юрию Михайловичу за чуткое руководство, постоянное внимание и терпение, неоценимую профессиональную и жизненную школу. Также благодарю А.Н.Тихонова за плодотворное сотрудничество и А.В.Воронова за стимулирующие дискуссии, критические замечания и обсуждение результатов. Кроме того, благодарю всех сотрудников лаборатории математической биофизики кафедры ОФиВП физического факультета МГУ за дружескую атмосферу, способствующую выполнению данной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе представлена модель фермента БрАТРазы как молекулярного устройства использующего энергию гидролиза АТФ для совершения механической работы (вращения вала), а также способного использовать механическую энергию для синтеза АТФ. Представленная самосогласованная модель связывает стохастические события посадки и выхода лигандов из активных центров, а также их взаимные превращения в активных центрах с детерминированным вращением ротора мотора. В отличие от существующих дискретных моделей, описывающих вращение ротора как переходы между конечным числом возможных устойчивых состояний фермента, представленная модель рассматривает движение ротора в непрерывном потенциале, что существенно расширяет ее возможности. Модельный потенциал может быть модифицирован с учетом новых экспериментальных данных по взаимодействию между ротором и статором мотора и данных расчетов молекулярной динамики и квантовой механики без внесения поправок в модельные уравнения.

Разработанная модель может быть использована как часть (или блок) в полной модели Р0РгАТРсинтазы. Процессы входа в каталитические центры субстратов и выхода из них продуктов могут быть смоделированы методами молекулярной динамики. При этом изменение «входной щели» и электростатического поля в кармане АЦ и на его входе в процессе изменения конформаций могут быть определены из знания взаимного расположения а, р и у субъединиц. (Аналогичная задача о проникновении субстратов и выходе продуктов из АЦ решалась, например, для Ацетилхолинэстеразы [5]). Такой подход позволит объединить расчет движений «малых молекул» субстратов,

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Погребная, Александра Францевна, Москва

1. Блюменфельд JI.A, Проблемы Биологической Физики. М.: «Наука», 1974.

2. Блюменфельд Л.А., Решаемые и Нерешаемые Проблемы Биологической

3. Физики. М. Изд-во «УРРС», 2002.

4. Хургин Ю.И., Чернавский Д.С., Шноль С.Э., Молек. Биология, Т. 1, 1967.

5. Чернавский Д.С., Чернавская Н.М., Белок-машина. Биологические имакромолекулярные конструкции. «Янус-К». 1999. 256 с.

6. Молекулярная Динамика Ферментов (под ред. Ю.М. Романовского и В.

7. Эбелинга), М. Изд-во МГУ, 2000.

8. Ebeling W., Schimansky-Gaier L., Romanovsky Yu.M. Stochastic dynamics of reacting biomolecules, New Jersey, London, Singapore, Hong Kong: World Scientific, pp.285-310, 2002.

9. Yakushevich L.V. Nonlinear physics of DNA, New York: Wiley, 1998.

10. Shaitan K.V. Protein dynamics and new approaches to the molecular mechanisms ofprotein functioning, (in 6), pp 285-310.

11. Chetverikov A., Ebeling W., Jenssen M., Romanovsky Yu. Excitations on ring molecules, in 6., pp 125-180.

12. Ю.Давыдов A.C. Солитоны в молекулярных системах, Киев: Наукова думка, 1986.

13. Junge W. Lill Н., Engelbrecht S., ATP synthase: an electrochemical transducerwith rotatory mechanics/I Trends Biochem. Sei. V. 22, pp.420-423, 1997.

14. A. F. Pogrebnaya, Y. M. Romanovsky, A. N. Tikhonov, Electrostatic interactionsin catalytic centers ofFrATPase II SPIE v.5068, pp. 27-35, 2003

15. А.Н.Тихонов, А.Ф.Погребная, Ю.М. Романовский, Электростатическиевзаимодействия в каталитических центрах Fi-АТРазы// Биофизика, 48(6), с. 1052-1070, 2003

16. A.F. Pogrebnaya, Yu.M. Romanovsky, A.N. Tikhonov, Stochastic model ofmolecular motor of ATPasell Complex Dynamics, Fluctuations, Chaos and Fractals in Biomedical Photonics, Proceedings SPIE, 5330, pp.120-131, 2004.

17. Y.M.Romanovsky, A.F.Pogrebnaya, A.N.Tikhonov, Mathematical Model of Fr

18. ATPase Molecular Motor//Palermo, Italy, 26-29 July, Book of Abstr., pp.12,2004.

19. А.Ф.Погребная, Ю.М. Романовский, А.Н.Тихонов, Стохастическаядинамика молекулярного мотора Fi-АТФазы//, III Съезд Биофизиков РОССИИ, Воронеж 2004, сборник тезисов, сс 85-86.

20. А.Ф.Погребная, Ю.М. Романовский, А.Н.Тихонов, Электростатические взаимодействия в каталитических центрах F¡-АТРазыН Математика, компьютер, образование'2003, 20-25 января, 2003, сборник тез., сс.226-227.

21. М.В.Гусев, JI.A. Минеева, Микробиология, МГУ, 1992.

22. Б.Албертс, Д. Брей и др., Молекулярная биология клетки, «Мир», 1994.

23. ВВА, V. 1458, № 2-3 (Special Issue. Guest Editor: J. Walker), 2000.

24. J. Bioenerg. Biomembr. V. 32, № 4 and № 5 (MINIREVIEW SERIES, ATP

25. Synthesis in the Year 2000: Current Views about Structure, Motor Components, Energy Interconversions and Catalytic Mechanisms, Parts I and II), 2000.

26. J. Exp. Biol. V. 203(1), (Special issue, W.R. Harvey, R.G. Boutilier, N. Nelson,1. Eds.), 2000.

27. Capaldi R.A., Aggeler R., Mechanism of the FoF¡-type ATP synthase, a biological rotary motor 11 Trends Biochem. Sci. V. 27, pp. 154-160, 2002.

28. Stock D., Gibbons C., Arechaga I., Leslie A.G.W, Walker J.E. Rotary Mechanismof A TPSynthasell Current Opinion in Structural Biology, V 10, pp.672-679, 2000.

29. Fillingame R.H., Jiang W., Dmitriev O.Y., Jones P.C. Structural interpretations of Fo rotary function in the Escherichia Coli FjF0 ATP synthase!I Biochim. Biophys. Acta, V. 1458, pp.387-403, 2000.

30. Weber J., Senior A.E., ATP synthase: what we know about ATP hydrolysis andwhat we do not know about ATP synthesisII Biochim. Biophys. Acta. V 1458, pp.300-309, 2000.

31. Senior A., Nadinaciva S., Weber J. The molecular mechanism of ATP synthesis by

32. F¡F0-ATP synthase II Biochim. Biophys. Acta. V. 1553, pp.188-211, 2002.

33. Weber J., Senior A.E., ATP synthesis driven by proton transport in F ¡Fq-A TPsynthase IIFEBS Letters. V. 545, pp. 61-70, 2003.

34. Weber J., Senior A.E., Catalytic mechanism ofF,-ATPasell BBA, V. 1319, pp.1958, 1997.

35. Weber J., Senior A.E. Bi-site catalysis in F ¡-ATPase: does it exist? II J. Biol. Chem., V. 276, pp. 35422-35428, 2001.

36. Weber J., Nadanaciva S., Senior A.E. ATP-driven rotation of the gamma subunit in

37. F(l)-ATPase II FEBS Lett., V. 483, pp. 1-5, 2000.

38. Abrahams J.P., Leslie A.G.W, Lutter R., Walker J.E. Structure at 2.8 À resolutionof Fj-ATPase from bovine heart mitochondria II Nature. V. 370, pp.621-628, 1994.

39. Abrahams J.P., Buchanan S.K., van Raaij M.J., Fearnley I.M., Leslie A.G.W.,

40. Bianchet M.A., Hullihen J., Pedersen P.L., Amzel L.M., The 2.8-Ä structure of rat liver F¡-ATPase: Configuration of a critical intermediate in ATP synthesisyhydrolysis И Proc. Natl. Acad. Sei. USA, V. 95, pp.11065-11070, 1998.

41. Stock D., Leslie A.G.W., and Walker J.E., Molecular Architecture of the Rotary

42. Leslie A.G.W., Walker J.E. Structural model of F¡-ATPase and the implications for rotary catalysis II Philos. Trans. R. Soc. Lond. В, V. 355, pp.465-472, 2000.

43. Menz R.I., Leslie,A.G.W., Walker J.E. The structure and nucleotide occupancy of bovine mitochondrial F¡-ATPase are not influenced by crystallization at high concentrations of nucleotide И FEBS Lett, V. 494, pp.11-14, 2001.

44. Gibbons C., Montgomery M.G., Leslie A.G.W., Walker J.E., The structure of thecentral stalk in bovine F¡-ATPase at 2.4 A resolution // Nat. Struct. Biol, V. 7, pp.1055-1061, 2000.

45. Braig K., Menz R.I., Montgomery M.G., Leslie A.G.W., Walker J.E., Structure of bovine mitochondrial F(l)-ATPase inhibited by Mg(2+) ADP and aluminium ßuoride II Structure, V. 8, pp.567-573, 2000.

46. Menz R.I., Walker, J.E., Leslie A.G.W., Structure of bovine mitochondrial F/~

47. ATPase with nucleotide bound to all three catalytic sites II Cell, V. 106, pp.331-341,2001.

48. Hausrath A.C., Capaldi R.A., Matthews, B.W. The conformation of the epsilonandgamma-subunits within the Escherichia coli F(l) ATPase II J. Biol. Chem, V. 276, pp.47227-47232, 2001.

49. Groth G., Pohl E. The Structure of the Chloroplast F¡-ATPase at 3.2 A Resolution/n. Biol. Chem., V. 276, pp. 1345-1352, 2001.

50. Groth G. Structure of spinach chloroplast F¡-ATPase complexed with the phytopathogenic inhibitor tentoxin II Proc. Natl. Acad. Sei. USA, V. 99, 34643468,2002.

51. G.I. Belogrudov, J.M. Tomich, Y. Hatefi, Membrane topography and nearneighbor relationships of the mitochondrial ATP synthase subunits e, f, and g// J. Biol. Chem., V. 271, pp.20340-20345, 1996.

52. R.J. Devenish, M. Prescott, X. Roncou, P. Nagley, Insights into ATP synthase assembly and function through the molecular genetic manipulation of subunits of the yeast mitochondrial enzyme complexll Biochim. Biophys. Acta, V. 1458, pp.428-442, 2000.

53. Seelert H., Poetsch A., Dencher N.A., Engel A., Stahlberg H., Muller D.J., Structural biology: proton powered turbine of a plant motor! I Nature, V. 404, pp.418-419, 2000.

54. Filiingame R.H., Dmitriev, O.Y. Structural model of the transmembrane F0 rotary sector of H*-transporting ATP synthase derived by solution NMR and intersubunit cross-linking in situ II Biochim. Biophys. Acta., V. 1565, pp.232245, 2002.

55. Filiingame R.H., Angevine C.M., Dmitriev O.Y. Coupling proton movements to c-ring rotation in FjF0 ATP synthase: aqueous access channels and helix rotations at the a-c interface II Biochim. Biophys. Acta., V. 1555, pp.29-36, 2002.

56. Rastogi V.K., Girvin M.V. Structural changes linked to proton translocation by subunit c of the ATP Synthasell Nature, V. 402, pp.263-278, 1999.

57. Penefsky H.S., Cross R.L. Structure and mechanism of FoF¡-type ATP synthases andATPasesll Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., V. 64, pp.173-214, 1991.

58. Boyer P.D. The binding change mechanism for ATP synthase — some probabilities and possibilities// Biochim. Biophys. Acta, V. 1140, pp.215-250, 1993.

59. Boyer P.D. Catalytic site occupancy during ATP synthase catalysis/1 FEBS Lett., V. 512, pp.29-32, 2002.

60. Boyer P.D., The ATP synthase a splendid molecular machine // Ann. Rev. Biochem., V. 66, pp. 717-749, 1997.

61. Futai M., Noumi T., Maeda M. ATP synthase (Ft-ATPase): results by combined biochemical and molecular biological approaches// Annu. Rev. Biochem. V. 58. pp. 111-136, 1989.

62. Senior A.E., Al-Shavi M.K. Further examination of seventeen mutations in

63. Escherichia coli F ¡-ATPase beta-subuni.H J. Biol. Chem., V.267 (30), pp. 2147121478, 1992.

64. Amano T., Tozawa K., Yoshida M., Murakami H. Spatial precision of a catalyticcarboxylate of Fj-ATPase beta subunit probed by introducing different carboxylate-containing side chains IIFEBS Lett., V.348, pp.93-98, 1994.

65. Ketchum C.J., Al-Shawi, M.K., Nakamoto R.K. Intergenic suppression of the yM23K uncoupling mutation in F0Fj ATP synthase by pGlu-381 substitutions: the role of the p380DELSEED386 segment in energy coupling// Biochem. J., V. 330, pp.707-712,1998.

66. Ahmad Z, Senior AE Mutagenesis of residue betaArg-246 in the phosphatebinding subdomain of catalytic sites of Escherichia coli Fl-ATPase//. Biol Chem, V. 279, pp.31505-13, 2004.

67. Tombline G, Bartholomew LA, Urbatsch IL, Senior AE Combined mutation of catalytic glutamate residues in the two nucleotide binding domains of P-glycoprotein generates a conformation that binds ATP and ADP tightly!I J Biol Chem, 279, pp.31212-20, 2004.

68. Nakamoto R.K., Ketchum C.J., Al-Shawi M.K., Rotational coupling in the FqFi

69. Duncan T.M., Bulygin V.V., Zhou Y., Hutcheon M.L., Cross, R.L. Rotation of submits during catalysis by Escherichia coli FqF¡-ATPase!I Proc. Natl. Acad. Sei. USA, V. 92, pp.10964-10968, 1995.

70. Zhou Y., Duncan T.M., Bulygin V.V., Hutcheon M.L., Cross, R.L. ATP hydrolysis by membrane-bound escherichia coli FqFj causes rotation of the y submit relative to the ß subunitsll Biochim. Biophys. Acta, V. 1275, pp. 96-100,1996.

71. Zhou Y. et al. Subunit rotation in Escherichia coli F0Fi~ATP synthase during oxidative phosphorylation!7 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, V. 94, pp. 10583-10587,1997.

72. Sabbert D., Engelbrecht S., Junge W. Intersubunit rotation in active F-ATPasei! Nature, V. 381, pp. 623-625, 1996.

73. Sabbert D., Engelbrecht S., Junge W. Functional and idling rotatory motion within F¡-ATPase!J Proc. Natl. Acad. Sei. USA, V. 94, pp.4401-4405, 1997.

74. Hasler K., Engelbrecht S., Junge W. Three-stepped rotation of submits yand € in single molecules of F-ATPase as revealed by polarized, confocal fluorometryll FEBS Lett., V. 426, pp.301-304, 1998.

75. Noji, H., Yasuda R., Yoshida M., Kinosita K. Direct observation of the rotation of FrATPasellNature, V. 386, pp.299-302, 1997.

76. Yasuda R., Noji H., Kinosita K., Yoshida M. FrATPase is a highly efficient molecular motor that rotates with discrete 120 degree steps!! Cell, V. 93, pp.1117-1124,1998.

77. Sambongi Y., Iko Y., Tanabe M., Omote H., Iwamoto-Kihara A., Ueda I., Yanagida T., Wada Y., Futai M. Mechanical Rotation of the c Subunit Oligomerin ATP Synthase (FoFj): Direct Observation// Science, V. 286, pp. 1722-1724,1999.

78. Noji, H., Hasler K., Junge W., Yoshida M., Kinosita K., Engelbrecht S. Rotation of Escherichia coli Fi-ATPas.ll Biochim. Biophys. Res. Comm, V. 260, pp.597599, 1999.

79. Futai M., Omote H., Sambongi Y., Wada Y. Synthase (Pf ATPase): coupling between catalysis, mechanical work, and proton translocation II Biochim. Biophys. Acta, V. 1458, pp.276-288, 2000.

80. K. Adachi, R. Yasuds, H. Noji, H. Itoh, Y. Harada, M. Yoshida, K. Kinoshita, Stepping rotation of F¡-ATPase visualized through angle-resolved single-fluorophore imaging II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 97, pp.7243-7247, 2000.

81. Kinosita K., Yasuda R., Noji H. and Adachi K. Rotary molecular motor that can work at near 100% efficiency// Philos. Trans. R. Soc. Lond. B, V. 355, pp. 473489, 2000.

82. Tsunoda S.P., Aggeler R., Noji H., Kinosita K., Yoshida M., Capaldi R.A. Observations of rotation within the FqF;-ATP synthase: deciding between rotation of the Fqc subunit ring and artifact // FEBS Lett., V. 470, pp.244-248,2000.

83. Masaike T., Mitome N., Noji H., Muneyuki E., Yasuda R., Kinosita K., Yoshida M., Rotation of F¡-ATPase and the hinge residues of the ¡3 subunit// J. Exp. Biol., V. 203, pp.1-8, 2000.

84. Panke O., Gumbiowski K., Junge W., Engelbrecht S. F-ATPase: specific observation of the rotating c subunit oligomer of EFqEFj// FEBS Lett., V. 472, pp.34-38, 2000.

85. Noji H., Yoshida M. The rotary machine in the cell, ATP synthaseII J. Biol. Chem., V. 276, pp.1665-1668, 2001.

86. Noji H., Bald D., Yasuda R., Itoh H., Yoshida M., Kinosita K. Purine but not pyrimidine nucleotides support rotation of Fi-ATPase// J. Biol. Chem., V. 276, pp.25480-25486, 2001.

87. Yasuda R., Noji H., Yoshida M., Kinosita K., Itoh, H. Resolution of distinct rotational substeps by submillisecond kinetic analysis of Fl-ATPasell Nature, V. 410, pp. 898-904,2001.

88. Ariga T., Masaike T., Noji H., Yoshida M., Stepping Rotation of F ¡-ATPase with One, Two, or Three Altered Catalytic Sites That Bind ATP Only Slowly!I J. Biol. Chem. V. 277, pp. 24870-24874. 2002.

89. Hirono-Hara Y., Noji H., Nishiura M., Muneyuki E., Hara K.Y., Yasuda R., Kinosita K., Yoshida M. Pause and rotation of F ¡-ATPase during catalysis!I Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 98. pp. 13649-13654. 2001.

90. Kinisita K Jr, Kengo Adachi, H Itoh, Rotation of F ¡-ATPase: How an ATP-Driven Molecular Machine may Work!! Biophys.Biolol.Structure, V.33, pp.245268, 2004.

91. Nakamoto R.K., Ketchum C.J., Kuo P.H., Peskova Y.B., AI-Shawi, M.K. Molecular mechanisms of rotational catalysis on the F0FI ATP synthase!I BBA, V.1458, pp.289-299, 2000.

92. Tanabe M., Nishio K., Iko Y., Sambongi Y., Iwamoto-Kihara A., Wada Y., Futai M. Rotation of a complex of the y subunit and c ring of Escherichia coli ATP synthase: The rotor and stator are interchangeable!! J. Biol. Chem., V. 276, pp.15269-15274, 2001.

93. K. Nishio, A. Iwamoto-Kihara, A. Yamamoto, Yoh Wada, and M. Futai, Subunit rotation of ATP synthase embedded in membranes: a or ß subunit rotation relative to the c subunit ring//VNA.S, V. 99 (21), pp. 13448-13452, 2002.

94. H. Ueno, T. Suzuki, K. Kinosita, M. Yoshida, ATP-driven stepwise rotation of FoFrATP synthase// PNAS, V. 102 (5), pp.1333-1338, 2005.

95. Tomoko Masaike, Eiro Muneyuki, Hiroyuki Noji, Kazuhiko Kinosita, Jr. and Masasuke Yoshida, F ¡-ATPase Changes Its Conformations upon Phosphate Release!/, The Journal Of Biological Chemistry, V. 277, N. 24, pp. 21643-21649, 2002.

96. Gumbiowski K., Cherepanov D., Muller M., Panke O., Promto P., Winkler S., Junge W., Engelbrecht S. F-ATPase: Forced full rotation of the rotor despite covalent cross-link with the stator// J. Biol. Chem., V. 276, pp.42287-42292, 2002.

97. Suzuki T., Ueno H., Mitome N., Suzuki J., Yoshida M. Fo of ATP synthase is a rotary proton channel: Obligatory coupling of proton translocation with rotation of c-subunit ring// J. Biol. Chem., V. 277, pp. 13281-13285, 2002.

98. Gumbiowski K., Panke O., Junge W., Engelbrecht S. Rotation of the c subunit oligomer in EFqEFj mutant cD61NH J. Biol. Chem., V. 277, pp.31287-31290, 2002.

99. H.Itoh, A.Takahashi, K. Adachi., H.Noji., Yasuda R , Yoshida M., Kinosita K., Mechanically driven ATP synthesis by F}-ATPase// Nature, V. 427, 2004.

100. Panke, O., Cherepanov, D.A., Gumbiowski, K., Engelbrecht, S., Junge W. Viscoelastic Dynamics of Actin Filaments Coupled to Rotary F-ATPase: Angular Torque Profile of the Enzyme!/ Biophys. J. 2001. V. 81, pp. 1220-1233.

101. Siddhartha Jain, Sunil Nath, Kinetic model of ATP synthase: pH dependence of the rate of ATP synthesis// FEBS Letters, V.476, pp.113-117, 2000.

102. Oliver Pänke, Bernd Rumberg, Kinetic modeling of rotary CFqF¡-ATP synthase: storage of elastic energy during energy transduction// BBA, V. 1412, pp.118128, 1999.

103. Ming S. Liu, B. D. Todd and Richard J. Sadus Kinetics and chemomechanical properties of the F¡-ATPase molecular motor// J of Chem. Phys., V 118 (21), pp.9890-9898, 2003.

104. Yi.Qin Gao, Wei Yang, Rudolph A.Marcus and Martin Karplus, A model for the cooperative free energy transduction and kinetics of ATP hydrolysis by Fj-A TPase// PNAS, V. 100(20), pp.11339-11344, 2003.

105. Markus Dittrich, Shigehiko Hayashi, and Klaus Schulten, On the Mechanism of ATP Hydrolysis in F¡-ATPase//Biophysical Journal, V 85, pp. 2253-2266, 2003.

106. R.A.Böckman, H.Grubmüller, Nanoseconds molecular dynamics simulation of primary mechanical energy transfer steps in FrATP synthase// Nature Structural Biology, V. 9 (3), pp. 198-202, 2002.

107. W.Yang, Y.Q.Gao, Q.Cui, J.Ma, M.Karplus, The missing link between thermodynamics and structure in F¡-ATPase, PNAS, V. 100, (3), pp.874-879, 2003.

108. Rainer A. Böckmann and Helmut Grubmüller, Conformational Dynamics of the FrATPase b-Subunit: A Molecular Dynamics Study// Biophysical Journal, V 85, 2003, pp. 1482-1491.

109. Iris Antes, David Chandler, Hongyun Wang and George Oster, The Unbinding of ATP from F,-ATPase// Biophysical Journal, V 85, pp.695-706, 2003.

110. G. Oster, H. Wang, Why Is the Mechanical Efficiency of FrATPase So High?// J. Bioenerg. and Biom., V. 32, 5, 2000.

111. C. Bustamante, D. Keller, and G. Oster, The Physics of Molecular Motors// Acc. Chem. Res, V. 34, 6, pp.412-420, 2001.

112. Hongyun Wang and G. Oster, The Stokes efficiency for molecular motors and its applications//Europhys. Lett., V. 57 (1), pp.134-140, 2002.

113. Elston Т., Wang H., Oster G. Energy transduction in ATP synthase //Nature, V. 391, pp. 510-513, 1998.

114. Wang H., Oster G. Energy transduction in the Fj motor of ATP synthase// Nature, V. 396, pp.279-282, 1998.

115. Oster G., Wang H. Reverse engineering a protein: the mechanochemistry of ATP synthase // ВВА, V. 1458, pp.482-510, 2000.

116. Sean X. Sun, H. Wang, G. Oster, Asymmetry in the Fl-ATPase and Its Implications for the Rotational Cycle// Bioph. Journal, V. 86, pp. 1373-1384, 2004.

117. Cherepanov D.A., Mulkidjanian A.Y., Junge W. Transient accumulation of elastic energy in proton translocating ATP synthase // FEBS Lett., V. 449, pp. 16, 1999.

118. Финкельштейн A.B., Птицын О.Б. //Физика Белка. Изд-во Книжный дом «Университет». Москва. 2002. 375 с.