Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ систем гибридного ... в ... Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ систем гибридного ... в ... Drosophila melanogaster"

pva 0

2 y ^

российская акадйяш наук

1П-1СХ1ГГУТ СШЕЙ генетики КМ. H Л'.ВАВИЛОВА

На правах рукописи уда 577.218:57t.?2

лтд

¿ВДЗЛЬ л'ЛЛ/В Г.-ОГ/'.ТЛ ся>АГг.гплн-;Л c~cïtu г:~п*цдого ~:сгп:пзл

Э СЯОГСГГСКЗ DROSCPillXA ¡ÜZ^rCG'.SüEn Спзц^слыгость 03.СО. 15 - гоизтпка

ЛВТСПГГ^ЛТ

ллссэртлшгл на сокскшжэ ученой стетюкл кондидата Снологцчосют. нпук

шлша I93t

Робота каолнана в лзбораторзл цзтогоштшя Института оО^зй генетика пл. H.H.Вавилова РАН

Научшй руководитель - кацюта? биологических наук

Н.Й.КВД2Ж0

Офзцзалыыа ошопапти:

доктор биологически паук, профессор U.U. ДСЛДПЯН кавдддат биологических наук В.Н. БОС1РОЗ

. Вадуцая организация

Институт Сиологаа развития ки. Н.К.Кольцова РАН

Ззгзггв дпссертацзн состоится " 1994 г.

в "_" часов на заседании спецаалкзпровшшого Ученого Совета

Д 002.49.01 при Институте об^сй генетшш mi. Н.И.Вавилова РАН по адресу: II7809 ГСП-I (¿осква В-333, ул. Губкшш, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института обцв1 генетики им. Н.И.Вавилова РАН-

Автореферат разослан (с "-л - ■ " 1994 Т. '

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета кандидат биологических наук

Г.Н. ПОЛУХИНА

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛИ51. Изучение систем гибридного дисгенеза у Drosophila oelanogäster позволяет внести существенный вклад в понимание роли транспозиции .генетических элементов в процессах адаптации и эволюции. Перемещение этих генетических факторов является молекулярным механизмом большинства, если не всех спонтанных • мутаций, в том числе и хромосомных аберраций у D.melanogauter (Rubin, 1983; Green,1987¡Engelв, 1989). Наиболее активно транспозиция мобильных элементов происходит б системах гибридного дисгенеза. К настоящему времени обнаружены три таких системы: Р-М, 1-Й и Н-Е. föi присуща высокая генетическая чувствительность, обусловленная перемещением соответственно Р-, hobo- и. 1-мобильвдх элементов и стерильность, которая в некоторых случаях достигает IQ03. Абсолютное число мутационных события, возникающих в этих системах, моввт на порядок превосходить соответствующие величины, наблюдаемые при самих высоких дозах облучения (Mackay, 1985). Эти чзрты дисгоншх систем легли в основу представлений об их участии з микрозволвции популяция (Bingham et al., 1982). Проявление свойств, характеризующих системы гибридного дисгенеза, возможно только п условиях взаимодействия ядра и цитоплазмы, при скрещивании самок, но суша Ii-, Е- или R-цитотипы с сводами Р-, Н- или 1-цитотипов. Тер-лт "цитоппГ был предложен американским исследователем В.Энгельсом (Engeln, 1982) и характеризует возможности цитоплазмы гониалышх клаток контролироровать транспозицию сопряженных мо-моблльных элементов. Перемещения носят тканеспецифический характер и происходят только в половых метках D.melanogaater на пре-мейотической стадии их развития. В Р-М и.Н-Е системах транспозиция осуществляется за счет деятельности транспозгзы, синтезируемой на полных Р- и hobo-элементах. В основе перемещения I-элемента легат обратная транскрипция.■

Достигения молекулярной биологии позволили достаточно полно изучить структуру -мобильных элементов, индуцирующих синдром гибридного дисгенеза. Секвенированы полные (активные) формы этих мобильных элементов, а таюкс неполные (делетированные) производные. Показано, что контроль перемещения генетических факторов Р, hobo, и I могут осуществлять не только цитоплазматические (определяющие цититип клетки), но и хромосомные репрессоры, к которым относятся их делэтированные производные (Black et al., 1987r Perlquet et

al., 19B9; Шага л Rio, 1590). Предполагается, что в основа такого механизма легсит либо "тытрсваш;е" транспозазы, либо синтез репрессора, воздействующего на транспозицию (Gloor et at, 1993). Развитие механизмов, контролирующих перемещение мобильных элементов в системах, гибридного дисгенеза, поддерживается отбором к способствует их широкому и быстрому географическому расселению (К1аж?11, 1S86; Arixolabehere et al., 1938; Fcrlquet et al.,'1989). Интерес к этим системах усиливается , такта работами, свидетельствующими о наличии аналогичных генетических-структур и у дру-ш высших организмов, в том числа и у млекопитающих (Rio et al., 1936; Bucheton et al.,1990). Однако у последних исследования таких факторов имеют ограничения, обусловленные методически:,и трудностями (Bucheton et al.,1990). Актуальность и важность подобных научных направлений но вызывает сомнений,.и дрозофила в этом плане является уникальным модельным объектом, представляя редкую возможность, во-первых, экспериментально индуцировать транспозицию мобильных элементов, вызывавших гибридный дисгенез, а во-вторых, всесторонне изучать последствия таких перемещений ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Диссертация посвящена исследованию событий, возникающих в процессе онтогенетического развития D.melanogaater, при перемещении мобильных элементов Р,.1 и hobo. Нзсмотря на про-двинутость исследований, направленных на изучение молекулярной структуры этих элементов, до сих - пор. остаются неисслвдованншш некоторые биологические аспекты ряда явлений, в частности в период эмбриогенеза дрозофилы. Появление большого количества хромосомных аберраций ь процессе перокещойия Р-, hobor- и 1-мобилышх элементов возможно при условии двунитевых разрывов хромосом (Engels, 1990). Это во многих случаях приводит к возникновению доминантных деталей и гибели - эмбрионов на той или иней стадии .развития. Оценка морфологических-отклонений, наблюдаемых в. процессе эмбриогенеза D.melanomater с позиции молекулярных характеристик изучаемых факторов позволит определить возмолаше причины 'таких событий и приблизиться к пониманию механизмов, ответственных за их реализацию. • • . • НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Впервые осуществлен сравнительный анализ молекулярных и генетических событий", наблюдаемых в процессе эмбриогенеза D.melanogaater при перемеце-

нип трех семейств мобильных элементов. Это оказалось возможным в при использовании новых генетических и эмбриологических подходов, позполлкг:;1Х Еести учет летальности на разных стадия эмбрионального разЕИтгя гибридов, которое были получены в системах скрещиваний ограниченного количества линий и ко с ли необходимый для реализация этих систем цитоташ. Получены нов jo данные, дополнякцие характеристики систем гибридного дисгенеза в ходе эмбрионального , развития D.Eelanogaoter, которые могут Сыть использованы в даль-пейнз. генэтичэскпх пслэдованиях, связанных с инсерционным и инду-цирозанкнм мутагенезом. Сочетание генетические и молекулярных ха-рсктврпстпк опытного материала позволило оценить роль делетиро-ветых производных, а такте влияние эффекта положения активных О"кторов на грот'оссмах в механизмах, контролирующих перемещения соответствую?^ мобильных элементов.

CaESJ П СТРУКТУРА /^СВРТДЩП. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, изложения результатов и их обсуздония, вдаодоз и списка цитированной литературы. Работа изломана на_стр. машинописного текста и содержит_рисунков н__ таблиц. •

'ПГСЗМТЛ РЛБОШ. Материалы диссертации долог® ны на UI съезде ВОГпС им. Н.И.Вавилова, Шнек (1992); на XI Симпозиуме "Структура п фупнцля ядра", С.-Петербург (1993).

идтнпша п ¡методы

D.n^lenc^zstor.

1.Щф-12/1гЦ21Л)0, dpl7lCy рг cn2(сокращенно MRli-12/Cy) выделена Грипом (Green; 1975) из природной популяции. Несет инверсию (запи-рателЬ перекреста), меченную • доминантной нутацией Су, Curly (2-6,1).о такг.э некоторые рецессивные мутации: dplvI, dumpy lethal vortex oi Ivex (2-13,0); pr, purple ( 2-54,5); cn, cinnabar (2-57,5),Линия имеет P-, Н-цитотипы (Green, 1984; Yannopoulos et al., 1987; Иврщенко и др., 1990)

2.уШ9гсШ9аШ19РШ9 (сокращенно у w ctIm), выделена Герасимовой (Матюнина и др.,1585). Несет следующие морфологические маркеры: у, yellow (Х-0,0); я, nhlte'(Х-1,5); ct, cut (Х-20,0). Классифицирована как несущая М'-, Е-цитотипы (Иващенко и др., 1990).

3.П - строгая р-линия, выделена Энгельсом (Engels, 1534) из

природной популяции. Имеет Р-цитотип.

4. у 8nw; bw;st (сокращенно snw), выделено Энгельсом (Engela, 1934). Несет следующие морфологические маркеры: у, yellow (Х-0,0); snw, singed-wuek (1-21.0); bw, brown (2-104,5); st, scarlet (3-44.0) и две дефектные копии Р-элемента в локусе snw (Karess, Rubin, 1984). Имеет М-цитотип.

5.0(1)DX, у r/Y/pn (сокращенно Sí/Y)- стандартная лабораторная линил. Самок эт^й линии использовали в опытах по изучению ыута-бильности локуса зп".

Культуры этих линий укэ в течение нескольких лет поддергиваются в лаборатории при t=24ii°c на стандартной питательной среде с добавлением патоки, агар-агара, дрожжей, а также О,IX нипапша . Схеш скрещиваний.

1. £ у w Ctjm X (f II2 (Г-М)

2. $ у w et® X cfMKh12/Cy ЧН-Е)

3. $ MRh-12/Cy X <f y w et® (1-Е)

Во всех системах скрещиваний изучались гонада особей F1 и проводился анализ яиц, личинок, куколок и имаго как у представителей F1 так и F2.

Отбор генетического материала, обеспечивающего перемещение Р-, hobo- и 1-мобилькых элементов, осуществлялся таким образом, чтобы ограничить количество используемых линий за счет сочетания . соответствующих цитотипов. Реализация такого подхода возможна при учете направления скрещивания (прямою или обратного), позволяющего использовать линию либо в роли донора, либо реципиента в зависимости от того, какую систему гибридного дисгенеза предполагалось . активизировать. Молекулярные характеристики использовании линий. Получены В.А.Могилой в Институте биологии гена Российской Академий Наук с помощью блот-анализа по Ge-узерну (Маниатис и др., 1984). Гибридизация In situ была осуществлена да хромосомах линий ywet® и MRh12/Су аспиранткой Вагаповой Р.Б. и использовалась в этой ра-'боте для подсчета сайтов, несущих активные копии I-элемента. В качестве,золдов брались следующие плазмиды: 1.Для Р-мобильного элемента - рП 25.1 (O'Hare, Rubin, 1983) - 2.Для höbe-мобильного элемента - pH 108 (Streck et al., 1.98<5) З.Длл I-мобильного элемента - pi 59 (Bucheton et al., 1984)

Использование рестрикции эпдонуклеаз (EcoRI- для элементов I и Р. Hlnd III - для hobo) и ДНК фага позволило определить уолеку-ляршю взса фрагментов и количество полных и делегированных копий пзучезмшс мобилышх элементов в линиях D.nelanoga3ter. Опрэдэязпиэ урссзя стерзлыюсти . У гибридов дисгенетических скрзсшзаннЗ уровни стерильности зависят от температуры, причем в разных системах ее действие кокет проявляться по разному. Поэтому гибридных особей, а такта потомков контрольного скрещивания выращивала при t=25 и 29°С. Доля атрофированных гонад у самцов и самок дрозофилы от общего числа изученных давала представление о частоте появления у них стерильности,индуцированной поремецехшем элз:лзнтов ? и hobo.

Опрз.г.злзтз г^тотстсз псслздус:"гх глггЭ. Неизвестная линия мокет бить протестирована на наличке того пли иного цитотипа с помощью нескольких определяем скрзщгвахшй со стандартными тесторными взияа при t=29°C и поелвдупдал Изучением состояшзя гонад у особой Р1. .

Клсссг^гкнпл лзтальпсстя. Проводилась по модифицированной иэтодасэ (íTurgel, 1968). Наблвдониз за развитием эмбрионов осуществлялось в.течение 72 часов при t=24°C. Остановившиеся в развитии эмбрионы дехорионизировались и анализировались под гг.псроскопсм при 24 - 1фатном увеличении. Наличие известных г.ярфологачэских тестов позволяло выявлять стадии развития, на которой произоала гибель -эмбриона. Светлые гомогенные в течение всого периода наблюдения яйца условно относились к неоплодотво-рзпным.

Определение ©тшцпопалыюго Р-элгмзпта.

В системе скрещиваний, предложенной Энгельсом (Engels, 1984), устанавливали дола особей, несущих мутацию локуса вп (sne или зп+). Для этой цели самцов изучаемой линии, имещих Р-цитотип, скрещивали с М линией, несущей аллель sn", а самцов первого поколения скрещивали с самками 5SC/Y. Установлено, что переход локуса вп" в новое аллельное состогаше связан с активностью полного Р-фактора (Engels, 1984). Появление новых аллелей этого локуса с частотой 5-8S соответствует уровню активности транспозазн одного полного Р-фэктора (Karess, Rubin, 1984).

Статистическая обработка материала. Для оцешш 'достоверности

различий экспэркленталышх данных использовав и-критерай" ' по Урбоху (1964). '■*. i-

РЕЗУЛЬТАИ! .

Цзтоплазизт1гсэс:а:й контроль пара^сцоплл цойзльее элзизптоз Глхб-ридпого дпсгспзза.

В результате перемещения Р- и 1юЬо-кобклышх элементов в зародышевых тканях гибридов Р., развизаэтся синдром, тлучн231й название гонадного, а в случае 1-элекзнта - гакатыого дасгонеза. Частота появления этого признака в значительной степена завгезт от молекулярных характеристик изучаемых сист&ы, которое обозначаются понятием "цитотип", т.е. чувствительностью клетки по отноаанкэ к внедрению активного Р-, hobo- или I-элементов. В таблкцэ I представлены дачные, определяющие•уровни стерильности гибридных особой в различных типах скрещиваний. Скрещивание А использовалось для того, .чтобы определить потенциальную активность мобильных элементов Р или hobo. Для этого самцов изучаемой .линии скрещивали с самками линии М либо Е. С помощью скрещивания А* определяли способность цитотипа изучаемой линии .репрессировать перемещение сопряженного мобильного элемента. Для этого са-,;ок неизвестной линий скрещивали с самцами, несущими активные факторы. Рощшрокноа по отношению к А скрещивание В, а таккэ внутрилинеПноо скрещивание Z, обеспечивающее взаимодействие мевду собой представителей одной и той не линии, служили для уточнения способности этих линий подавлять экспрессию активного фактора. 'Скрещивание-' В*, обратное скре- . ииванию А*, контролировало появление I- фактора, причастного не к гонадной, а к гаметной или SF-стёрильности самок.

Сопоставление скрещиваний ? и 4, проведенных по типам А и А* с известными линиями snw' и- П^,-которые тлеют соответственно М- и Р-цитотипы, позволяет отнести лтанш ywct^ к М-типу. При использовании этой линии в качестве индукторной транспозиция генетических Факторов отсутствовала (скрещивание 2), а в роли-реципиента она не репрессировала перемещение Р-элемеита (скрещивание 4). Однако, взаимодействие самок ywct® с самцами MRh12/Cy тага® приводило к появлению дисгенных особей (скрещивание 6).'. Аналогичные ■ события развивались и в скрещивании I, проведенном по типу А. В скрещйва-шш 5 с участием самцов П2, по типу At транспозиция Р-элемента

коптролпровалась цитоплазмой самок 1111:12/07, что сзязако с Р-цп-тэтпюм лтшии ИШ12/Су.

Использование такого фактора внэшюй, срэдц как температура позволяет влиять на механизм, опрэдедякппЗ синдром гибридного дасгспзза п дг®эрепцарозать ¿¡хспрзсспп Р- и ЪоЬо-эламептов. Кае ■ пскезвла рпботи (Упппорои1оз а1.. 1537) поЕУкениэ температура с ' 25°С до 2Э°С в пзрпод разштпл эмбрионов приводит к усилении , трсисЕозглсп Р-эдемзпта а сшсзешта экспрессии 1шЬи-элаиента. 'ГсЗлггл 1

Лай стсргытз ггбргдоз п Езсаяодеягсрэвгпх япц в реасппях тшах

Номера: Рсдлтальсдю скра- ; линпп пзва- : <о а от) гей» • : т

: Стерильность : Стерилы;

лрчо'г Ъ11 п&тппя Б

:ЮСТЬ

:тпш : 5

:скр9-:кеошга-: семск Р', (55): самцов г/Л)

:щива-:дотво- :—г—т—„--г----х—7—р—

:ш!й -.езп.ялц: 25 с : 29°о : 25°с : 29°с

1.

2> 3.

„я

от х у я с!5

8Тр ЗС П2

А А А Л9 А* А* 3 •В

4. у я сг*-11 х п2

5. ШШ12/Су X П2

6.угсг'21 х КШг12/Су

7. "ЯШ 2/Су х кг7

8.- упег*® х спп ■ 9. П2 X у Т7 в* 10. П2 х ШП2/Су В* 11 .гдаиг/су х ут7сггт в* 12. уте г131 х г

• 13.КШ5/Су х !£НЛ12/су г и.п2 х п2 г

0.5 11.2 15:э 21.1 6.9 14.0 12.6* 5.2 14.3 '19.9

52.2 7.9 14.5

13.3

29.3 0.0 .51.8 <18.1 0.0 31.0 0.0 0.1 0.0 0.0. 0.0 0.0 0.6 0.1

13.0 0.0 100.0 100.0 0.0 18.0 0.0 2.0 0.2 0.0 0.0 0.1 0.3 0.2

21.1 0.0

43.3

19.3 0.0

16.4 0.0 0.0 0.0 0.8 0.0 0.0 0.1 0.4

12.2 0,1 63.5 27.8 . 0.0 10.1 0.0 0.0 . 0.0 1.1 0.0 0.0 0.2 0.4

Действительно,, в'Скрещивании 3 (линий вгг7 и П2), которое осуществлялось по классической схеме Р-Ц гибридного длегенеза, повышение текператури увеличивало экспрессию Реактора. Аналогичная картина пзбдядалось и в скрещивании 4, где индукторной такгз была линия П^. Однако, в скрсютаниях I и 6, где в качество индукторной выступгйта линия !Ш.12/Су, поЕкаьнко температуры сгагдало частоту появления

стерильных особей. Результаты собственных экспериментов и литературные данные позволили нам сдолать заключение о воз«х>гщо2 активности в этих скрещиваниях 1юЬо-мобильного элемента и, поэтому, наличия у линий за* и уис^ не только М-, но и Е-цптотипа, такте как у линии ЫЮИ2/Су не только Р-, по и Н-цитотипа. Это допущение подтвердилось при изучении стабильности локуса зп". Известно, что этот ген сайтспецкфичен для Р-, но но ЬоЬо-элбыента. Соответствующий генетический анализ скрещивании 3 п I показал поязлекио нобых аллелей этого локуса с частотой 26% в третьем и на более ЗЖ в первом скрещивания, то есть активность тракспозазы в одном случае и отсутствие активности этого фермента в другом. Таким образом, среди скрещиваний, представленных в таблице I, скрещивания I и 6 могут быть отнесены к Н-Е, а скрещивание 3 и 4 - к Р-М системам гибридного диагенеза.•Активность перемещения в этих системах Р- и ЬоЬо-мобильных элементов зависит от молекулярных механизмов, контролирующих этот процесс, и определяется не только цитотипом, но и другими регуляторами, рассмотрение которых будет проведено в следующих разделах.

Анализ скрещиваний В-, В*- я 2- типов, представленных в таблице I, позволил сделать заключение об отсутствии в этих скрещиваниях такого явления как гонадный дисгенез. Однако, регистрация более 52% неоплодотворенных яиц-у особей Р^ в скрещивании 11, осуществленном по типу В*, скорее всего свидетельствовало об активности 1-мобильного элемента, транспозиция которого вызывает таг. называемую БГ-стерильность самок, обусловливающую дефектность гамет и появление высокого процента неоплодотворенных яиц. Необходимые .дополнения для этих представлений могут быть получены при изучении событий, происходящих в потомстве , и . результатов молекулярного анализа исследуемых4линий.

Анализ летальности у потомков Р^-1).гг:^1апо£?з.з1;ег в зцСриапалькыЯ и постзыбриональный периода раззития.

В связи с тем, что перемещение мобильных' элементов происходит в зародышевых тканях гибридоЕ на премейотической .стадии их развития, регистрация генетических событий возможна только в Таблица 2 и график I ■ представляют данные гибели эмбрионов, а также личинок и куколок иод влиянием перемещения трех семейств мобильных элементов гибридного дисгенеза. Очевидно, что

дифференцированный отвэт меток на транспозиции мобильных элементов, относящихся к различным системам гибридного дисгенеза, имеет место, главным образом, па эмбриональных стадиях развития. Тсбгща 2

Лэтзлькссть у гпбрпдсз ?2 3 прсцзссэ сптогепзза D.mslano gaster в сзягп с пзрзигггэпзга i-, tobo- я Р-цоЕзяылп. элзизэтез.

тш9 ¡Системы ¡гибридного :дисгенеза :11росмот- Стадии летальности (%%)

: яиц эмбриональная :0б- :постзг,:бр опальная

: : а* : 0* : В* : г*:™™3"1 куколки

i Р-П 9346 15.б:1з.з:ю.7:з.2:47.в: s.ss 2.28

2 н-н 7112 3.9: 5.з: 6.2:7.4:22.3: 2.67 1.33

3 I-R 8010 з.э: 8.1: 4.5:з.з;19.8: з.79 2.56

4 К** ...... . ' ■ 7314 : 0.0: 0.3: 0.7:0.2: .1.2: 3:18 : 1.63

* - Стадии эмбриогенеза (а-дроблзниэ ядра; б-бластуль; в-гаструл^

г- органогенез) •

«го тгя

** - Контроль ( К - утсГи1х У'с! )

В система Р-М гибридного 'дисгенеза пик гибели эмбрионов приходился на начальную стадию эмбриогенеза - дробление ядра. В дальнейшем наблюдалось сштанпе частот гибели эмбрионов, и на стадии органогенеза доминантныо летали составляли около половила от тех, ко-ГрсС^ I

Гпбзль С'.гбргюпоз при ПерЗМЗЩЗЕПИ трох ССГЗЙСТЗ ^ОбГТЛЫПХ ЭЛ21!ЗТГТСЗ.

AAZ

А - 1-й

Б - Р-и В - Н-Е

1 - дробление ядра

2 - бластула

3 - гасгрула

4 - органогенез

5 - личинки

6 - куколки

5 б

N

N

торае были зарагкстарованы в начале развитая. Налротпз, в спстста Н-Е гсж гибели еу.Зрконов приходился на стадия оргаиогенэза с, постепенны?.! уменьшением частот тотальности к стадии дроблопвя ядра Система I-R занимала прожиточное юлогешэ: сс-';о5 чувствительной ; по отношению к перемещение 1-эдамэнта'оказалась стадия бластула. Слодует отметить, что в контрольной скрещивании эмбриональная гибель не превышала 0.75S, а общее количество погабаих £г.брио;гов составляло !.'<.%, т.о. было на порядок мэнькэ, чем, например, в Р-!' •системе гибридного дасгенеза. Для лнчкпок и куколок текло различия мекду контрольными п опытны;,и скрещиваниями ко выявлялась и частота' их колебалась от 1.6 до 3.2S.

Тагам образом, последствия перзкацэннй мобильных эломзптов гибридного дисгеноза у потомков Fj в 6ольесй стегани проявлялись в системе Р-М, причем пик кривой, отражающей этот процесс был сдвинут влево и свидетельствовал о более ранней, по срашнаа с .крупна системам.!, гибели эмбрионов. - •

Количественлое прояЕлешю летальности в Н-Е и I-R системах гибридного дасгенеза оказалось довольно близким и колебались от 3.9 до 7.4% и от 3.9 до 8. IS. в первой н второе системах соответственно и достоверно превосходило все контрольные показатели. Заключение о предполагаемых механизмах, опрэдолягдкх'этп события, возможно на основе колекуляных характеристик опытных линий,. которые представлены.в следующем разделе. , .

Молекулярный впализ лилий, использовапЕЛХ с рзЗото. Таблица 3 дает возмохиость оценить корлекулярныэ характеристики лилии, формирующих системы гибридного дисгенеза путец сопоставления результатов блот-анал!.за и гибридизации In altu. Соотшиенио пол1шх и делегированных производных соответствующих мобильных эле-, мантов определяет потенциальные возмоаностп линий D.rcelanc^a3ter и позволяет сравнить фенотишческие события, наблздаемые при перемещении Р- hobo- и I-мобильных элементов в кагдей система с результатами возможных взаимодействий таких копий. Молекулярный анализ позволил обнаружить наличие 8 . неповрежденных копий Р-эломента в лиши П^.и 7-8 активных элементов hobo в лиши HRhl2/Cy. Количество делетированных производных' .составляло 13 и 17 копий соответственно. В линиях ywet®* мобильные элемента Р и hobo были представлены только в виде делетированных. производ-

T26jraí3 3.

Содсртзига пэлих a дагаткрозгипа: кешзЯ »обткьпах элементов п

ГССГОДСВаППЦХ ЛЗИЯХ. ч

JTiHüni . : P I hobo

: полные делзтир. полные : ДЭЛЭТЛр. по ЛПК 3 делетнр

¡™v12/Су : 0 5 <t i 11 7 17

y Tí ct:in : ü 2 5 j 10 0 1В •

ir : 8 13 o : 0 0 0

пых, причем дэлзтаровакпах зл-змэнтоз hobo било з 9 раз Ооль'лз, чем сзааопгагв Р-олегантов, а пх регмэри пэ прэвкзалз 2.6 lib, а у олегзнта Р колебались от 1.25 до 2.6 kb. Таким образом, лпнля ™ct^ содержала только дедэтярозоннио ко игл: ксбилыггх элементов Р л bobo, тогда как Озктор i б:хл представлен в стой лнеп бссмз *£ло-псмз семейства. В '3íh12/C7, its:: к предполагалось, отсутство-

вали полные Р-элэмептн, однако ¡юбпльпиз слзмзнты I и hobo бчли прэдстввлепн семействам, т.е, пэпозрэадепнут.я и дзлэ!ПфозЕГП1га коягтп.

Используя дашгэ но In situ гибрэдизг-цил на полптенэнх хромосомах ot:ix лита, шлучгнпзх сспгргнг::сй БпгсповсЯ Р.Б., удзлось сбнаругять опрэдолзппуз направленность з распрэдолепп элементов I па хромосомах, которая зависела _от лазил, з которой сзп локализованы. Например, в лисп yrat1*5* полнее элзмзптн располагались, главным образом, па правей плече трзтьеГ; хромосома, а в пии ÜRh12/Cy - на Х-хромосоме. Тсбгща 4.

СаСти пнеерция 1-мсбплы:сго зламзптз г.™ поптгггпгх хрс*-к»ссч:!х п-ПГЙ1 IJRht 2/Су п у w ct1® D.nelanogaster.

Л: шли Хромосома 3R Кол-во сайтов Х-хромосома Кол-во сайтов

сайта инсерци сайты инсерции

у и ctr*. 83?; 84А; 65АР; 8ГЗ; 89В б 5С 1

!ÍRh12/Cy - 0 4А; 5AD; 7С 4 С

Таким образом, наблюдаются на количественные, а качественные различия мевд исходными линиями в ^тнопешш • локализации I-фактора на хромосомах, которые, возможно, являются опрадзлящимп при вступлении линии в роль индуктора или реципиента.

ОЕОТДШШЕ

Как извостно, перемещение мобильных элементов P,I п hobo происходит только -в генеративных, но не соматических тканях' гибридов Г1 (O'Hare, Rubin, 1983; Blactoan et ¿1., 1S89; Pinnegan, 1989). Тканеспоцкфгееский характер таких транспозиций обусловлен молекулярными механизмами, которые контролируют пэрзыэцчнке соответствующих'мобильных элементов. Для Р-элемента устаковлэно, что регуляция транспозиций в соматических тканях гибридов первого поколения осуществляется на уровне. пре-мРНК сплайсинга за счет из-вырозания третьего интропа из первичного транскрипта и синтеза нефункционального полипептида (Laskl et al., 1906; Slebol, Rio, 1990; Chain et al., 1991).

В половых клетках гибридов существует несколько типов рэпрзс-сии, механизмы которой сейчас интенсивно изучается, v Развитие гонадного и гаметного дисгенеза у габридов Fj, а такг.о появление мутаций в последующих поколениях осуществляется при взаимодействии процессов, обеспечивающих транспозиции мобильных влеыентоз п их регуляцию. Отсутствие такой рогуляции, которая определяется, в часности, цитотипом клетки, !.!os:qt приводить к развитию 100« стерильности у гибридов первого поколения. Предполагается, что рзп-■ рессоры, осуществляющие контроль за перемещением мобильных- элементов, синтезируются полным!: активными элементами и накапливаются в.цитоплазме материнской клетки. От количества этого репрессора зависит частота появления стерильности у гибридов P1(Engelj, 1981; Sved, 1987; Robertson, Engels, 1989; Ulsra et al., 1990). Динамика стерильности, развивающей при различных теширатурных рекимах в скрещиваниях 3 и 4 (таблица I), которые осуществляются по схеме Р-М гибридного дисгенеза, свидетельствует, что цитотип « Л1ший snw и ywctMR может контролировать у гибридных самок до 5ОХ стерильности. Однако, повышение температуры до 29°С вызывает у них 100%-ое недоразвитие гонад. Возможно, это связано с инактива--

цией репрессора, имеющего полипьптидную природу.

Накапливаются данные, свидетельствующие о том, что такие соединения могут -синтезироваться не только полными Р-элементаки (Hisra, Rio, 1990), но и делетиросанными производными (Black ft al., 1987; Jackson et al., 1988). Результаты молекулярного анализа подтверждают, например, наличие двух двлетированных 'копий в линии yrct1® (табл. 3), а литературные данные (Nltaaaka, Yair.a-zaki, 1938) указывают на содержание в линии зп4 не менее двух таких производных. Действительно, количество полных активных Р-фак'горов в индукторной линии П^ равно 8, а появление новых аллелей локуса зп" составляет 26%. Это приблизительно соответствует активности транспозазы только 5-ти полных Р-факторов, если исходить' из денных лаборатории Рубина (Кагезз, RuDin, 1988). Таким образом, регуляция транспозиции, наблюдаемая в скрещиваниях 3 и 4, чвстично обеспечивается и этими дефектными копиями Р-элекента.

Отсутствие температурной зависимости в системе Н-Е гибридного дисгенеза (скрещивания I и 6 в табл. I) позволяет'говорить об актуальности не цитоплазчатич&ской, а хромосомной регуляции. В otj. .- . чие от цитоплазматической, этот тип репрессии ве зависит от повышения температуры, передается по наследству через оба пола и могет проявляться при скрещивании как в одном, так и в другом направлении (Yannopoulos et al., 1987; stssatis et al., 1989). В роли таких хромосомных факторов выступают полные и делетированные элементы. Последние могут влиять на активность транспозиции либо за счет "титрования" транспозазы, либо путем инактивации. Наличие таких двлетированных производных, которые, как полагают, способны осуществлять подобные футпедга, обиаругэпо в семействах Р(КР)- и hobo(Th)-мобильных элементов (Streck et al., 1986; Black et al., 1987;Jacksorx et al., 1988; Periquet et al., 1989; Staons et al., 1990). Однако, это нэ единственные претендента на роль структур обеспечивающих регуляцию. В настоящее время вскрываются и некоторые другие производные, способные оказывать на транспозицию репрессирующее воздействие (Gloor et al.,1993).

Молекулярный анализ геномов линий ywct1® и !ffih12/Су (табл.3) позволил установить в них значительное колгеество дефектных копий hobo- и 1-элементов (18/10 и 17/11 соответстсвнно), которые, по всей видимости, оказывали влияние на характер кривой, отражающей

гибель эмбрионов второго поколения в Н-Е и I-R системах гибридного дисгенеза. В отличие от Р-М система, где количество делетированннх копий Р-элемэнта в линии-реципиенте ywct® равнялось 2. Таким образом, соотношение полных и дэлэтированккх производных в индукторной линии и линии 'реципиенте, т.е. фактор*-' хромосомной регуля'ца!, наряду с цптоплазматкчэской, играют роль в изучаемых системах Р-ИиН-Е гибридного дисгенеза, однако в система Н-Е акцент делается на первом, а в Р-М - на втором типе регуляции.

Реализация I-R системы гибридного дисгенеза в каких экспери- , ментах связана с вариантом скрещивания, обратным Н-Е спстсмо, т.е. ' самок MFUH 2/Су с самцами ywct . Были проанализирована разллчшэ механизмы наблюдаемых событий. Вначале исключалось участке в них Р-элемента, наличие которого в линии LTOi12/Cy могло влиять на дис-генетический поте1щиал этой линии. Использование методов гокати-ческого (мутабильность локуса впи ) и молекулярного методов анализа (табл.С) не подтвердили активности этого фактора в исследуемых скрещиваниях. Экспрессивность мобильного элемента hobo ftxna связана, главным образом, с прямым направлением скрещивания, тогда, как события, происходящие в обратном направлении, на исключали активности I-мобильного элемента. Проада всего об этом' свидетельствовало появление в F1 больсого количества неошгадотворенных яиц и отсутствие гонадного дисгенеза. Результаты молекулярного анализа не позволили сделать однозначный вывод, т.к. количество полных и делетированных производных I-элемвнта в -этих линиях было довольно сходным, т.е. предпосылки аддитивного•эффекта отсутствовали. Однако,' по данным гибридизации In altu, наблюдалось дифференцировакное (в зависимости от линии) скопление этого фактора на хромосомах. Пс данным шведского ученого By (fiu 1990), полученным при анализе нескольких десятков линий D.melanogaater, активные I-элементы располагались, главным образом, на третьих хромосомах, а неактивные - на, половых хромосомах. (В данном случае' речь идет только о полных, неделетированных формах, локализующихся на плечах хромосом, тогда как дефектные копии этого элемента накапливаются исключительно в гетерохроматине центромэрных районов (Flnnegan 1989). Возможно, это свойство мобильного элемента I оказалось определяющим в индукторной роли линии ywct1® в условиях об-

ратного варианта скрзгсгвания.

Обоб'лешыо характеристики изучаемых систем были получены при анализа гибели эмбрионов на разшх стадиях развития. Количествен-Ено п качественные показатели графика I давали да4фзренцированное предстзвлэнпэ не только о специфжа перемещения этих мобильних элементов, но и о деятельности рзгулпрустх кэхснигмов. Например, тролепоз:гция сакейства Р-кобильшх элементов вызывало пик гибели эмбрионов на семой ранней стадпи-дро1ленпя ядра, причем эти значения били достоверно вншэ аналогичных показателей Н-Е и 1-Я спетом гибридного дисгзиеза и совпадали с дппшмп генетического и голзкулярпого анализов. Различие «езду I-П и Н-Е спстзмсид состояло, в основном, в появлении пинов гибели сгтбриопов на стадии «Злэс-ту.тл для первой и оргапогеноза - для второй систем. Г аккм образом, бели исходить из обратной зависимости м-згщу последствия-га, которпэ Ензнзготся пэрексг.эняем различных сс:.тайств мобильных элементов и уровнем развития мехаписмсз, контролирующих трансио-згацнэ, то Р-М система окззывеетбя в ото:-! плана наименее продвинутой. Действительно, есть доказательства того, что в Р-М систоу птбрэдного ди'сгспоза процесса сболгциойнзго форнпровения механизмов, котроларуютх порэмзщзниэ соответсгвугдаго es:.:зйства мобильных алвкэнтоз еще из завзрпепи. 05 этом, во- первых, свиде-дэтэльствуат Зольпшэ отклонения гтзгеду линии: гл по количеству копий итого элемента, в отличие, папр:п:зр, от 1-элгмзнта, количество которого в геномэ дрозофилу стабилизировалось на 15—1; Ъо-вторих, наличием в кэздой лигпп дзлзтирезенпих производных Р-элемэнта, Егрьирувппх по величине (.у D.tfllliatcni кнзот мэсуо варьирование этого элемента е™э я по нуклеотидис:^ составу, достиггиглзэ 10" ) (Daniels et al.,-1590), тогда как, например, hobo-элемент в пределах ОДНОЙ линия ПрЭДСТЕЗЛЗИ д9ло-ТИР02С:л!1г,я копия? hi ТОЛЬКО од-НОЛ воличшш; в-третьих, псиользовскпэ з системе Р-Н гибридного дисгенеза разных мох8ш;зыов • рэгуляитп: цптопдяз?латического, хро-?'оссгпюго и,возмогло, эффекта положения, у hobo в наибольшей мзро представлен хромосомный, а у 1-элементов - механизм э$фзкта положения. Последний, вероятно, является наиболее эволюционно за-пер^еншел, т.к. основан на системе слоившихся внутригензшх взаимоотношений.

ЕЫВОДЫ • '

I.Отработан метод, позволяющий проводить сравнительный анализ последствий, возникающих з процессе эмбриогенеза D.melanogaster при' перемещении трех семейств мобильных элементов. Одновременная рега-стрчция количественных, и качественных различий, не только позволяет легко дифференцировать системы, ответственные за проявление исследуемых морфологических показателей, но и судить о возможностях механизмов, контролирующих перемещение. _ 2.Обнаружена повышенная чувствительность стадии дробления ядра к перемощению мобильного элемента Р, а бластулы и органогенеза к I и hobo соответственно. . '

3.Дашше молекулярного и генетического анализов указывает на про- ' превалирующую роль цитоплазматической регуляции в система Р-Н, , хромосомной - в Н-Е и эффекта полоЕения в I-R системе гибридного дисгенеза. .

4.Сделаны попытки определить эволюционную завершенность структур, контролирующих перемещение мобильных элементов в различных системах гибридного дисгенеза, в связи с проявлением уровня их полиморфизма.

Основные результаты дассертацгш отрегзкы в слодущзх сообща киях: '

1. Ата А.Т.Н., Т.М.Гришаева, Н.И.Изащенко: "Особенности онтогенетического развития Drosophlla melanogaater при перемещении трох семейств мобильных элементов". Генетика, (в печати)

2. Ата A.M.Т., Н.И.Иващенко:"Локализация и экспрессия I-мобильного элемента в геноме Drosophlla melanogaster". 1993, XI Всероссийский симпозиум'"Структура и фу.жция клеточного ядра", С.-Петербург.

3. Иващенко 'Н.И., Ата А.Т.М., Т.М.Гришаева:"Контролируемый характер изменчивости в системах гибридного дисгенеза Droc:>phlla melanogaster". 1992, и Съезд ВОГиС, Минск.

Формат СоШЧ/щ Здиз 1G

' Тираж gt)

Подписано в печать 7ЖсГЩ Усл. печ. л. "if О

Типография Россслмозакадосш